Krooninen sairaus

tiivistelmä

Genistein on isoflavone löytyy soijaa, ja sen Chemo-ennaltaehkäisevää ja -therapeutic vaikutukset ovat vakiintuneet iältään

in vitro

tutkimuksissa. Viime aikoina on kuitenkin sen terapeuttiset vaikutukset

in vivo

on kyseenalaistettu vuoksi ristiriitaisia ​​raportteja eläinkokeista, jotka perustuvat jyrsijämalleilla tai istutusta solulinjojen eläimiin. Selventää

in vivo

vaikutusten genisteiiniä edennyt eturauhassyöpä potilaiden kehitimme potilaasta johdettujen eturauhassyöpäksenograftista malli, jossa kliininen eturauhasen näyte oksastetaan immuuni hiirillä. Tulokset osoittavat lisääntyneen imusolmuke (LN) ja toisen elimen etäpesäkkeitä genisteiini-käsitellyissä hiirissä verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Mielenkiintoista on, että invasiiviset pahanlaatuiset solut yhteen muodostaen saaria /mikrometastaasin vain toissijainen elinten genisteiinin-käsitellyssä ryhmässä, eikä hoitamattomaan verrokkiryhmään. Ymmärtää taustalla olevaa mekanismia metastasoineeseen etenemistä, tutkimme solujen lisääntymisen ja apoptoosin parafiiniin osissa. Immunohistologisia tiedot osoittavat, että kasvaimia genisteiinin hoidetuissa ryhmissä on enemmän lisääntyvän ja vähemmän apoptoottisia syöpäsoluja kuin käsittelemättömän ryhmän. Meidän immunoblottauksella tiedot viittaavat siihen, että lisääntynyt lisääntymistä ja etäpesäkkeiden liittyvät toiminnan tehostuminen tyrosiinikinaasien, EGFR ja sen loppupään Src, in genisteiini hoidetuissa ryhmissä. Huolimatta chemopreventive vaikutuksia ehdottamaa aikaisemmin

in vitro

tutkimuksissa syövän edistävä vaikutus genisteiinin havaittu täällä tarvitaankin huolellinen valinta potilaiden ja turvallisempaa suunnittelua kliinisissä tutkimuksissa.

Citation: Nakamura H Wang Y, Kurita T, Adomat H, Cunha GR, Wang Y (2011) Genistein Lisäykset epidermaalisen kasvutekijän reseptori Merkinanto ja Edistää syövän etenemisen Advanced Human eturauhassyöpä. PLoS ONE 6 (5): e20034. doi: 10,1371 /journal.pone.0020034

Editor: Robert Z. Qi, Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong

vastaanotettu: 07 helmikuu 2011; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 16, 2011

Copyright: © 2011 Nakamura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institute of Health Research (MOP-86730: YZW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCa) on yleisimmin diagnosoitu noncutaneous maligniteetin kesken North American men [1]. Vuonna 2009 noin 192 280 uutta tapausta eturauhassyövän todettiin, ja 27, 360 raportoitu kuolemantapauksia Yhdysvalloissa, Sijoitukseen toiseksi korkein kuolleisuus keuhkosyövän jälkeen [2]. Verrattuna Yhdysvaltoihin, ilmaantuvuus ja kuolleisuus eturauhassyöpään on huomattavasti alempi Aasiassa [3], [4], [5]. Maahanmuutto tutkimukset ovat osoittaneet, että aasialaiset, jotka ovat ottaneet Länsi ruokavalio jälkeen maahanmuutto Yhdysvaltoihin, oli merkitsevästi enemmän eturauhassyövän ilmaantuvuus kuin alkuasukkaat Aasian maissa [6], [7]. Monien ravinnon eroja Pohjois-Amerikan ja Aasian ero soija kulutus on poikkeuksellinen. On arvioitu, että aasialaiset kuluttavat 20-50 kertaa enemmän soija-ruoat asukasta kohden verrattuna pohjoisamerikkalaisten [8]. Aiemmat epidemiologiset raportit ovat osoittaneet käänteinen korrelaatio soijan kulutuksen ja PCa riski, mikä viittaa siihen, soija n chemopreventive vaikutuksia [9]. Ensisijainen aktiivinen komponentti soija on isoflavone nimeltään genisteiini (4,5,7-trihydroxyisoflavone) [10], [11], [12], [13]. Johtuen samanlainen molekyylirakenne estradioli, genisteiiniksi tiedetään osoittavan heikkoa estrogeenista aktiivisuutta sitoutumalla estrogeenireseptori (ER), ja siten muokataan estrogeenisäädeltyjen geenin transkription kohde-elimissä, [14], [15].

