Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant aktivoitumisen Wnt koulutusjakson vaikuttaa ihmisen syövän etenemiseen. Antagonisteja, jotka häiritsevät Wnt ligandi /reseptori vuorovaikutusten voivat olla käyttökelpoisia syövän hoitomuotoja. Tässä tutkimuksessa arvioimme terapeuttista potentiaalia liukoisen Wnt reseptorin houkutuslintuna syövän geeniterapiassa. Suunnittelimme Wnt antagonisti sLRP6E1E2, ja tuotti replikaatiokyvyttömäksi adenovirus (Ad), DE1-K35 /sLRP6E1E2, ja replikaatiokompetentin onkolyyttinen Ad, RdB-K35 /sLRP6E1E2, sekä ilmentävät sLRP6E1E2. sLRP6E1E2 esti Wnt-välitteisen vakauttaminen sytoplasminen β-kateniinin, laski Wnt /β-kateniinin signalointi- ja solujen proliferaation kautta mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin ja fosfatidyyli-3-kinaasi reittejä. sLRP6E1E2 aiheuttama apoptoosin, sytokromi

c

julkaisu, ja lisääntynyt lohkaisu PARP ja kaspaasi-3. sLRP6E1E2 kasvun estyminen ihmisen keuhkojen -tuumoriksenografti, ja vähentää liikkuvuutta ja invaasion syöpäsoluja. Lisäksi, sLRP6E1E2 upregulated ilmentyminen epiteelin markkerigeenejä, kun taas sLRP6E1E2 vaimentua mesenkymaalisten markkerigeeni. Yhdessä sLRP6E1E2, estämällä vuorovaikutusta Wnt ja sen reseptori, tukahdutetaan Wnt aiheuttaman soluproliferaation ja epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon.

Citation: Lee JS, Hur MW, Lee SK, Choi WI, Kwon YG , Yun CO (2012) romaani sLRP6E1E2 Estää Canonical Wnt Signaling, epiteeliä-to-mesenkymaalitransitioon, ja indusoi Mitochondria-riippuvaista apoptoosia in Lung Cancer. PLoS ONE 7 (5): e36520. doi: 10,1371 /journal.pone.0036520

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu 6 marraskuuta, 2011; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 14, 2012

Copyright: © 2012 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia ministeriön Knowledge Economy (10030051, tri CO Yun), Korean Science and Engineering Foundationin (2009K001644, 2010-0029220, tri CO Yun), ja Korean Food and Drug Administration (KFDA 10172- 332 Dr. CO Yun). Jung-su Lee on jatko-opiskelija sponsoroi Brain Korea 21 Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Etelä-Korea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on erittäin aggressiivinen ja yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Vuonna 2009, American Cancer Society arvioi, että oli 219440 uutta keuhkosyöpää Yhdysvalloissa. Standard hoitomuotoja, kuten leikkaus ja säteily eivät ole tehokkaita monissa tapauksissa [1]; kuitenkin suurempi ymmärtäminen molekulaarisia mekanismeja keuhkosyöpä on johtanut lupaavien uusien hoitojen [2]. Vaikka kemoterapia edistysaskeleet ovat parantuneet yleistä potilaiden elinaikaa aggressiivinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, chemoresistance edelleen merkittävä syy hoidon epäonnistumisen [3]. Monet aggressiivinen keuhkosyövässä osoittavat muutoksia eri syöpään liittyvien geenien, kuten Wnt, K-ras, ekstrasellulaarisen signaali säädelty kinaasi (ERK), Akt, ja COX-2-, mikä viittaa eri molekyyli- koulutusjakson syövän syntymistä keuhkojen adenokarsinooman [4] – [6].

rooli Wnt signaloinnin syövän ensin ehdotettiin 20 vuotta sitten löydettiin Wnt-1 integraatio sivusto hiiren nisäkasvainviruksen [7]. Useissa tutkimuksissa on todettu, että muuttunut ilmentyminen Wnt ligandeja, reseptoreja, ja solunulkoinen antagonisteja liittyy syövän kehityksen /etenemisen ja kantasolujen itseuudistumisen /erilaistuminen [8]. Expression of Wnt ligandin, LDL-reseptoriin liittyvä proteiini 5 (LRP5: stä), ja LRP6 ilmentyminen li- sääntyy keuhkosyövässä, kun taas Wnt antagonisteja, jotka sitoutuvat Wnt-ligandien estää vuorovaikutusta reseptorien (esim Wnt estävä tekijä-1 (WIF- 1), secreted Frizzled-sukuiset proteiinit (SFRP) ja dickkopf proteiinit (DKK) on vaimentua tai inaktivoidaan [9], [10]. Näin ollen monoklonaalisia vasta-aineita ja pieniä häiritseviä RNA: ita vastaan ​​Wnt- ja yli-ilmentyminen Wnt antagonistien tukahduttaa kasvaimen kasvua eri

in vitro

ja

in vivo

kasvainmuodoista.

