Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

D-vitamiinin reseptorin (VDR) reitti on tärkeä ehkäisyssä ja mahdollisesti hoidossa moniin syöpiin. Yksi tärkeä mekanismi VDR toiminta liittyy sen vuorovaikutusta Wnt /β-kateniinin reitin. Agonisti-sidottu VDR estää kasvaimia synnyttävän Wnt /β-kateniinin /TCF-reitin vuorovaikutuksessa suoraan β-kateniinin ja joissakin soluissa lisäämällä kadheriiniekspressiota mikä puolestaan ​​rekrytoi β-kateniinin kalvoon. Täällä tunnistamme TCF-4, transkription säädin ja β-kateniinin sitovan kumppanin epäsuorana kohteena VDR reitin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä työssä osoitamme, että -että TCF- 4 (geeni nimi TCF7L2) on vähentynyt maitorauhasen VDR hiiressä verrattuna villityypin hiiren. Lisäksi osoitamme 1,25 (OH)

2D

3 lisää TCF-4 RNA ja proteiini tasoilla useissa ihmisen peräsuolen syövän solulinjoissa, jonka vaikutus on täysin riippuvainen VDR.

In silico

analyysi ihmisen ja hiiren TCF7L2 promoottorit löydetty useita otaksuttu VDR sitovia elementtejä. Vaikka TCF7L2 promoottori toimittajat vastasi eksogeenisia VDR, ja 1,25 (OH)

2D

3, mutaatio analyysi ja kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä, osoitti, että kasvu TCF7L2 ei vaadi rekrytointi VDR tunnistettuihin elementtejä ja osoittaa, että asetuksen mukaan VDR on epäsuora. Tätä vahvistaa vielä vaatimus

de novo

proteiinisynteesiä tähän ylössäätöä.

Johtopäätökset /merkitys

Vaikka onkin yleisesti oletetaan, että sitoutuminen β-kateniinin jäsenille TCF /LEF perhe on syöpä edistäviä, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että TCF-4 toimii sen sijaan transkription repressori, joka rajoittaa rinta- ja peräsuolen syövän solujen kasvua. Näin ollen voimme päätellä, että 1,25 (OH)

2D

3 /VDR välittämää kasvu TCF-4 voi olla suojaava rooli paksusuolen syövän sekä diabetes ja Crohnin tauti.

Citation: Beildeck ME, Islam M, Shah S, Walesin J, Byers SW (2009) valvonta TCF-4 Expression by VDR ja D-vitamiini hiiri maitorauhasen ja peräsuolen syövän solulinjoissa. PLoS ONE 4 (11): e7872. doi: 10,1371 /journal.pone.0007872

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2009; Hyväksytty: 14 lokakuu 2009; Julkaistu: 17 marraskuu 2009

Copyright: © 2009 Beildeck et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: R01- CA-129-813 (SWB); DoD CDMRP Predoctoral Harjoittelu Award: W81XWH-06-1-0786 (MEB) https://cdmrp.army.mil/bcrp/default.htm; Core Facilities Grant: NIH P30 CA51008 (LCCC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aktivointi D-vitamiinin polku on liittynyt pienentynyt riski kehittymistä ja etenemistä moniin syöpiin (tarkistetaan [1]). Vaikka epidemiologisissa tutkimuksissa eivät ole yhtä selviä koskien yhdistys syöpäriskiä kanssa seerumin D-vitamiinin ja sen metaboliittien, molekyylibiologian ja eläinkokeet tukevat rooli D-vitamiinin lisääntyneeseen apoptoosin ja solujen erilaistumista, ja laski solujen kasvua. Koska D-vitamiini on yhdiste, joka on saatavilla ruokavalioon (vaikkakin riittävän) lisänä tai helposti-syntetisoida elin, se on houkutteleva ehdokas kemopreventiolle ja kemoterapiaa. Sen kliinistä hyötyä tässä ominaisuudessa kuitenkin estyy annosta rajoittava hyperkalsemia, sivuvaikutuksena joka kehittyy ensisijainen rooli D-vitamiinin kalsiumhomeostaasissa. Kun pyritään hyödyntämään D-vitamiinin klinikalla kuin syövän vastaisen aineen, on pyritty tuottamaan D-vitamiinin analogit, jotka johtavat alentuneeseen hyperkalsemia. Vaikka nämä analogit ovat osoittaneet suurta lupausta

in vitro

ja eläinmalleissa, ne jäävät muistelemalla vastaavan vasteen klinikalla. Lisäksi onnistunut analogi voi aiheuttaa erityisen ongelman yhteydessä peräsuolen syöpä, kolmanneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman miesten ja naisten Yhdysvaltain. Vaikka todisteet D-vitamiinin kuin solunsalpaajaksi tässä elimessä on erityisen vahva, maha-suolikanavan on kiinteästi mukana vaikutukset välittyvät D-vitamiinin kalsiumin homeostaasiin. Tämä osoittaa, että paksusuolessa, se voi olla vaikeaa irrottaa syövän ja kalsiumin homeostaattisen vaikutuksia D-vitamiinia Vaikka muissa tutkimuksissa osoitamme, että jotkut D-vitamiinin osittaisina antagonisteina aktivoi D-vitamiini- reseptoriin soluissa, jotka ilmentävät korkeita aktivoitujen β-kateniinin (syöpäsolut), mutta ei normaaleissa soluissa ja sillä voi olla potentiaalia tehdä tämän [2].

