Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Dipeptidyylipeptidaasi IV (EY 3.4.14.5) (DPPIV) on seriini peptidaasi osallistuvat solujen erilaistumiseen, tarttuvuus, immuunimodulaatioaktiivisuuksia ja apoptoosin, toimintoja, jotka ohjaavat neoplastisten muutosta. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet muuttunut ilmentyminen ja toiminta kudosten ja kiertävän DPPIV useissa syövissä ja ehdotti sen mahdollisuuksia käyttökelpoisuus varhaisdiagnosointiin peräsuolen syöpä (CRC).

menetelmät ja tärkeimmät havainnot

aktiivisuutta ja mRNA ja proteiini ilmentymistä DPPIV oli takautuvasti analysoitiin adenokarsinoomat, adenoomia, sivullisten peräsuolen limakalvoa ja plasman 116 CRC potilaille Fluorimetristä, kvantitatiivinen RT-PCR ja immunohistokemiallisia menetelmiä. Tulokset korreloivat tärkein klassinen patologisia liittyviä tietoja aggressiivisuutta ja 5-vuoden eloonjäämisluvut. Tulokset osoittivat, että: 1) mRNA-tasot ja aktiivisuuden DPPIV kasvoi peräsuolen kasvaimet (Kruskal-Wallisin testi, p 0,01); 2) Sekä adenoomien ja CRC näkyy positiivinen sytoplasman immuunivärjäysmenetelmällä kanssa luminaali kalvo vahvistaminen; 3) plasmaattiset DPPIV aktiivisuus oli pienempi CRC potilailla kuin terveillä henkilöillä (Mann-U-testiä, p 0,01); 4) plasmaattiset DPPIV aktiivisuus liittyi huonompi yleistä ja taudista vapaan eloon jäämisestä (log-rank p 0,01, Cox analyysi p 0,01).

Päätelmä /merkitys

1) Up-regulation of DPPIV in Kolorektaalituumorien viittaa rooli tämän entsyymin neoplastisen transformaation paksusuolen kudoksiin. Tämä havainto avaa mahdollisuuden uusille hoitotavoitteet näillä potilailla. 2) plasmaattiset DPPIV on itsenäinen ennustetekijä selviytymisen CRC potilaista. Määrittäminen DPPIV aktiivisuustasoa plasmassa voi olla turvallinen, vähän invasiivisia ja edullinen tapa määritellä aggressiivisuus CRC päivittäisessä käytännössä.

Citation: Larrinaga G, Perez I, Sanz B, Beitia M, Errarte P, Fernández A, et al. (2015) dipeptidyylipeptidaasi IV Activity korreloi peräsuolen syövän Ennuste. PLoS ONE 10 (3): e0119436. doi: 10,1371 /journal.pone.0119436

Academic Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 07 syyskuu 2014; Hyväksytty: 14 tammikuu 2015; Julkaistu: 19 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Larrinaga et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Baskimaan hallituksen (IT8-11 /13), University of Baskimaan UPV /EHU (UFI 11/44), ja Gangoiti Barrera Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CRC on kolmas yleisin maligniteetti miehillä ja naisilla Yhdysvalloissa, jossa on yli 136500 arvioitu uutta tapausta ja yli 50000 arvioitua kuolemaa vuonna 2014 [1]. Eurooppa ja muut kehittyneet alueet osoittavat samaa vauhtia ilmaantuvuuden ja kuolleisuuden [2]. Perinteisesti liittyvät ruokailutottumuksiin [3], sen taajuus on kasvanut tasaisesti viime vuosikymmeninä länsimaissa seurauksena moderni tyyli elämän tulla terveysongelma on suuri huolenaihe. Valtavat resurssit ovat investoineet ennaltaehkäisyyn ja varhaiseen diagnosointiin tämän taudin. Väestöpohjainen seulonta kampanjoita yrittää löytää niin paljon varhain kasvaimet ja esiasteleesioita mahdollisimman tavoitteenaan vähentää taudin esiintyvyyden, yksinkertaistaa potilaiden kliinisessä hoidossa, kun vaurio kehittyy, ja parantaa selviytymistä.

Vuodesta patologinen näkökulmasta adenomatous vaurioista paksusuolessa on täysin hyväksytty esiasteita CRC [4,5] ja adenooma-karsinooma sekvenssi tarjoaa edelleen vankka malli tutkimusta syövän synnyn [6]. Kuitenkin suuri määrä solun aineenvaihduntaan vielä juurikaan tunneta osallistuvat alkuperä ja kehitys neoplastisten prosessien [7].

peptidaasien keskeisessä asemassa syövän syntymistä useilla tavoilla, esimerkiksi säännellä bioaktiivisia peptidejä, jotka ovat ratkaiseva neoplastista kasvua ja immuunivasteen, hajottavat solunulkoisen matriksin, joka toimii adheesiomolekyylit tai osallistumalla solunsisäiseen signalointiin [8]. Lisäksi jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että toimintaa ja näiden entsyymien ilmentymää vaihtelevat eri kasvaimissa riippuen useita patologisia muuttujia, kuten histologinen Grade, Stage, ja potilaan eloonjääminen [8-12]. Tästä syystä peptidaasit ovat käyttökelpoisia välineitä kehitettäessä kliinistä strategioiden hoidon ja seurannan syöpäpotilailla.

