Krooninen sairaus

tiivistelmä

Adenoviraaliset geeniterapian ja oncolysis olisi kriittisesti hyötyä kohdesolun merkintä muuntogeenisten kapsideista. Tämä edellyttää sekä ablaatio natiivi adenoviruksen tropismista ja tunnistaminen ligandeja, jotka ovat toimintakykyisiä viruksen yhteydessä. Täällä asetamme solutyyppispesifiselle pääsyn HAdV-5-pohjaiset vektorit geneettisellä ligandin insertiota kimeerinen kuidun akselin ja nuppi verkkotunnuksia lyhyen HAdV-41 kuitua (Ad5T /41sSK). Tämä kuitu muoto kerrottiin ablate transduktio

in vitro

ja biologinen jakautuminen maksaan

in vivo

. Osoitamme, että YSA peptidi, sitoutumisen yleiseurooppalainen syöpämarkkerien EphA2, voidaan lisätä kolme asentoa kimeerisen kuidun, jolloin vahva transduktion EphA2-positiivinen, mutta ei EphA2-negatiiviset solut ihmisen melanooman koepaloja ja tuumoriksenograftien jälkeen kasvaimensisäistä injektio. Transduktio esti liukeneva YSA peptidi ja palautettu EphA2-negatiivisten solujen jälkeen rekombinantti EphA2 ilme. YSA peptidi voidaan myös insertoida kolme asentoa a CAR sitova-ablatoitu HAdV-5 kuitu, jonka avulla tietyn transduktion; kuitenkin Ad5T /41sSK formaatti oli ylivoimainen

in vivo

. Lopuksi asetamme adenoviruksen kapsidin helpottaa toiminnallisia lisääminen kohdistaminen peptidien ja uusi adenovirus käyttäen tuumorimarkkeri EphA2 kuin reseptoriin suurella mahdollisuuksia syövän geeniterapiassa ja virusonkolyysiä.

Citation: Behr M, Kaufmann JK, Ketzer P, Engelhardt S, Mück-Häusl M, Okunin PM, et ai. (2014) adenoviruksia vastaan ​​käyttämällä Cancer Marker EphA2 kuin Receptor in vitro ja in vivo geneettinen ligandi sijoittaminen erilaisiin Capsid tukirakenteet. PLoS ONE 9 (4): e95723. doi: 10,1371 /journal.pone.0095723

Editor: Ilja Ulasov, Swedish Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2013 Hyväksytty: 30 maaliskuu 2014; Julkaistu 23. huhtikuuta 2014

Copyright: © 2014 Behr et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Helmholtz-yliopiston Young tutkija Group avustusta VH NG 212 ja Deutsche Krebshilfe (saksa Cancer Aid) myöntää 10-7946. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rekombinanttiadenoviruksia (mainokset) ovat prekliinisen ja kliinisen kehityksen onkolyyttisten aineita ja vektoreita rokotukset ja geeniterapia [1], [2] .uch Ad-pohjainen lääkkeet voivat merkittävästi hyötyä tai jopa riippuvat solu tyyppikohtaisia ​​toimintatapa, jotta voidaan rajoittaa haittavaikutuksia, säilyttäen terapeuttinen teho. Solutyypin-spesifisyys Ad-pohjaisia ​​vektoreita ja onkolyyteille on vakiintunut jälkeisellä lähtötasona kopiointiin kohdentamista ja microRNA asetus [3], [4] .Vuonna sijaan kohdentaminen Ad solun merkintä, mikä parempi välttää sivuvaikutukset ja virus sitomista, on edelleen haaste. Geneettiset strategioita Ad tulon kohdistaminen helpottaa yksinkertainen kliinisen laadun tuotannon (ei kemiallisia muutoksia tai erillisiä sovittimia tarvitaan) ja varmistaa, että jälkeläiset onkolyyttisten mainokset tuotettu potilaiden kasvaimet säilyttävät parantuneet ominaisuudet. Kuitenkin strategioita geneettinen tulon kohdentamista mainokset vaikeuttavat jäykän Ad kapsidin rakenne, kyvyttömyys vasta-molekyylejä, edullisina ohjaavia osia, taittaa oikein jälkeen fuusio cytosolically ilmaistuna kapsidiproteiineista, ja monimutkaiset vuorovaikutukset isännän tekijät moduloiva Ad solu merkintä potilailla (katso jäljempänä).