syövän vastainen vaikutus genisteiinin ovat hyvin tutkittu

in vitro

ja raportoitu useissa syöpäsolulinjoissa lukien leukemia, keuhko-, eturauhas- ja rintasyövän [16], [17], [18], [19]. Data aikaisemmista tutkimuksista osoittavat, että genisteiini on laaja kirjo biologisia vaikutuksia, joita ovat: induktio solujen erilaistumisen ja apoptoosin [17], [18], [19], [20], solujen kasvun esto [19], [21 ], [22], [23], [24], ja kumota signaalitransduktioreaktioteiden [25], [26], [27]. Genistein, mikä on herättänyt huomattavan määrän huomiota syöpätutkimuksessa erityisesti sen estävä vaikutus proteiinityrosiinikinaasin (PTK) toimet, jotka ovat tärkeitä solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [25], [26], [27].

huolimatta niin lupaavia

in vitro

syövänvastainen tiedot, viimeaikainen

in vivo

tutkimuksissa on raportoitu ristiriitaisia ​​tuloksia koskien genisteiini- vaikutuksista etäpesäkkeitä. Tutkimukset käyttäen TRAMP ja PC-3 eläinmalleissa on osoitettu, että genistein yllättäen lisääntynyt etäpesäke [28], [29], kun taas toisessa tutkimuksessa käyttämällä PC-3M

in vivo

mallissa osoittivat päinvastainen vaikutus [30]. Nämä raportit yhdessä epäselviä alustavia tuloksia vaiheen II kliinisissä kokeissa [31], [32] viittaavat siihen tarvetta tutkia tarkemmin vaikutusten genisteiinin

in vivo

käyttäen malleja, jotka ovat enemmän kliinisesti merkityksellisiä kuin muut tavanomaiset

in vivo

malleja, jotka luottavat käyttö solulinjoissa.

tutkimuksessamme olemme hyödynsi sisälsivät kapselin alle ksenografti tekniikkaa käyttäen alhainen kulkua potilaasta johdettujen PCa mallin ei-lihavilla diabeetikko, vakava Yhdistetyt immuuni-puutosta (NOD-SCID) hiiriin. Ihmisen syöpä ksenografteissa uskollisesti säilyttää histopatologinen ja genotyyppisistä piirteet alkuperäisen kliinisen näytteen [33], [34]. Käyttämällä potilaasta johdettujen PCa vierassiirrettä järjestelmä, olemme havainneet, että Genistein at farmakologisen annoksen lisää solujen lisääntymistä, vähentää apoptoosia ja edistää etäpesäkkeiden kehittyneen ihmisen PCa. Tällaisia ​​kasvainta edistävät vaikutukset genisteiinin liittyy lisääntynyt fosforylaatioon EGFR: n ja Src tyrosiinikinaasien.

Methods

1. Materiaalit ja eläinten

LTL163a kasvaimen linja (www.livingtumorlab.com) on johdettu korkealaatuisesta eturauhassyöpä näyte saadaan potilaalta, ja ksenografti Kasvain siirrettiin linja kehitettiin tämän kliinisen kudosnäytteestä, kuten edellä on on kuvattu [33], [34]. Kirjallinen suostumus saatiin potilaasta sekä etiikan hyväksynnän University of British Columbia-British Columbia Cancer Agency tutkimuseettiseltä (UBC BCCA REB), Vancouver, Kanada. Eläinten hoito ja kokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti Kanadan neuvoston Animal Care (CCAC), ja eläinten käyttö kokeissa tutkittiin ja hyväksyttiin Animal Care komitean University of British Columbian (lupa #: A10 -0100).

Lyhyesti, kasvain kudos leikattiin tasaisesti useiksi pieniksi paloiksi, 1 x 3 x 3 mm, ja oksastettu alle munuaisten kapseli NOD-SCID-uroshiiriä, jotka olivat 6-8 viikkoa vanhoja [33 ], [34]. Kaksi kappaletta kasvaimen kohti munuaisen asetettiin munuaisten kapseli. Hiirten täydennettiin testosteronin pellettejä (10 mg /hiiri), jotka oli valmistettu PARR pellet press (PARR Instrument Co., Moline, Illinois) ja istutettiin ihonalaisesti edistää solujen kasvua. Köynnöksen kasvatettiin munuaisten sivuston 60~90 päivää, kerättiin ja osat köynnöksen kiinnitettiin histopatologista analyysiä. Kehitetään Kasvain siirrettiin linja, korjattu kasvain köynnöksen näytteille nopeaa kasvua leikattiin pieniksi paloiksi ja uudelleen oksastetaan munuainen uusien isäntien. Kolmen siirto sukupolvea, turvonneet imusolmukkeet havaittiin, joita jakaa kahtia ja histologisesti tutkittiin etäpesäke. Kun etäpesäke vahvistettiin, tuore imusolmuke kudoksia sisältäviä metastasoitunut talletukset uudelleen istutetut päälle munuainen kehittää etäpesäkekasvainten viiva ja nimettyjen LTL163a. ​​

