Krooninen sairaus

tiivistelmä

Glykolyyttinen vaste hypoksisten solujen ensisijaisesti välittyy hypoksian indusoima tekijä alfa (HIF-1α), mutta vaikka läsnä runsas hapen kasvaimia tyypillisesti korkeat Glykolyysivaiheen. Korkeammalla HIF-1α kasvaimissa liittyy huonompi ennuste ja ylös-säätely merkkiaineiden epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) johtuen HIF-1α toimia. Olemme äskettäin osoittaneet, että EMT tapahtuu sisällä CD44

korkea syövän kantasoluja (CSC) fraktio ja että epiteelin ja EMT CSCS erottuvat korkean ja matalan ESA ilme, vastaavasti. Me täällä osoittaa, että hypoksia indusoi selvästi siirtymä CSC murto kohti EMT johtavat muuttuneisiin solujen morfologia, kasvaneesta osuudesta CD44

korkea /ESA

alhainen solujen malleja geenin ilmentymisen tyypillistä EMT, ja parannettu sphere- muodostavat kyky. Koko EMT jakeet palasivat hallitsemaan tasolle normoksia osoittaa palautuva prosessi. Yllättäen kuitenkin jopa happiolosuhteissa murto-EMT CSCS oli läsnä ja ylläpitää korkeita HIF-1α, johtuen ilmeisesti toimia sytokiinien, kuten TNFa. Toiminnallisesti tämä EMT CSC jae osoitti väheni mitokondrion massa ja kalvojännite, kulutetaan paljon vähemmän happea solua kohti, ja tuotti merkittävästi alhaisempia reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Nämä erot malleja hapen aineenvaihdunnan osa-alat kasvainsolujen tarjoavat selityksen yleisen terapeuttisia vastus CSCS sekä vielä suurempi vastus EMT CSCS. He myös tunnistaa mahdolliset mekanismit manipulointi CSCS.

Citation: Gammon L, Biddle A, Heywood HK, Johannessen AC, Mackenzie IC (2013) Sub-sarjat Cancer Kantasolut Differ Luonnostaan ​​niiden Patterns of Oxygen Metabolism . PLoS ONE 8 (4): e62493. doi: 10,1371 /journal.pone.0062493

Editor: Yao Liang Tang, University of Cincinnati, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 lokakuu 2012; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2013; Julkaistu: 30 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Gammon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Fanconin anemia Research Foundation, NC3Rs, Barts ja London Charity ja Norja Medical Research Council. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kasvaimet ovat erittäin glykolyyttisten jopa, kun läsnä on runsaasti happea, niin sanottu ”Warburg vaikutus” [1], [2]. Hypoksian indusoima tekijä 1 alfa (HIF-1α) on tärkeä tekijä säätelevä solu hypoksinen vasteita [3]. Suurilla happipitoisuus, HIF-1α on ubikitinoitu ja suunnattu hajoamista kun taas alemmilla happipitoisuus hajoaminen estyy ja HIF-1α siirtyy tumaan, jossa se dimeroituu kanssa hypoksian indusoima tekijä 1 beeta (HIF-1β) ja sitoutuu hypoksiavaste elementit (hRes) kohdegeenien jotka auttavat solujen sopeutuminen hypoksia [4]. Yliekspressio HIF-1α esiintyy monenlaisia ​​primaarinen ja metastaattinen syöpä [5], ja on vastuussa erilaisia ​​kasvaimeen liittyvät ominaisuudet, mukaan lukien vähentäminen reaktiivisen hapen [6], lisääntynyt radio-resistenssi [7] – [ ,,,0],9], ja suojaa soluja peräisin lääkkeen aiheuttama apoptoosin [10] ja vanhenemista [11].

Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ovat entistä liittyy syövän kantasolut (CSCS), sub-set syöpäsolut kykenee itseuudistumisen, on kasvaimeen aloittamista kyky, ja on vastustuskykyinen hoito [12], [13]. Sekä paikallisia kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden kaukaisiin sivustot vaativat vaeltavien kykyjä hankittu epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) on CSCS [14], jonka aikana epiteelin ominaisuudet menetetään ja epiteelin proteiineja, kuten E-kadheriinin ovat alassäädetty ja mesenkymaalisten proteiinien, kuten vimentiinista ja Twist sääteli [15]. Induktio EMT rintasyövän solulinjoissa tuloksia soluissa hankkia markkeri fenotyyppi tyypillinen rinnan CSCS, suurempaa liikkuvuutta, ja resistenssi terapeuttiset aineet [16], [17].

