Krooninen sairaus

tiivistelmä

induktio polyploidian pidetään lisääntymis- loppuun solujen, mutta on näyttöä siitä, että polyploideja giant syöpäsolujen (PGCCs) edistää solujen harvenneiden aikana kasvaimen uusiutumisen. Kuitenkin rooli näiden solujen kehityksessä, etenemiseen ja hoitovaste paksusuolen syöpä on edelleen määrittelemätön. Siksi päätavoitteena oli tutkia sukupolven PGCCs paksusuolen syöpäsoluissa sekä menettelyt muodostumista. Hoito HCT-116 ja Caco-2 paksusuolen syövän solujen hypoksia matkivat CoCl

2 indusoi muodostumista solujen suuremman solun ja ydinvoiman koko (PGCCs), kun taas solut, joilla on normaali morfologia valikoivasti eliminoitu. Sytometrinen analyysi osoitti, että CoCl

2 indusoi G2 solusyklin pysähtymiseen ja sukupolven polyploideja solun alapopulaatio lisääntynyt solujen DNA sisältöä. Polyploidia hypoksian indusoiman PGCCs vahvistettiin FISH-analyysillä. Lisäksi CoCl

2 hoitoa tehokkaasti indusoi vakauttamisen HIF-1α, differentiaalinen ilmentyminen typistetty muoto p53 (P47) ja alentuneesta sykliini D1, mikä osoittaa molekyylimekanismeja liittyy solusyklin pysähtymiseen G2. Sukupolven PGCCs myös osaltaan laajeneminen solun alapopulaation syövän kantasoluja (CSCS) ominaisuudet, kuten on esitetty colonosphere muodostumisen määritykset, ja parannettu chemoresistance 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinia. Johtopäätöksenä on, että farmakologinen induktio hypoksia paksusuolen syöpäsoluissa aiheuttaa muodostumista PGCCs, laajennus solun alaryhmän, jossa CSC: n ominaisuudet ja chemoresistance. Molekyylimekanismeja, mukaan luettuna vakauttaminen HIF-1 α, osallistuminen p53 /p47-isoformi ja solusyklin pysähtymiseen G2, ehdottaa uusia tavoitteita estämään kasvaimen uusiutumisen ja hoidon epäonnistuminen paksusuolensyöpä.

Citation: Lopez-Sánchez LM, Jimenez C, Valverde A, Hernandez V, Peñarando J, Martinez A, et al. (2014) CoCl

2, joka on Mimic on Hypoksia indusoi muodostaminen polyploidisilla jättisolut with Stem Ominaisuudet Colon Cancer. PLoS ONE 9 (6): e99143. doi: 10,1371 /journal.pone.0099143

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 09 toukokuu 2014; Julkaistu: 16 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Lopez-Sánchez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot sisältyvät käsikirjoituksen.