2. Genistein hoito

Jotta tutkia farmakologisista vaikutuksista genisteiiniä etäpesäke ihmisen eturauhassyövän, päätimme käyttää LTL163a etäpesäkekasvainten linja, joka olivat peräisin 10

th elinsiirtoa sukupolvi. Kasvaimet leikattiin 1 x 3 x 3 mm kappaletta ja oksastettiin kahdeksantoista NOD-SCID uroshiirillä jokaisen munuainen, jossa on yksi kasvain siirteen (2 köynnöksen /hiiri). Testosteroni pelletit (10 mg) istutettiin ihonalaisesti edellä kuvatulla kaikissa eläimissä aikaan oksastamalla säilyttää riittävä testosteronin taso koska genisteiini–hoidon on osoitettu vähentävän seerumin testosteronipitoisuus kautta hypotalamus /aivolisäke /sukupuolirauhasen akselilla [35] . Seitsemän päivää siirron jälkeen eläimet jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään; ohjaus (käsittelemättömät), pieniannoksisen ja suuren annoksen genisteiinin (puhtaus 99%, LC Laboratories, Woburn, MA). Hiiret matalan annoksen ryhmässä annettiin genisteiiniä liuotettiin maapähkinäöljyyn letkulla 2 mg /vrk (80 mg /kg /vrk). Hiiret korkean annoksen ryhmässä annettiin 10 mg /vrk (400 mg /kg /vrk) genisteiinin. Ohjaus hiiret saivat 0,1 ml öljyä ajoneuvon vain. Kaikki ryhmät ruokittiin samalla jyrsijän ruokavalio (PicoLab Jyrsijöiden Diet 20) ja koska autoklavoitiin juomavettä. Genisteiini hoito aloitettiin viikkoa siirteen ja sitä jatkettiin kolmen viikon ajan. Siirteet kasvatettiin munuaisten yhteensä 4 viikkoa. Lopussa 4

th viikolla verinäytteitä ja (munuaiset kasvaimen siirteitä, maksan, keuhkojen, pernan ja imusolmukkeiden) kerättiin analyysejä varten.

3. Mittaamalla seerumin genisteiinin tasojen

LC-MS (nestekromatografia-massaspektrometria) käytettiin mittaamaan seerumin genisteiinin. Ensimmäinen, pakastetut seeruminäytteet sulatettiin jäällä, ja 5 ui 1 ug /ml luteolin etanolissa, lisättiin 25 ui seerumia sisäisenä standardina (IS). Uuttaminen suoritettiin vorteksoimalla 80 ui asetonitriiliä ja 5 ui 0,2 M HCl: ää. Uute selkeytettiin sentrifugoimalla 5 minuuttia 20.000 x g, ja supernatantti kerättiin, laimennettiin 1:01 tislatulla vedellä ja sentrifugoitiin vielä 5 minuuttia. Saatu supernatantit analysoitiin. ACQUITY UPLC kanssa 2,1 × 100 mm BEH 1,7 uM C18 pylväs kytketty PDA ilmaisimen sopusoinnussa Quattro Premier XE (Waters, Milford, MA) käytettiin vedellä ja asetonitriilillä, joka sisälsi 0,1% muurahaishappoa liikkuvana vaiheissa. 25-100% asetonitriiligradientilla 0,2-2,0 minuuttia käytettiin seurasi uudelleen tasapainottaminen Aloitusehtojen yhteensä ajoaika 4,5 min. MS ajettiin yksikössä resoluutio on 3 kV kapillaari, 120 ° C ja 350 ° C lähde ja desolvaatiolämpötilat, 50 ja 1000 l /h kartio ja desolvation N

2 kaasuvirtoja ja Ar törmäys kaasun asetettu 5.0e

-3 mbar. M /z 287 89 ja 287 153 käytettiin havaitsemaan luteolin IS, ja m /z 271 91 ja 271 153 käytettiin genisteiini- kanssa kartio jännitteen ja törmäys energiat optimoida kutakin. OD tiedot 210-600 nm kerättiin PDA detektori ja OD260 käytettiin myös päätepisteenä. 5 pisteen lineaarinen kalibrointikäyrä 1-800 ng /ml 218 ng /ml IS käytettiin kvantitointiin (R2 0,99; bias 10%). Genistein-glucoronide oletettiin olevan yleisin konjugaatin, ja tasot arvioitiin OD260 tiedot olettaen, että ekstinktiokerroin on samanlainen kuin genisteiinin.

4. Histopatologia ja immunohistokemia

Korjattu kasvain köynnöksen leikattiin kahtia paksuin pisteen kasvain. Puolet kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin histologista /immunohistologisilla (IHC) analyysit. Toinen puoli oli snap-jäädytetty proteiinin analyysiin. Kiinteän Kudos jalostettu parafiini ja upotettu keskiviivan leikkaus on alaspäin vuonna parafiiniblokkiin, jotta osiot alkoi alkuperäiseen leikkaus keskiviivan pinta. Valmistaminen parafinoidut kudosten ja IHC analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Ensisijainen vasta tässä tutkimuksessa käytetyt ovat Ki67 (Dako, Carpinteria, CA), kaspaasi-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ERa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja ER (Biogenex Laboratories, San Ramon , CA). Kaikki kudosnäytteiden olivat vasta-värjätty 5% (w /v) Harris hematoksyliinillä ja peitettiin Permount-peitinlaseilla (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA).