nukleaarihormonireseptorit voivat vaikuttaa kanoninen Wnt signalointiryöpyn vuorovaikutuksessa β-kateniinin [3 ]. Tämä ilmiö saattaa olla erityisen merkityksellistä paksusuolensyöpä, jossa 80% tapauksista ovat satama APC mutaatioista, jotka poikkeavasti aktivoivat β-kateniinin [4], mikä johtaa kertyminen aktivoitua β-kateniinin tumassa (katsaus esitetty [5]). Tumassa, β-kateniinin vastaa co-aktivointi transkription geenit, joiden promoottorit ovat käytössä jäsenet TCF /LEF perheen transkriptiotekijöiden. Jotkut näistä geeneistä, kuten

c-myc

[6] ja

sykliini-D1

[7], ovat mukana solukierron säätelyssä ja voi osaltaan onkogeenisessä fenotyyppi. Solujen käsittely joidenkin (mutta ei kaikkien) ydin- hormonireseptoripositiivinen (NHR) agonistit aiheuttaa säätely ylöspäin NHR reagoivien geenien samalla aiheuttaen lasku TCF /β-kateniinin kohdegeenin transkription. Tämä on katsottu johtuvan kilpailevan sitoutumisen välillä TCF ja NHRs varten β-kateniinin [3], [8] – [11], ja /tai yhteinen co-aktivaattorit kuten p300 [2]. Toinen tila esto Wnt kohdegeenin transkription syyksi on ehkäisyyn β-kateniinin tumaansiirtymiseen rekrytoimalla sytoplasman β-kateniinin ja vyöliitos [9], [12], [13]. Kolmanneksi, on näyttöä siitä, NHRs sitoutuvat TCF /LEF perheenjäsenet, suoraan, ja siten estää transkriptiota TCF /β-kateniinin reagoiva geenejä [14] – [18]. Tämä johtuu todennäköisesti rekrytointi yhteistyössä repressors kuten TLE (Groucho) [19], NCOR ja SMRT [20].

Kirjoittajat raportoivat ylimääräisen mekanismi vuorovaikutuksen β-kateniinin reitti ja vitamiini D-reseptorin (VDR) kautta. Selventää, käytämme seuraavaa nimistöä: TCF7L2 yhteydessä plasmidien, DNA: n ja RNA: n ja TCF-4 yhteydessä proteiinia, vain. Olemme havainneet, että TCF-4 ilmentyy differentiaalisesti soluissa, jotka ovat peräisin DMBA-indusoidun hiiren maitorauhasen kasvainten VDR villityypin ja knock-out-hiiret, ja maitorauhasista itse. Lisäksi tutkimus paljasti VDR-riippuvainen säätely ylöspäin TCF7L2 mRNA ja proteiini tasoilla käsittelemällä 1,25 (OH)

2D

3 Caco2 soluissa. Analyysi ihmisen ja hiiren TCF7L2 promoottori ennustettu useita otaksuttu D-vitamiinin reseptorin sitovat elementit proksimaalisesti transkription aloituskohdasta. Vaikka kloonaus tämän promoottorialueen paljasti sääntelyä VDR /1,25 (OH)

2D

3, myöhemmin mutaatio analyysi, kromatiinin immunosaostus ja proteiinisynteesin inhibition kokeet osoittavat, että tämä vaikutus on todennäköisesti välittyy epäsuorasti, kautta VDR /1,25 (OH)

2D

3-herkkä välittäjä. Kohonneita TCF-4-proteiinin tasot kääntää lisääntyneestä TopFlash toimintaa sen jälkeen 24 tuntia ligandin hoidon Caco2 soluissa. Ehdotamme mekanismi, jonka vaikutus voi estää kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden

vuonna cellulo

.