LRP6, jäsen LRP superperheen, tarvitaan aktivointi kanonisen Wnt-signalointireitin, joka johtaa vakauttamiseen ja tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin, avain efektorimolekyylin [11]. LRP6 koostuu neljästä eri YWTD β-potkurin /EGF-kaltaisen domeenin paria, ensimmäisen ja toisen YWTD domeenit (E1 ja E2) vaaditaan sitoutumaan Wnt [ ,,,0],12] – [14]. Tässä tutkimuksessa selvitimme terapeuttista potentiaalia uuden liukoisen Wnt-reseptori, sLRP6E1E2, joka koostuu LRP6 E1 ja E2 alueilla. Olemme tutkineet biologisia vaikutuksia sLRP6E1E2 sitoutuminen solunulkoisen Wnt-ligandien ja estää ligandi-reseptori-vuorovaikutusta. Tuloksemme antamaan suoraa näyttöä siitä, että tietty Wnt ligandi /reseptori vuorovaikutusten mahdollista käyttöä syövän vastaisina terapeuttisina aineina.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Eläinten käsittely suoritettiin mukaisesti kansallisten ja kansainvälisten ohjeiden eläimessä laitos akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory animal Care (AAALAC). Lukumäärä käytettyjen eläinten minimoitiin, ja kaikki tarvittavat varotoimet otettiin lieventämiseksi kipua tai kärsimystä. Pöytäkirjat hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Yonsein yliopisto terveysjärjestelmän (2010-0160).

Materiaalit

Polyklonaalisia vasta-aineita MAPK-kinaasia (MEK1 /2), p44 /42 mitogeeni aktivoitujen proteiinikinaasi (MAPK; Erk1 /2), mTOR, fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) ja Akt, ja monoklonaalisia vasta-aineita Wnt3a, Dvl2, ak- siini, glykogeenisyntaasikinaasi (GSK3-β), poly (ADP-riboosi) polymeraasin (PARP), ja pilkotaan kaspaasi-3 ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyvien molekyylien β-kateniinin, E-kadheriinin ja vimentiinin saatiin Cell Signaling Technology, ja vasta-ainetta vastaan, N-kadheriinin hankittiin eBioscience (San Diego, CA). Vasta-aineita sykliini D1 (H-295), sytokromi

c

(C-20 Western blot-analyysi), ja LRP6 (C-10), ja proteiini A /G-agaroosihelmiä ostettiin Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA). Monoklonaalinen vasta-aine kaspaasi-3 oli peräisin StressGen Biotekniikka (Victoria, BC). Polyklonaaliset vasta-aine sytokromi

c

(6H2.B4 varten immunohistokemia) oli BD Pharmingen (San Diego, CA). Alexa Fluor 488-konjugoitu ja Alexa Fluor 568-konjugoitu anti-kani-IgG-vasta-aineita saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). DAPI (1 ug /ml), Hoechst 33342, ja tetrametyyli- isotiosyanaatti (TRITC) konjugoidun phalloidin olivat Sigma (St. Louis, MO). Puhdistettu Wnt3a proteiini ostettiin R Life Technologies, Grand Island, NY); H322, H2009 ja H1299 solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 (Life Technologies), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 1% MEM-ei-välttämättömiä aminohappoja, penisilliiniä-streptomysiiniä (100 IU /ml), ja Hankin tasapainotettua suolaliuosta (Life Technologies). Solut hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, 5% CO

2.

sukupolven adenovirusvektoreiden ilmentävien Liukoinen LRP6 Receptor

tutkimiseksi biokemiallinen funktio liukoisen LRP6 reseptorin (sLRP6E1E2), me syntyy konstruktit E1 ja E2 ekstrasellulaaristen domeenien (Wnt-sitoutumiskohdat) on LRP6 [15] ja FLAG-merkitty sLRP6E1E2 subkloonattiin pCA14 sukkulavektoriin [ ,,,0],16]. Tämä pCA14-sLRP6E1E2 vektori co-transformoitu replikaatiokyvyttömäksi adenoviruksen 5/35 kimeerisen vektorin (DE1-K35) tai replikaatiokykyisten kimeerisen onkolyyttinen adenovirusvektori (RdB-K35) [17], ja se tuottaa PDE1-K35 /sLRP6E1E2 ja pRdB -k35 /sLRP6E1E2, vastaavasti. Nämä yhdistelmä-DNA-plasmidit transfektoitiin HEK293-soluissa tuottaa DE1-K35 /sLRP6E1E2 ja RdB-K35 /sLRP6E1E2. Replikaatio-kykenemätön DE1-K35 /LacZ ja replikoitumiskykyisen onkolyyttinen RdB-K35 vektoreita käytettiin negatiivisina kontrolleina [18] (Fig. 1A). Kaikki virukset on saatu kuten edellä on kuvattu [19].