Dipeptidyylipeptidaasi IV (EY 3.4.14.5) (DPPIV), joka tunnetaan myös cluster eriyttämisen antigeeni CD26 , on seriini peptidaasin ilmaistaan ​​eri soluihin, kuten epiteeli-, endoteeli- ja lymfosyytit [13]. Kuten muut membraaniin sitoutunut glykoproteiineja, se voidaan myös vapauttaa aktiivisessa muodossa kehon nesteitä, kuten plasmaa, seerumia ja virtsaa [14]. DPPIV lohkaisee N-terminaalin dipeptidejä valikoiduista bioaktiivisia peptidejä kuten jotkut sytokiinien, kemokiinien ja neuropeptidit johtaa niiden poistoa ja /tai hajoamista. Riippumaton sen entsymaattinen aktiivisuus, DPPIV vuorovaikutuksessa soluväliaineen (ECM) komponentteja, mukaan lukien kollageenin ja fibronektiinin, siten säätelemällä solu-solu- ja solu-ECM vuorovaikutusta, ja jossa on useita reseptorit ja proteaasit, joka johtaa eritykseen matriksimetalloproteaaseja (MMP). Näiden useita toimintoja, DPPIV säätelee erilaisten biologisten prosessien kuten solujen erilaistuminen, adheesio, immuunimodulaatioaktiivisuuksia ja apoptoosin, toimintoja, jotka ohjaavat neoplastisen transformaation [13].

Monet tutkimukset ovat kuvanneet, että DPPIV ilmaisun ja toimintaa on merkittävästi muuttunut useassa kiinteä kasvain kudosten ja että nämä muutokset liittyvät kasvaimen, vaihe ja potilaiden 5 vuoden pysyvyys, jotka viittaavat tämän entsyymin mahdollisena diagnostinen työkalu ja terapeuttinen kohde [12,13,15]. Lisäksi on osoitettu, että veren DPPIV tasot ovat huomattavasti alhaisemmat syöpäpotilailla kuin terveillä henkilöillä, päätelmä on tullut suurta mielenkiintoa kehittää lisää kasvainmerkkiaineet [14,16-19].

Mitä CRC, kahteen tuoreeseen tutkimukseen kuvattu, että korkeampi immunohistokemiallinen ilmentymistä DPPIV CRC kudoksissa korreloi etäpesäkkeitä ja huonompi eloonjäämisaste CRC potilaista [20] ja että kiertävä DPPIV tasot korreloivat etäpesäkkeenä CRC [21]. Me ja muut ryhmät kuvataan myös, että ilmaisu ja aktiivisuuden profiilia muiden seriini peptidaasien liittyvät DPPIV vaihtelevat ympäri adenooma-adenokarsinooma sekvenssi ja jotka ovat itsenäisesti korreloivat eloonjäämisen CRC potilaiden [22-26]. Kaikki nämä kertyneet todisteet osoittavat analyyseja seriinin peptidaasien kuten DPPIV lupaavina työkaluja suunnitella uusia diagnostisia /prognostisia biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita CRC [14,20-26].

Tässä yhteydessä esillä olevan työn tarkoituksena oli tutkia prospektiivisessa tavalla metabolisen ja ilmaisun profiilit DPPIV potilailla, joilla on CRC analysoimalla kudosta adenooma-adenokarsinooma sekvenssin ja plasmanäytteet, ja korreloida saadut tulokset klassisella histopatologista parametrit kasvain ennustetta ja eloonjääminen .

Materiaalit Menetelmät

Kirjoittajat julistaa, että kaikki kokeet suoritettiin tässä tutkimuksessa noudattavat nykyisiä Espanjan ja Euroopan unionin lain määräysten. Näytteet ja data potilailta mukana tässä tutkimuksessa toimittivat Baskimaan Biopankkiverkosto tutkimuksen-OEHUN (www.biobancovasco.org). Kaikki potilaat ilmoitettiin mahdollisesta käytöstä tutkimuksen niiden kirurgisesti toistoleikattiin kudoksiin, ja hyväksynyt tähän mahdollisuuteen allekirjoittamalla tietyn asiakirjan hyväksymän eettisen ja tiedekomiteoiden Baskimaan Public Health System (Osakidetza) (CEIC 11/51).

potilaat

kaikkiaan 116 potilasta, joilla CRC prospektiivisesti mukana tutkimuksessa. Kaikki potilaat saivat osittaisen koolonin poistot. Topografinen jakelu oli 41 oikeanpuoleinen CRC, 51 vasen yksipuolista ja 24 peräsuolesta. 7 potilasta sai leikkausta edeltävän hoidon 49 potilaat saivat kemoterapiaa tai kemosädehoidon jälkeen resektio, ja 60 potilasta eivät saaneet mitään hoitoa.