Tulokset

rintarauhasiin alkaen VDR Knockout Mice vähemmän TCF-4 kuin rintarauhasiin maasta VDR Wild tyyppinen hiiret

VDR145

+ /+ ja VDRK240

– /- solulinjat ovat peräisin DMBA-indusoidun hiiren maitorauhasen kasvaimet villityypin (WT) ja VDR knockout (KO) hiiriä, vastaavasti ja kuvattiin aiemmin [21]. VDR KO hiiret ovat alttiimpia karsinogeeni aiheuttamaa maitorauhasen ja paksusuolen syöpää aiheuttavia aineita sekä muita vaurioita [22], [23]. Alustavat kokeet osoittivat, että TCF-4 oli runsaampaa WT soluja kuin KO-soluja (ei esitetty). Suoritimme Western blot analyysi TCF-4 ja vahvisti, että VDRK240

– /- soluilla on hyvin alhainen TCF-4 verrattuna VDR145

+ /+ -soluista (kuvio 1A). Me seuraavaksi suoritetaan alasvetopiiri määritys, jossa käytimme kaksi GST-merkitty β-kateniinin fuusioproteiineja. WT GST-merkittyjä β-kateniinin sitoo TCF /lefs kautta Armadillo toistoalueen, kun taas GST-dTCF-β-Cat, joka satamat mutaatiot tähteissä 253, 312, ja 435 sisällä Armadillo alueella, on dramaattisesti-heikompi affiniteetti TCF /lefs [24]. Yhdenmukainen western blot tiedot, WT fuusioproteiini vedetty alas enemmän TCF-4 päässä VDR145

+ /+ lysaatit niinkään VDRK240

– /- lysaatit. Mutatoitunut fuusioproteiini vedetty alas vähemmän TCF-4 päässä VDR145

+ /+ soluja eikä yksikään päässä VDRK240

– /- solut (kuvio 1 B).

(A) Western blot kokosolulysaateista, kahtena kappaleena, mistä VDR145

+ /+ (VDR + /+) solujen (kaistat 1 ja 2) ja VDRK240

– /- (VDR – /-) solut (kaistat 3 ja 4) koestettiin TCF-4, VDR ja GAPDH. (B) Avattava proteiinien VDR + /+ ja VDR – /- lysaatit GST-merkittyjä β-kateniinin konstruktioita ja koestettiin TCF-4. GST-WT-β-kateniinin (GST-β-Cat) käytetään kaistat 1 ja 2. mutaation β-kateniinin, joka ei sitovat tehokkaasti TCF /LEF proteiinit (GST-dTCF-β-Cat) käytetään kaistat 3 ja 4. Helmet yksin käytetään kaistat 5 ja 6 (C) OT aktiivisuus VDR + /+ ja VDR – /- solut transfektoitu

Renillaa

ja VP16-β-kateniinin. Tulokset on normalisoitu

Renilla

. Virhe palkit edustavat SEM. p-arvot edustavat Studentin t-testi MERKITTÄVÄT erot solulinjat. RLU: Suhteellinen Light Units (D) OT aktiivisuus VDR + /+ ja VDR – /- solut transfektoitu

Renillaa

, VP16-β-kateniinin ja tai ilman TCF7L2 plasmidia. Virhe palkit edustavat SEM. Tilastot ovat opiskelijan t-testi erot Transfektoituja ja valvonta-transfektoiduissa soluissa. * P 0,05; *** P 0,0005. (E) maitorauhasen kudoksia VDR WT (ylälevyissä) ja VDR KO (alapaneeli) hiiristä värjättiin TCF-4 esitetään kolme suurennoksilla.

vieressä käyttäneet OT /OF toimittaja järjestelmän määritys TCF /β-kateniinin aktiivisuutta näissä soluissa. OT Reportteri sisältää kolme tandem TCF /LEF sitovia elementtejä ylävirtaan lusiferaasigeeniin ja vastaava ohjaus toimittaja (OF) on muuntunut TCF sitoutumiskohtiin ja edustaa tausta sitova. Koska nämä solut ovat alhaisen endogeenisen β-kateniinin aktiivisuutta, VP16-β-kateniinin koekpsressoitiin kanssa reportterivektoreita kaikissa näytteissä. Sopusoinnussa niiden kevyemmästä TCF-4, VDRK240

– /- solut oli vähemmän β-kateniinin aktiivisuus kuin VDR145

+ /+ soluja (kuvio 1 C). Tämä ero oli merkittävä, mutta ei suuria ja osoittaa, että VDRK240

– /- solut ovat muita TCF perheenjäseniä, jotka voivat kompensoida TCF-4, ja /tai alhainen TCF-4, jotka pysyvät näissä soluissa riittää aktivointi ainakin yhteydessä korkeita aktivoitu β-kateniinin [25], [26]. Kotransfektion eksogeenisen TCF7L2 pelastettiin alennettu β-kateniinin aktiivisuus VDRK240

– /- solut (kuvio 1 D). Sen määrittämiseksi, onko tämä ilmiö tapahtuu myös

in vivo

, me värjätään normaali rintarauhasen kudokset VDR WT ja VDR KO hiiriä TCF-4. Yhdenmukaiset muun datan kuvion 1, rintarauhasen kudokset VDR WT eläimillä on merkittävämpi värjäystä verrattuna rintarauhasen kudokset VDR KO eläimistä (kuvio 1 E). TCF-4 värjäytyminen ei ole täysin poissa VDR KO maitorauhasineen, vaikka se on paljon harvemmin ja vähemmän intensiivistä (kuvio 1 E, alhaalla oikealla paneeli).