5. Paikallinen invaasio ja metastaasi analysoi

tutkimiseksi metastaattista esiintyvyys, keuhko-, maksa-, munuais-, haima-, ja lannerangan imusolmukkeet kerättiin kustakin hiirestä. Kukin näistä elimistä oli kiinteä ja käsitellään kuten edellä IHC analyysiä. Leikkeet värjättiin anti-ihmisen erityisiä mitokondriot-vasta-ainetta (Millipore, Billerica, MA) ja seulottiin läsnä metastaattisen soluja. Kuvia IHC leikkeitä kustakin elin siepattiin käyttäen AxioCam HR CCD asennettu Axioplan 2 mikroskoopilla ja Axiovision 3.1 -ohjelmisto (Carl Zeiss, Toronto, ON), jossa lopullinen suurennoksia × 400. Prosenttiosuudet eläimet, jotka sisältävät ihmisen metastaattisen soluja joko lannerangan tai rintarangan imusolmukkeet laskettiin. (In munuaisten ja haiman imusolmukkeiden kaikki eläimet kolmessa ryhmässä näkyi merkkejä ihmisen syöpäsoluja riippumatta hoidon ohitettu laskettaessa.) Keuhkosyövän ja maksan määrä positiivisesti värjäytyneiden solujen laskettiin sisällä satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs- per yksilö .

6. Solujen lisääntyminen ja apoptoosin analyysit

leviämisen indeksi (PI) arvioitiin IHC käyttämällä ihmisen erityinen leviämisen merkki, Ki67. Kuvia IHC leikkeitä kustakin siirteen vangittiin kuten edellä. Keskiosa proteesin kanssa tiheimmin asutuilla ihmisen syöpäsoluja valittiin kuvantamisen kaikille kasvaimia. Lukumäärät Ki67 positiiviset ja negatiiviset-ihmisen solut laskettiin sisällä koko mikroskooppinen kentän kunkin siirteen kaikista eläimistä ja keskiarvo. Perustuu keskimäärin solumäärä kussakin testiryhmässä, PI laskettiin seuraavasti: PI (%) = (Ki67 positiivinen solumäärä /yhteensä ihmisen solujen määrä) x 100.

Samalla Apoptotic Index (AI) oli laskettu lohkaista-kaspaasi-3 värjätään IHC osissa kasvain köynnöksen. Lukumäärä apoptoottisten solujen kohti 10000 ihmissoluja laskettiin kunkin kasvaimen siirteen ja keskiarvo. AI laskettiin kuten edellä.

7. Western blot analyysi

Loput puoliskot korjatun kasvaimen kudokset olivat snap-jäädytetty proteiinin analyysi, josta hiiren munuaiskudokset poistettiin kirurgisesti käyttämällä preparointimikroskooppia ennen pakastamista. Nämä pakastettiin kudokset homogenisoitiin käyttäen huhmaretta ja survinta NP-40 hajotuspuskuria (150 mM natriumkloridia, 1,0% NP40: tä, ja 50 mM Tris-HCI, pH 8,0) jäissä, sentrifugoitiin 12000 rpm 20 minuutin ajan 4 Celsius-asteessa mikrosentrifugissa, ja supernatantti kerättiin. Bikinkoniini- happo (BCA) -määrityksellä (Thermo Scientific, Waltham, MA) suoritettiin yhtiön ohjeiden mitata proteiinipitoisuus kullekin kasvaimen näytteen, ja absorbanssi mitattiin 562 nm: ssä. Geelielektroforeesia varten, proteiini näytteitä keitettiin 5 minuutin ajan, ja 20 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla (polyakryyliamidigeelielektroforeesi) geelillä ja sähkön avulla PVDF-kalvolle. Membraani blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), tai 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (TBST), ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja alfa- aktiini, fosfo (p) -tyrosiinia (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), yhteensä EGFR, p-EGFR (tyr1068), p-Src (tyr416) ​​ja yhteensä Src (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Jälkeen primaarisessa vasta-aineessa inkubaation jälkeen membraanit pestiin TBST: llä ja tutkittiin asianmukaisten HRP-konjugoidun sekundaarisen anti-hiiri (Pierce, Rockford, IL) tai anti-kani (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA) vasta-aineita. Havaita kiinnostavia proteiineja, tehostettu kemiluminesenssi Western-blottaus kit käytettiin (Pierce, Rockford, IL).

8. Tilastollinen analyysi

Metastasoitunut ilmaantuvuus, vertailu seerumissa, PI ja AI arvioitiin käyttämällä kaksisuuntaista parittomia Studentin

t

-testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, jos

p

arvot olivat pienempiä kuin 0,05.