20 potilasta, sekä adenomatous ja adenocarcinomatous polyyppeja diagnosoitiin. 13 adenoomia olivat putkimainen, 6 olivat tubulovillous adenoomia, ja 1 villous adenooma. Lisäksi 16 osoitti lievää tai kohtalaista dysplasiaa ja 4 osoitti korkealaatuista dysplasia. Keskikoko oli 2.1cm (vaihteluväli 0.6-4cm). Nämä 20 tapausta käytettiin analysoimaan DPPIV aktiivisuutta ja mRNA /proteiinin ilmentymisen koko normaalin limakalvon-adenooma-adenokarsinooman järjestyksessä.

Amerikkalainen sekakomitea Cancer järjestelmä (AJCC, 7

th edition) [27 ] on sovellettu määrittää Stage ja Grade. Seuranta suljettiin 30. kesäkuuta 2014. Tuolloin 43 potilasta (37%) oli kuollut tautiin. Keskimääräinen seuranta-aika oli 53 kuukautta (vaihteluväli 4-88).

Plasma kerättiin myös ennen leikkausta ja analysoitiin 98 näistä potilaista. Plasma 72 terveillä vapaaehtoisilla, joilla ei ole sairastaneet neoplastisten sairauksien käytettiin kontrollina näyte.

Kliiniset tiedot mukana tutkimuksessa haettiin potilaasta kliiniset tiedot ja on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

kudosnäytteiden

Kirurginen resektio jätetty

tuoreeseen

sen patologian Lab kuluessa 30 minuutin poiston jälkeen. Aineisto Tämän tutkimuksen tulee ylimääräistä kudosta patologisen diagnoosin. Käsittely yksilöiden suoritettiin seuraavia tavanomaisia ​​protokollia hallintaan kirurginen asemointia paksusuolen ja peräsuolen [28]. Kasvaimen ominaisuudet olivat kirjattu brutto tarkastus ja valitut fragmentit kasvaimen ja muiden kasvainten kudokset jäädytettiin isopentaanin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Rutiini menettelyjen Patologian Lab mukana formaliinilla kiinnittynyt kirurgisen näytteen ja parafiiniupotusta kudoksen fragmentit valittu histopatologista tutkimusta. Histologinen Objektilasit värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla. Lisäksi ääreislaskimoiden verinäytteet 98 näistä potilaista saatiin ennen leikkausta ja sentrifugoitiin 1500 rpm 15 minuutin ajan. Saatu plasma säilytettiin myös -80 ° C: ssa. Entsyymianalyysi on tehty plasmasta saadun 72 terveillä vapaaehtoisilla (täsmäsi sukupuolen ja iän mukaan).

Näytteen valmistus

irrotetut kasvaimen homogenisoitiin 10 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, 30 sekuntia nopeudella 800 rpm käyttäen Heidolph PZR 50 Selecta homogenisaattorilla, ja ultrasentrifugoitiin on Centrikon T-2070 Kontron Instruments laitteessa 100,000

g

35 minuuttia. Saastumisen estämiseksi liukoinen entsyymejä, tuloksena pelletit pestiin kolme kertaa suspendoimalla 10 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,4. Sitten pelletit homogenoitiin 10 mM Tris-HCl-puskuria pH 7,4, ja sentrifugoidaan alhaisella nopeudella (1500

g

) 3 min puhdistamiseksi näytteistä. Supernatantit Näin saadut käytetään määrittämään DPPIV aktiivisuuden ja proteiinin pitoisuuksia. Kaikki edellä mainitut vaiheet suoritettiin 4 ° C: ssa.

DPPIV toiminnan mittauksia

DPP IV: n aktiivisuutta mitattiin kolmena kappaleena käyttäen H-Gly-Pro-β-naftyyliamidi substraattina, jälkeen modifioitu versio menetelmästä Alponti et al. [29]. Määritys perustuu fluoresenssin tuotteiden syntyvät substraatin hydrolyysi entsyymin. Reaktiot aloitettiin lisäämällä 30-50 ui näytettä 1 ml: aan sopivan inkuboinnin seosta (50 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, ja 0,2 mM aminoasyyli-β-naftyyliamidi). 30 min inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, 1 ml 0,1 M natriumasetaattia (pH 4,2) lisättiin seokseen reaktion lopettamiseksi. Annosteltu tuote määritettiin mittaamalla fluoresoiva intensiteetti Shimadzu RF-540 Spectrofluorophotometer (viritys- ja emissioaallonpituudet olivat 345 ja 412 nm, vastaavasti). Aihiot käytettiin määrittämään taustafluoresenssi. Suhteellinen fluoresenssi muutettiin pikomoolia tuotteen käyttäen standardikäyrää rakennettu kasvavien pitoisuuksien kanssa β-naftyyliamiini.