CYP24A1 on parhaiten tunnettu, myötävirtaan kohde-vitamiinin D-reitin ja sen mRNA on erityisen herkkä VDR-agonistit. CYP24A1 osallistuu metaboliaan aktiivisten D-vitamiiniyhdisteiden inaktiivisiksi metaboliiteiksi. Aktiivisuus CYP24A1 toimittaja oli poissa eikä vaikuta 1,25 (OH)

2D

3 VDRK240

– /- solut mutta palautui kun transfektioon VDR (kuvio 2A). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että solut, jotka ovat nolla varten VDR on alhaisempi pohjapinta tasoilla TCF-4 ja että tämä heikentää β-kateniinin aktiivisuuden meidän VDR-null rintarauhasen malli.

(A) CYP24-luc aktiivisuus in VDRK240

– /- (VDR – /-) ja VDR145

+ /+ (VDR + /+), solut, jotka transfektoitiin GFP tai VDR, ja sitä käsiteltiin 10

-7 M 1,25 ( OH)

2D

3 tai EtOH-ohjaus 24 tuntia kuten. RLU = suhteellinen Light Units. (B) käänteiskopioijaentsyymi- PCR-analyysi hiiren CYP24A1 (yläpaneeli), hiiren ja ihmisen VDR (keskimmäinen paneeli) ja β-aktiini (alapaneeli) selostukset vastauksena eksogeeninen ihmisen VDR ilmaisun ja 1,25 (OH)

2D

3 kuvatun käsittelyn osassa A (C) Eri peräsuolen syövän solulinjoja inkuboitiin 24 tuntia 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai EtOH, kuten osoitettu. Cellular proteiinit analysoitiin TCF-4 lauseke (yläpaneeli) ja GAPDH seurattiin yhtäläistä kaistaa lastaus (alempi kuva). Sekä TCF-4 bändejä edustavat eri isoformeja TCF-4, jotka ovat eripituisia C-pää. (D) Caco2-solut transfektoitiin eri määriä VDR tai siRNA: ssa 24 tuntia ja käsiteltiin 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai EtOH myöhemmin 24 tuntia, kuten osoitettu, ja koestettiin TCF-4. NT: Non-kohdistaminen. (E) densitometrinen analyysi kolmesta western blotit kuten osassa A. Käyttäjän piirrettiin suhteessa kuhunkin EtOH hoidettuun kontrolliryhmään. p-arvot syntyvät yksisuuntainen t-testi: * p 0,05; ** P 0,005; *** P 0,0005 (F) Caco2 transfektoitiin 24 tuntia VDRE-luc,

Renillaa

ja siRNA ja hoidettiin myöhemmin 24 tuntia 10

-7 M 1,25 ( OH)

2D

3 esitetyllä. RLU: Suhteellinen Light Units. (G) Caco2 transfektoitiin siRNA 24 tuntia ja käsiteltiin myöhemmin 24 tuntia 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai EtOH kuten on osoitettu. CYP24A1 selostukset analysoitiin qPCR. Tulokset on normalisoitu GAPDH ilmaisun ja piirrettiin suhteessa kuhunkin EtOH valvontaa.

VDR /1,25 (OH)

2D

3 Säätelee TCF7L2 mRNA ja proteiini peräsuolen syövän Cell Lines

seuraava transfektoitu VDRK240

– /- solut ihmisen VDR ja totesi, että TCF-4-proteiinia ja TCF7L2 mRNA ei vaikuttanut VDR tai 1,25 (OH)

2D

3 (täydentävät Kuva S1A ja S1B). Huomattavaa on, että vaikka aktiivisuus CYP24A1 toimittaja oli herkkä ulkoisille VDR ja 1,25 (OH)

2D

3 näissä soluissa (kuvio 2A), kuten TCF7L2,

endogeenisen

CYP24A1 mRNA ei ollut, vaikka transfektio optimointi joka antoi meille mahdollisuuden saavuttaa 60% hyötysuhde (kuvio 2B). Nämä tiedot osoittavat, että VDRK240

– /- solut ovat pitkäikäisiä muutoksia kykyä endogeenisen kohdegeenien vastaamaan ohimenevä palauttaminen VDR. Kuten eksogeenisesti ilmaisi promoottorit ovat herkkiä, tämä on todennäköisesti seurausta muutoksista kromatiinin organisaatio, jota ei voida kumota lyhytaikainen ilmentyminen VDR ja hoidon 1,25 (OH)

2D

3.