HNSCC ja useat muut syövät, osa- populaatiot CSCS on korkea ilmentymä CD44 [18] – [21]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että solulinjoissa suun ja ihon karsinoomat, EMT tapahtuu CD44

korkea CSC jae tuloksena on kaksi CSC fenotyyppejä, joka on epiteelin ja osoittaa korkea ilmentyminen epiteelin antigeenin (ESA), ja toinen että on EMT ominaisuudet ja alhainen ilmentyminen ESA [22]. CSCS välillä voidaan vaihtaa epiteelin ja EMT fenotyyppien ja molemmat jakeet aloittaa kasvaimia jälkeen

in vivo

hiiren elinsiirron [22]. Kuten useat tutkimukset ovat nyt suoraan sidoksissa hypoksia ja korkea HIF-1α ja EMT [23] – [26], halusimme tietää, onko luontainen aineenvaihdunnan erot liittyvät hapen käyttö välillä on epiteelin ja EMT CSC fenotyyppejä. Osoitamme, että alhainen happipitoisuus palautuvasti kasvattaa EMT jakeiden sisällä HNSCC solulinjoissa ja että verrattuna epiteelin CSCS (Epi CSC), EMT CSCS on korkeampi hypoksia vastaus proteiini HIF-1α, jopa normoxic olosuhteissa. Suuria eroja aineenvaihdunnan tämän alaryhmän kanssa korkeampi HIF-1α ilmentymisen EMT CSCS korreloi säätely ylöspäin glykolyyttisistä geeneistä, selvä vähentäminen hapenkulutuksen laski mitokondrion massa ja kalvojännite, ja vähensi reaktiivisten happiradikaaleja (ROS).

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmä ja Hypoxic induktio

HNSCC solulinjoja kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lukuun ottamatta H357 [27], kaikki solulinjat (CA1, LuC4, CaLH2, CaLH3) ja normaalin suun kautta keratinosyyttien (NOK2 NOK3) saatiin laboratoriossamme. Tissue kerättiin kirjallinen suostumus seuraava protokolla (Oral Cancer, 04 /Q0601 /53) hyväksymä NE Lontoo The City eettinen komitea. Hypoksinen induktio mukana viljelemällä soluja käytettäessä InVivo1000 hypoksinen kammio (Ruskinn Life Sciences, Wales, UK) 0,2% tai 2% O

2 5% CO

2. HIF-1α vakautus- käytetään 1 mM Dimethyloxalylglycine (DMOG) (Sigma) ja inhibitio 3- (5′-hydroksimetyyli-2′-furyyli) -1-benzylindazole (YC-1) (Sigma), 10 uM tai 50 uM. Sillä alalla muodostumista määrityksessä, päällystettiin PolyHEMA (Sigma) (12 mg /ml 95% etanolia) estää solujen kiinnittymiselle maljattiin 1000 solua /kuoppa FAD väliaineessa, johon on lisätty 1% methlycellose (Sigma). TNFa käsiteltyjä soluja viljeltiin 6 tai 24 tunnin ajan 10 ng /ml rekombinantti-TNFa: aa (R HIF-1α – Mouse 1:1000 Cat # 610958 BD, HIF-2α – Rabbit -1:500 Cat # ab20654 Abcam, β-Actin – Mouse 1:10,000 Cat # ab8226 Abcam, GAPDH – Rabbit 1:10,000 Cat # ab9485 Abcam , PDK1- hiiri 1:1000 Cat # ab110025 Abcam, SOD2- Rabbit 1:5000 Cat # ab13533 Abcam, VHL – Rabbit -1:1000 Cat # ab28434 Abcam, ja TNFR1- Rabbit -1:1000 Cat # ab19139.