Jos haluat varmistaa, että muodostumista β-naftyyliamiini (β-NA) johtui toiminnan DPPIV ja ei johdu muiden entsyymien, suoritimme inhibitioanalyyseissä CRC kudoksen ja plasman tietyllä estäjä (diprotiini A, 0,2 mM). Vapauttamalla β-NA lähinnä inhiboivat peräsuolen kudosten (82%) ja plasman näytettä (86%).

Proteiinipitoisuus mitattiin kolmena kappaleena Bradfordin menetelmällä [30], käyttäen BSA: ta (1 mg /ml) kuin kalibraattori. Tulokset CRC kudosten ja plasmanäytteistä kirjattiin yksikköä peptidaasi per milligramma proteiinia (UP /mg prot) ja litrassa plasmaa (UP /L), vastaavasti. Yksi yksikkö peptidaasiaktiivisuus (UP) on se määrä entsyymiä, jota tarvitaan vapauttamaan yksi pmol β-naftyyliamiini per minuutti. Fluorogenic määritykset olivat lineaarisia suhteen hydrolysointiaika ja valkuaispitoisuus.

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudosta 20 CRC, adenomatous polyypit ja mitäänsanomattoman ympäröivän limakalvon immunovärjättiin monoklonaalisella spesifistä vasta-ainetta DPPIV /CD26 (Novus Biologicals NB 100-59021, kanin anti-humaani, työskentely laimennus 1: 250). Immunovärjäyksen prosessi suoritettiin seuraava rutiinimenetelmiä automaattisella immunostainer (Dako Autostaineriin Plus). Lyhyesti, endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla liukuu 3% vetyperoksidilla absoluuttista metanolia 10 minuutin ajan. Antigeeni haku suoritettiin sitraattipuskurissa (10 mM, pH = 6), 15 minuutin ajan 100 ° C: ssa mikroaaltouunissa. Ensisijainen vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Myöhempi reaktio suoritettiin sekundääristen vasta-aineiden ja biotiini-free-HRP entsyymillä leimattu polymeeri EnVision-Flex havaitsemisjärjestelmä (Dako, Carpinteria, CA). Epäspesifinen IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Positiivinen reaktio visualisoitiin diaminobenzydine ratkaisu seurasi counterstaining hematoksyliinillä.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

ilmentyminen

DPP4

, geeni, jotka koodaavat DPPIV , analysoitiin kudokseen 20 CRC, adenomatous polyypit ja uninvolved ympäröivän limakalvon. Hajoamisen välttämiseksi, kudosleikkeet upotettiin RNAlater heti leikkauksen jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käsittelyyn asti. Kokonais-RNA uutettiin 20 mg kudosta käyttäen TriReagent (Sigma, St. Louis, MO). RNA-näytteitä inkuboitiin sitten RNase-free DNaasi I ja RNasin (Promega, Madison, WI), jäljelle jääneen genomista DNA: ta. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 5 ug kokonais-RNA: ta kunkin ihmisen näytteestä käyttäen ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi kit (Roche, Mannheim, Saksa). Tuloksena cDNA Näytteet monistettiin PCR erityisiä oligonukleotidialukeparit suunniteltu analysointiohjelmisto Primer 3 ja syntetisoi Sigma-Genosys (Cambridge, UK). Perustuen edelliseen kokeita ihmisen munuaissyövän [15], CRC [12] ja muita ihmiskudoksia [31] valitsimme glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

), polymeraasi (RNA) II (DNA- Ohjaaja) polypeptidi A (

POLR2A

), hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin 1 (

HPRT1

), β-aktiini (

ACTB

), sukkinaattidehydrogenaasi monimutkainen, alayksikkö A (

SDHA

), TATA sitova proteiini (

TBP

) ja peptidylprolyl isomeraasi A (

PPIA

) endogeenisinä viite geenejä. Sekvenssin monistamiseen käytetyt alukkeet

DPP4

ja seitsemän siivous geenit on esitetty taulukossa 2.

ilmentyminen

DPP4

ja siivous geenit oli määrällisesti kaikki cDNA reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen iCycler iQ reaaliaikainen havaitseminen laite (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Kokeet suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [12,15,32]. Laimennoksia cDNA-templaattia valmistettiin kussakin kudoksessa ja monistettiin kolmena kappaleena käyttäen SensiFAST SYBR Mix (Bioline Ltd., Lontoo, Iso-Britannia). Kolme negatiiviset kontrollit (ei mallia, ei käänteiskopioijaentsyymiä eikä RNA käänteistranskriptaasireaktio) olivat mukana myös jokaiselle levylle havaitsemiseksi mahdollista saastumista. Kun kuuma aloitus (10 min 94 ° C: ssa), parametrit PCR-monistukseen käytettiin olivat: 10 s 94 ° C: ssa, 20 s 60 ° C: ssa ja 30 s 72 ° C: ssa, 50 sykliä.