Näin ollen edelleen vaikutusten määrittämiseksi VDR ja sen klassisen ligandin TCF-4 ilmaisua, me testattiin useita peräsuolen syöpään solulinjoja muutoksia TCF-4 ilmentymistä vasteena 1,25 (OH)

2D

3 (kuvio 2C, Täydennyskuvio S2). Vaikka kaikki nämä solut lisääntyneen ilmentymisen TCF4 vasteena D-vitamiinin päätimme käyttää ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinja, Caco2 useista syistä. Nämä solut ovat hyvin tutkittu yhteydessä D-vitamiinin signaloinnin ja niiden kasvu estyy 1,25 (OH)

2D

3 [27]. Lisäksi ne ovat ainutlaatuinen järjestelmä, joka jäljittelee normaalin suolen epiteelin sillä kun ne tulevat konfluenteiksi he erilaistua kulttuuri [28]. Nämä solut myös ilmaista VDR, mutta alemmilla (ts normaali) tasojen suhteen useisiin muihin koolonsyöpäsolulinjaa [29], [30]. Hoito confluent Caco2 solujen 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai ilman transfektiota VDR johtavat vankka ja tilastollisesti merkittävä kasvu TCF-4-proteiinin (kuvio 2D ja E). Vaikutukset 1,25 (OH)

2D

3 vaatimattomasti voimistaa eksogeeniset VDR ja tämä on todennäköisesti liian alhainen, sillä vain 50-60% solut transfektoidaan. Vielä tärkeämpää on, kasvu TCF-4 indusoi 1,25 (OH)

2D

3 on täysin riippuvainen VDR, koska sen pudotus inhiboi ei ainoastaan ​​vaikutuksia 1,25 (OH)

2D

3 aktiivisuuden VDRE promoottorireportterivektori ja CYP24A1 mRNA induktio, vaan myös TCF-4-induktion (kuvio 2D-G). Toisin kuin VDRK240

– /- solut (Täydennyskuvio S1B), TCF7L2 ja CYP24A1 mRNA: t lisättiin 1,25 (OH)

2D

3 Caco2-soluissa (kuvio 3A). Sekä TCF7L2 ja CYP24A1 tasot olivat koholla 4 tunnin jälkeen, jossa TCF7L2 maksimi saavutetaan induktion 24 tunnin (kuvio 3B). Tämä asetus sovelletaan myös solutiheyteen, koska tilastollisesti merkitseviä eroja TCF7L2 mRNA todettu vain suurempi tiheys (Täydennyskuvio S3). Tämä voi olla analoginen vaatimattomasti voimisti vaikutukset eksogeenisen VDR 1,25 (OH)

2D

3-välitteisen lisäys TCF-4 (kuvio 2E), kuten Caco2 solujen tiedetään säätää ylös VDR upon yhtymäkohta /erilaistuminen [31].

(A) qPCR analyysi Caco2 transfektoitu ja käsitellään kuten on kuvattu kuviossa 2D ja 2E. TCF7L2 (vasen paneeli) ja CYP24A1 (oikea paneeli) selostukset. Aineisto on normalisoitu GAPDH ja piirrettiin suhteessa toisiinsa EtOH hoidettuun kontrolliryhmään. p-arvot on johdettu opiskelijan t-testissä vertailu EtOH ja D

3 valvonta: * p 0,05; **; p 0,005; *** P 0,0005 (B) Caco2 solut käsiteltiin eri ajankohtina 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 enintään 48 tuntia ennen keräämistä. mRNA TCF7L2 (vasen paneeli) ja CYP24A1 (oikea paneeli) määritettiin qPCR. Data normalisoitiin GAPDH ja piirretään kertainen muutos suhteessa 0 Hr aikapisteessä. p-arvot olivat peräisin opiskelijan t-testissä verrattuna 0 Hr ajankohta: * p 0,05; **; p 0,005; *** P 0,0005.

VDR /1,25 (OH)

2D

3 Säätelee aktiivisuus TCF7L2 promoottorin hiiren maitorauhasen ja ihmisen peräsuolen syövän solut

Koska TCF7L2 säädellään 1,25 (OH)

2D

3 mRNA tasolla Caco2 soluissa, me skannattu hiiren ja ihmisen TCF7L2 geenien noin 4000 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta läsnäolon puoli-sivustoja, jotka noudattavat VDRE konsensus RGKTSA (R = A tai G, K = G tai T; S = G tai C), tai puoli-sivustoja, jotka poikkeavat hieman konsensus, mutta jotka on kuvattu toiminnallinen VDRE puoli sivustoja kirjallisuudessa. Olemme tunnistaneet useita otaksuttu VDREs koodattu TCF7L2 edistäjänä sekä ihmisen että hiiren geeni (Supplemental Taulukko S1 [32] – [41]). Koska hiiren ja ihmisen TCF7L2 promoottorin osuus on yli 80% sekvenssi-identiteetti ensimmäisessä ~2000 emäsparia, meillä on kloonattu kaksi osaa hiiren promoottorista lusiferaarikonstrukti (kuvio 4A). Yksi reportteri, -1037-luc, sisältää alueen välillä +522 ja -515 emäsparin suhteessa transkription aloituskohdasta ja sisältää 5’UTR ja ennustettu TATA -25 emäsparia. -2068-Luc-reportterin kattaa alueen välillä +430 ja -1542 suhteessa transkription aloituspaikan. Plasmidi nimet ja myöhemmin mainittua VDREs viittaavat etäisyyden aloituskodonista eikä transkription aloituskohdasta lähtien tietokanta transkription aloituspaikkoja vaihtelevat. Puoli-sivustoja -187 /-177 DR4 elementtejä, (kaksi heksameeristen puolen sivustoja järjestetty suorat toistot välissä on neljän nukleotidin) osuus puolet päällä niiden välillä.