(a) Kaavamainen esitys genomista rakennetta Ad käytetyistä vektoreista. (B) Endogeeninen Wnt3a (vasen paneeli) ja LRP6 (oikea paneeli) ilmentymistä useissa ihmisen keuhkosyövän solulinjat. (C) eritys ja ilmaus sLRP6E1E2. Soluviljelysupernatantit arvioitiin FLAG erityisiä Ab (ylempi paneeli). Ponceau värjäytyminen on esitetty latauskontrollina (Pohjalevy). (D) H322 ja H460-solut transdusoitiin DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2 (50 MOI) 48 tuntia. Solulysaatit immunosaostettiin antiseerumeja Wnt3a (IP: Wnt3a) tai LRP6 (IP: LRP6) ja sen jälkeen Western blot-analyysi, jolla on sama vasta-aineita.

Luciferase Reporter Assay for β-kateniinin Activity

TOPflash ja FOPflash lusiferaasireportteri- vektorit (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), käytettiin mittaamaan β-kateniinin /T-solu-tekijä (TCF) signalointia toimintaa. A549, H322, ja H460-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja transfektoitu 0,3 ug TOPflash (joka sisältää villin tyypin TCF sitoutumiskohtia) tai FOPflash (sisältäviä mutatoitu TCF sitovat kohdat) negatiivista kontrollia DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2 (20, 50 MOI) seerumittomassa väliaineessa. 12 tunnin kuluttua väliaine korvattiin 1% DMEM kanssa tai ilman 100 ng /ml Wnt3a, ja soluja inkuboitiin vielä 24 tunnin ajan. Solut hajotettiin passiivista hajotuspuskuria, ja 20 ui solu-uutetta analysoitiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

siRNA transfektio

siRNA transfektio suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin kuuden kuoppalevyllä 60% konfluenssiin ja välittömästi ennen transfektiota pestiin seerumittomalla väliaineella, ja 800 ui seerumitonta alustaa lisättiin kuoppaa kohti. Seosta, jossa oli 0,3 ug TOPflash vektori, LRP6-spesifisiä tai ohjata siRNA (10 nM), ja 5 ui lipofektamiinia (Invitrogen) 200 ui: aan seerumia inkuboitiin sitten 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja lisättiin kuhunkin kuoppaan. Seerumi lisättiin 8 tuntia myöhemmin lopullinen pitoisuus oli 10%. Seuraavana päivänä soluja stimuloitiin kanssa tai ilman rekombinantti Wnt3a (100 ng /ml) vielä 16 tunnin ajan.

proliferaatiomääritystä

soluproleferaatiomäärityksessä määritettiin 3- (4 , 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-liumbromidi (MTT) (Sigma). A549 ja H322-soluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille (2 x 10

4 solua /kuoppa). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin PBS: llä, DE1-K35 /LacZ, tai DE1-K35 /sLRP6E1E2. Seuraavana päivänä soluja stimuloitiin kanssa tai ilman rekombinantti Wnt3a (100 ng /ml) vielä 48 tunnin ajan. Absorbanssi 540 nm: ssä luettiin mikrolevylukijalla. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Western-blottaus

Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa on 1% naudan sikiön seerumia 100 mm: n maljoille tehtiin transdusoitiin DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2 . Seuraavana päivänä solut käsiteltiin tai ei Wnt3a (100 ng /ml) 16 tunnin ajan. Immunoblottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Estetty kalvoja inkuboitiin vasta-aineiden Wnt3a, FLAG, LRP6, Dvl2, ak- siini, sykliini D1, GSK3-β, MEK1 /2, p44 /42 MAPK (Erk1 /2), surviviinia, mTOR, PI3K, Akt, PARP, pro- kaspaasi 3, pilkotaan-kaspaasi 3, ja sytokromi

c

yön yli 4 ° C: ssa. Blotteja inkuboitiin seuraavan sekundääriset vasta-aineet on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin: vuohen anti-kani-IgG, vuohen anti-hiiri-IgG, tai hiiren anti-vuohen IgG: tä (Cell Signaling Technology) ja kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Ruotsi ).