Reaaliaikainen PCR data ilmaistiin kertamuutos kohdegeenin ilmentymisen suhteen geometrinen keskiarvo (gM) mRNA: n ekspressio on housekeeping geenien kussakin näytteessä, kuten ovat kuvanneet Vandesompele et al. [33]. Taitteen muutos geenien ilmentyminen laskettiin kaavalla: 2

-ΔΔ C

T, jossa C

T on kynnys syklin laskema iCycler ohjelmisto, ACk

T = (C

Ttarget geeni-C

Tg.m.reference geenejä) ja ΔΔC

T = (ACk

tTest näyte-ACk

Tcontrol näyte).

näytteet saman potilaan olivat aina mitattiin samalla analyyttinen ajaa jättää väliin aikavälin vaihteluita. PCR saadut tiedot yhdessä tavanomaisen CRC-näytteet valittu mielivaltaisesti kontrollina, ja tämä näyte oli kaikissa PCR-kokeita korjata mahdolliset interassay muunnelmia.

Tilastollinen analyysi

Kolmogorov-Smirnov ja Shapiro-Wilk testit sovellettiin saatuihin kudos- ja plasmanäytteistä vastaavasti tietää, jos numerot seuraa tai ei seuraa normaalijakaumaa. Näiden tietojen perusteella (p 0,05), DPPIV aktiivisuus kudoksessa ja plasmassa analysoitiin parametritonta koettimilla: Mann-Whitney testi ja Kruskal-Wallisin testiä käytetään havaitsemaan erot kahden tai kolmella ryhmällä, vastaavasti.

Lopuksi Kaplan-Meier käyrät ja log-rank-testi suoritettiin arvioimaan yhdistyksen välillä DPPIV aktiivisuus ja 5-vuoden pysyvyys, vertaamalla ryhmiä luoma cut-off pistettä vastaanotin toimineiden (ROC) käyriä. COX regressiomallin käytettiin testaamaan riippumattomia vaikutuksia kliinisten ja patologisten muuttujien ja DPPIV toimintaa eloonjäämiseen. SPSS® 21,0 ohjelmistoa käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Tulokset

DPPIV aktiivisuuden ja ilmentymisen peräsuolen kudoksissa CRC potilaista

Kun DPPIV aktiivisuus analysoitiin koko peräsuolen adenoma- adenokarsinooma järjestyksessä, korkeampi aktiivisuus havaittiin CRC ja adenoomia kuin viereisessä uninvolved limakalvon (Kruskal-Wallisin testi, p = 0,015).

DPP4

mRNA ilmaisu oli saman suuntainen, korkeasti molemmissa kasvaimet kuin ei kasvainkudoksessa (Kruskal-Wallisin testi, p = 0,001). Nämä tulokset on esitetty taulukossa 3.

Kun tiedot stratifioitiin topografinen jakelu CRC, emme löytäneet mitään merkittävää eroa (Kruskal-Wallisin testi, p = 0,965). Tissue DPPIV aktiivisuus oli samanlainen potilailla, jotka saivat ennen leikkausta hoitoa, leikkauksen jälkeinen hoito ja potilaiden, jotka eivät saaneet mitään hoitoa jälkeen resektio (Kruskal-Wallisin testi, p = 0,842).

Kuva. 1 esittää immunohistokemiallista ilmentymistä DPPIV paksusuolen adenokarsinooma, adenooma ja normaali vieressä limakalvolla. Normaali limakalvo ei ilmaissut DPPIV immunovärjäyksen. Kuitenkin molemmat adenoomia (putkimainen, tubulovillous ja villous) ja CRC näkyvissä positiivisia sytoplasman immuunivärjäysmenetelmällä kanssa luminaaliselle kalvo vahvistaminen. Tulehduksellinen komponentti kaikissa tapauksissa oli myös positiivinen.

DPPIV immuunivärjäystä sijaitsee sytoplasmassa adenoomien ja CRC soluilla luminaaliselle kalvo vahvistaminen.

