Krooninen sairaus

tiivistelmä

Paklitakseli on merkittävä rooli hoidossa munasarjasyöpä; kuitenkin, vastustuskykyä paklitakseli havaitaan usein. Niinpä uusi hoito, joka voi voittaa paklitakseli vastustus on merkittävää kliinistä merkitystä. Arvioimme antiproliferatiivisia vaikutusten antimitoottista ja antivaskulaarinen agentti BPR0L075 paklitakselin kestävä munasarjasyöpäsoluja. BPR0L075 näyttää voimakas ja laaja-alaista sytotoksisuutta alhaisilla nanomolaarisina pitoisuuksina (IC

50 = 2-7 ​​nM) vastaan ​​sekä vanhempien munasarjasyöpäsoluja (OVCAR-3, SKOV-3, ja A2780-1A9) ja paklitakselilla kestävä alalinjoja ( OVCAR-3-TR, SKOV-3-TR, 1A9-PTX10), riippumatta siitä, ilmentymisen tasojen monilääkeresistenttisyyden transporter P-gp: n ja luokan III β-tubuliinia tai mutaatio β-tubuliinia. BPR0L075 estää solusyklin G2 /M-vaiheen paklitakseli-resistentit solut, kun taas yhtä suuri pitoisuus paklitakselihoidolla oli tehoton. BPR0L075 indusoi solukuoleman kaksi mekanismia vanhempien ja paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja. Vuonna emosoluista (OVCAR-3 ja SKOV-3), BPR0L075 indusoi apoptoosin, osoittaa poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkoutumisen ja DNA-tikkaat muodostumista. BPR0L075 solukuolema paklitakselin kestävä munasarjasyöpäsoluja (OVCAR-3-TR ja Skov-3-TR) johtuu pääasiassa mitoottisiin katastrofin, osoituksena muodostumista jättiläinen, monitumaiset solut ja ilman PARP pilkkominen. Immunoblottaus analyysi osoittaa, että BPR0L075 indusoi ylössäätöä sykliini B1, bubR1: tä, MPM-2, ja Surviviiniproteiini tasoja ja Bcl-XL fosforylaatiota vanhempien soluissa; kuitenkin resistentit solut, endogeeninen ilmauksia bubR1: tä ja surviviinin loppuivat, BPR0L075 hoito ei onnistunut indusoimaan MPM-2 ilmaisun ja Bcl-XL. BPR0L075 solukuolema sekä vanhempien ja paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja etenevät kaspaasi-3: riippumattomien mekanismien. Lopuksi BPR0L075 näyttää voimakas sytotoksinen vaikutuksia munasarjasyövän solujen mahdollisesti voittaa paklitakselia vastustus ohittamalla efflux kuljettajat ja asiakkuutta mitoottisiin katastrofin. BPR0L075 edustaa uutta mikrotubulusten terapeuttinen voittaa monilääkeaineresistenssin ja laukaista vaihtoehtoisia solukuoleman mitoottista katastrofi munasarjasyöpäsoluja jotka ovat apoptoosin kestäviä.

Citation: Wang X, Wu E, Wu J, Wang TL, Hsieh HP Liu X (2013) Lentotoiminnan antimitoottiset ja antivaskulaarinen Agent BPR0L075 voittaa monilääkeaineresistenssin ja indusoi Mitoottista luonnonkatastrofi Paklitakseli hylkivät munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (6): e65686. doi: 10,1371 /journal.pone.0065686

Editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 marraskuu 2012; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2013; Julkaistu: 06 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy (X. Liu). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä, kaikkein vaarallisin maligniteetti on gynecologic syöpä, aiheuttaa vuosittain yli 14000 Yhdysvalloissa ja 114.000 maailmanlaajuisesti kuolemia. Huolimatta edistysaskeleet diagnostiikassa ja hoidossa, viiden vuoden eloonjäämisaste vaiheessa IV potilailla on noin 18% [1], [2]. Kyvyttömyys voittaa lääkeresistenssin ja estää etäpesäkkeitä on tärkein syy hoidon epäonnistumisen [3]. Innovatiivisia ja tehokkaita uusia hoitomuotoja, jotka voittavat lääkeresistenssi kriittisesti parantamiseksi tarvitaan selviytymistä ja elämänlaatua potilailla, joilla on tämä tauti.