Rahoittajat: tukemana apurahoja A.R.-A. alkaen Programa de Promoción de la Investigación en Salud del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00428 ja PI13 /00553) (https://www.isciii.es/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi yleisin syöpä kanssa 1234000 tapauksia maailmanlaajuisesti vuonna 2008 mukaan GLOBOCAN [1]. CRC osuus on 13% kaikista syövistä ja lähes 1000 uutta CRC tapausta diagnosoitiin vuonna 2012 Euroopassa [2], jossa on kolmanneksi yleisin syöpä ja keuhkosyövän jälkeen se on toiseksi yleisin kuolinsyy [3]. Vaikka kuolleisuus CRC, laski hieman 1990 tähän, ja vaikka kehitys havaitsemiseen ja kirurginen hoito, ei ole tiedossa parannuskeinoa metastasoituneen CRC, ja 5 vuoden pysyvyys näistä potilaista on valitettavan vähäistä (noin 8%) . Olemassaolo suhteellisen harvinainen hitaasti jakautuviin tai levossa solujen alaryhmästä, kestävät hyvin lääkkeitä, joilla on samanlaiset ominaisuudet kantasoluja ja tunnetaan syövän kantasolut (CSCS), on ehdotettu yhdeksi pääsyynä hälyttävä tehottomuus standardin syöpähoitojen [ ,,,0],4], [5]. Viime vuosikymmenen aikana, on osoitettu, että nämä CSCS pystyvät lisääntymään ja tuottamaan koko kasvaimen massaan. Tämä on johtanut ehdottaa mallin CSCS tai kasvaimen hierarkkisen mallin, jossa kasvainsolut ovat heterogeenisiä, ja vain pieni solupopulaation, joka on huipulla hierarkkinen pyramidi, on vastuussa aloittaa ja ylläpitää kasvaimen kasvu [5] . Kuitenkin uudempien tutkimusten mukaan syövän stemness voidaan hankkia vaihtamalla geenien ilmentyminen ohjelmia ja siksi CSC biologia on siirryttävä jäykkä hierarkkinen joustavampaan mallin [6], [7]. CSCS ovat paljon kestävämpi kuin eriytetty kasvainsolujen hoitoja, joita käytetään klinikalla [4], [8], ja vaikka hoito pystyy tehokkaasti poistamaan suurimman kasvaimen solujen ja kasvaimen tilavuus pienenee, CSCS ei vaikuta, ja kun terapia pysäyttää ne pystyvät jatkamaan kasvaimen kasvua ja erilaistumista, selittää tapahtumia kasvaimen uusiutumisen. Näin ollen on osoitettu, että riski toistumisen CRC on verrannollinen ilmentymisen primaarikasvaimen geenien spesifinen suolen kantasoluja, jotka myös tunnistaa CSC väestön kasvaimen [9]. Lisäksi CSCS näyttää olevan tärkeä rooli tiedonvälitys, kasvaimen lepotilan ja etäpesäkkeiden [10].

Hypoksia on yksi tärkeimmistä patologisia piirteitä kiinteiden kasvainten, koska se on seurausta epätasapainosta välillä kasvainsolujen lisääntymistä ja hapen [11]. Kasvain hypoksia ei vain on suuri ongelma, joka vaikuttaa terapeuttinen pyrkimyksiä, mutta on olemassa kokeellista näyttöä, joka muodostaa fysiologinen selektiivinen paine edistää kasvaimen aggressiivisuus [12]. Tärkeää on, hypoksia liittyy ylläpitoon ja muodostumista CSCS [11], [13], edistää niiden fenotyyppi ja kasvaimen kehittymisen [14]. Monet soluvasteiden hypoksia välittyvät muutoksia geenien ilmentyminen säätelee hypoksian indusoima tekijä (HIF-1α), joka on tullut erittäin houkutteleva kohde uusien syövän hoitomuotoja [11]. Under happiolosuhteissa HIF-1α proteiini jatkuvasti hajoaa jälkeen hydroksylaatio prolyyli -hydroksylaasien on kaksi keskeistä proliinijäännösten sen hapesta riippuvainen hajoamista verkkotunnuksen [15]. Kuitenkin hypoksisissa olosuhteissa HIF-1α on vakiintunut, siirtyy tumaan ja sitoutumisen HIF-1β alayksikön kanssa muodostaa aktiivisen transkriptiotekijän, joka kykenee aktivoimaan ilmentymisen kohdegeenien helpottaa solujen sopeutuminen hypoksia [13]. Kobolttikloridia (CoCl

2) on jäljittelevää ainetta käytetään

in vitro

aiheuttavan soluvasteita hypoksia. Uskotaan, että CoCl

2 stabiloi HIF-1α estämällä propyylihydroksylaasia entsyymejä [16].