Tissue DPPIV toiminnan mukaan 5 vuoden selviytymisen ja patologisten ominaisuuksien

Voit selvittää paras cut-off-arvot yleistä (OS) (Fig. 2A) ja taudista vapaan eloonjäämisen analyysit (DFS) (Fig. 2B), ROC käyrät tehtiin. Kudosten DPPIV aktiivisuutta, 2600 UP /mg proteiinia rajakohtaa osoitti optimaaliset herkkyys ja suhteet (Se = 47% ja Sp = 55% OS, ja Se = 48% ja Sp = 55% DFS) (kuvio . 2A ja 2B).

Optimal herkkyys ja suhteet havaittiin käyttäen seuraavia raja-arvo: 2600 UP /mg prot kudosta DPPIV toiminnan OS (A) ja DFS (B).

Kaplan-Meier käyrät ja log-rank-testi osoitti, että viiden vuoden OS ja DFS sairastavien potilaiden CRC ei korreloi kudoksen DPPIV aktiivisuutta (log-rank testi, p = 0,8 OS, ja p = 0,67 DFS) (Fig. 3A ja 3B, vastaavasti).

Kokonaiselossaoloaika (A) ja taudista vapaan eloonjäämisen käyrät (B) CRC potilaiden mukaan niiden kasvaimen DPPIV aktiivisuutta kuvio. Potilaiden määrä vaarassa kussakin ryhmässä yksittäisinä ajankohtina on myös mukana.

Samoin kerrostuminen DPPIV aktiivisuuden useat patologisen muuttujia ei heittää mitään tilastollisesti merkittävää tulosta (taulukko 4).

DPPIV aktiivisuus plasmassa näytteissä CRC potilaista

plasmasta CRC potilaista DPPIV aktiivisuus oli merkitsevästi pienempi kuin terveillä henkilöillä (175 ± 7,2 UP /l vs. 218 ± 10,1 UP /L, Mann-Whitneyn testi p 0,01) (Fig. 4). Kuitenkin kerrostuneisuus tietojen mukaan patologisia muuttujia ei saatu merkittävä tulos (taulukko 5).

Arvot ovat keskiarvoja ± SE yksiköitä peptidaasiperheen litrassa plasmaa (UP /l). (*) Studentin t-testillä, p 0,01.

plasmanäytteistä ROC käyrät tehtiin sekä DPPIV aktiivisuuden ja syöpä -antigeeni (CEA) tasot. Sillä plasmaattiset DPPIV toimintaa, 165 UP /L raja-arvo osoitti optimaaliset herkkyys ja suhteet (SE = 64% ja Sp = 63% OS, ja Se = 65% ja Sp = 58% DFS) (Fig. 5A ja 5B). Cut-off-arvo on 5 ng /ml CEA, jonka tiedetään olevan prognostinen vaikutus CRC [34], osoitti pienempi herkkyys (44% OS, ja 39% DFS), mutta suurempi spesifisyys (68% OS , ja 64% DFS) kuin DPPIV (Fig. 5A ja 5B).

Optimal herkkyys ja suhteet havaittiin käyttäen seuraavia raja-arvo: 165 UP /l plasman DPPIV toimintaa sekä OS ( A) ja DFS (B). Cut-off-arvo on 5 ng /ml CEA, osoitti pienempi herkkyys mutta suurempi spesifisyys kuin DPPIV.

Kaplan-Meier käyrät ja log-rank-testi osoitti, että sekä OS (Fig. 6) ja DFS (Fig. 7) on käänteisesti verrannollisia plasmassa DPPIV aktiivisuutta. Niinpä, kun plasman DPPIV aktiivisuus oli suurempi kuin 165 UP /l OS ja DFS oli merkitsevästi huonompi (log-rank p = 0,009 ja = 0,018, vastaavasti) (kuviot. 6A ja 7A).

(A) Kaplan-Meier käyrä ja log-rank-testi. (B) monimuuttuja-analyysi ennusteeseen viittaavia muuttujien ja plasman DPPIV toiminnan ennakoinnissa OS. Potilaiden määrä vaarassa kussakin ryhmässä yksittäisinä ajankohtina on myös mukana.

(A) Kaplan-Meier käyrä ja log-rank-testi. (B) monimuuttuja-analyysi ennusteeseen viittaavia muuttujien ja plasman DPPIV toiminnan ennakoinnissa DFS. Potilaiden määrä vaarassa kussakin ryhmässä yksittäisinä ajankohtina on myös mukana.