Tulokset

Serum taso genisteiinin

Jotta genisteiini- hoidetuilla ryhmät saivat farmakologista yhdisteen annos, seerumin genisteiinin mitattiin käyttäen suuren suorituskyvyn nestekromatografialla chromatography- massaspektrometrialla (HPLC-MS). Meidän HPLC-MS-analyysi osoitti, että käsittelemätön kontrolliryhmä oli hyvin alhainen jälkeäkään seerumin genisteiinin (0,002 ug /ml), jonka todennäköisesti lähde on niiden Chow (PicoLab Rodent Diet 20, Delta, BC). Vertailun vuoksi pieni annos ja korkea-annoksella käsitellyt eläimillä oli 1,30 ug /ml 6,63 ug /ml vapaata genisteiinin, vastaavasti. Meidän käsitellyillä hiirillä, nautitaan genisteiini muodostettu glukuronidikonjugaatteja, ja vain pieni osa genisteiinin pysyi vapaina aglykonit veressä. Tasot sekä vapaan ja konjugoitujen genistein olivat merkittävästi korkeammat matala (

p

0,04) ja suuren annoksen saaneilla hiirillä (

p

0,0006) kuin kontrolliryhmässä (kuva 1).

hoitoon, kuusi eläimiä niukassa annoksen ryhmässä annettiin genisteiiniä liuotettiin maapähkinäöljyyn letkulla 2 mg /vrk (80 mg /kg /vrk). Kuusi hiirtä korkean annoksen ryhmässä annettiin 10 mg /vrk (400 mg /kg /vrk) genisteiinin. Viisi kontrollihiiret (yksi kuoli ennen hoidon päättymisen) sai 0,1 ml ajoneuvon vain. Veri kerättiin lopussa 3 viikon hoidon.

Sarakkeet

: keskimääräinen seerumin genisteiinin ± SD.

kasvaimen kasvua potilaasta johdettujen PCa vierassiirrettä jälkeen genisteiini- hoidon

Effects genisteiinin on etäpesäke kehittyneen ihmisen Eturauhassyövän tutkittiin käyttämällä potilaasta johdettujen PCa vierassiirrettä kasvain siirrettiin linja, LTL163a, joka oli kehittynyt eturauhasen näyte pitkälle ja valittu metastaattisen aktiivisuuden. Kasvaimet alkaen 10

th elinsiirtoa sukupolven LTL163a kasvainlinjaan leikattiin tasakokoisia paloja (1 x 3 x 3 mm) ja kasvatettu munuainen kapselia (yksi kasvain pala /munuainen, kaksi kasvain köynnöksen /hiiri) kahdeksantoista mies NOD SCID täydennetty 10 mg: n ihonalaisen testosteronia pelletti. Seitsemän päivää siirron jälkeen, isäntä eläimet sijoitetaan satunnaisesti kolmeen hoitoryhmään; käsittelemätön-ohjaus, pieniannoksisen ja suuren annoksen genisteiinipitoisuuden. Suun kautta genisteiiniä tai öljyllä (kontrolliryhmä) jatkettiin kolmen viikon ajan. Tuolloin sato, suurentuneet munuaiset, joissa on hyvin kasvatettu kasvaimia todettiin kaikissa kolmessa ryhmässä. Keskimääräinen kasvainten tilavuuden valvontaa pieniannoksinen ja suuren annoksen ryhmät ovat; 650 mm

3, 655 mm

3 ja 670 mm

3, tässä järjestyksessä. Huolimatta kasvaimen lisääntyvän määrän suuntaus genistein hoitoon, ei ollut tilastollista merkitystä ryhmien kesken. Lisäksi ylöspäin laaja kasvaimen kasvua munuaisten pinnan kasvaimet kaikkien kolmen ryhmän tunkeutuneet paikallisesti munuaiseen (tuloksia ei ole esitetty).

Genisteiini edistää imusolmuke ja toisen elimen etäpesäkkeiden

jotta voitaisiin arvioida kaukainen leviäminen kasvainsolujen, keräsimme haiman, rinta-, lanne ja munuaisten imusolmukkeet sekä sisäelimiin. Kaikki ryhmät osoittivat todisteita ihmisen syöpäsoluja munuaisten ja haiman imusolmukkeiden riippumatta hoidon (tietoja ei esitetty). Kuitenkin ja lannerangan solmuja, kontrolliryhmä ei ollut tai metastaasien vähäinen ilmaantuvuus (0% lannerangan ja 17% rintakehä). Sitä vastoin sekä matalan ja korkean annoksen genisteiinipitoisuuden hoidot osoittivat korkeampia metastaattisen ilmaantuvuus näiden kahden solmun verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään (kuvio 2a); (17% alhaisen annoksen ja 50% korkean annoksen lannerangan solmussa. 50% matalan annoksen ja 83% korkean annoksen rintakehä solmu). Samoin numerot metastaattisen syöpäsolujen johdetussa elimiin, kuten keuhko- ja maksan olivat merkittävästi korkeammat genisteiini- saaneissa ryhmissä kuin kontrolli (kuva 2b). Vaikka hajallaan syöpäsolut havaittiin toisen elimissä kaikki hiiret (kuvio 2c), vain genisteiini-käsitellyistä hiiristä osoittivat aggregoitumista syöpäsolujen ( 75 soluaggregaatteja) näissä elimissä muodostaen saaria /mikrometastaasin kuten on esitetty kuviossa 2d. Siten useita kriteerejä, genisteiini oli annoksesta riippuvaa etäpesäke edistävät vaikutukset LN ja toissijainen elimiä mallimme.