Immunosaostusanalyysi

H322 ja H460-solut ympättiin 10 cm: n maljoilla infektoitiin kunkin Ad (MOI, 50). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia infektion jälkeen solut kerättiin ja lyysattiin lyysipuskurissa (50 m

M

HEPES, joka sisälsi 0,15

M

NaCl, 0,5% Nonidet P-40, ja proteinaasi-inhibiittorit fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, tosyyli-L-lysiiniä klorometyyliketoni, ja

N

-tosyyli-l-fenyylialaniinikloorimetyyliketonia). Yhteensä Solulysaatti (500 ug) oli ensimmäinen immunosaostettiin Wnt3a tai LRP6 vasta-aineella ja analysoitiin Western blot anti-Wnt3a ja anti-LRP6-vasta-aine.

immunofluoresenssimääritystä

immunofluoresenssimikroskoopilla, viljeltiin solut pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten läpäiseviksi inkuboimalla 15 minuutin ajan 0,1% Triton X-100 PBS: ssä. Näytteet salvattiin 1% naudan seerumin albumiinia seurasi inkubointi E-kadheriinin, β-kateniinin tai anti-sytokromi

c

primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Jauhot 488-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG sekundääristä vasta-ainetta 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopullinen vasta-aine käsittely sisälsi myös TRITC-konjugoidun aktiini ja Hoechst 33342 tai DAPI-värjäys (molemmat 1 ug /ml, Sigma) tumavärjäystä. Objektilasit asentaa Vectashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA), ja soluja tarkasteltiin konfokaalisella laser-skannaus mikroskooppi (LSM510, Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY).

Mitokondrioiden fraktiointi ja Western blotting

mitokondrioiden fraktiot valmistettiin käyttäen Qproteome mitokondrioiden eristämisen (QIAGEN, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut pestään 0,9% natriumkloridiliuoksella suspendoitiin jääkylmällä lyysipuskuria pipetoimalla ylös ja alas. Sen jälkeen, kun 10-min inkuboinnin lysaattia sentrifugoitiin 1000

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti, joka sisältää sytosolisen proteiinit poistettiin varovasti. Pelletti, joka sisälsi ytimiä, solujäänteet ja katkeamaton solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään hajotuspuskuria, ja sentrifugoitiin 1000

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti (mikrosomaalinen fraktio) siirrettiin puhtaaseen microtube. Saatu pelletti, joka sisältää mitokondrioita pestiin mitokondrioita varastoinnin puskuriin ja sentrifugoitiin 6000

g

20 minuutin ajan 4 ° C: ssa; kaista kohti putken pohjalle kerättiin mitokondrion osa. Western blotting suoritettiin kanin anti-sytokromi

c

vasta-aineeseen käyttämällä edellä kuvattua menetelmää.

Anti-kasvain Effects in Human ksenograftimallissa

Ihmisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän syöpä (H460) -ksenografti perustettiin 6- 8 viikon ikäisiä urospuolisia kateenkorvattomiin nu /nu-hiiriä (Charles River Japan, Yokohama, Japani) ihon alle istuttaminen 1 x 10

7 H460 soluja vatsan. Kun kasvaimen tilavuutta saavutetaan noin 80-100 mm

3, hiiret jaettiin viiteen ryhmään, joilla on samankaltaisia ​​kasvaimen keskimääräinen määriä. Adenovirusvektoreita annettiin kasvaimen (2 x 10

10 viruspartikkelia /hiiri) ensimmäisenä hoitopäivänä (päivä 1) ja päivinä 3 ja 5. Kaikki eläinkokeet tehtiin vuonna Yonsein University College of Medicine mukaan institutionaalisten määräysten eläimessä laitos akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory animal Care (AAALAC). Kasvaimen tilavuus (

V

) laskettiin

V

= 0,52 x

2 x

b

(

, pienin pinnallinen läpimitta;

b

, suurin pinnallinen halkaisija).