On esitetty, että samalla tavoin kuin normaalit kantasolujen, paikallinen mikroympäristö on kriittinen ylläpitää eloonjäämisen CSCS heidän ”markkinarako”, jossa vastaanotto erityisten molekyyli signaalit säätelevät niiden lisääntymistä ja erilaistumista [17]. Yllättäen vaikka useat tutkimukset ovat viime aikoina osoittaneet tärkeä tehtävä endoteelisolujen (EC) ja verisuonia kapealla säätelyssä normaalit kantasolujen ja CSCS, muut tutkimukset osoittavat, että hypoksia myös avainasemassa [17]. Tärkeys on verisuonia kapealla säätelyssä CSCS toisaalta ja rooli hypoksia muissa voi tuntua ensi silmäyksellä paradoksaalista. Kuitenkin, ECS kasvain mikroympäristössä voi läpikäydä toiminnallisia muutoksia, jotka johtavat sukupolven hypoksinen mikroympäristön. Näin ollen, glioblastooma CSCS löytyy kosketuksessa poikkeavan kasvaimen verisuonistossa [18]. Äskettäin on raportoitu, että hypoksia voi valita polyploideja jättiläinen syöpäsoluja, (PGCCs), jotka edistävät aktiivisesti kasvaimen kasvua tuottamalla CSCS [19]. Itse asiassa suurin osa ihmisen kasvaimista ovat solujen heterogeeninen [20], ja yli vuosisadan ajan, patologit ovat havainneet jättiläinen kasvaimet, merkitsevästi useammin jälkeen jonkinlaista terapeuttisen intervention [19]. Nämä solut edistävät kasvaimen heterogeenisuus mutta suurin osa niiden toiminnoista ei vielä ole määritelty. Vaikka induktio polyploidian on perinteisesti pidetty lisääntymis- loppuun solujen, on todisteita, että jättiläinen solut edistävät solujen harvenneiden aikana kasvaimen uusiutumisen [21], [22].

Vaikka tiedot sukupolven PGCCs munasarjojen ja rintasyövän, rooli näiden solujen kehityksessä, etenemiseen ja hoitovaste CRC edelleen määrittelemätön. Siksi päätavoitteena oli tutkia

in vitro

sukupolven PGCCs paksusuolen syöpäsoluissa sekä menettelyt muodostumisen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja colonosphere muodostuminen määrityksessä

Caco-2-soluja (ECACC, Salisbury, UK) kasvatettiin MEM Earle: n suoloja (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta), joka sisälsi 15% naudan sikiön seerumia. HCT-116-solut (DSMZ, Braunschweig, Saksa) kasvatettiin McCoyn 5A-alustassa (Biowest, Nuaille, Ranska), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (PAA Laboratories). Viljelyalustassa, johon oli lisätty 2 mM glutamiinia, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja amfoterisiini B: tä (2,5 ug /ml). Soluja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Tuore varastoliuos 0,4 M kobolttikloridia (CoCl

2) valmistettiin veteen ja lisätään väliaineen saamiseksi halutun lopullisen pitoisuudet.

colonosphere muodostumista määrityksessä, käsittelyn jälkeen eri annoksilla CoCl

2 48 tuntia, solut tripsinized, laskettiin ja uudelleen ympättiin kloonitiheydessä (1 solu /ul) 96-kuoppaisella levyllä, äärimmäisen pieni kiinnityspinta (Costar, Corning, NY, USA) seerumittomalla Dulbeccon MEM ravinteiden Seos F + 12 Ham väliaineessa, jota oli täydennetty 10 ng /ml emäksinen fibroblastikasvutekijä, 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää ja 1% tilavuus /tilavuus metyyliselluloosaa (R 0,05.

Tulokset

CoCl

2 hoito indusoi muodostumista PGCCs paksusuolen syöpäsoluissa

Kun HCT-116 ja Caco- 2 koolonsyöpäsolulinjaa viljeltiin normaaliolosuhteissa joitakin suuria soluja laajentuneen ytimet (PGCCs) on satunnaisesti havaittu. Kuitenkin, kun solut käsiteltiin CoCl

2 nämä PGCCs selvästi lisääntyneet, kun taas solut, joilla on normaali morfologia selektiivisesti poistetaan (kuvio 1A). PGCCs aiheuttama CoCl

2 hoito oli 3-10 kertaa suurempi kuin normaalit solut, ja erottuva morfologia riippuen solulinjassa (kuvio 1A). Siten HCT-116-solujen hoidon CoCl

2 syntyy PGCCs kanssa soluliman laajennuksia muistuttaa solujen neuronaalista tyyppiä (kuvio 1A), kun taas Caco-2-solujen indusoidun PGCCs pyöristettiin ja ollut oksat (Fig. 1A) . Kasvu ydin- koko hoidon jälkeen vaihteli välillä solulinjoista, ja vaikka selvää kasvua havaittiin molemmissa solulinjoissa, ydinvoima laajentuminen näkyi selvimmin tapauksessa Caco-2-solut (kuvio 1 B).