Microtubule-stabilointiaineet, kuten taksaanit, epotilonien, ja mikrotubulia epävakautta, kuten

vinka

alkaloidit ovat tehokkaimpia kemoterapeuttisten käytetty klinikalla [4]. Kuitenkin yksi suurimmista esteistä kehittynyt klinikalla on moniresistenssin (MDR). Erityisesti paklitakselin, huolimatta merkittävästä ensimmäinen vastaus pitkälle munasarjasyövän paklitakseli ja sisplatiini pohjainen yhdistelmähoito, valtaosa potilaista relapsi ja kehittää lääkeresistenssideterminantit [5], [6]. Paklitakseli vastus on monitekijäinen, kuten ylös-säätely kalvon huumeiden effluksitransportteri P-glykoproteiinin (P-gp) [7], [8], mutaatiot β-tubuliinia geeni [9], [10], [11], [12 ], muutokset ilmentymisen β-tubuliinia isotyyppien [13], [14], poikkeava signaalintransduktioreitteihin [15], [16], ja muutokset apoptoottiset sääteleviä proteiineja, kuten Bcl-2 [17], [18] ja apoptoosi-inhibiittori-proteiinin surviviinin [19]. Tunnistaminen uusia antimitoottinen aine, joka voi voittaa taksaania vastus, näyttää endurable aktiivisuutta taksaania tulenkestävä kasvaimia voitaisiin mahdollisesti saada kliinistä hyötyä potilaille, joilla on edennyt munasarjasyöpä.

BPR0L075 [6-metoksi-3- (3 ’, 4 ’, 5’-trimetoksi-bentsoyyli) -1 H-indoli] on uusi synteettinen indoli yhdiste, joka estää tubuliinin polymeroitumisen sitoutumisen kautta kolkisiinin sitoutumiskohtaan tubuliinin [20]. BPR0L075 on rakenteellisesti klassisen tubuliinia sitovan ja verisuonten häiritsevää ainetta kombretastatiini. BPR0L075 on osoittanut antimitoottinen ja antiangiogeenisesti

in vitro

ja

in vivo

[20], [21]. Me raportoitu että BPR0L075 näkyvät verisuonten häiritsevän indusoimalla nopea, vaikkakin tilapäinen kasvaimen verisuonten sammutus ja johtaa hidastanut kasvaimen perfuusio potilaalle tehdä ihmisen rintasyövän ksenograftien [22]. BPR0L075 pidätti ihmisen kohdunkaulansyövän KB solut G2 /M mitoosi tarkastuspiste, ja indusoi apoptoosia (IC

50 = 3,6 nM) häiritsemällä mitokondrion kalvon potentiaalia ja aktivoimalla kaspaasi-3 cascade [20]. BPR0L075 hallussaan hyvä selektiivisyys normaalin ja syöpäsolujen, IC

50 arvo normaalissa fibroblastien Detroit 551 solua suurempi kuin 1 uM [20]. BPR0L075 esittelee ainoana lääkkeenä antituumorivaikutuksia kasvua ihmisen mahalaukun ja kohdunkaulansyövän ksenografteissa [20]. Se myös parantaa synergisesti antituumoriaktiivisuus ihmisen keuhkojen, paksusuolen ja peräsuolen, ja kohdunkaulan tuumoriksenografteja yhdistettynä sisplatiinin kanssa [21].

Nykyisessä tutkimuksessa havaitsimme, että BPR0L075 oli erittäin aktiivinen paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja ja niiden vanhempien solut IC

50 arvot yhden numeron alhainen nanomolaarisina pitoisuuksina. BPR0L075 indusoi apoptoosin vanhempien munasarjasyöpäsoluja. Sen sijaan, se indusoi mitoosi katastrofin paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja osoituksena muodostumista suuria, monitumaiset polyploideja soluja. BPR0L075 edustaa uutta ja lupaava mikrotubulusten terapeuttinen voittaa taksaania vastuksen ja laukaista vaihtoehtoisia solukuoleman mitoosi katastrofi soluissa, jotka ovat apoptoosin kestäviä.

Tulokset

BPR0L075 Näyttää Voimakkaat Sytotoksisuus in Paklitakseli kestävä Human munasarjakarsinoomasolut

testattiin sytotoksisuuden BPR0L075 ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV-3, OVCAR-3, ja A2780-1A9 sekä paklitakseli-resistenttejä alalinjoja SKOV-3-TR, OVCAR-3 -TR, ja 1A9-PTX10, joka valittiin alle jatkuvaa altistusta 0,25 uM paklitakseli (SKOV-3-TR), 0,5 uM paklitakseli (OVCAR-3-TR), ja 15 ng /ml paklitakselia ja 5 mg /ml verapamiilia ( 1A9-PTX10), tässä järjestyksessä. Kuvio 1A osoittaa, että kuten paklitakseli, BPR0L075 osoitti vertailukelpoisia antineoplastinen aktiivisuus tappamisessa vanhempien munasarjasyöpäsoluja alhaisilla nanomolaarisina pitoisuuksina. Kuitenkin BPR0L075 oli tehokkaampi kuin paklitakseli paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja, lähes kokonaan säilyttäen sen sytotoksinen teho näitä resistenttejä alalinjoja, jossa paklitakseli oli lähes tehoton. Kuvio 1B esitetään yhteenveto IC

50-arvot BPR0L075, paklitakselin ja doksorubisiinin kasvua vastaan ​​näiden ihmisen munasarjasyövän solujen ja niiden resistenttejä alalinjoja jälkeen 4 päivää jatkuvan altistuksen. SKOV-3-TR ja OVCAR-3-TR-solut osoittivat suuri vastus suhteet ( 400-kertainen) paklitakselin verrattuna vastaavaan vanhempien soluja. 1A9-PTX10 soluilla kohtalainen vastus suhde (98-kertainen) paklitakseli. Nämä paklitakseli-resistentit solut osoittivat myös ristiresistenssiä doksorubisiinia (1,8-12-kertainen). BPR0L075 näkyy samanlainen herkkyys kaikissa pariksi vanhempien ja paklitakseli-resistenttejä munasarjojen solulinjoissa IC

50 arvot vaihtelevat 2-7 nM (kuvio 1 B).