Entry kohdistamista mainokset edellyttää kahta vaihetta: ablaatio native tropismista terveitä soluja ja uudelleen kohdentaminen reseptorin ilmentyy spesifisesti kohdesoluihin liittämällä vastaavan ligandin osaksi Ad kapsidi. Cell tulo natiivimainoksista aloitetaan sitomalla kapsidiproteiinista kuidun liitetiedoston reseptoriin, joka on Coxsackie-Ad-reseptori (CAR) varten yleisimmin käytetty serotyyppi HAdV-5 [5] .Virus sisäistämisen jälkeen laukaisee sitoutuminen penton base solujen integriinien [6] .For terapeuttisia sovelluksia mainokset ole tarkoitus kohdistaa maksan kudosta, maksa de-kohdentaminen on keskeinen merkitys välttää myrkyllisiä sivuvaikutuksia. Kuitenkin poistoväline CAR sitova muta- kuitu ei vähentänyt maksan transduktion jälkeen systeemisen virus injektion [7] .Additional poistaminen integriinin sitova mutatoimalla Pentoniprote- pohja johti maksan transduktio joissakin mutta ei kaikissa tutkimuksissa [7] .Moreover, pentoniin emäksen mutaatiot saattavat vaikuttaa kielteisesti yhteydessä Ad kohdistaminen, koska virus entry ja post-merkintä vaiheet uudelleen kohdennettujen viruksia voi vaarantua [8] .Liver transduktio HAdV-5, riippumatta niiden vuorovaikutus CAR ja integriinit, johtui veren hyytymistekijöiden sitoutuneena heksoni ja kuidun [9] – [11] .Which reseptori välittää transduktio hepatosyyttien by HAdV-5

in vivo

keskustellaan edelleen [12], [13].

Meidän lähestymistapamme maahantulon kohdentamiseen HAdV-5-virusjohdannaiset on korvata kuidun akselin ja nuppi verkkotunnuksia vastaavien domeenien HAdV-41 lyhytkuituista (Ad5T /41sSK) ja lisätä peptidiligandeiksi tähän kimeerisen kapsidi. HAdV-41 sitoutuu CAR kautta toisen pitkiä kuituja, kun taas mitään solua sitova aktiivisuus syyksi on lyhyt kuitu. Vastaavasti voimakkaasti alentunut transduktio

in vitro

ja maksan transduktio

in vivo

ovat osoittaneet useat ryhmiä HAdV-5-pohjaiset vektorit, jotka sisältävät lyhyitä kuituja HAdV-41 tai läheisesti liittyvien HAdV -40 [14] – [19] Meillä on aiemmin osoitettu, että tarttuvuuden mainokset kimeerisellä Ad5T /41sSK kuitu (silloin kutsuttiin F5 /41s) voidaan palauttaa geneettinen peptidi ligandin lisääminen käyttämällä integriiniä sitova RGD4C-peptidi mallina peptidi [14] .Vuonna asiassa olemme tunnistaneet useita toiminnallisia sisäänpanokohdat, jolloin syntyy kimeerinen Ad5T /41sSK kuitua joustavana kuitu tukirakenteen ligandin lisäystä: HI ja EG silmukoita sivussa nupin ja IJ silmukka sen päälle , jolloin ylivoimainen transduktiotehoon verrattuna C-terminaalin fuusiot. Kuitenkin, kuten integriinit ovat ekspressoituvat, The RGD4C peptidi ei ollut sopivaa osoittaa potentiaalin Ad5T /41sSK muodossa solutyyppispesifisen solun merkintä ja transduktio. Siksi käsillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli luoda soluun pääsyn kohdennusta Ad5T /41sSK strategiaa käyttäen solu-selektiivisen peptidiligandin ja vertaamaan tätä strategiaa, jossa on HAdV-5 kuitupohjaisten kohdistamista lähestymistapaan.

YSA peptidi, 12-mer faaginäytöllä tunnistettuja, sitoutuu selektiivisesti reseptorityrosiinikinaasin EphA2, mutta ei liittyvien kinaasien [20] Meillä keskittäneet tutkimusta tämän peptidin ligandin, koska toisin kuin useiden muiden testattujen peptidien se säilytetään solu- sitoutumisaktiivisuutta yhteydessä Ad kuitua. Tärkeää on, EphA2 on saamassa lisääntyvää huomiota myös kohteena syövän hoidossa, koska se on (i) säädelty useimpien kiinteiden kasvainten ja kasvaimen endoteelin, (ii) parempi saatavilla kasvaimia, jotka usein puuttuu soluihin liittynyt ligandeja, (iii) toiminnallisesti liittyvät kasvaimen etenemisen, ja (iv) äskettäin raportoitu olevan syövän kantasoluja merkki [21], [22] .Several EphA2 kohdistetut hoitomuodot ovat osoittaneet proof of concept prekliinisissä tutkimuksissa, mukaan lukien estäjät, vasta-aineet, immunotoksiineja suunniteltu T-solut, liukoiset reseptorit, ja rokotteet [22] – [24].