) sekä HCT-116 ja Caco-2-solulinjat käsiteltiin 300 uM CoCl

2: ssa 48 tuntia. Kaikki mikrovalokuvia saatiin käyttämällä samaa lopullinen suurennos (x 200). Asteikkoviiva vastaa 20 mikronia. Värjäys soluytimet DAPI suoritettiin arvioimaan keskimääräinen ydinvoiman koko (Final suurennos, × 200). Mittaviivat vastaavat 20 mikronia. B) Muutokset ydin- koko jälkeen CoCl

2 hoitoa. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05 verrattuna kontrolliin).

PGCCs muodostumista paksusuolen syöpäsoluissa liittyy solusyklin muutokset ja polyploidia

tutkimaan edelleen mekanismeja vastuussa induktion PGCCs, solukierron analysoitiin virtaussytometrialla. Molemmissa solulinjoissa CoCl

2 hoito aiheutti selkeitä muutoksia eri vaiheissa solusyklin (kuva 2). Selvä väheneminen solujen määrä G1 vaiheeseen, sekä nostaa solujen S- ja G2-vaiheissa havaittiin. Lisäksi virtaussytometrinen analyysi vahvisti, että käsittely CoCl

2, joka matkii hypoksiaa pystyy tuottamaan solun alaryhmän, jolla on suuri DNA-pitoisuuden nousua ja siten vastaavat PGCCs. Polyploidisia luonne näiden solujen vahvistettiin fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla (FISH) läsnäolon havaitsemiseksi on useita kopioita DNA yksittäisten PGCCs. For Caco-2-solut FISH analyysit tuottivat selkeitä tuloksia, mahdollisesti koska tämä solulinjan on jo vakavasti alentunut karyotyyppi. Kuten voidaan nähdä kuviosta 3, kun taas HCT-116 ohjaus solut osoittivat normaalia ydin- koko ja markkereita osoitti normaalia disomia varten kromosomien X (vihreä), 18 (sininen) ja 21 (punainen), hoito CoCl

2, indusoi PGCCs osoittaa kohonneen ydinvoiman koko mukana polyploidia kolmen kromosomaalisia markkereita käytetään.

Both HCT-116 (A) ja Caco-2-soluissa (B) käsiteltiin osoitetulla annoksella CoCl

2 6 tai 48 tuntia. Seuraavaksi solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla. Pylväiden oikealla osoittavat suhteelliset muutokset ohjata solujen solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta riippumattoman viljelmän.

HCT-116-soluja viljeltiin, kun läsnä oli 300 uM CoCl

2 ja FISH-analyysillä käyttäen koettimia kromosomien X (vihreä) , 18 (sininen) ja 21 (punainen) suoritettiin.

Molecular mekanismeja muodostumista PGCCs paksusuolen syövän

sarja kokeita vieressä suoritettiin analysoida mahdollisia molekyylitason mekanismeja sukupolven PGCCs paksusuolen syöpäsoluissa. Ensinnäkin ilmaisu HIF-1α-proteiinia analysoitiin vahvistaa, että hoito CoCl

2 voi tehokkaasti aiheuttaa sen vakauttaminen. Kuten kuviossa 4 on esitetty, vaikka ilmentyminen HIF-1α oli havaittavissa kontrollisoluissa, käsittely CoCl

2 indusoi molemmissa solulinjoissa, ja annoksesta riippuvalla tavalla, lisääntyminen ekspressiotasot tämän proteiinin . Siksi matkivat hypoksian paksusuolen syöpäsoluissa liittyy muutoksia solusyklin ja sukupolven PGCCs.

A) HCT-116 ja Caco-2-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella CoCl

2 6 tuntia ja sitten ilmentymistä HIF-1α, p53 ja sykliini D1-proteiinien arvioitiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita. B) vastaava densitometristä analyysit proteiinivyöhykkeet havaitaan immunoblot ja normalisoitiin signaalin β-Actin on myös esitetty. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (* P 0,05 verrattuna kontrolliin).