(A) Lisääntyvät ihmisen munasarjasyöpäsoluja (SKOV- 3, OVCAR-3, ja A2780-1A9) ja paklitakselilla kestävä alalinjoja (SKOV-3-TR, OVCAR-3-TR, ja 1A9-PTX10) käsiteltiin BPR0L075 (punainen ympyrä) tai paklitakselin (sininen neliö) 3 -15 nM: ssa 4 päivää, ja sytotoksisuus arvioitiin SRB-määrityksellä. Osa solujen eloonjäämistä suhteessa kontrolleihin edustaa keskiarvoa ± SD 12 määrityksen. (B) Yhteenveto P-gp ilmaisu, βIII-tubuliinin ilmaisun, ja herkkyys pariksi munasarjasyövän solulinjoissa paklitakseli, doksorubisiinin, ja BPR0L075 hoitoon. Suluissa edustaa kestävyysaste (x-kertainen) ilmaistuna suhteena IC

50 arvot verrattuna vastaaviin vanhempien linjat. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

BPR0L075 ei substraatti ulosvirtausaika Kuljettimet, ja Aktiivinen munasarjasyöpäsoluja muuttuneeseen βIII-tubuliinia ilmaisujen ja β-tubuliinin Mutaatio

Immunoblottausmääritys analyysi osoitti, että resistenttien solujen OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR on korkea ilmentymisen P-gp-proteiinia, kun taas vanhempien OVCAR-3 ja SKOV-3-soluja ei ole havaittavissa P-gp: n ilmaisun (kuvio 2A). Sen vahvistamiseksi, että BPR0L075 ei ole substraatti effluksipumppujen, mittasimme solunsisäisiä BPR0L075 tasot kaksi paria solulinjojen OVCAR-3 /OVCAR-3-TR ja SKOV-3 /SKOV-3-TR käytettäessä herkkää LC /MS /MS-menetelmää (kuvio 2B). Molemmat parit saatujen solujen samankaltaisia ​​solunsisäisiä BPR0L075 pitoisuudet jälkeen BPR0L075 hoidon (20 nM: ssa 6 tuntia, kuvio 2C), joilla ei ole tilastollista eroa (

P

0,05). BPR0L075 ei substraatti toiseen ATP-sitova kasetti effluksitransportteri rintasyöpä resistance protein (BCRP), osoituksena vertailukelpoinen sytotoksisuutta ihmisen rintasyövän MCF7-solut (IC

50 = 3,5 nM) ja mitoksantronille kestävä MCF7 /MX-solut (IC

50 = 4,0 nM), MCF7 /MX solujen tiedetään yli-ilmentää BCRP [23], [24], [25]. Yhdessä tulokset osoittavat, että effluksitransportteri P-gp osaltaan valittu paklitakseli vastus SKOV-3-TR ja OVCAR-3-TR-solut, mutta BPR0L075 ei ole substraatti effluksipumppujen, joka edistää sen kyky voittaa paklitakseli vastus .

(A) Western blot analyysi P-gp ja βIII-tubuliinin lausekkeita pariksi munasarjasyövän solulinjoissa. Pan β-tubuliinia ja β-aktiini asettaisit valvontaa. (B) LC /MS /MS-analyysi solunsisäisten BPR0L075 tasoilla, LC kromatogrammi, joka esittää retentioajan sisäistä standardia [1- (1 H-indol-3-yylikarbonyyli) -1 H-imidatsoli], ja BPR0L075 2,2 ja 2,8 min, vastaavasti . Massa siirtymät m /z 212 → 144 sisäisen standardin ja m /z 342 → 195 BPR0L075 seurattiin kvantifiointiin. (C) solunsisäinen BPR0L075 tasot pariksi munasarjasyövän solulinjoissa. Soluja inkuboitiin 20 nM BPR0L075 6 tunnin ajan, sitten solut pestiin, otettiin talteen ja lyysattiin LC /MS /MS-mittaus. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta riippumattomasta testejä. Tilastollisesti merkittävää eroa ei havaittu (

P

0,05, opiskelija

t

-testi).