Täällä tutkimme Ad merkintä kohdistaminen

in vitro

ja

in vivo

geneettisesti työntämällä EphA2 sitova YSA peptidin eri reseptoria sokea Ad kuitua tukirunkoja. Erityisesti tutkimme sivustoja toiminnallinen YSA peptidin laittamista nuppi verkkotunnuksia lyhyen HAdV-41 kuitua ja HAdV-5 kuitua. Lisäksi viruksen muodostumista yhdistetty kuitu transfektiolla /virus superinfektio kuten olemme tehneet aiemmin [14], tutkimme suoraan engineering kuidun geenien viruksen genomeja, mikä on edullista tai joita tarvitaan helppous viruksen valmistus ja virusonkolyysiä, vastaavasti . Selektiivisyys ja tehokkuus Ad solun tulon välittyy YSA peptidi tutkittiin soluviljelmässä ihmisen etäpesäkkeitä koepaloja, ja eläin- ksenograftimalleja kolmea erilaista kuitua muodossa: (i) kimeerisen Ad5T /41sSK kuitua, (ii) pitkän shafted kimeerinen kuitu sisältävä HAdV-5 kuitua hännän ja akselin verkkotunnuksia ja lyhyen HAdV-41 kuitua nuppi, ja (iii) pitkän shafted mutta CAR sitova ablatoitu HAdV-5 kuitua.

tulokset

erityisiä transduktio EphA2-positiivisten solujen mainokset kanssa YSA peptidin työnnetään kimeerisiä kuituja sisältävä nuppi HAdV-41 lyhytkuituista

Tutkimme tulon kohdentamista mainokset geneettisen insertoimalla kohdistaminen peptidin kimeerisiä kuidut HAdV -41 nuppi kuin de kohdistetun rakennusteline. Tätä varten olemme asettanut 12-mer EphA2-sitoutuvan peptidin YSA [20] tukena lyhyet linkkerit osaksi HI, IJ tai EG silmukoita tämän nupin verkkotunnuksen. Tutkia merkitystä varren pituus YSA välittämän Ad transduktion yhdistimme nämä YSA sisältäviä nupit lyhyt HAdV-41 kuitu akseli (Ad5T /41sSK viruksia, Fig. 1A) tai pitkän HAdV-5 kuitu akseli (Ad5TS /41sK viruksia, Fig. 1 B). Kolmannessa joukko kuituja, me sisällytetty pitkän HAdV-5 kuitu akseliin mutatoitunut hepariinisulfaatti- proteoglykaanin (HSPG) sitoutuvilla motiivi (Ad5TS * /41sK viruksia, Fig. 1 C). Tämä mutaatio raportoitu antamaan parannetun de kohdistamisen [17], [25], [26] Jälkeen plasmiditransfektiolla, kaikki konstruktit ilmaisivat ja omisti trimerointiin kapasiteetti, mutta trimeroituminen oli selvästi tehottomampi pitkän shafted konstruktioita, erityisesti joka sisältää peptidin HI silmukka (Fig. 2A). Käyttämällä yhdistetty transfektio /superinfektio protokollaa (katso materiaalit ja menetelmät), pystyimme tuottamaan korkean tiitterin pseudotyypitettyä LacZ toimittaja Ad vektorien kaikkien kuitua muotoja. Sisällyttäminen kuitumolekyylejä viruspartikkeleihin oli tehokas lyhyen shafted kuitua ja huolimatta alentunut trimeroituminen kapasiteettia, pitkän shafted IJ-YSA kuituja (Fig. 2B). Pitkän shafted EG-YSA ja HI-YSA kuituja osoitti alentuneita tai puuttui kuitu sisällyttämisestä viruspartikkeleita, vastaavasti.