kasvainhistologiaa ja immunohistokemia

Tuumorikudos fiksoitiin 4% paraformaldehydillä ja upotettiin parafiiniin vaha histologista tutkimus ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Edustavia leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja tutkittiin valomikroskoopilla. Määrällisesti kapillaaritiheys ja Wnt ilmaisun, kasvaimen leikkeet värjättiin anti-hiiri-CD31-lgG (BD Pharmingen), anti-kani-β-kateniinin IgG: tä (Cell Signaling Technology), tai anti-hiiri-Wnt3a IgG (Santa Cruz Biotechnology). Sammutuksen jälkeen endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus ja estää ei-spesifistä proteiinia sitovan normaalin vuohen seerumin (Vector Laboratories), leikkeitä inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten biotinyloidun sekundaarisen IgG (Jackson Immuno- Research, West Grove, PA). Positiivinen immunoreaktiivisuus visualisoitiin ABC-peroksidaasin sarjat (ChemMate ™ DAKO Kuvitella ™ Detection Kit, DAKO). Kontrollit valmistettiin inkuboimalla merkityksetön alaluokka ja lajien yhteensopivat IgGs. Kaikki objektilasit vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä. Ilmentymistasojen Wnt3a ja β-kateniinin arvioitiin puolikvantitatiivisesti käyttäen MetaMorph® kuva-analyysi-ohjelmisto (Universal Kuva Corp., Westchester, PA). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona optisen tiheyden viidelle eri digitaalisia kuvia.

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla dUTP Nick End Labeling Pitoisuus

5 um formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut kudosleikkeiden poistettiin parafiini ja rehydratoitiin standardimenetelmien mukaisesti [21]. Apoptoosi havaittiin terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys (DeadEnd ™ fluorometrinen TUNEL System, Promega). Lyhyesti, kudosleikkeet tehtiin läpäiseviksi proteinaasi K: lla (20 ug /ml) 10 min ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin sitten liittimen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) ja fluoreseiini-12-dUTP in TdT-puskuria huoneenlämmössä 60 minuutin ajan ja pestiin TdT-puskuria. Lopuksi tumat vastavärjättiin DAPI. Näytteet analysoitiin fluoresenssimikroskopialla tavallisella fluoresoivaa suodatin.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

In vitro

muuttoliike määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, alapinta 6,5 ​​mm polykarbonaattisuodattimien (8 um: n huokoskoko, Corning Costar, Cambridge, MA) päällystettiin upottamalla 0,1% gelatiinia. Elatusaine saatiin A549-soluja on transdusoitu PBS, DE1-K35 /LacZ ja DE1-K35 /sLRP6E1E2 hoidon jälkeen tai ilman Wnt3a ja sijoitettu pohjalle Transwell kammion. A549-solut maljattiin sitten ylempään kammioon (7 x 10

4 solua /kuoppa). Viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan, kiinnitettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.

In vitro

matrigeelin invaasio analyysit suoritettiin käyttäen bio-takki solumigraation kammioita. Suodattimet (8 um huokoskoko) päällystettiin Matrigelillä tyvikalvon matriisin (37 mg /suodatin, BD Biosciences, San Jose, CA), ja koe suoritettiin kuten on kuvattu solun migraatiokokeessa. 24 tunnin kuluttua noninvading solut poistettiin, ja tunkeutuvat solut alle suodattimen pinta kiinnitettiin ja värjättiin. Kalvot asetettiin lasilevyille, ja siirtyneet solut laskettiin 200-kertaisella suurennuksella. Viisi kenttää laskettiin kutakin määritystä varten, ja kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Ryhmä tuloksia vertailtiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seurasi jälkikäteen Studentin

t

-testi parittomalle havainnot tai Bonferronin korjausta monimuuttujille tarvittaessa.

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Liukoinen Wnt Decoy reseptori ilmentyy Lung Cancer Cell Lines ja sitoutuvan Wnt3a

Endogeeninen Wnt3a ja LRP6 tasot arvioitiin seitsemän ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat (A549, H322, H596, H460, H358, H2009, ja H1299) western blot -analyysillä. Sekä Wnt3a ja LRP6 olivat voimakkaammin ilmaistuna H322, H460, ja H2009 solut kuin muissa solulinjoissa (Fig. 1 B ja kuviossa S1); Näin ollen, H322 ja H460-solut valittiin arvioida kykyä liukoisen Wnt valereseptori (sLRP6E1E2) estää Wnt signalointia. Expression of sLRP6E1E2 peräisin DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoitujen A549-solut varmistettiin Western blot -analyysillä käyttäen anti-FLAG-vasta-aineita (Fig. 1 C). Eritystä sLRP6E1E2 DE-K35 /sLRP6E1E2-transdusoidut solut oli annoksesta riippuvaa. Tasapuolisen lastaus, siirrettiin proteiinit visualisoitiin värjäämällä Ponceau Red.