Toisaalta, ilmaus sykliini D1 on välttämätöntä solusyklin edetä G1 S-vaiheeseen, joka on kohta, jossa solu on jo sitoutunut toteuttamaan uuden kierroksen solunjakautumisen. Kun solu ”decides” aloittaa tämän S vaihe, korkea sykliini D1 ovat vaimentua sallimaan DNA-synteesiä. Jos olosuhteet sallivat edelleen solujen kasvua, sykliini D1 taso kasvaa jälleen vuoden G2 vaiheessa. Jos solusyklin vaarantuu tässä vaiheessa, sykliini D1 tasot pysyvät alhaisina. Kuten kuviossa 4 on esitetty, alempia sykliini D1 havaittu käsiteltäessä HCT-116 tai Caco-2-solujen CoCl

2 ehdotti myös solusyklin pysähtymiseen G2, vahvistaa saatujen tulosten virtaussytometriseen analyysiin.

tiedetään, että p53 on tärkeä rooli säätelyssä solusyklin etenemisen klo G1 ja G2 tarkistuspisteitä. Tarkemmin sanottuna vasteena DNA-vauriolle, aktivointi molekyyli reittejä säätelee p53 johtaa solusyklin pysähtymisen G1-[23]. Lisäksi viime aikoina on raportoitu, että ekspressio p53-isoformia, jolta puuttuu ensimmäiset 39 aminohappoa, ja jota kutsutaan p47, on mukana solusyklin pysähtymisen G2 vasteena solun eri stressiolosuhteissa, mukaan lukien endoplasmakalvostoon stressi, laskostumattoman proteiinin vaste ja hypoksia [24]. Siksi me seuraavaksi analysoitu ilmaus molempien p53-isoformien paksusuolen syöpäsoluissa hoidon jälkeen CoCl

2. Kuten kuviossa 4 on esitetty, hoito CoCl

2 ei muuttanut ilmentyminen täyspitkän proteiinin p53 (p53FL), mutta indusoi ilmentymisen katkaistun isomuodon (p53 /p47). Nämä tulokset viittaavat siihen, että matkivat hypoksian paksusuolen syöpäsoluissa indusoi p53 /p47-isoformin negatiivisesti säätelevät solusyklin etenemistä G2. Siksi rooli p53 /p47 tutkittiin edelleen käsittelemällä paksusuolen syövän soluja pifithrin-α (PFT-α), joka spesifisesti estää p53-välitteisen transaktivaation. Hoito Caco-2-solujen PFT-α aiheutti odottamattoman sytotoksisuuden joka esti myöhemmin morfologiset ja solusyklin analyysit. Kuitenkin, ja kuten kuviossa 5A on esitetty, hoito HCT-116-solujen kanssa 10 uM PFT-α vähentänyt CoCl

2 solusyklin Lisäksi tämä esikäsittely, joka tukkii spesifisesti transkriptionaalista aktiivisuutta p53, kumosi muodostumista of PGCCs aiheuttama CoCl

2 HCT-116-solut (kuvio 5B). Näin ollen, transkriptionaalisesti aktiivinen p53 /p47 on tarpeen hypoksian indusoiman solusyklin muutoksia ja muodostumista PGCCs paksusuolen syöpäsoluissa.

HCT-116-soluja käsiteltiin 300 pM CoCl

2: n läsnä tai puuttuessa 10 uM pifithrin-α (PFT-α), joka on spesifinen inhibiittori transkriptionaalista aktiivisuutta p53. Seuraavaksi solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla. (A) Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta riippumattomasta kulttuureissa. (* P 0,05, verrattuna solujen altistuvat CoCl

2 puuttuessa polyesterikuitufilamenttitouveja-α), ja (B) solujen morfologian muutoksiin tutkittiin käyttäen näkyvää mikroskopia. Mittaviivat vastaavat 50 mikronia.