Paklitakseli resistenssifenotyyppi liittyy usein muuttaminen luokan III β-tubuliinia isotyyppiä ilmaisun [26]. Havaitsimme ero ilmauksia tubuliinia isotyyppiä βIII-tubuliinia vanhempien ja paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja. Sekä OVCAR-3 ja Skov-3-soluissa on korkea ilmauksia βIII-tubuliinin, mutta valinnan jälkeen paklitakselin, ilmaus βIII-tubuliinin merkittävästi vähentynyt (kuvio 2A), muutos on βIII-tubuliinin ilmaisuja resistenttien solujen ei vaikuttaa herkkyys BPR0L075. 1A9-PTX10 solujen tiedetään olevan ei-MDR1 resistenttejä fenotyyppi, ne satama β-tubuliinia mutaation heikentynyt paklitakselin vuorovaikutus tubuliinin [27], [28], [29], [30] (kuvio 1 B). Mutaatio β-tubuliinia ei vaikuta kielteisesti BPR0L075 indusoitua sytotoksisuutta 1A9-PTX10 soluissa (kuvio 1). Yhdessä BPR0L075 on sytotoksinen soluille korkean P-gp: n ja BCRP ilmaisuja; sytotoksisuutta on riippumaton βIII-tubuliinin ekspressiotasot tai β-tubuliinia mutaatiostatus.

BPR0L075 indusoi G2 /M pidätys Sekä Vanhempien ja paklitakselin kestävä munasarjasyöpäsoluja

Seurasimme solusyklin etenemisen sekä vanhempien ja paklitakseli-resistentit solut jälkeen BPR0L075 hoidon. Kuten kuviossa 3, BPR0L075 hoitoa (10-100 nM, lääkkeen tasot voidaan saavuttaa hiiren ksenografteissa [22]) 24 tuntia johti tappioihin solun väestön G0-G1 vaiheita, joissa samanaikainen kertyminen solujen G2 /M vaiheessa niin OVCAR-3 ja OVCAR-3-TR-soluissa. Verrattuna vankka solusyklin pysähtymisen mukaan BPR0L075, paklitakseli-resistentit solut osoittivat viallinen mitoosi reaktiota paklitakselille, jotka eivät pidättämään mitoosissa jopa käsiteltiin 100 nM paklitakselin (tuloksia ei ole esitetty). Sillä OVCAR-3-TR-solut, Polyploidisten solujen ( 4N DNA) ilmestyi jälkeen BPR0L075 hoidon vertaamalla OVCAR-3-soluissa. Tutkimme myös ajankul- BPR0L075 aiheuttama solukierron pysähtymisen, kun käsiteltiin 10 nM BPR0L075. BPR0L075 alkoi estää OVCAR-3 solujen G2 /M vaiheessa jo 12 tunnin, ja eteni loppuun pidätys 24-48 tuntia sekä OVCAR-3 ja OVCAR-3-TR-soluissa. BPR0L075 käsitelty OVCAR-3-TR-soluissa johti merkittävään osaan Polyploidisten solujen (DNA-pitoisuus 4N) klo 24-48 tuntia (kuvio 3, nuolet). Samoin BPR0L075 hoito myös aiheuttamaa pitoisuudesta ja ajasta riippuvia solukierron pysähtymisen G2 /M vaiheessa sekä SKOV-3 ja SKOV-3-TR-solut, joilla on suuri osa polyploideja solujen SKOV-3-TR (Kuva S1 ). Mitoosi solukuoleman tai mitoosi katastrofi liittyy usein kasvun pysähtymistä G2 /M vaiheessa solusyklin seuraa muodostumista suuria Polyploidisten solujen [31], [32], nämä Polyploidisten solujen havaittiin viittaa siihen, että BPR0L075 aiheuttama mitoosi katastrofin paklitakseli kestävä munasarjasyöpäsoluja.

OVCAR-3 ja OVCAR-3-TR-solut käsiteltiin etanolilla ajoneuvon tai BPR0L075 (10-100 nM), 24 tuntia tai 10 nM BPR0L075 varten osoitetaan kestot (0-48 tuntia ), värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrillä. Solusyklin profiilit esitetään kolmiulotteinen peitto. X-akseli esittää intensiteettiä propidiumjodidin fluoresenssi, joka osoittaa solun DNA-sisältöä eri solusyklin vaiheissa. Y-akseli edustaa solumäärät; ja z-akselilla näkyy pitoisuus tai aika olevia BPR0L075 hoitoa. 2N, solut asuvat G0-G1 vaiheeseen solusyklin; 4N, solut G2-vaiheessa tai mitoosia. BPR0L075 indusoi merkittäviä G2 /M pidätys seurasi ulkonäkö sub-G1 väestön sekä vanhempien ja resistentit solut, joissa Polyploidisten solujen (nuolet) ainoastaan ​​resistentit solut. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