(A) Kaksi hiiri TCF7L2 promoottori konstruktit kloonattiin ylävirtaan lusiferaasireport-. Neljä otaksuttu VDRE paikoissa suhteessa translaation aloituspaikasta on merkitty, ja kaikki VDREs koodataan ei-koodaavan säikeen. -177 Ja -187 VDREs ovat päällekkäisiä ja jakaa puoli päällä niiden välillä. -1037 Konstrukti (-1037-luc) sisältää alueen -1–1037 suhteessa translaation aloituskohta ja hänellä -177 /-187 VDRE vain, kun -2068 reportteri (-2068-luc) sisältää välisellä alueella -96 ja -2068 suhteessa translaation aloituspaikasta hiiren TCF7L2-promoottori, ja sillä on kaikki neljä oletetun VDREs. (B) Caco2 transfektoitiin 24 tuntia

Renillaa

ja toimittajille kuten sekä eri määriä p53. Tulokset on normalisoitu

Renillaa

ja tyhjille toimittaja ilme. RLU = suhteellinen Light Units. (C) -1038-Luc tai tyhjän vektorin rakenteet transfektoitiin Caco2-solut

Renilla

ja eri määriä VDR, kuten on osoitettu. 24 tuntia transfektion jälkeen, solut käsiteltiin vielä 24 tuntia 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai EtOH ajoneuvon hallinnan. Virhe palkit edustavat SEM. Tilastot olivat peräisin kaksisuuntainen ANOVA erot EtOH- ja 1,25 (OH)

2D

3-käsiteltyjen näytteiden: * p 0,05; **; p 0,005; *** P 0,0005. (D) Caco2 solut transfektoitiin, käsiteltiin ja analysoitiin kuten osassa C käyttäen -2068-luc sijasta -1038-luc. Tilastot muodostettiin kaksisuuntainen ANOVA merkittäviä eroja määrän VDR transfektoitujen: *** p 0,0005. Virhe palkit edustavat SEM. RLU: Suhteellinen Light Units.

Reporter -1037-luc sisältää ensimmäisen otaksuttu, yhdiste VDRE vain, kun -2068-luc-reportterin sisältää kaikki neljä VDREs. p53 vähentää aktiivisuutta ihmisen TCF7L2 toimittaja, ja olemme havainneet, että p53 inhiboi myös sekä -2068-luc ja -1037-luc hiiren toimittajat [42], [43] (kuvio 4B). Lisäksi pohjapinta aktiivisuus -2068-luc-reportterin oli selvästi pienempi kuin -1037-luc-reportterin osoittaa vahvan repressorin osa tällä alueella (kuvio 4B). Vuonna Caco2-soluissa -1038-luc-konstrukti vastaa vaatimattomasti, mutta huomattavasti, lisäämistä ligandin, mutta vaikutus ei ollut voimistua eksogeeninen VDR (kuvio 4C, vasen paneeli). Sen sijaan -2068-luc reagoi voimakkaasti ulkoapäin VDR, mutta ei hoitoon 1,25 (OH)

2D

3 Caco2 ja VDRK240

– /- solut (kuvio 4C, oikea paneeli ja täydentävä Kuvio S4A, vastaavasti). Nämä tiedot osoittavat, että VDR ja hoito 1,25 (OH)

2D

3 vaikutteita aktiivisuutta TCF7L2 promoottorin, mutta ne eivät osoita, että vaikutus on välitön.

Oletetut VDREs sisällä hiiri TCF7L2 promoottori eivät ole tärkeitä asetuksen VDR vuonna hiiren maitorauhasen ja ihmisen peräsuolen syövän solut

sen hypoteesin testaamiseksi, että mahdollinen VDREs olivat tärkeitä välittää vaste TCF7L2 promoottori VDR, kolmas ja neljäs nukleotidit kussakin puolen päällä mutatoitiin kaksinkertainen alaniinitähdettä (kuvio 5A). 5 ’puolen sivusto -187 ei mutatoitunut koska 3’half-sivustosta, jos tämä VDRE on jaettu -178 VDRE, ja mutatoitiin että konstruktio. Nämä mutaatiot muuttavat puoli-sivustoja, siten, että ne eivät ole yhdenmukaisia ​​VDRE konsensussekvenssi, ja ei tulisi sitoa VDR. Mutaatioita syntyy siten, että kukin VDRE (joka sisältää kaksi puolikasta sivustoja, kukin) mutatoitiin kaikissa seitsemässä mahdolliset yhdistelmät yhden mutaatioiden, kaksinkertainen mutaatioita, ja yksi kolmen hengen mutaatio. Transfektio Näiden rakenteiden osoitti, että ne säilytetään vastata eksogeenisen VDR Caco2-soluissa ja VDRK240