tutkimiseksi edelleen, jos sLRP6E1E2 ilmennetään DE1-K35 /sLRP6E1E2 voi häiritä sitova kyky endogeenisen LRP6 ja Wnt3a, solulysaateista DE1-K35 /LacZ- tai dE1-K35 /sLRP6E1E2 transduktoitu- H322 ja H460-soluissa, jotka endogeenisesti yli-ilmentävät Wnt3a immunosaostettiin Wnt3a tai LRP6 vasta-, ja sitten Endogeenisen Wnt3a (ylhäällä) ja yhteensä LRP6 (alhaalla) tasot havaittiin anti-Wnt3a ja anti- LRP6 vasta-aine. Havaitsimme, että molemmat Wnt3a ja LRP6 proteiinin tasot olivat alhaisempia soluissa transdusoitiin DE1-K35 /sLRP6E1E2 kuin soluissa transdusoitiin DE1-K35 /LacZ (Fig. 1 D), jotka osoittavat, että ulkoisesti ilmaistaan ​​sLRP6E1E2 voi tehokkaasti sitoutua Wnt3a, mikä ehkäisy vuorovaikutuksen endogeenisen LRP6 ja Wnt3a.

Decoy Wnt Reseptori Vähennykset Sytosoliset β-kateniinin tason ja TCF transkriptioaktiviteettia

seuraava olettamuksiin erittyvän sLRP6E1E2 proteiini estää Wnt signalointia suoraan sitoutumisesta ja Wnt. Siksi luonnehtia sLRP6E1E2 vaikutuksia Wnt3a /β-kateniinin signalointi, päätimme sen vaikutus β-kateniinin käyttäen lusiferaasireportterisysteemillä aktivoidaan p-kateniinin /TCF [23]. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, lusiferaasi-aktiivisuus oli alhainen A549-soluja transdusoitiin DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2 puuttuessa Wnt3a, koska endogeeninen ilmentyminen tasolla Wnt3a A549 on hyvin pieni (Fig. 1 B). Wnt3a käsittely lisäsi lusiferaasin ilmentyminen on noin 7- ja 8-kertaisesti kontrollisoluissa, mutta ei DE1-K35 /sLRP6E1E2-transdusoidut solut, viittaa siihen, että eritetty sLRP6E1E2 voivat estää signalointi vaikutus ulkoisesti käsiteltyjen Wnt3a. Puuttuessa Wnt3a, lusiferaasiaktiivisuus vähennettiin DE1-K35 /sLRP6E1E2 H460 (48%) ja H322 (12%) soluja, verrattuna DE1-K35 /LacZ valvontaa (Fig. 2B;

P

0,05). Jotta tähän tulokseen enemmän pakottavia, tutkimme vaikutus LRP6-erityisiä siRNA (si-LRP6) on Wnt3a /β-kateniinin signalointi. Kuten kuviossa S2, lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi vähentää käsittelemällä si-LRP6 sekä läsnä ollessa ja puuttuessa Wnt3a, kanssa seurauksena edellä (Fig. 2).

(a) TCF /LEF lusiferaasireportterista määritys A549-soluissa. Luonnehtia sLRP6E1E2 vaikutuksia Wnt3a /β-kateniinin signalointi, solut transfektoitiin TOPflash (joka sisälsi villityypin TCF sitoutumiskohdat) tai FOPflash (jotka sisältävät mutatoituja TCF sitoutumiskohtia) sivektorissa. *

P

0,05 versus DE1-K35 /LacZ-transduktoituja tai PBS-käsitellyt solut. (B) TCF /LEF lusiferaasireportterista määritys H460 ja H322-soluissa. *

P

0,05 verrattuna PBS tai DE1-K35 /LacZ-transdusoidut solut tai ilman Wnt3a. (C) H322-soluja transdusoitiin DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2 (50 MOI) kanssa tai ilman Wnt3a. Solut leimattiin anti-β-kateniinin. Alkuperäinen suurennos, × 630. (D) Semi-kvantitatiivinen analyysi paneelin (c) tuloksia käyttämällä MetaMorph® kuvantamisen analyysin ohjelmisto. Kukin datapiste vastaa keskiarvoa ± SEM (kukin ryhmä, n = 5). **

P

0,001 verrattuna PBS tai DE1-K35 /LacZ-transdusoitujen solujen Wnt3a.