BPR0L075 häiritsee Microtubule Cytoskeleton ja indusoi Mitoottista luonnonkatastrofi Paklitakseli kestävä munasarjasyöpäsoluja

tutkittiin, mikä vaikutus BPR0L075 järjestämisestä mikrotubulusten verkostoja munasarjojen syöpäsolujen immunofluoresenssivärjäyksen on α-tubuliinin (vihreä). Kuten kuviossa 4, etanoli vehikkelikäsitellyt OVCAR-3 ja Skov-3-solut olivat hyvin järjestetty tyypilliset radial mikrotubulusverkoston matriisia; Sitä vastoin BPR0L075 (20 nM 18 tuntia) käsiteltiin OVCAR-3 ja Skov-3-solut oli pyöristetty muoto, kondensoitu kromosomeja, joissa häiriöitä mikrotubulusverkoston kuidut solujen mukana solujen muodonmuutoksia. Sillä paklitakseli-resistenttejä OVCAR-3-TR ja Skov-3-TR-solut, pitkän mikrotubulusten kuidut harvoin ajoneuvoon käsitellyissä soluissa, joissa vielä vähemmän värjäyksen jälkeen hoitoon BPR0L075. BPR0L075 käsiteltiin resistentit solut osoittivat myös, ominaisuudet mitoosi katastrofin määritelty muodostuminen giant, monitumaiset solut (kuvio 4, nuolet).

peitelaseille, jotka sisältävät OVCAR-3 ja SKOV-3 vanhempien ja paklitakseli-resistentit solut altistuvat ja elatusainetta, joka sisälsi etanolia ajoneuvon tai 20 nM BPR0L075 18 tuntia. Solut kiinnitettiin, peitinlasit värjättiin sitten anti-α-tubuliinin-vasta-ainetta (AlexaFluor 488, vihreä) mikrotubuleiksi ja 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI, sininen) solutumien, ja havaittiin Olympus IX81 fluoresenssimikroskooppiin . Ohjaus vanhempien solut osoittivat tyypillisiä radial mikrotubulusten taulukot. BPR0L075 käsittely häiriintyy mikrotubulia tukirankansa sekä vanhempien ja kestävä munasarjasyöpäsoluja. Valkoinen nuolet osoittavat jättiläinen, monitumaiset solut ominainen mitoottisten katastrofin. Asteikko bar, 10 pm.

Paklitakseli vastustuskykyisten munasarjasyöpäsoluja Näyttö vapautettiin Mitoottista Response ja kuluminen Elossa

Analysoimme avain molekyyli liittyvät tapahtumat BPR0L075 aiheuttama solusyklin pysähtymiseen. Sykliini B1 on solusykliä säätelyproteiini mukana mitoosia ja ilmaisi pääasiassa aikana G2 /M vaiheessa solusyklin. Western blot-analyysi osoitti, että pohjapinta ilmentymiä sykliini B1 paklitakselin kestävä OVCAR-3-TR ja Skov-3-TR-solut olivat merkittävästi alhaisemmat kuin OVCAR-3 ja SKOV-3-soluissa. BPR0L075 hoito (10-100 nM 24 tuntia) aiheutti pitoisuudesta riippuvainen kasvu sykliini B1 tasoilla sekä vanhempien solulinjoissa ja paklitakseli-resistenttejä alalinjoja (kuvio 5A, B). BPR0L075 hoito indusoi myös säätely ylöspäin sukkularihmaston tarkistuspiste proteiinia bubR1: tä vanhempien OVCAR-3 ja SKOV-3-soluissa. Paklitakselin kestävä OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR-solut, endogeeninen ilmentyminen bubR1: tä tuli havaitsemattomaksi (kuvio 5A, B). Meillä on myös seurattava MPM-2-proteiinia, joka on perustettu markkeri mitoosi-solujen, joka tunnistaa ryhmän fosforyloidun muotoja proteiineja, joita fosforyloituu vain mitoosia [33], [34]. BPR0L075 hoito (10-100 nM 24 tuntia) aiheutti välittömän induktion MPM-2 vanhempien soluissa, mutta ei vastustuskykyisten alalinjoja jotka ovat mitoosi vikoja (kuvio 5A, B). Havaitsimme myös endogeeninen surviviinin ilmentymiseen, joka mitoosia säädin ja apoptoosi-inhibiittori-proteiinin, on OVCAR-3 ja SKOV-3-soluja (kuvio 5A, B). BPR0L075 välittämä mitoosi pidätys liittyy induktioon surviviinille pitoisuudesta riippuvalla tavalla vanhempien soluissa, joka säilyttää selviytymisen koulutusjakson syöpäsoluja. Sitä vastoin surviviinin ilmentymistä köyhdytettyä OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR alalinjoja, BPR0L075 hoito ei onnistunut indusoimaan surviviini ajan sääntelyn paklitakseli-resistentit solut (kuvio 5A, B).

BPR0L075 hoito (10-100 nM 24 tuntia) aiheuttamiin muutoksiin sykliini B1, bubR1: tä, MPM-2, ja surviviinin ilmaisuja OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-solut (A) ja SKOV-3 /SKOV-3- TR-solut (B). BPR0L075 hoito (10 nM) indusoi muutoksia PARP, BCL-XL, ja Bcl-2-proteiinien eri ajankohtina (0-72 h) in OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-solut (C) ja SKOV-3 /SKOV- 3-TR-solut (D). 50 ug proteiinia lysaatti ladattiin SDS-PAGE ja kokeet toistettiin ja edustavat blotit on esitetty.