Tuolloin sato, keuhko-, maksa- ja neljä imusolmukkeiden kuten munuaisten, haiman, lanne ja rintakehä solmut kerättiin kaikista eläimistä. Kukin näistä elimistä on vahvistettu, jalostettu, värjättiin anti-ihmisen erityinen mitokondrioiden ainetta ja seulotaan läsnäolo ihmisen metastaattisen soluja. Kuvia IHC leikkeitä kustakin elin siepattiin käyttäen AxioCam HR CCD asennettu Axioplan 2 mikroskooppi lopullinen suurennoksia × 400. a) eläinten osuus, joka sisältää ihmisen metastaattisen soluja joko lannerangan tai rintarangan imusolmukkeet laskettiin. Munuaisten ja haiman imusolmukkeiden, kaikki eläimet kaikissa kolmessa ryhmässä näkyi merkkejä ihmisen syöpäsoluja riippumatta hoidon (tuloksia ei ole esitetty), mikä jättää pois laskennassa. Kuitenkin, genisteiini-käsiteltyjen ryhmien osoitti lisääntynyt ilmaantuvuus etäpesäkkeiden ja lannerangan solmut verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään. Metastaattisen levisi ja lannerangan imusolmukkeiden esitetään keskiarvona prosentteina hiirillä kuljettavat LTL163A kasvain köynnöksen kolmesta ryhmää (käsittelemätön-kontrolli, pieniannoksisen ja korkea-annos genisteiinipitoisuuden).

musta pylväs: metastasoitunut esiintyvyys rintakehä imusolmuke. Valkoinen pylväs: metastasoitunut esiintyvyys lannerangan imusolmuke

. b) keuhkoissa ja maksassa, määrä positiivisesti värjäytyneiden solujen laskettiin sisällä satunnaisesti valitun mikroskooppikentästä.

sarake

: keskimääräinen lukumäärä hyökkääviä syöpäsolujen kohti mikroskooppisia kentän havaittiin keuhkoissa ja maksassa kolmen ryhmän ± SD. Tulokset analysoitiin tilastollisesti t-testin 95%: n luottamusväli. c) Ki67-IHC värjäys edustavien osien toissijainen elinten (maksa ja keuhko) käsittelemättömästä-ohjaus ja genistein käsitellyillä hiirillä. Ki67-vasta-ainetta käytettiin tässä tutkimuksessa on ihmisen tietyn. Kaikki suurennokset ovat × 400. d) Ki67-IHC värjäys maksan peräisin genisteiini hoidetuista eläimistä näyttää yhdistäminen hyökkäävän syöpäsoluja. Punainen ympyrä tarkoittaa pieni saari /mikrometastaasin painopiste sisältävien 75 ihmisen syöpäsoluja, joka havaittiin vain genisteiini- saaneilla hiirillä. Suurennus on × 400.

Genistein vaikuttaa solujen lisääntymisen ja apoptoosin

Koska meidän tiedot osoittivat, että genisteiini edistänyt leviämisen ihmisen syöpäsolut hiiren isännät, tutkimme sen vaikutuksia kasvainsolun leviämisen ja apoptoosin. Immunohistokemia käyttämällä ihmisen tietyn Ki67-vasta-aineen suoritettiin mittaa kasvainsoluproliferaation. Tulos osoitti vahvan positiivisen intensiteetti sisällä kasvain köynnöksen kaikista ryhmistä sekä paikallisesti hyökkäsi alueen hiiren munuaisen (tuloksia ei ole esitetty). Leviämisen-indeksi (PI) mitattiin keskiosa kasvaimen siirteen alueella. Vertailu ryhmien välillä osoitti, että sekä matalan ja korkean annoksen ryhmillä oli korkeampi proteaasinestäjiä (77,3% ja 86,1%, tässä järjestyksessä) kuin käsittelemätön kontrolli (70,0%), mutta vain korkean annoksen ryhmässä oli merkittävästi erilainen hoitamattomaan verrokkiryhmään (

p = 0,004

) kuten kuvassa 3.