Real Time q-PCR

RNA eristettiin aikaisemmin kuvatulla [22], käänteinen cDNArksi suoritettiin käyttäen Superscript III ensimmäisen juosteen synteesiin SuperMix- (Invitrogen). cDNA normalisoitui vastaan ​​viittaus geenin 28S-RNA. QPCR ajettiin käytettäessä ABI7500 reaaliaikainen PCR järjestelmän avulla Virta SYBR green mix (Applied Biosystems). Katso olevat tiedot tiedosto (tukeminen Information S1) olosuhteisiin ja koko alukesekvensseissä.

virtaussytometria

Solut analysoitiin Becktonissa Dickenson (BD) LSR II ja fluoresenssi solulajittelutekniikkaa (FACS ) suoritettiin BD FACS Aria. Viljellyt solut irrotettiin käyttäen Accutasella (PAA), suspendoitiin uudelleen PBS: ään 1 x 10

6 solua /ml ja inkuboitiin vasta-aineiden CD44 (klooni G44-26, BD Biosciences) ja ESA (klooni HEA-125, Miltenyi Biotec) klo 1:100 15 minuuttia. Solut pestiin kerran ennen uudelleen suspendointia tuoretta PBS DAPI (Sigma) 200 ng /ml jättää kuolleita soluja.

Happi ja ROS mittaukset

hapenkulutus solulinjan Fraktioiden mitattuna 96-happi bioanturin levyjen (BD Biosciences, Oxford, UK Cat # 353830) käyttäen protokollaa mukautettu Heywood et al [29], kvantitatiivista mittausta. ROS värjäys suoritettiin lajitellut elävien solujen jakeet käyttäen CellROX ™ (Invitrogen) 5 mM yhdessä Hoechst 33342 20 ug /ml 30 min kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantifiointi saatiin virtaussytometrianalyysin solujen kolminkertainen värjättiin ESA, CD44 ja CellROX ™.

Lactate ja glukoosi Analyysit

Lactate määritettiin aiemmin raportoitu, 1 x 10

5 solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan alustaa (fenolipunaista) ja inkuboitiin 8 tuntia. Laktaatti laskettiin vertaamalla standardikäyrän Laktaatille (Sigma L1750) vaihtelevat 0-10 mM. Glukoosipitoisuus määritettiin käyttämällä glukoosin kolorimetristä määritystä Kit (Abcam, ab65333). Laktaatti käyminen jae on laskettu vertaamalla karkottaa laktaatin kanssa teoreettinen maksimi laskettu glukoosin käytössä.

Mitokondrioiden Analyysit

Mitokondrioiden massa arvioitiin käyttäen MitoTracker Green ™ (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Viljelmiä kasvatettiin kloonitiheydessä, irrotetaan maljalta. ja inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa 50 nM MitoTracker (vihreä) ennen pesua ja analysointi. Sisäistä kalvo mitokondrion potentiaali (IMMP) solususpensiot ladattu Dil

1C (40 nM) (Invitrogen), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 minuuttia ennen pesua kerran ja uudelleen suspendoimalla tuoreeseen PBS: ssä. Keskiarvot EMT ja ei-EMT CSC fraktiot ilmaistiin murto arvot vastaavien vanhempien populaatioiden.

Cell Cycle Analysis

solusyklin analyysit, solususpensiot fiksattiin 70 % etanolia, pestiin kerran PBS: ssä ja inkuboitiin DAPI (1 ug /ml) (Sigma) 20 min yhdessä vasta-aineiden CD44 ja ESA.

tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa ja vertailun arvojen suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista parillista t-testiä, ellei toisin mainita. Virhe palkit raportoidaan ± SEM.

Tulokset

Pitkäaikainen Hypoksia Edistää EMT Fenotyyppikuvaus ja Lisäykset alapopulaatio Ominaista Vähentynyt ESA

arvioimiseksi solujen hypoksinen vasteita alensi happipitoisuudet, 3 HNSSC solulinjat (CA1, H357 ja LuC4) viljeltiin joko normoxic (-20% O