BPR0L075 indusoi Bcl-XL Vanhempien Solut, mutta ei paklitakseli-resistenttejä Munasarjojen Cancer Cells

Bcl-2-perheen proteiinit ovat keskeisiä säätelijöitä apoptoosin, ja niiden ekspressiotasot on ehdotettu korreloivan herkkyys paklitakselin [35], [36], [37]. OVCAR-3 ja SKOV-3 solulinjat eivät ilmaisseet Bcl-2-proteiinin kohteena on immunologisesti tasolle, mutta havaittiin ilmentävän korkeita Bcl-XL. Sen sijaan, että OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR alalinjoja, Bcl-2-proteiinin taso oli helposti havaittavissa, joka liittyy vähentynyttä ilmentymistä Bcl-XL (kuvio 5C, D). Kun käsitellään emosoluilta 10 nM BPR0L075, fosforyloidun muodon Bcl-XL ilmestyi 12-72 tuntia, on osoituksena elektroforeettisen liikkuvuuden muutoksiin immunobloteissa (kuvio 5C, D). Kuitenkin samanlainen altistus BPR0L075 ei aiheuttanut Bcl-2 tai Bcl-XL fosforylaatiota OVCAR-3-TR ja Skov-3-TR alalinjoja. BPR0L075 pienensi Bcl-XL tasot OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR-solut vaikuttamatta Bcl-2 tasossa (kuvio 5C, D).

BPR0L075 solukuolema on kaspaasi-3 Independent sekä Vanhempien ja paklitakselin kestävä munasarjasyöpäsoluja

BPR0L075 indusoi proteolyyttisen poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) peräisin MW 116 kDa: n polypeptidin MW 85 kDa: n fragmentin OVCAR-3 ja SKOV-3 solujen aikaa (kuvio 5C, D) ja pitoisuudesta (kuvio 6A, B) riippuvaisella tavalla. Kuitenkin PARP katkaisu ei havaittu OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR-solut (kuvio 5C, D, 6A, B), huolimatta siitä, että BPR0L075 hoito tappoi sekä vanhempien ja resistentit solut, joilla on samanlaiset IC

50-arvot (kuvio 1). Havaitsimme myös, että BPR0L075 indusoi DNA tikkaat muodostumisen tunnusmerkki solun apoptoosin, että SKOV-3 ja OVCAR-3-soluissa, mutta ei SKOV-3-TR ja OVCAR-3-TR alalinjoja (kuvio 6C). Western blot -analyysiä käyttämällä emme havainneet kaspaasi-3 (tappio prokaspaasi 3 tai ulkonäön pilkottiin kaspaasi-3) sekä vanhempien ja resistentit solut jälkeen BPR0L075 hoidon joko spesifisiä vasta-aineita tunnustettu prokaspaasi-3 tai lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ( Kuva 6A, B). Edelleen vahvistamaan kaspaasi-3 riippumatonta solukuolemareittiin, me esikäsitelty solut kaspaasi-3 erityinen ja peruuttamaton estäjä (20 uM Z-DEVD-FMK) tai negatiivinen kontrolli estäjää (20 uM Z-FA-FMK) 24 tuntia ennen lisäämällä BPR0L075. Tilastollisesti merkitsevää eroa sytotoksisuuden havaittiin kunkin parin solulinjojen (kuvio 6D,

P

0,05, opiskelija

t

-testi); kaspaasi-3-estäjällä ei estänyt solukuolemaa sekä vanhempien ja resistentit solut. Mitoosi katastrofin tiedetään johtaa solukuolemaan kaspaasi-2, ja kaspaasi-3-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien [38]. Tarkastetaan kaspaasi-2 aktivaation hoidon jälkeen BPR0L075, kaspaasi-2 lohkaisu ei havaittu sekä vanhempien ja resistentit solut (kuvio 6A, B). Yhdessä tulokset osoittavat, että kaspaasi-2, ja kaspaasi-3 riippumatonta solukuolemaa oli mukana sekä vanhempien ja paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja; vallitseva solukuolemareittiin oli apoptoosin kautta vanhempien soluissa, ja mitoottisten katastrofin resistenttien munasarjasyöpäsoluja.