PGCCs sukupolvi paksusuolensyöpä liittyy lisääntymiseen alaryhmästä syövän kantasoluja

On ehdotettu, että hypoksia tuotettu PGCCs voivat aktiivisesti myötävaikuttaa kasvaimen kasvua sukupolven CSCS [19]. Siksi päätimme analysoida sitten muodostumiseen colonospheres

in vitro

, joka on toiminnallinen määritys on itseuudistumisen capbility of CSCS. Tätä varten, kun rikastuminen PGCCs käsittelemällä CoCl

2 48 tuntia, elossa soluja viljeltiin kloonitiheydessä seerumittomalla väliaineella matalan tarttuvuuden levyille, jotka estävät solujen tarttumista. Näissä olosuhteissa, eriytetty epiteelikasvainsolut kuolemaan anoikis ja vain alapopulaatio kasvaimen erilaistumattomien solujen kantasolujen ominaisuuksia (CSCS) selviää, joka pystyy tuottamaan tumorospheres (colonospheres) suspensiossa itseuudistumisen. Edelliset kokeet, joissa käytetään lipofiilisten fluoresoivia tahroja tehtiin sen varmistamiseksi, että yksittäiset colonospheres olivat peräisin yksittäisistä soluista. Siten sekoittamalla yhtä paljon Dil (punainen) – tai DiO (vihreä) -leimattuja soluja ennen suorittamista colonosphere muodostumista määrityksessä, jolloin muodostui pallojen, jotka sisältävät vain yhden tai muun etiketti (kuvio S1).

Kuten kuviossa 6 on esitetty, esikäsittely CoCl

2 ja myöhemmin rikastamiseen PGGCs kasvoi sekä HCT-116 ja Caco-2-solujen kyky muodostaa colonospheres, mikä viittaa siihen, että sukupolven PGCCs edistää laajentamiseen CSC alaryhmän molemmissa solulinjoissa. Seuraavaksi muodostetaan colonospheres olivat eriteltyjä ja tuloksena solupopulaatiota viljeltiin uudelleen kloonitiheydessä muodostumista toissijainen colonospheres. (Kuvio 6). Solut johdetut colonospheres muodostettu CoCl

2-käsiteltyjen paksusuolen syövän soluja säilytetään suurempi kyky muodostaa colonospheres, vahvistaa erinomaisen kyky uusiutua. Lisäksi toissijainen colonospheres johdettu colonospheres muodostettu solut altistettiin hypoksia olivat huomattavasti suurempia verrattuna johdettu ohjaus soluja (kuvio 7). Tämä kasvettua tukenut tätä CSCS syntyy solussa populaation rikastunut PGCCs myös hallussaan suurempi kyky itseuudistumiseen, ja siksi ne olivat selvempiä stemness ominaisuuksia [25].

Kun rikastumisen PGCCs käsittelemällä varten 48 uM CoCl

2, elossa soluja viljeltiin kloonitiheydessä seerumittomalla väliaineella matalan tarttuvuuden levyille ja määrä ensisijaisen muodostunut colonospheres arvioitiin seitsemän päivän kuluttua. Ensisijainen colonospheres olivat eriteltyjä ja tuloksena solupopulaatiota viljeltiin uudelleen kloonitiheydessä muodostumista toissijainen colonospheres. Grafiikka näyttää numerot ensisijaisen (harmaat palkit) ja toisen (mustat palkit) colonospheres muodostama HCT-116 ja Caco-2-solujen kunkin hoidon jälkeen. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta riippumattomasta viljelmät (* p 0,05 verrattuna kontrolliin).

toissijainen colonosphere muodostumisen määritys suoritettiin, kuten on kuvattu kuviossa 6 selite ja alle Materiaalit ja menetelmät. (Lopullinen suurennus, x 200). Asteikkoviiva vastaa 10 mikronia.

Sukupolvi PGCCs paksusuolen syöpäsoluissa liittyy vastustuskykyä 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinia

Verrattuna enemmän normoxic kasvaimia, kasvaimet, joilla on korkeampi hypoksinen osa ovat vastustuskykyisempiä sädehoidon ja kemoterapian [12]. Myös molemmat PGCCs [19] CSCS [5] on liittynyt resistenssin kemoterapiaa. Siksi seuraava päätettiin analysoida paksusuolensyöpä soluviljelmissä rikastunut PGCCs antiproliferatiivinen aktiivisuus 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinia, kaksi tavallista huumeiden kemoterapiassa peräsuolen syöpä. Kuten kuviossa 8 on esitetty, nämä soluviljelmät, joita oli rikastettu PGCCs käsittelemällä CoCl

2, osoitti lisääntynyttä resistenssiä antiproliferatiivinen vaikutus kummankin lääkeaineen.