2) tai hypoksinen (2%: n tai 0,2%) happipitoisuus ennen valmistamiseksi proteiinin lysaatit arvioida HIF-1α vakauttaminen. Kaikki solulinjat vastasivat hypoksia lisääntynyt HIF-1α-proteiinia (kuvio. 1). Voit selvittää vaikutukset hypoksia koosta EMT osapopulaatiosta [22], soluja viljeltiin hypoksiaolosuhteissa jopa 21 päivää, ja tutkitaan morfologisia muutoksia. Pitkän aikavälin viljelmät (14-21 päivää) oli merkittävä lasku määrän muodostavat solut yhtenäinen pesäkkeitä ja lisätä määrä fibroblastien kaltaisten solujen (Fig. 2A). Sen määrittämiseksi, onko tämä elimellisen muutoksen edusti kehittäminen EMT väestön solut analysoitiin virtaussytometrialla varten CD44

korkea /ESA

alhainen EMT fenotyyppi aiemmin tunnistettu [22]. Kaikkien solulinjoja, pitkäaikainen hypoksia johti suureen kasvuun CD44

korkea /ESA

alhainen Solufraktioiden (Fig. 2B, Fig. 2C). Kohonneita EMT oli vähemmän 2% kuin 0,2% happea. Prolyylihydroksylaasi estäjä, DMOG johti vakauttaminen HIF-1α, ja myös jotkut vakauttaminen HIF-2α (Fig. 2D). Tähän liittyi lisääntyminen solujen EMT kaltainen, ulkonäkö ja CD44

korkea /ESA

pieni fenotyypin (Fig. 2D). Voit selvittää palautuvuus EMT poistettaessa hypoksia, soluista viljellään 0,2% happea 21 päivän palautettiin happiolosuhteissa ja arvioidaan virtaussytometrialla 7 päivän välein. Kaikissa linjat, koko CD44

korkea /ESA

alhainen EMT murto väheni ajan ja vielä 21 vuorokauden oli palannut takaisin tasolle kontrolliviljelmien (Fig. 2E).

Western blot proteiinin lysaatit CA1, H357 ja LuC4 solulinjojen viljelyn jälkeen alle normoksia (N), 2% ja 0,2% happea.

A; vaihe-kontrastin kuvia CA1, H357 ja LuC4 soluja kasvatettiin normoxic ja 0,2% hypoksinen viljelyolosuhteet 21 päivää (upotteet suurempi suurennos EMT kaltaisia ​​soluja). B; rianalyysit osoittaa muutosta värjäytymisen CD44 (y-akseli) ja ESA (x-akseli) solujen johtuvat hypoksia. C; analyysi kasvaa EMT johtuvat hypoksia. D; kasvua CA1 solulinjan 21 päivän ja 1 mM DMOG aiheuttaa morfologisia muutoksia (ylhäällä), joka vastaa muutokset CD44 ja ESA värjäytymistä (keskellä), stabilointi HIF-1α mutta vain vähän muutoksia HIF-2α (alhaalla vasemmalla), ja kasvaa EMT jae (alhaalla oikealla). E; aika riippuvainen lasku koko hypoksian aiheuttamaa EMT jakeet palanneen happiolosuhteissa.

Hypoksia indusoi solupopulaation kanssa EMT liittyviä geeniekspressiomalleja ja Lisääntynyt Sphere Muotoilu Kyky

sen määrittämiseksi, onko laajentuneen CD44

korkea /ESA

pieni osa aiheuttama hypoksia ollut malleja geenin ilmentymisen tyypillistä EMT, alaryhmien CA1 soluja, FACS-lajiteltu ennen RNA. Verrattuna ESA

korkea /CD44

korkea (Epi CSC) jae, CD44

korkea /ESA

alhainen (EMT) jakeet osoittivat, kuten aiemmin raportoitu [22], suurempi ilmaus EMT- liittyvien geenien Twist ja vimentiinin ja vähentynyttä ilmentymistä E-kadheriinin (kuvio. 3A). Sphere muodostavat määritykset, jotka on käytetty korvikkeena määrityksissä CSCS [30], tehtiin sen määrittämiseksi, onko lisäys EMT aiheuttama hypoksia lisäsi solujen lukumäärä tämän kantasolujen piirre. Kaikki solulinjat, fraktioimatonta solupopulaatioita ylläpidetään hypoksisissa olosuhteissa on 21 päivää muodostettu suuremman määrän palloja kuin soluja on kasvatettu happiolosuhteissa (Fig. 3B 3C). HIF-1α estäjä YC-1 vähensi pohjapinta tasoilla HIF-1α alle normoxic olosuhteissa (Fig. 3d) ja väheni sekä pallo muodostavien kyky (Fig. 3E).