Toisaalta, monimuuttuja-analyysi osoitti, että plasman DPPIV aktiivisuutta (p = 0,001), histologinen luokka (p = 0,02 ) ja paikallinen invaasio (p = 0,01) olivat riippumattomia vaikuttavia tekijöitä potilaan OS (Fig. 6B), ja että plasman DPPIV aktiivisuutta (p = 0,005), verisuonten invaasio (p = 0,02) ja ryhmitellään vaihe (p = 0,02) olivat riippumattomia ennustetekijöiden tekijät DFS (Fig. 7B).

keskustelu

pahanlaatuisiksi normaalista syöpäkudokseen liittyy solun pinnan glykoproteiinin muutoksia. Nämä fenotyyppiset muutokset voivat ratkaisevassa asemassa kasvaimen synnyssä ja voi olla hyödyllistä tuumorimarkkereina erottavien pahanlaatuinen hyvänlaatuisesta kudoksista [8]. Mitä CRC, kasvain-karsinooma järjestyksessä paksusuolessa kuvailee, että asteittainen eteneminen normaalista dysplastic epiteelin, ja siten karsinooma, on seurausta peräkkäisten geneettisten mutaatioiden, jotka johtavat muuttuneeseen tasoilla useita glykoproteiineja, kuten jotkut peptidaasit [6,8].

ensimmäinen asiaa tulos tutkimuksessamme oli DPPIV osoittivat suurempaa aktiivisuutta ja mRNA tasot esineoplastiset adenomatoottisen vaurioita ja CRC verrattuna sivullisten ympäröivän limakalvon, vaikka se ei korreloinut patologinen muuttujat ja 5-vuoden pysyvyys CRC potilaista. Aiemmin on raportoitu, että aktiivisuus ja ilmaisun kahden muun seriini peptidaasit, fibroblasti aktivointia proteiini alfa (FAP) ja prolyyli endopeptidaasilla (PEP), oli suurempi adenoomien ja alkuvaiheessa CRC vastaavasti [22,24]. Lisäksi FAP ilmaisu korreloi elinajan [22,23] ja PEP toimintaa teki sen paremmin yleistä ja tautivapaan elinajan [25]. Vaikka nämä erilaiset vaikutteet CRC ennusteeseen antaa erilaisia ​​vaikuttavia roolia näissä seriini peptidaaseja tässä sairaudessa, ilmaisun ja aktiivisuus kasvaa näiden peptidaasien neoplastisten ja esineoplastiset kudokset olisi otettava huomioon suunniteltaessa uusia hoitomenetelmiä ja peräsuolen syöpä.

Koska sen muuttujalauseke kiinteisiin kasvaimiin ja sen monipuolinen biologisiin toimintoihin, tarkkaa roolia, DPPIV pelaa syöpä on vielä selvittämättä. On kuvattu, että DPPIV voivat joko edistää tai estää kasvainten kehittymistä riippuen tietyntyyppistä kasvain tai kehitysvaiheessa kasvain on [13]. Tämä ilmiö kasvainspesifisyys esitetään käytännön vaikeuksia haettaessa peptidaasi-inhibiittorit syövän hoitomuotoja, ja tässä vaiheessa on aktiivisesti tutkitaan nykyään [35,36]. Uusi suuntaus tähän aiheeseen muodostuu käytön sytotoksisen aihiolääkkeiden mahdollisuus aktivoida erityisiä peptidaasien ainoastaan ​​silloin, kun nämä peptidaasit ovat aktiivisempia tai hyvin ilmaisi, jonka tarkoituksena on vahingoittaa vainsolukasvun muuttamatta entsyymin toiminnot [35,36]. Jotkut tutkijat työskentelevät aihiolääkkeitä FAP tavoitteeksi [35]. Koska sen homologinen DPPIV on myös erittäin aktiivinen adenoomien ja CRC, ehdotamme, että tämä seriini peptidaasi voi olla kohteena vastaavien aihiolääkkeiden.

solupinnan glykoproteiineja voidaan vapauttaa solunulkoiseen tilaan, näkyvät erilaisissa kehon nesteistä ja ovat hyödyllisiä seerumin tai plasman biomarkkereita auttavat seulontaan, diagnosointiin, lavastus, ennustetta ja seurantaa syövän hoidossa. Tärkein esimerkki kliinisessä seuraavassa CRC potilaista on syöpä -antigeeni (CEA) [34]. Kuitenkin analyysi DPPIV plasmassa tai seerumissa näistä potilaista on osoittautunut luotettavaksi menetelmä varhaiseen toteamiseen CRC, joka täydentää Classic verta ulosteessa tentti ja muiden seerumin biomarkkerit, jotka ovat kliinisessä tutkimuksessa nykyään [14, 17-20].