– /- (kuvio 5B ja täydentävä kuvio S4b, vastaavasti). Me seuraavaksi suoritetaan kromatiinin immunosaostuksella (chip) määritykset testata rekrytointi VDR kuuteen otaksuttu VDREs tunnistettu sisällä ihmisen TCF7L2 promoottori (kuvio 5C). Caco2 solut ympättiin tiheää ja käsiteltiin 4 tunnin ajan 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3. Sekä retinoidiseoksen X-reseptorin (RXR) ja VDR rekrytoitiin julkaistun VDREs on CYP24A1 promoottori (kuvio 5D, kaistat 1 ja 2), mutta kumpikaan NHR rekrytoitiin jollekin otaksuttu VDREs ihmisen TCF7L2 promoottorialueen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kasvu TCF7L2 ilmaisua ei johdu rekrytointi VDR näihin otaksuttu VDREs hiiren ja ihmisen TCF7L2 promoottorit. Tämä voi tarkoittaa, että joko VDR ollaan palvelukseen muille alueille genomin ja ohjaamalla transkriptiota TCF7L2 suoraan tai VDR sääntelee tätä ilmiötä kautta 1,25 (OH)

2D

3-herkkä välittäjä .

(A) graafinen esitys neljän oletetun VDREs ensimmäisten ~1500 emäsparia hiiren TCF7L2 promoottorin ja niiden sekvenssit. DR3: suoran toiston välissä on kolmen nukleotidin. 2xDR4: kaksi, päällekkäistä suorat toistot välissä on neljän nukleotidin. Vaikka otaksuttu VDREs on koodattu ei-koodaavan säikeen sekvenssiä, niiden sekvenssit on kirjoitettu käännetyn täydentää siten, että VDREs voidaan tunnistaa vastaa vaadittua RGKTSA yksimielisyyteen. (B) -2068-luc-konstrukti, joka sisältää kaikki kolme sarjaa puoli-mutaatiot (d1502 /d1153 /d177) transfektoitiin Caco2-soluihin ja käsiteltiin ligandin, kuten on kuvattu kuviossa 4C vain 3 pitoisuuksia VDR (matala, keskisuuri ja korkea ). Virhe palkit edustavat SEM. Tilastot ovat analyysi käyttäen kaksisuuntaista ANOVA: * p 0,05. RLU-Suhteellinen Light Units. (C) Depiction kuudesta otaksutun VDREs yksilöity 4000 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta ihmisen TCF7L2 promoottorialue ja on nimetty suhteessa niiden etäisyys luennanaloituskeskus (+ ollessa alavirtaan, ja voinnin ylävirtaan). Kaikki alueet paitsi +88 (merkitty) on koodattu koodaamattoman juosteen. (D) Kromatiini immuunisaostuksessa VDR ja RXR-sitoutuneen DNA-osia Caco2 soluista käsiteltiin 4 tunnin ajan 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 (D-parilliset kaistat) tai EtOH (E-parittomat kaistat). Alueet, jotka vahvistavat VDRE sisältäviä alueita on merkitty yläreunassa rataa. CYP tuote monistaa alueen ihmisen CYP24A1 promoottorin, jonka tiedetään sitoutuvan VDR ja RXR: n läsnä ollessa ligandin ja toimii positiivisena kontrollina. IgG edustaa ei-spesifinen monistuminen. Input osoittaa vastaavaa materiaalia käytetään kunkin näytteen.

asetukseen TCF7L2 mukaan VDR /1,25 (OH)

2D

3 todennäköisesti Tukena välillisen mekanismin kolorektaalisyövässä solut

Voit testata Viimeksi mainitussa tilanteessa, käytimme käännöksen estäjä, sykloheksimi- (CHX). Caco2-solut esikäsiteltiin eri määriä CHX 30 minuuttia ja käsiteltiin sitten 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3: ssa 24 tuntia. Vuonna Caco2-soluissa, niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 12,5 ug /ml, CHX kykeni merkittävästi estää induktion TCF7L2 mRNA by1,25 (OH)

2D

3, kuten on DKK-4, epäsuora D-vitamiinin tavoite joka on negatiivisesti säädelty (kuvio 6) [44]. Nämä tiedot osoittavat vaatimus

de novo

proteiinisynteesiä sääntelyyn 1,25 (OH

) 2D

3. CYP24A1 mRNA induktio 1,25 (OH)

2D

3 on myös merkittävästi estyy CHX, mutta on silti indusoi -20-kertaisesti 1,25 (OH)

2D

3: n Suurimmalla CHX (Täydennyskuvio S5), joka on ilmiö, joka on osoitettu toiselle suoraan D-vitamiinin kohdegeenin, E-kadheriinin [9]. Sääntely CYP24A1 on niin dramaattinen, että se edellyttää todennäköisesti jatkuva synteesi koaktivaattoria proteiineja tukemaan induktio tätä suuruusluokkaa. Yhdessä nämä tiedot merkitsevät, että sääntely TCF7L2 mukaan VDR /1,25 (OH)

2D

3 on epäsuora.