Both HCT-116 ja Caco-2- soluja esi-inkuboitiin 48 tunnin ajan, kun läsnä tai poissa CoCl

2 PGCC rikastamiseen ja sitten ne altistettiin 72 h erilaisilla annoksilla 5-fluorourasiilin (A) tai oksaliplatiinin (B). Soluproliferaatiota on esitetty prosentteina kontrollista solujen valottamattomat kemoterapeuttisten lääkkeiden. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (* p 0,05, verrattuna soluihin ilman CoCl

2 hoitoa).

Keskustelu

Hypoksia kasvaimissa on pitkä liittynyt lisääntynyt kasvaimen aggressiivisuus, huonompi ennuste ja sietävät paremmin sädehoidon ja kemoterapian [26]. Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että matkii hypoksiaa in vitro käyttämällä CoCl

2, joka stabiloi HIF-1α-proteiinia inhiboimalla sen hajoamisen, pystyy tuottamaan PGCCs paksusuolen syövän soluviljelmässä. PGCCs aiheuttama käsittelemällä CoCl

2 ovat vakaita ja hallussaan erottuva morfologia mutta niiden sukupolvi fysiologisissa

in vivo

hypoksinen olosuhteet on vielä määrittämättä. Meidän kokeissa morfologia PGCCs aiheuttama hypoksia vaihteli välillä HCT-116 ja Caco-2-solut (kuvio 1). Tämä riippuvuus solulinja sama tutkimus Zhang et al [19], jossa PGCCs peräisin kasvainsolulinjoja HEI (munasarjojen) ja MDA -MB-231 (rinta) oli neuronaalinen kaltainen morfologia, kun taas PGGCs johdettu SKOV3- soluja (munasarja ), osoitti pyöristetty morfologian soluliman laajennuksia tai oksia. Tutkimuksessamme morfologia PGCCs peräisin HCT-116-solut on sama kuin niillä, HEI ja MDA -MB-231-soluissa, kun taas syntyy Caco- 2 olivat samanlaisia ​​kuin on kuvattu SKOV3- soluja. On syytä korostaa, että hei, MDA -MB- 231 ja HCT-116 ovat huomattavasti invasiivisia solulinjat, joka edustaa epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) prosessi, joka kärsii jonkin verran alapopulaatiot syöpäsoluja [27]. Siksi tai tulokset viittaavat siihen, että geneettinen ohjelma, joka ohjaa EMT kasvainsoluissa saattaa myös olla tärkeä tekijä sukupolven PGCCs suuremman kapasiteetin soluttautumisen ja levittää.

Tuloksemme osoittivat myös, että muodostumista PGCCs vuonna koolonkarsinoomasoluissa liittyy muutoksia solusyklin ja sen jälkeen polyploidia (kuviot 2 ja 3). Yksisoluinen prokaryootti- ja eukaryoottisoluissa jakamalla amitotic prosesseja. Monimutkaisissa eukaryoottisolut, vaikka mitoosia vallitsee hyvin dokumentoitu muutoksia mitoosi solusyklin tapahtuu saavuttaa solujen kasvua ja kehitystä stressaavissa olosuhteissa. Näistä vaihteluista on endoreplication prosessi, muunnelma normaalin mitoosi solusyklin johon liittyy useita kierroksia DNA-replikaation ilman osallistumista vaihe mitoosia [28]. Kasvain jättisoluja havaita patologit on perinteisesti pitää pysyvänä siitä näkökulmasta kasvaimen kannan lisäämis-. Kuitenkin uudet tiedot osoittavat, että nämä solut kykenevät tuottamaan klonogeeniset jälkeläisten tuottamiseen epäsymmetrinen jako ja orastava [19]. Näin ollen menetelmä on kuvattu, jossa solut paeta mitoosi katastrofin solukuolema tulossa PGCCs, että ennen kuin he kuolevat, aiheuttaa useita soluja kautta ydin- orastava ja epäsymmetrinen sytokineesiin. Tämä tila solunjakautumisen syöpä on nimetty neosis, ja on liittynyt alkuperä syövän kantasolujen [29], [30].