vaikutuksen arvioimiseksi sLRP6E1E2 on β-kateniinin lokalisointi, immunofluoresenssivärjäyksen oli suoritetaan H322-soluissa käsitelty PBS tai transdusoitu dE1-K35 /LacZ tai dE1-K35 /sLRP6E1E2. Puuttuessa Wnt3a, β-kateniinin värjäytyminen rajoittui pääasiassa solu-solu-kontakti sivustoja kaikissa ryhmissä. Kun Wnt3a stimulaatio, kontrollisolut (PBS ja DE1-K35 /LacZ) oli vähentynyt β-kateniinin lokalisointi on solukalvon, erityisesti solu-solu-liittymissä, ja lisääntynyt β-kateniinin tasoilla sytosolissa ja tumassa. Sen sijaan, DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien solut osoittivat alempia sytosolin β-kateniinin, ja korkeampi kalvoon liittyvä β-kateniinin (Fig. 2C). Kvantifiointi ydin β-kateniinin ilmentymistä osoitti 98,08%: n lasku DE1-K35 /sLRP6E1E2-transdusoidut solut verrattuna DE1-K35 /LacZ valvonnan läsnä Wnt3a (Fig. 2D). Tulokset näiden toiminnallisten tutkimukset osoittavat, että vuorovaikutukset sLRP6E1E2 ja Wnt voi olla riittävä estämään Wnt signalointia.

Decoy Wnt-reseptorin sLRP6E1E2 Estää Lung Cancer Cell Proliferation

Wnt-reitin säätelee monenlaisia ​​cellular toimintoja kuten solujen lisääntymisen [24]. Voit testata vaikutukset sLRP6E1E2 proliferaatioon A549 ja H322-solujen

in vitro

, soluja käsiteltiin PBS: llä tai transdusoitu DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2. 72 tuntia transduktion jälkeen DE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI), solujen lisääntymisen väheni 39% A549-soluja ja 51% H322-soluissa verrattuna DE1-K35 /LacZ transduktoitu- valvontaa. Wnt3a stimulaation lisääntyvän leviämisen noin 10-20% hallinnassa soluissa, mutta ei ollut selvää vaikutusta DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluissa. Leviämisen oli 54% pienempi A549-soluja ja 61% pienempi H322 DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluja kuin DE1-K35 /LacZ-transdusoidut solut (

P

0,001; Fig. 3A).

(a) A549 ja H322-soluja transdusoitiin dE1-K35 /LacZ tai dE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI). Seuraavana päivänä, nämä solut inkuboitiin kanssa tai ilman Wnt3a (100 ng /ml). Jälkeen 3 päivää, soluproliferaatiota arvioitiin MTT-määrityksellä (keskiarvo ± SEM). *

P

0,05,

#

P

0,01 vs. käsittelemätön kontrolli kullekin ryhmälle; **

P

0,001 versus DE1-K35 /LacZ-transduktoituja tai PBS-käsitellyt solut. ei riittävä = Ei merkitsevä. (B) A549-soluja käsiteltiin, kuten edellä on esitetty (Fig. 3a). Western blot käyttäen spesifisiä vasta-aineita LRP6, Dvl2, ak- siini, sykliini-D1, tai GSK-3β. (C) A549-soluja kerättiin 6 tunnin kuluttua Wnt3a hoidon. P-Erk1 /2, Erk1 /2, p-PI3K, PI3K, p-Akt, ja Akt proteiinit havaittiin Western blot -analyysillä.

karakterisoimiseksi signalointireiteissä mukana antiproliferatiivisia toiminta sLRP6E1E2, tutkimme sen vaikutuksia kanoninen Wnt signalointia. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, LRP6, Dvl2 ja ak- siini proteiinin tasot ohjaus soluissa (PBS ja DE1-K35 /LacZ) lisäsivät Wnt3a, mutta oli ilmeisesti muuttumattomana Wnt3a in DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluissa. Samoin sykliini D1 ilmentyminen oli hieman lisääntynyt valvonta soluissa Wnt3a stimulaation, mutta hieman laski DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluissa. GSK3p tasot myös näytti olevan hieman vähentynyt jälkeen Wnt3a hoidon.

Wnt on keskeinen rooli lisääntymisessä aktivoimalla Erk1 /2 ja PI3K-Akt reittejä [25]. Siksi tutkimme, sLRP6E1E2 voi downregulate näitä reittejä. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, fosforylaatiota Erk1 /2, PI3K ja Akt sen voimistuvan Wnt3a hoitoa, mutta tasot phorphorylation oli pienempi DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluja verrattuna PBS-käsitellyn ja DE1-K35 /LacZ-transdusoidut solut. Expression of mTOR, PI3K ja Akt ei vaikuttanut Wnt3a stimulointi, ja oli pienempi DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluja kuin valvonnan H460-soluissa (kuvio S3). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että sLRP6E1E2 kiinnostavuus antiproliferatiivinen toimia estämällä Wnt signalointia kautta MEK-ERK ja PI3K- Akt polkuja.