(A) Lyhyt shafted kimeerisiä kuitujen kanssa HAdV-5 hännän fuusioitu akseli ja nuppi HAdV-41 lyhyt kuitu. (B, C) Pitkän shafted kimeerisiä kuituja sisältävä HAdV-5 hännän ja villin tyypin (B) tai mutantti (C) akselille fuusioitu HAdV-41 lyhyt kuitu nuppi. (D) CAR sitoutuminen-ablatoitu HAdV-5 kuituja. YSA peptidi insertiokohdat merkitty silmukoita. Insertion linkkerisekvenssin eri asennoissa HAdV-5 kuitu nuppi IJ silmukka johti menetykseen trimerisointireaktion kapasiteetti (tuloksia ei ole esitetty) ja virukset eivät valmista tälle insertiokohtaa.

(A) immunoblottaus unboiled solulysaateista jälkeen ohimenevän transfektion kuidun -ekspressioplasmidien 293T-soluihin. (B) Immunoblotti puhdistettua virusta hiukkasten pseudotyypitettyä LacZ reportteri viruksia tuottaman transfektion /superinfektio protokollaa. (C) transduktio EphA2-positiivisten ja EphA2-negatiivisten solujen pseudotyypitettyä LacZ reportteri viruksia. SK-MEL-28-soluja transdusoitiin neljänä rinnakkaisena, kaikki muut solulinjat transdusoitiin kolmena rinnakkaisena. Pylväät ja virhepalkkeja näyttää keskiarvot ja standardipoikkeamat β-Gal aktiivisuutta, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä; * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna 5T41sSK vastaavissa solulinjassa.

Seuraavaksi analysoitiin EphA2 ilmentymisen paneeli haimasyövän soluja, melanoomasoluja , endoteelisolujen, ja maksan solulinjaan. Olemme havainneet vahva EphA2 ilmaisu haimasyöpä, endoteelisolujen, ja 4 6 melanooman soluviljelmissä (Fig. S1). EphA2 ei havaittu kahden Melanoomasolulinjojen SK-MEL-28 ja Mel624 ja maksan HepG2. Transduktio kokeiluja EphA2-positiivisia solulinjoja PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 (haimasyöpä) ja C8161 (melanooma) tuotti tuloksia, jotka olivat samanlaiset vastaavien solulinjoissa: Kaikki kolme virukset pseudotyypitetty lyhyen shafted YSA kuidut osoitti transduktio, joka oli oleellisesti vahvempi kuin valvonta-viruksiin YSA peptidi (Fig. 2C; 10-kertaisesti 35-kertainen β-Gal-aktiivisuus). Virusten varalta muunneltua HAdV-5 akseli, sijoittelua YSA osaksi HI, IJ ja EG silmukoita osoittivat heikkoa, vahva, ja väli transduktioteho, vastaavasti. Pitkän shafted IJ-YSA virus oli jopa parempi kuin lyhyt shafted viruksia (p 0,05 kaikissa solulinjoissa.). Kaikkien virusten kanssa mutatoitunut pitkärikinen, havaitsimme tehoton transduktion (esitetty PANC-1 ja C8161-solujen). In EphA2-negatiivinen SK-MEL-28-soluja, EG-YSA virus ja erityisesti IJ-YSA virus modifioimattoman pitkän akselin osoitti transduktion merkittävästi suurempi kuin kontrolli viruksia. Olemme päätellä, että lyhyen shafted Ad5T /41sSK viruksia YSA peptidin työnnetään EG, HI tai IJ silmukka selektiivisesti transdusoida EphA2-positiivisia kasvainsoluja, kun taas pitkä shafted Ad5TS /41sK-IJ-YSA virus havaittiin vielä voimakkaampi, mutta vähemmän selektiivinen transduktio .

Seuraavaksi tutkimme miten transduktioteho pseudotyypitettyä YSA virusten vertaa viruksia sisältävä perustettu, integriiniä sitova RGD-peptidin kasvain- ja endoteelisoluissa. Useimmat aiemmat tutkimukset geneettisestä peptidiligandin lisäys käytetään RGD sisältäviä peptidejä ja osoittivat parempaa, mutta ei kohdesolun entry [27] – [29] .Indeed, HAdV-5 virusten RGD peptidin HI silmukka tutkitaan kliinisissä tutkimuksissa, koska niiden parantuneen solujen pääsyn tehokkuutta [30] Meillä havaittu, että yhteydessä Ad5T /41sSK kimeerisen kuidun YSA peptidi-välitteisen transduktion EphA2-positiivisten solujen oli samanlainen tai jopa parempi kuin transduktio välittämien RGD4C peptidi lisätään HI silmukka (Fig. 3A ja B), tehokkain insertiokohdan tämän peptidin [14] .Vuonna EphA2-negatiivinen SK-MEL-28-soluja, vain RGD virus johti transduktion huomattavasti suurempi kuin kontrolli viruksella ilman peptidiä. Lopuksi, voisimme osoittaa, että transduktion EphA2-positiivisten solujen Ad5T /41sSK-HI-YSA ja Ad5T /41sSK-IJ-YSA mutta ei Ad5T /41sSK-HI-RGD tehokkaasti estänyt liukoinen YSA peptidi, kun taas ohjaus peptidin satunnaistettu sekvenssi ei estänyt transduktion (Fig. 3B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat voimakkaita YSA-välitteisen transduktion nimenomaan EphA2-positiivisten solujen mainokset YSA peptidin työnnetään kimeerinen Ad5T /41sSK kuitua.