leviämisen indeksi (PI) arvioitiin IHC käyttämällä ihmisen erityinen leviämisen merkki, Ki67. Lukumäärät Ki67 positiiviset ja negatiiviset-ihmisen solut laskettiin sisällä satunnaisesti valittu mikroskooppinen kenttä kunkin kasvaimen siirteen kaikista eläimistä ja keskiarvo. Leviämisen Index (%): (Ki67 positiivinen solumäärä /yhteensä ihmisen solujen määrä) x 100.

tutki myös genisteiini- vaikuttaa hinnat ohjelmoidun solukuoleman, apoptoosin. Immunohistokemiallinen analyysi anti-kaspaasi-3-vasta-ainetta paljasti, että kasvaimia genisteiini-käsitellyillä hiirillä oli vähemmän kaspaasi-3-positiivisia soluja kuin ne, kontrolliryhmässä (kuvio 4). Vertailuryhmä oli korkeimmat apoptoottinen indeksi (AI) 0,18%, kun taas sekä matalan ja korkean annoksen ryhmissä oli AI vain 0,07% (

p = 0,05

: kuvio 4a), joka osoittaa merkittävästi vähentynyt rate solukuoleman genisteiini-käsitellyt tuumorit.

apoptoottinen Index (AI) laskettiin kaspaasi-3 värjätään IHC osat kasvaimen köynnöksen kaikilta hiiriltä. Lukumäärä apoptoottisten solujen kohti 10000 ihmissoluja laskettiin kunkin kasvaimen siirteen ja keskiarvo. a) Apoptotic indeksi (%) = (kaspaasi-3 positiivinen solujen määrä /koko ihmisen solujen määrä) x 100. b) kaspaasi-3: immunohistologinen värjäys kasvaimen köynnöksen käsittelemättömien ja käsiteltyjen eläinten. Punaiset nuolet osoittavat positiiviset /apoptoottisia soluja. Kaikki suurennokset ovat × 400. Upotettavat on suurennettu kuva positiivisten solujen.

Genistein lisää fosforylaation Proteiinityrosiinikinaasien

Edellinen

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että genistein moduloi tyrosiinia signalointipolkujen by muuttamalla kinaasiaktiivisuudet [25], [26], [27]. Sen määrittämiseksi, onko parannettu etäpesäke havaittiin genisteiini-käsiteltyjen hiirten liittyy muuttunut fosforylaation kuvioita, Western blot-analyysi suoritettiin kasvaimen peräisin olevaa proteiinia lysaatit käyttäen anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta. Immunoblottaus osoitti, että genisteiini-käsitellyt tuumorit olivat korkeamman tason fosforylaation 60 kDa: n proteiinijuovana verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään. Mielenkiintoista, pidemmissä altistukset x-ray elokuva, voimakkaampi juovakuviot havaittiin korkeamman molekyylipainon proteiineista genisteiini hoidetussa ryhmässä kontrolliin verrattuna (kuvio S1). Erityisen kiinnostavaa oli bändi 170 kD. Pidemmät altistuminen paljasti bändejä genisteiini hoidetussa ryhmässä, kun taas ei fosforylaatio havaittiin kontrolliryhmässä juuri tällä kokoinen proteiini.

tutkittava tarkemmin, suoritimme immunoblottaus vasta-aineilla on suunnattu tietyille tyrosiinikinaaseiksi. Mahdollisia ehdokkaita 60 kD ja 170 kDa proteiinit (nuolet kuvassa 5 ja kuvassa S1) ovat Src ja sen potentiaali alkupään molekyyli, epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR). Kuten kuvassa 6a on esitetty, genisteiini lisääntynyt yhteensä EGFR-proteiinin ilmentymisen hieman verrattuna valvoa. Vaikka lähes kaikki käsittelemätön kontrolli kasvaimet (paitsi yksi) osoittivat hyvin vähän tai ei lainkaan fosforylaation Tämän proteiinin, useimmat genisteiini-käsitellyt tuumorit osoittivat korkean kaistan intensiteetin (kuvio 6a). Vastaavasti, Src, tavoite EGFR, osoitti hieman säätelyä koko proteiinin ilmentymisen verrattuna kontrolliryhmään. Jälleen, ei fosforylaatiota Src havaittiin verrokkiryhmässä (paitsi yksi kasvain on pidempi altistus), kun taas huomattavasti suurempi fosforylaation havaittiin genisteiini-kasvaimen näytteissä (kuvio 6b). Näitä erityisiä EGFR: n ja Src immunoblot vyöhykekuviot (kuvio 6) vahvistaa yleisen p-tyrosiinin värjäyskuviot havaittu aiemmin (kuvio 5).

Kolmen viikon hoidon genisteiinin, kasvaimet kerättiin, ja proteiini uutettiin kuusi genisteiini-käsitellyn ja viisi käsittelemättömien-kontrollihiiriin (yksi kontrollihiiristä kuoli hoidon aikana). Western blot -analyysi suoritettiin kasvaimen peräisin olevaa proteiinia lysaatit fosfotyrosiinille, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Sama kalvo värjättiin anti-alfa-aktiini-vasta arvioimiseksi proteiinia lastaus. Kaistat edustavat proteiineja yksittäisistä kasvaimista.

a) Genistein lisää fosforylaatio EGFR at tyrosiini- 1068 jäännöksen. Alla on määrällisesti kaistan intensiteetin fosforyloidun EGFR proteiinia lysaateista 5 käsittelemätön kontrolli ja 6 genistein käsiteltyä kasvaimia.