Decoy Wnt Reseptori sLRP6E1E2 indusoi apoptoosia

Wnt signalointi voi ehkäistä apoptoosin ja edistää solujen lisääntymistä ja selviytymistä [26]. Luonnehtia molekyylitason mekanismeja, joilla sLRP6E1E2 estää ei-pienisoluinen keuhkosyöpä proliferaatiota, me arvioitiin vaikutuksia sLRP6E1E2 apoptoosiin. 3 päivän kuluttua DE1-K35 /sLRP6E1E2 transduktion, me havaitsimme, että A549, H1299, ja H358-solut vähitellen irrotettiin viljelymaljasta ja tuli pyöreämpiä ja pienempi kuin kiinnittyneitä soluja (Fig. 4A), mikä viittaa siihen, että sLRP6E1E2 aiheuttamaa apoptoosia. Näyttöä apoptoosin haettiin etsimällä ydin- apoptoottisten kappaleiden (tuloksia ei ole esitetty), ja sitten arvioitiin käyttämällä TUNEL-määritystä havaitsemiseksi internukleosomaalisen DNA: n fragmentoituminen [27]. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, lisää TUNEL-positiivisia soluja havaittiin joukossa DE1-K35 /sLRP6E1E2-transdusoidut solut kuin muun kontrolli-solujen läsnä tai poissa ollessa Wnt3a. Kvantitointi TUNEL värjäys osoitti, että apoptoosin oli noin 1,9-kertainen (ilman Wnt3a) ja 2,8-kertainen (jossa Wnt3a) in DE1-K35 /sLRP6E1E2 transdusoimattomien soluissa kuin DE1-K35 /LacZ transduktoitu- valvonta

(P

0,001) (Kuva. 4C).

(a) Solut transdusoitiin dE1-K35 /LacZ tai dE1-K35 /sLRP6E1E2 at (20 MOI), ja otettiin valokuvia 72 tuntia myöhemmin. Alkuperäinen suurennos, × 200. (B) Detection of sLRP6E1E2 indusoiman apoptoosin TUNEL värjäys. Alkuperäinen suurennos, × 400. (C) kokonaismäärä TUNEL-positiivisia soluja per kentät (keskiarvo ± SEM). *

P

0,05 verrattuna PBS tai DE1-K35 /LacZ käsitelty Wnt3a; **

P

0,001 verrattuna PBS-käsitellyt tai DE1-K35 /LacZ transduktoitu- valvontaa. ei riittävä = Ei merkitsevä. (D) Western-analyysi sLRP6E1E2-välitteistä apoptoosia. H460-soluja transdusoitiin DE1-K35 /LacZ tai DE1-K35 /sLRP6E1E2 (20 MOI). Western blot käyttäen spesifisiä vasta-aineita vastaan, katkaisemattomasta PARP, pilkottiin PARP, pro-kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3, ja sytokromi

c

. (E) H460-solut käsiteltiin kuten edellä (Fig. 4d). Solunosasijaintia sytokromi

c

määritettiin western blot analyysi sytosolin ja mikrosomaalifraktioilla.

seuraava arvioidaan sääntelyviranomaisten apoptoosin, joista kaspaasin perheen ja sytokromi

c

ovat parhaiten karakterisoitu. Puuttuessa ja läsnä Wnt3a, täyspitkän 116-kDa: n PARP-proteiini pelkistettiin ja 85 kDa: n pilkkominen fragmentit lisääntynyt DE1-K35 /sLRP6E1E2-transdusoidut solut (Fig. 4D). Tasot pilkkoa (aktiivinen) muodossa kaspaasi-3 myös merkittävästi kasvanut sLRP6E1E2. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, DE1-K35 /sLRP6E1E2-transdusoidut solut osoittivat myös lisääntynyt soluliman sytokromi

c

ja laski mikrosomaalisia sytokromeja

c

. Stimulaatio Wnt3a tuottivat samankaltaisia ​​vaikutuksia.

Decoy Wnt Reseptori sLRP6E1E2 Estää -tuumoriksenografti Growth

vieressä arvioitiin kyky sLRP6E1E2 estää kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimallissa. Kasvaimet syntyvät ihonalaisella H460 solujen vatsan alue nude-hiirissä. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimääräinen koko 80-100 mm

3, ne injektoitiin PBS, DE1-K35, RdB-K35, DE1-K35 /sLRP6E1E2, tai RdB-K35 /sLRP6E1E2 päivinä 1, 3 ja 5 . Fig. Alkuperäinen suurennus, × 100. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.