(A) transduktio EphA2-positiivisia ja EphA2-negatiivisia soluja pseudotyypitettyä Ad-vektorit, jotka sisältävät lyhyen shafted kimeerisiä kuidut geneettisen insertion YSA peptidin verrattuna matching vektorien geneettinen insertio RGD4C peptidin. Solut transdusoitiin neljänä rinnakkaisena. (B) transduktio EphA2-positiivisten PANC-1-soluissa, kun kilpailevat liukoisen YSA peptidin tai verrokkipeptidin satunnaissekvenssisegmentti. Solut transdusoitiin pseudotyypitettyä mainokset kolmena rinnakkaisena. Pylväät ja virhepalkkeja näyttää keskiarvot ja standardipoikkeamat β-Gal aktiivisuutta, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01 *** p 0,001 versus 5T /41sSK (*) tai 5T /41sSK-HI-RGD (

#).

erityisiä transduktion EphA2-positiivisten solujen mainokset kanssa YSA peptidin työnnetään CAR sitova-ablatoitu HAdV-5 kuitu

erityisiä sovelluksia, kuten jotka edellyttävät kasvainspesifisiä geeninsiirto mutta ei maksa de-kohdistus (ks keskustelu), mainoksia, joiden HAdV-5-pohjainen kuitua saattaa riittää tai edullista verrattuna laajemmin muokattu kimeerisen kuitupitoista viruksia. Tästä syystä ja verrata meidän kimeerisiä kuitu muodossa natiivi yksi, tutkimme mikä sisäänpanokohdat mahdollistaa geneettinen sisällyttäminen YSA peptidin autoon sitova-ablatoitu HAdV-5 kuitu nuppi KO1 (S408E ja P409A mutaatioita, viite [31], kuva 1D). Huomasimme, että YSA peptidi voidaan lisätä CD, EG ja HI silmukoita kuidun pidike trimerisointireaktion kapasiteetti (jonkin verran vähemmän tehokas CD loop) ja sisällyttäminen valmiudet otetaan viruspartikkelit tuottaman transfektion /superinfektio protokollaa (Fig. 4A ja B). Olemme myös tutkineet IJ silmukka mahdollisena asema peptidin ligandin lisäys ottaen huomioon suotuisa sijainti päällä nupin verkkotunnuksen. Olemme kuitenkin havaittu kuituhukkaa trimerisaatiodomeeni jälkeen kytkijäjaksoa asemissa G560 /H561 tai I564 /N565 (ei esitetty). Pseudotyypittää Mainokset kanssa YSA peptidin työnnetty EG, HI tai CD silmukan KO1 nupin välittämän tehokas transduktio EphA2-positiivisten solujen, joka oli 8-kertainen 230 kertaa parempi kuin kontrolli virus Ad5KO1 ilman peptidin lisäys (Fig. 4C ). Ad5KO-HI-YSA virus oli tehokkaampi kuin Ad5KO-EG-YSA ja Ad5KO-CD-YSA viruksia kaikilla testatuissa solulinjoissa sekä parempi Ad5T /41sSK-EG-YSA. Lisäksi Ad5KO-HI-YSA virus osoittivat samanlaisia ​​tai parempia transduktiotehokkuus verrattuna Ad5WT virus, joka sisältää villityypin HAdV-5 kuitua. In EphA2-negatiiviset solut, yksikään viruksia YSA peptidin työnnetään KO1 kuidun lisääntynyt transduktiotehokkuus verrattuna emo-virus (Fig. 4C), mikä osoittaa puute off-kohde-transduktion. Lopuksi transduktion tehokkuutta mainokset kanssa YSA peptidin laittamista HAdV-5 kuitu riippuu pistokohtaan kanssa HI paikoilleen kiinnitettävää transduktiotehoa ja spesifisyys.