Useat kirjoittajat [14,17,19] ovat kuvanneet pienennyksen verenkierrossa DPPIV CRC potilailla verrattuna terveisiin koehenkilöihin. Lisäksi kasvaa tämän entsyymin on havaittu seerumissa metastaattisen

vs

. non metastaattinen potilaat [14,17,19,20]. Nämä tiedot saatiin immunodetektioon, mikä viittaa sen mahdollisuudet käyttökelpoisuutta varhaisen diagnoosin ja kliinistä seurantaa. Olemme myös havainneet, että aktiivisuus DPPIV mitattuna Fluorimetristä menetelmillä oli merkittävästi vähentynyt plasmassa CRC potilaista. Sen sijaan, huomasimme, että tämä toiminta ei korreloi metastaattinen asema tai minkä tahansa muun patologisen muuttuja.

korkea erot potilaiden määrä ryhmien välillä ja ilman etäpesäkkeitä voi olla alkuperästä tämän osittaisen ristiriita. Muut syyt olisi myös otettava huomioon, koska se on kuvattu, että useat biologiset ilmiöt voivat vaikuttaa aktiivisuuteen kiertävän DPPIV /CD26 vaikuttamatta proteiinin tasolla. Tässä mielessä läsnä verenkierrossa molekyylejä, jotka muuttavat tämän entsyymin aktiivisuutta on raportoitu [37,38]. Nazarian et ai. [38] ovat osoittaneet hyvin tuoreessa tutkimuksessa että metastaattinen eturauhassyöpä potilaista vähentynyt kiertävä DPPIV aktiivisuuden kun taas proteiinin tasot olivat samanlaisia ​​suhteen potilailla, joilla oli paikallinen primaarikasvaimen. Tämä havainto viittasi kiertävän pienen peptidin yksi mahdollinen syy eston [38] ja avaa uusia näkökulmia lisätutkimuksia selvittämään mahdollisia hyödyllisyyttä yhdistetty analyysi DPPIV aktiivisuuden ja proteiinin tasot seerumissa /plasma syöpäpotilaita.

Koska plasman tasoja ja toiminnasta PEP ja FAP on myös korreloi selviytymisen CRC potilaiden [19,25], päätavoitteena meidän oli analysoida prospektiivisesti korrelaatiota plasman aktiivisuus sen homologisen DPPIV ja 5 vuoden pysyvyys potilaista. Tiedot osoittivat, että potilailla, joilla on korkeampi plasman DPPIV toiminta oli huonompi yleistä ja taudista vapaan eloonjäämisen. Nämä tulokset osoittivat parempaa herkkyyttä mutta huonommin spesifisyys kuin ne, jotka saatiin CEA. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että DPPIV on itsenäinen ennustetekijä vaikuttavista CRC potilaan selviytymistä. Siksi on olemassa vakuuttavia todisteita siitä, että määrittäminen kiertävän DPPIV voi olla apua varhaisessa diagnosoinnissa [14,17-19,21] ja myös ennustetta CRC.

alkuperä kiertävän DPPIV sairastavilla potilailla syöpä on kiistanalainen kysymys. Nykyinen hypoteesit sijoittaa sen alkuperä maksassa ja immuunijärjestelmän solut [14] ja kasvaimen mikroympäristössä [8,14,19,38]. Me tehdään immunohistokemiallista analyysiä koko adenooma-karsinooma sekvenssi tietää sijainti DPPIV että peräsuolen kudoksiin. Non neoplastisia soluja paksusuolen limakalvon ei tahraa kanssa DPPIV. Sen sijaan, adenooma ja CRC-solut osoittivat positiivisia sytoplasmista immuunivärjäysmenetelmällä kanssa luminaaliselle kalvo vahvistaminen. Tämä immunohistokemiallinen kuvio yhtyy suurempi aktiivisuus ja mRNA-tasot olemme myös löydetty kasvaimet. Lisäksi olemme huomanneet, immunovärjäys kanssa DPPIV on tulehdussolujen lamina propria normaaleissa ja neoplastisissa limakalvo. Tämä havainto saattaa olla osoitus että DPPIV vapautuu sekä immuunijärjestelmän ja neoplastisten solujen CRC.

Yhteenvetona esillä tutkimus osoittaa, että DPPIV on säädellään ylöspäin adenomatoottisen ja CRC kudoksissa verrattuna uninvolved limakalvon. Plasmaattiset DPPIV aktiivisuus on pienempi kuin terveillä koehenkilöillä ja on itsenäisesti liittyy huonompi 5 vuoden pysyvyys in CRC potilailla. DPPIV aktiivisuus määritys plasmassa on turvallinen, vähän invasiivisia ja edullinen menetelmä, ja se voi täydentää määrittämiseksi CD26-proteiinin tasot CRC potilailla. Uudet tutkimukset suuremmilla määrä potilaita, kerätä ennen leikkausta ja leikkauksen jälkeisiä plasmanäytteiden useissa aikapisteissä [21], olisi suoritettava vahvistaa ennustearvo Näiden tulosten diagnostisia aikaa ja aikana potilaiden seurannan.

Kiitokset

Haluamme kiittää Arantza Pérez (UPV /EHU) hänen tekninen panos tämän tutkimuksen ja professori Juan Bilbao (UPV /EHU) hänen tilastollista tukea.