A; kertainen muutos geenien ilmentyminen EMT merkkiaineita CD44

korkea /ESA

alhainen solujen suhteessa CD44

korkea /ESA

korkea soluja. B; edustavia näytteitä pallo muodostavia viljelmiä jälkeen 21 päivän kasvun normoxic ja hypoksinen olosuhteet. C; kasvaa pallo muodostumista seuraavissa hypoksinen kulttuuriin. D; vähennys pohjapinta tasoilla HIF-1α in normoxic kulttuureissa H357 lisäämisen jälkeen YC-1. E; vähennys normoxic alalla muodostumisen lisäyksen jälkeen YC-1 (vasemmalla) ja vaiheen mikroskopia (oikealla) valvonta- ja YC-1 (10 uM) käsiteltiin pallo kulttuureissa.

EMT Sub-jakeet ovat Lisääntynyt HIF -1α ja Up-regulation of Anaerobinen Metabolinen Genes

Under happiolosuhteissa, syöpäsolun linjat, kuten niiden kasvaimet alkuperän, yleensä näytä lisääntyneen energian osuutta peräisin glykolyyttisissä prosesseista sekä korkeampi HIF-1α [ ,,,0],5]. Normoxic viljelmiä HNSCC solulinjojen osoitti korkeampia pohjapinta tasoja HIF-1α kuin NOK (Fig. 4A). Mitä pidemmälle kasvu EMT indusoiman hypoksian ehdotti, että HIF-1α ilmaisu saattaa vaihdella CSC alafraktiot. EMT ja Epi CSC fraktiot siis lajiteltuna CA1 ja LuC4 solulinjojen vertailussa niiden fraktioimattomalla väestö. Verrattuna Epi CSCS tai emo populaatiot, EMT solut osoittivat korkeampaa HIF-1α taas HIF-2α oli suurempi Epi CSC osa (Fig. 4B). Koska korkeampi HIF-1α in EMT jakeet voitaisiin valmistaa joko vähentynyt hajoaminen tai lisääntynyt tuotanto proteiinin, arvioimme Von Hippel-Lindaun proteiini (pVHL), joka kohdistuu HIF-1α varten proteasomaalisten hajoamista. Ei kuitenkaan eroa välillä havaittiin jakeet pVHL proteiinin tasot (kuvio 4C). Tutkitaan HIF-1α tuotantoa EMT murto huomasimme, että viesti HIF-1α nostettiin (Fig. 4D) viittaa siihen, että lisääntynyt tuotanto sen sijaan laski hajoaminen johtaa kohonneisiin nähty EMT soluissa. Tuotanto HIF-1α alle happiolosuhteissa lisääntyy vastauksena tulehdussytokiini TNFa, [31] ja tämä sytokiini on myös voimakas induktori EMT [32]. Vaikutusten arvioimiseksi TNFa on HIF-1α sisäpuolella linjojen solulinjojen happiolosuhteissa, soluja viljeltiin TNFa 6 tai 24 tuntia. Sekä ajankohtina, ja molemmat linjat testataan, kohonneet HIF-1α havaittiin (Fig. 4E). Sitten tutkittiin, onko Epi ja EMT alafraktiot vastasi differentiaalisesti TNFa ja totesi, että korkeammat lähtötasolle HIF-1α läsnä EMT fraktiot nostettiin entisestään TNFa (kuvio 4F). Ei vaikutusta Epi CSC alaryhmästä nähtiin osoittaa selektiivisesti vaikutus EMT murto, ehkäpä johtuen suurempia määriä TNFa-reseptori 1 (TNFR1) ilmaistuna nämä solut.

A; Vertailun western blottauksella normoxic ilmentymisen HIF-1α NOK ja HNSCC solulinjoissa. B; HIF-1α ja HIF-2α ilmaisun lajitellun vanhempien, EMT CSC ja Epi CSC jakeet CA1 ja LuC4 solulinjojen normoksia. C; western blot varten pVHL tasoilla lajitellun massan että CA1 solulinjan. D; PCR arviointi HIF-1α ilmaistuna EMT CSC tasoa suhteessa Epi CSC tasot CA1 solulinjan. E; vaste HIF-1α tasot CA1 ja LuC4 linjat käsittelemällä 10 ng /ml TNFa: aa 6 tai 24 tuntia happiolosuhteissa. F; western blots for varten HIF-1α ja TNFR1 Saharan murto CA1 solulinjan seuraavat TNFa hoitoa. G; PCR arviointi glykolyyttisen geenikohteet ilmaistuna EMT CSC tasoa suhteessa Epi CSC tasoilla CA1 solulinjassa. H; edustava vaihe mikroskooppiset kuvat Epi ja EMT soluja (vasemmalla) ja vertailu sirontamittari EMT ja Epi CSC jakeet (oikealla).