Caco2 soluja esikäsiteltiin 30 minuuttia eri pitoisuuksilla proteiinisynteesiä inhibiittorin Sykloheksimidi (CHX), ennen kuin lisättiin 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai EtOH: ssa 24 tuntia, kuten on osoitettu. Analyysi mRNA runsaasti TCF7L2 (yläpaneeli) ja DKK4 (alapaneeli) määritettiin qPCR. Virhe palkit edustavat SEM. * P 0,05 kautta opiskelijan t-testi merkittäviä eroja D

3 vs. EtOH käsiteltyihin soluihin.

1,25 (OH)

2D

3 Lisäykset TCF Reporter aktiivisuus peräsuolen syövän solut

Vaikka sääntely TCF7L2 on tärkeää monista pathologic tuloksia, halusimme katsoa sitä yhteydessä syövän. Päätimme tarkastella vaikutuksia VDR-välitteisen TCF-4 ylössäätö kautta klassisen TopFlash toimittaja, joka on aiemmin kuvattu (TopFlash, toisin kuin OT, käytetään vähintään

c-fos

promoottori). Caco2-solut on somaattinen APC-mutaatio, jonka avulla β-kateniinin kerätä ja tumaan. Kun on kyse yli-runsas, aktiivinen β-kateniinin voimme odottaa kasvu TCF7L2 ilmentyminen johtaa lisääntyneeseen TopFlash toimintaa. Itse asiassa me toistetaan sama VDR titraus kokeissa kuvatun TCF7L2 promoottori reportteri kokeissa (kuvio 4C), käyttäen TopFlash (normalisoitu kontrolli plasmidin, FopFlash) sijaan, ja havaittiin johdonmukaisesti, merkittävä kasvu TopFlash aktiivisuutta 24 tunnin 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 Caco2 soluissa (kuvio 7), joka, kuten proteiini data (kuva 2D ja 2E) voimistaa VDR. Nämä tulokset tukevat rooli VDR-riippuvaisen, 1,25 (OH)

2D

3-välitteisen lisäys TCF-4 hiiren maitorauhasen ja ihmisen kolorektaalisyöpäkasvainsoluja, jonka vaikutukset voivat eri tavoin säädellä β-kateniinin aktiviteetti

in vivo

.

Caco2 solut transfektoitiin 24 tuntia TopFlash,

Renillaa

ja eri määriä VDR ja hoidettiin myöhemmin 24 tuntia 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 tai EtOH. Luciferase data normalisoitiin

Renillaa

ja FopFlash ja piirrettiin suhteessa kuhunkin EtOH käsitellyn kontrollinäyte. Virhe palkit edustavat SEM. p-arvot ilmoitetaan ovat opiskelijan t-testiä. RLU: Suhteellinen Light Units.

Keskustelu

D-vitamiini on osoittanut erittäin lupaavalta solunsalpaajaksi sekä molekyyli- ja eläinkokeissa, sekä joitakin epidemiologiset tutkimukset (katsaus esitetty [45]). Kun pyritään erottamaan toisistaan ​​syöpälääkkeen vaikutuksia D-vitamiinia kalseemista vaikutuksista, jotka rajoittavat sen käyttökelpoisuutta klinikalla, monet laboratoriot ovat dissecting sen loppupään toimintaa. Useat molekulaarisia mekanismeja, jotka edistävät mahdollinen terapeuttinen vaikutus D-vitamiinin liittyy vuorovaikutus β-kateniinin kautta. Suora vuorovaikutus β-kateniinin ja NHR, tässä tapauksessa retiinihapporeseptorin kuvattiin ensimmäisen vuonna 1999 [3]. Siitä lähtien monet tutkimukset ovat osoittaneet samanlaisia ​​vuorovaikutusten androgeenireseptorin [8], [10], [11], peroksisomiproliferaattorin aktivoiman reseptorin [18], ja VDR [2], [9]. Nämä tutkimukset osoittavat, että NHR ja TCF /LEF perheenjäseniä kilpailevat sitoutumisesta P-kateniinin ja /tai yhteinen co-aktivaattorit, kuten p300. Läsnäollessa ligandi, β-kateniinin ja /tai p300 suosii sitoutumisen NHR aiheuttaen synergistinen ylössäätöä (yhdessä NHR ligandi) NHR geenien sekä samanaikaisesti alas-säätely TCF /β kateniinia reagoiva geenejä.