Sarakkeet

: keskimääräinen suhde fosforyloidun EGFR /yhteensä EGFR-proteiinin bändi intensiteetti ± SD. b) Genistein vaikuttaa fosforylaatiota Src at tyrosiinin 416 jäämiä. Aktivoidut Src ilme on huomattavasti suurempi genisteiini- saaneilla kasvaimia kuin hoitamattomilla kontrolli. Kaistat edustavat proteiineja yksittäisistä kasvaimista.

Keskustelu

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Pohjois-Amerikassa. Käyttöönoton jälkeen androgeeniablaatio terapiaa Huggins ja Hodges 1940-luvulla, hormoni manipulointi on käytetty pääasiassa hoidon kehittyneitä Eturauhassyövän [36]. Huolimatta alkuperäisen kasvainregressio seuraavat hormonihoitoa, jotkut jäljellä PCa solut voivat selviytyä tämän terapian, hankkia androgeenireseptorin itsenäisyys ja tulla hormoniresistentti [37]. Kun tauti etenee hormoni-tulenkestävien tilassa, ei ole olemassa tehokasta hoitoa tällä hetkellä saatavilla [38]. Siksi huomattava määrä on panostettu strategioihin hoitoon kehittyneitä Eturauhassyövän. Edellinen

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että genistein on kemoterapia-potentiaali hormoniriippuvaisen syöpäsolun linjat. Kuitenkin genisteiini n

in vivo

toimia ovat viime aikoina kyseenalaiseksi ristiriitaisia ​​raportteja [28], [29], [30], [39], [40], [41], [42]. Esimerkiksi yhdessä tutkimuksessa raportoitiin, että genisteiini inhiboi PC3 luun kasvaimen kasvua SCID-hiirissä [43], ja toinen osoittivat, että genisteiini laski keuhkojen etäpesäkkeiden androgeenireseptorin-negatiivinen PC3-M istutetaan hiiriä, jotka syötettiin genisteiini-rikastettu Chow [30]. Sen sijaan, Raffoul

et al.

Havaittu, että genisteiinin nieleminen johtaa kasvuun imusolmuke etäpesäke niiden PC3 istutetaan eläinmallissa [29]. Vuonna 2009 TOUNY ja Banerjee osoittivat kaksivaiheiseksi vaikutuksia genisteiinin käyttäen TRAMP hiiri (siirtogeeninen adenokarsinooma hiiri eturauhasen) malli. Genistein esti heikosti eriytetty PCa näissä hiirissä, kun ne kootaan niiden ruokavalio ennen kasvaimen aloittamista (eli kun hiiret ruokittu genisteiini–ruokavalio välillä 4~12 viikon iässä). Kuitenkin, jos genisteiini-ruokavalio annettiin vanhemmat TRAMP-hiiret iät 12~20 viikkoa, kun eturauhasen intraepiteliaalinen neoplasia (PIN) oli jo läsnä, se edistää PCa etenemistä ja indusoidun imusolmukkeen etäpesäke [28]. Sellaiselta tiedot, voidaan ymmärtää, että elämän ajan kohtalainen kulutus (tai varhainen altistuminen) genisteiiniä on tärkeää taudin ehkäisyyn, mutta genisteiini ehkä ole havaittavissa kemoterapeuttisia vaikutuksia

in vivo

kerran PCa on jo perustettu tai edennyt jo pitkälle.

Voit ratkaista kiista genisteiinin vaikutuksista

in vivo

kehitimme kliinisesti merkittäviä ksenograftimallia joka on tuotettu potilaan eturauhasen yksilö. Tuloksena potilaasta peräisin eturauhasen kasvain linja käytetään Tutkimuksessamme LTL163a, on kuljetettiin vain 10 sukupolvien immuuni-hiirissä ja on säilyttänyt alkuperäisen histopatologinen ja genotyyppisistä piirteet alkuperäisen kliinisen näytteen [33], [34]. Tuloksemme osoittavat, että sekä matala ja korkea annos genisteiinipitoisuuden hoitoja edistää etäpesäke tässä kehittynyt ihmisen PCa elinsiirtoa linja. Vaikka kasvaimen kokoa ei merkitsevää eroa ohjaus ja genistein hoidetuissa ryhmissä 3 viikon kuluttua hoidon, metastaattisen ilmaantuvuus oli suurempi genisteiini- saaneilla vs käsittelemättömiä kontrolleja. Metastaattista etenemistä havaittu mallissamme oli ominaista lisääntynyt solujen lisääntymistä ja laski apoptoosin.