Sen arvioimiseksi, onko korkeampi HIF-1α tasojen läsnä EMT soluja happiolosuhteissa korreloi voimistunutta ilmentymistä HIF-1 alavirran geenien, 3 glykolyyttisissä tavoitteet tutkittiin. Heksokinaasilla II (Hex2), pyruvaattidehydrogenaasikinaasi 1 (PDK1), ja Laktaattidehydrogenaasi A (LDHA), havaittiin kaikkien niiden nopeuttamista EMT murto verrattuna Epi CSC osa (Fig. 4G). Kuten PDK1 on ilmoitettu vaikuttavan osuuden glukoosi käytetään käyminen laktaatti, tutkimme havaitut lisäykset HIF-1α ja sen tavoite glykolyyttisissä geenit korreloivat muutosten sokeriaineenvaihduntaan ja laktaatin. Mitään eroja ei nähty PDK1 proteiinin tasojen fraktiot (Fig. S1A) ja tarkastus glukoosin kulutuksen ja laktaatin tuotannon paljasti saman verran glukoosia anaerobisesti metaboloituu kunkin osan riippumatta siitä, HIF-1α ilmentymistä (Fig. S1B suhteellinen hapenkulutus EMT ja Epi CSC jakeet verrattuna vanhempien linjan ensimmäisen tunnin (ylälevyissä) ja CA1 yli 2 tuntia (alla). B; immuunifluoresenssivasta kuvia verrataan ROS tasoilla EMT ja Epi CSCS vastavärjättiin Hoechst. C; virtaus rianalyysit keskiarvon ROS tasoilla EMT ja Epi CSCS suhteessa vanhempien soluihin. D; PCR kertainen erot SOD2 välillä EMT ja Epi CSCS. E; western blots for HIF-1α ja SOD2 varten 3 osa-alat CA1 solulinjan. F; keskimääräinen mitokondrioiden massa EMT ja Epi CSCS suhteessa vanhempien soluihin. G; vertailu IMMP EMT ja Epi CSCS suhteessa vanhempien soluihin. H; solusyklin profiilit EMT ja Epi CSC jakeet 3 solulinjoissa.

Muodosta jos vähennetään hapenkulutusta korreloi alennettua ROS tasoilla EMT soluja, live EMT ja Epi CSC soluja verrattiin käyttämällä ROS merkki CellRox ™ Deep Red Reagent. Paljon vähemmän värjäys tämä merkki nähtiin EMT soluja (kuvio. 5B) ja sytometrinen määrällistä ROS soluissa kolminkertainen värjättiin ESA, CD44 ja CellRox ™ vahvistettu vähemmän ROS EMT CSC väestöstä (Fig. 5C). QPCR (Fig. 5D). Western-blottauksella (kuvio 5E) osoitti ROS scavenger superoksididismutaasi 2 (SOD2) olevan erittäin ilmaista sisällä EMT CSCS.

Kuten oksidatiivisen fosforylaation tapahtuu mitokondrioissa, se oli odotettavissa, että muuntunut hapenkulutus saattavat liittyä muuttuneisiin mitokondrioiden valtiot sisällä CSC osapopulaatiosta. Erot yhteensä mitokondrioiden massan välillä solun osapopulaatiosta joten ne arvioitiin triple-värjäys ESA, CD44 ja MitoTracker Green ™. Kaikkien solulinjoja, EMT jakeet verrokkeja vähemmän mitokondrioiden massa (~ 10%) kuin vanhempien väestö ja silmiinpistävää 40%: n vähennys verrattuna Epi CSC väestöstä (Fig. 5F). Koska merkkiaine functon, sisempi mitokondrion kalvon potentiaali (IMMP) arvioitiin lataamalla solut Dil

1C (5). Tämä osoitti alempaa IMMP (~ 10%) EMT jakeet kuin vanhempien väestön ja vielä alhaisemmalla tasolla verrattuna Epi CSCS (Fig. 5G). Arviointi solusyklin eroista solufraktiois- osoitti, että Epi CSCS taipumus kerääntyä G2, kuten aikaisemmin on esitetty [18], kun taas suurin osa EMT soluja läsnä G1 (Fig. 5 H).