Western blot analyysi PARP, kaspaasi-2, ja kaspaasi-3: sen jälkeen, kun BPR0L075 (10-100 nM) hoitoa 24 tuntia OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-solut (A) ja SKOV-3 /SKOV-3-TR-solut (B). β-aktiini kuormituksen valvonta. (C) DNA-tikkaat määritykset käsitellyissä soluissa 10 nM BPR0L075 72 tuntia. Genomi-DNA alistettiin 1% agaroosigeelielektroforeesilla. Geeli värjättiin etidiumbromidilla ja DNA kaistoja visualisoitiin ultraviolettivalolla transilluminaattori. (D) vaikutus kaspaasi-3-estäjällä on BPR0L075 indusoitua sytotoksisuutta. Soluja esikäsiteltiin kaspaasi-3-estäjällä (20 uM Z-DEVD-FMK) tai negatiivinen kontrolli inhibiittoria (20 uM Z-FA-FMK) 24 tuntia ennen inkubaatiota 10 nM BPR0L075 lisää 72 tuntia. Päätyttyä inkuboinnin solujen elinkelpoisuus määritettiin SRB-määrityksellä. Tilastollisesti merkitsevää eroa sytotoksisuuden havaittiin kunkin parin solulinjojen (

P

0,05, opiskelija

t

-testi). Data edustaa keskiarvoa ± SD.

Keskustelu

Paklitakseli on yksi onnistuneen kemoterapeuttisia aineita ja jota käytetään hoidettaessa erilaisia ​​ihmisen maligniteettien, mukaan lukien kiinteät kasvaimet ja hematologiset maligniteetit [4], [39]. Paklitakseli tiedetään sitoutuvan p-tubuliinia ja edistää sen kokoonpano mikrotubuluksiksi [40], mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen G2 /M-vaiheessa, aktivoi sukkularihmaston ”tarkastuspiste”, ja lopulta johtaa apoptoottisen solukuoleman [4]. Paklitakseli on etulinjan aine munasarjasyövän kemoterapian yhdessä platinaa aineita. Kuitenkin edenneen munasarjasyövän paklitakselin haittaa kehittymistä lääkeresistenssin. Identifioida uusia aineita, jotka voittaa paklitakseli vastus tarvitaan kiireesti. BPR0L075 on heterosyklinen 3-aroylindole mikrohaaroihin epävakautta ainetta, joka häiritsee kasvainsolujen mikrotubulusdynamiikan, johtaa syövän solusyklin pysähtymiseen ja solun kuolemaan kaspaasi-3-välitteisen apoptoosin [20] ja antiangiogeenisten vaikutusten [21]. Lisäksi BPR0L075 häiritsee verisuonien ja sammuu kasvain veriperfuusio

in vivo

[22]. Nykyisessä tutkimuksessa testasimme tehokkuutta ja mekanismi BPR0L075 hoidettaessa paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja.

tulokset osoittavat, että munasarjasyövän solulinjoissa, jotka kestävät mikrotubulia stabilointiaine paklitakseli voivat olla herkkiä mikrotubulusten -destabilizing agentti BPR0L075. BPR0L075 näkyy voimakas sytotoksisuus sekä vanhempien munasarjasyöpäsoluja ja paklitakseli-resistenttejä alalinjoja IC

50-arvot noin 5 nM, kun taas yhtä suuri pitoisuus paklitakselihoidolla oli tehoton erittäin kestävä munasarjasyöpäsoluja (kuvio 1). Nämä paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja osoitti myös rajat resistenttejä muille kemoterapeuttisille aineille, kuten doksorubisiini (kuvio 1 B). Tämä havainto on yhdenmukainen tunnetun raportin, joka BPR0L075 on tehokas monilääkeresistenteistä ihmisen kohdunkaulansyövän KB-soluja, jotka ovat resistenttejä vinkristiini, paklitakseli ja kolkisiini [20]. Tuloksemme osoittavat, että BPR0L075 on potentiaalinen hyödyllinen aine kontrolloinnissa monilääkeresistenteistä munasarjasyöpäsoluja.

Tuloksemme osoittavat, että BPR0L075 voittaa kaksi resistenssimekanismeihin paklitakselin, eli MDR1 resistenssi johtuu P-glykoproteiinin yli-ilmentymisen ja muuttaminen luokan III β-tubuliinia isotyyppiä ilme. Paklitakseli-resistenttejä OVCAR-3-TR ja SKOV-3-TR alalinjoja osoitti yli-ilmentymisen P-gp (kuvio 2A), joka on effluksipumpun pystyy haitata säilyttäminen taksaanien ja muiden kationisten lääkkeiden [41]. BPR0L075 ei substraatti P-gp ja BCRP effluksipumppujen, osoituksena samanlainen BPR0L075 solunsisäisiä tasoja saavutettu vanhempien ja kestävä alalinjoja (kuvio 2C) ja vertailukelpoinen IC

50 arvoja MCF7 ja MCF7 /MX-soluissa. Sekä OVCAR-3 ja SKOV-3-soluja on korkea ilmentyminen luokan III β-tubuliinia, kun taas OVCAR-TR ja SKOV-3-TR osoitti merkittävästi vähentynyt ilmentyminen luokan III β-tubuliinia (kuvio 2A), mikä viittaa siihen, että muutos luokan III β-tubuliinin ilme vaikuttaa herkkyyttä paklitakselin mutta ei BPR0L075. BPR0L075 on myös erittäin tehokas tappamaan 1A9-PTX10 solujen β-tubuliinin geenimutaatio [27], [28] (kuva 1). Tuloksemme tukevat aiempien kertomusten että mutaatiot β-tubuliinia ja muutoksia ilmentymistä luokan III β-tubuliinin isotyyppien aiheuttaa resistenssiä mikrotubulia stabilointiaineet ja yliherkkyys mikrotubulia horjuttanut aineet läpi muutoksen mikrotubulusverkoston kokoonpanoon ja dynamiikka syöpäsoluissa [42]. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että paklitakseli ja BPR0L075 sitoa eri sivustoja tubuliinin; ovat ei-päällekkäisiä resistenssimekanismi, siten mahdollisesti käytön sallimista BPR0L075 niille munasarjasyöpäpotilailla aaltomaisesti paklitakselin jälkeen kemoterapiaan.

BPR0L075 aiheuttama solusyklin pysähtymiseen G2 /M vaihe vanhempien ja paklitakseli-resistenttejä munasarjojen syöpäsolut kun paklitakselihoidolla oli käytännöllisesti katsoen tehoton (Kuva 3, Kuva S1). Virtaussytometria tiedot osoittavat, että BPR0L075 ei aiheuta täydellistä mitoottista pidätys paklitakseli-resistentit solut, mikä osoittaa, että resistentit solut voidaan edelleen läpi DNA-synteesin, vaikka vika solunjakautumisen. BPR0L075 käsitelty resistentit solut johti merkittävään osaan Polyploidisten solujen (Kuva 3, Kuva S1), mikä viittaa siihen, että BPR0L075 solukuolema paklitakselin-resistenttien solujen edetä mitoottisiin katastrofi. Mitoosi katastrofi on toinen muoto solukuolemareittiin joka johtuu epänormaali mitoosin ja /tai korjaamaton kromosomivaurioista [32], [43], [44], [45]. Mitoosi katastrofin tapahtuu aikana tai pian sen jälkeen vapautuneilla tai epäonnistunut mitoosia ja voidaan liittää morfologinen muutos, kuten micronucleation (ulkonäkö kromosomien tai kromosomaalisten materiaalin ulkopuolella kaksi tytär ytimet) ja multinucleation (ulkonäkö kahden tai useamman ytimet samanlaisia ​​tai heterogeeninen kooltaan, jotka johtuvat puutteellisesta erottelua sytokineesiin) [43], [44], [45]. Muodostuminen jättiläinen monitumaisten solujen fenotyyppiä mitoottista katastrofin soluissa ionisoivan säteilyn aiheuttama [46], [47] tai syöpälääkkeet vaikuttavat mikrotubulia vakaus [43], [48], [49], [50]. Immunofluoresenssivärjäyksen esittää ulkonäkö giant, monitumaiset solut (kuvio 4) seuraavasti BPR0L075 käsittely resistentit solut, viittaa siihen, että kromosomi erottelu esiintyy ainakin jossain määrin paklitakseli-resistentit solut, mutta sytokineesi epäonnistui.

Tutkimuksemme osoittaa, että mitoosi vastaus reitit ovat erittäin vapautettiin säännöstelystä OVCAR-3-TR ja Skov-3-TR syöpäsoluja, osoituksena alas-säätely sykliini B1, ehtyminen sukkularihmaston Checkpoint proteiinia bubR1: tä, ja kyvyttömyys aktivoida mitoottisiin epitooppiin MPM-2 resistenttien solujen verrattuna emo-soluja (kuvio 5A, B). Havainnot ovat yhdenmukaisia ​​raportteja, että vähentynyt ilmentyminen sykliini B1 ja bubR1: tä liittyy heikentynyttä kara tarkistuspiste ja paklitakselin resistenssin munasarjakarsinoomasolut [51]; ehtyminen bubR1: tä siRNA aiheutti menetys kehräkokoonpanon tarkistuspisteen toiminta ja kestävyys paklitakseli [52].

surviviinia ehtyminen paklitakseli-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja voisi olla rooli BPR0L075 aiheuttama mitoottisiin katastrofi. Surviviini on bifunktionaalinen proteiini, joka toimii vaimentimen apoptoosin ja mitoottisen säädin [53], [54], [55]. Surviviinispesifisiä estää apoptoosia vuorovaikutuksessa kaspaasi ja Smac /DIABLO proteiineja, tukahduttaa aktivointi loppupään kaspaasien, joka säilyttää selviytymisen polku [56]. Surviviinispesifisiä myös moduloi useita mitoosi tapahtumia, kuten kara ja interphase mikroputkiorganisaatiota, kara koota tarkistuspisteen ja sytokineesiin [44]. Havaitsimme menetys perusilmennystä surviviinille paklitakselia resistenttien solujen verrattuna vanhempien soluihin (kuvio 5A, B), mikä viittaa heikentyminen karan tarkistuspiste on resistentit solut. Paklitakseli tiedetään olevan tehoton hoidettaessa surviviiniperäistä köyhdytettyä syöpäsoluja [57], [58].