Keskustelu

Olemme hiljattain kuvattu heterogeenisuus sisällä CSC osapopulaatiosta [22] ja että vaikka suurin osa CSCS on CD44

korkea /ESA

korkea solunpintafenotyyppi ja ilmaista epiteelin markkereita, vaihtelevasti kokoinen murto of CSCS on tehty EMT. Sekä Epi ja EMT CSC populaatiot ovat itseuudistuvien

in vitro

ja ovat kasvain aloittamista jos istuttaa

in vivo

(25). Kuitenkin EMT CSCS kestävät anoikis ja on suurempi kyky kasvaa suspensiossa kasvainten aloilla, ominaisuus, joka tarjoaa korvike määritys tälle potilasryhmälle. Arvioidaan joko morfologisesti tai CD44

korkea /ESA

alhainen solujen, pienten EMT osa tyypillisesti läsnä solulinjojen happiolosuhteissa lisääntyy huomattavasti vastauksena hypoksia tai jälkeen stabilointi HIF-1α proteiini, muuttuu aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä [23] – [26]. Laajentunut väestö näyttää geeniekspressioprofiili tyypillistä EMT ja on parannettu palloja muodostavan kyky. Sen jälkeen nopeutetun hajoamisen HIF-1α on vähenemiseen alalla muodostumiseen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että HIF-1α on funktionaalinen rooli asiakkuutta ja ylläpitää CSC EMT fenotyyppi.

HIF-1α kirjataan ajaa soluja kohti aineenvaihdunnan ilmiasuun vähensi oksidatiivisen aineenvaihdunnan ja lisääntynyt laktaatin tuotantoa, välittämä osittain säätely ylöspäin PDK-1 [6], [33]. Under happiolosuhteissa, löydämme noin 50% suurempi määrä synteesin HIF-1α sisällä EMT osa ja että tämä korreloi korkeamman proteiinin tasot. Samantasoista pVHL proteiinin ehdotettu mitään muutosta hajoamisen ja siksi päätellä, että korkeampi HIF-1α sisällä EMT ylläpitää tuotannon lisäämistä. EMT on raportoitu indusoivan TGF-β1, interleukiinit ja tulehdusta edistävien sytokiinien, kuten TNFa: n, joka on myös raportoitu lisäävän tuotantoa HIF-1α [31]. Olemme vahvistaneet samankaltaisia ​​vasteita meidän solulinjojen ja osoittavat myös, että EMT solut reagoivat selektiivisesti TNFa lisäämällä niiden HIF-1α. Tämä tärkeämpää syytöksiä vaikutukset kasvaimen microenviroment siirtämisessä ja ylläpitää EMT fenotyyppi ja siksi etenemistä ja hyökkäys kasvaimia.

HIF-1α tuotanto on myös ehdotettu vuoksi myötäkytkentärakenne silmukka PDK-1 [ ,,,0],34]. Kuitenkin vaikka löysimme lisääntynyt viesti PDK-1 sisällä EMT CSC osapopulaatiosta löysimme mitään muutosta proteiinin tasoja. Myös mitään eroa välillä todettiin epiteeli- ja EMT jakeet osuuden glukoosin metaboloituu laktaatti, joka oli noin 60% kaikkien alapopulaatioiden, prosentteina samankaltainen kuin Warburgin yli 80 vuotta sitten [1]. Kuitenkin suhteessa EMT CSCS koon, glukoosin määrä käyttö olisi korkeampi ja tämä yhdessä merkityn vähentää hapen kulutusta, ehdottaa riippuvuuden väheneminen oksidatiivisen fosforylaation kanssa EMT solujen ollessa vähemmän metabolisesti aktiivinen kuin Epi CSCS. Solusyklin havaittuja muutoksia ovat myös viittaavia entistä lepotilassa EMT fenotyypin kuten on aiemmin esitetty EMT solujen HNSCC linjat [35].

hypoksiaolosuhteissa, HIF1 kautta toimivien PDK1 [6] johtaa vähenemiseen mitokondrion hapenkulutus [33] ja vähentää tuotannon ROS. Yli-ilmentyminen PDK1 myös korreloi huonon ennusteen [36]. Korkeammat ekspressiotasot HIF-1α ja PDK1 löydettiin sisällä normoxic CSC EMT väestö liittyy vähentää hapen kulutusta ja ROS tasoilla muuttuu samanlaiset kuin soluja hypoksisissa olosuhteissa. Korkeaa tasoa SOD2 vuonna EMT CSCS toimisi myös inaktivoida kuten ROS kuten voitaisiin tuottaa. Papandreou ja työtoverit [33], tutkimalla fraktioimatonta kasvainpopulaatiot, havaittu mitään rakenteellisia muutoksia mitokondriot. Kuitenkin analysoimalla eroja CSC alafraktiot vähensi mitokondrion massan EMT CSCS yhdessä alhaisempi suhteellinen IMMP mikä viittaa vähentyneeseen mitokondrioiden toimintaan. Zhang et al [37] ovat raportoineet sortotoimille of HIF1 mitokondrion biogeneesin kautta tukahduttaminen transkription C-Myc [38], [39] ja olemme aiemmin raportoitu alas-säätely C-Myc on normoxic EMT osapopulaatiosta [ ,,,0],22]. PCR-analyysit (tuloksia ei ole esitetty) osoittavat myös säätelyä alaspäin C-Myc laajentuneessa hypoksinen EMT jakeet.

CSCS on useita ainutlaatuisia ominaisuuksia, jotka erottavat ne suurin osa erottaa solupopulaation [12], [18 ], [30] ja tuoreita julkaisuja ovat liittyy hankintaan kantasolujen ominaisuuksia EMT. Esimerkiksi induktio EMT ei-tuumorigeeninen rintojen solulinja käsittelemällä TGF-β1 johtaa hankinnan CD44

korkea /CD24

alhainen solunpintafenotyyppi tyypillistä rintojen CSCS jotka ovat kasvaimeen aloittamista ja kasvaimen -sphere muodostavat kyvyt [16]. Sädehoitoa käytetään laajalti hoidettaessa HNSCC ja alhainen hapen ja solujen ROS yhdessä korkeampi antioksidantteja, ovat kriittisiä välittäjiä vähentää solujen tappaminen säteilyttämällä [12]. Alhainen happipitoisuus arvot liittyvät sädehoidon vika [40], ja se on siksi erityisen kliinisen edun mukaista, että hypoksinen induktio CSCS osaksi EMT fenotyyppi lisäisi vielä entisestään vastustusta eri hoitomuodot näkyy CSCS [17]. Esillä oleva data laajennetaan näitä havaintoja, ensimmäinen tukemalla läsnäollessa, kuten aiemmin on raportoitu [22], kahden kantasolujen fenotyyppiä ja toiseksi, esittämällä useita muita ominaisuuksia EMT CSC fenotyyppiä, joka todennäköisesti liittyy parempi terapeuttinen vastus. Metabolinen ominaisuudet EMT CSC osa, ja sen kasvu koko hypoksia, todennäköisesti siksi toimimaan parantaa säteilyn kestävyys. Lisäksi hitaampi solusyklin ja mitokondrioiden väheneminen EMT CSCS voi myös olla vaikutuksia apoptoottisia vastauksia sekä säteilyn ja syöpälääkkeet. Näyttää siltä, ​​että terapeuttinen poistaminen vähemmän metabolisesti aktiivisia EMT väestö vaatii kohdennettua hoitoa ja että mallit EMT induktion kautta sekä hypoksia ja sytokiinien voi antaa ratkaiseva alustan kehittämisen tällaisten hoitomuotojen.

tukeminen tiedot

Kuva S1.

Sub osa glukoosin hyväksikäytön. A; western blots for PDK1 tasoilla sub jakeet. B; glukoosi käyttö (vasemmalla), laktaatti karkotetaan (keskellä) ja prosenttia glukoosia metaboloituu muodostaen laktaatti (oikealla) on CA1 solulinjassa ja C; että LuC4 solulinjassa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0062493.s001

(TIF) B olevat tiedot S1.

QPCR Ehdot ja Primers.

doi: 10,1371 /journal.pone.0062493.s002

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Dr Gary Warnes hänen teknistä apua ja tohtori Daniela Elena Costea hänen kriittinen panos tutkimuksessa suunnittelussa.