(A) Immunoblotti unboiled solulysaateista jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla kuitua -ekspressioplasmidien 293T-soluihin. (B) Immunoblotti puhdistettua virusta hiukkasten pseudotyypittää LacZ reportteri viruksia. (C) transduktio EphA2-positiivisten ja EphA2-negatiivisten solujen pseudotyypitettyä LacZ reportteri viruksia. Solut transdusoitiin neljänä rinnakkaisena, pylväät ja virhepylväät osoittavat keskiarvot ja standardipoikkeamat β-Gal aktiivisuutta, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01, ***

/### p 0,001 versus 5T /41sSK (*) tai 5KO1 (

#) .

EphA2 välittämää transduktion kasvain ja endoteelisoluissa genomisesti kuitu-modifioitu mainokset

seuraava kehittäneet EphA2 kohdistetut viruksia muunnettu kuitujen koodaama niiden genomin sijaan pseudotyypitettyä transfektiolla . Genomisesti muokatut virukset yksinkertaistaisi valmistusmenetelmät ja helpottaa suuren mittakaavan tuotantoon viruksia. Myös perimän kuitu lisäys vaaditaan yhteydessä virusonkolyysiä. Ei kuitenkaan ole selvää, kuinka genomista kuidun korvaaminen vaikuttaa tuotantoon tarttuvien virusten. Itse asiassa, aikaisemmassa tutkimuksessa raportoitiin kasvuhäiriöt ja /tai viallisen hiukkasia Ad-vektorit, joissa natiivin kuidun geenin korvattu geenillä, joka koodaa koko lyhyen HAdV-41 kuitu peptidi insertioita [32] .Using BAC recombineering tekniikka, meidän kloonattu kuusi genomien ensimmäisen sukupolven GFP /Luc toimittaja viruksia. Kolmessa genomien HAdV-5 kuidun korvattiin YSA sisältävää kuitua, jotka edustavat kunkin kuidun muodossa (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA ja Ad5KO1-HI-YSA). Muut kolme genomien edustaa ohjaus virusten Ad5T /41sSK, Ad5wt, ja Ad5KO1. Kaikki virukset voitiin valmistaa korkean tiitterin ja näytti tehokas kuitujen sisällyttäminen (Kuva. 5A). Tulokset transduktio kokeita näiden geneettisesti muokatut virukset jäljentää, jotka saatiin pseudotyypitettyä viruksia tuottaman transfektiolla /superinfektio protokolla, joka osoittaa, että genominen kuidun lisääminen onnistui (Kuva. 5B-D): In EphA2-positiivisten haimasyöpäsoluissa, melanoomasoluja ja endoteelin solut, me taas havaittiin dramaattinen kasvu transduktiotehoon varten YSA-viruksia sisältävät verrattuna reseptoria sokea ohjaus virusten (15-kertaisesti 236-kertaiseksi). Insertio YSA peptidin osaksi KO1 kuitu johti Suurinta kasvu transduktiotehoa. IJ-YSA säiekimeeristen virus pitkä varsi oli jälleen hieman vahvempi kuin vastaava virus on lyhyt varsi. Huomattavaa on, että YSA virukset johti vahvempi transduktio myös verrattuna viruksen sisältävä villityypin HAdV-5 kuidun EphA2-positiivisten solujen. Näin oli, ei ainoastaan ​​soluja heikosti transdusoitu viruksia, joissa on HAdV-5 kuidun, eli C8161-soluja (36-kertaisesti 220-kertaisesti), mutta myös EphA2- ja CAR-positiivisia [33], [34] soluja MIA PaCa-2, PANC-1 ja HUVEC. In EphA2-negatiivisia SK-MEL-28 ja HepG2-soluissa, Ad5T /41sSK-IJ-YSA ja Ad5KO1-HI-YSA ei osoittanut merkittävää kasvua transduktiotehokkuus verrattuna verrokkeihin nähden ilman peptidin lisäys, kun taas Ad5TS /41sK-IJ-YSA jälleen osoitti jonkin verran lisääntynyt transduktio. Visualisointi GFP: n ilmentymisen vahvisti, että mainokset kanssa YSA peptidi johti transduktion huomattavasti suurentunut prosenttiosuuksien EphA2-positiivisten solujen verrattuna ohjaus viruksia ilman peptidin ja myös verrattuna Ad5wt (Fig. S2). In EphA2-negatiivisia soluja, transduktiotehokkuus siten kuin tässä GFP-pohjainen lukema oli voimakkaasti pienentyä Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5KO1-HI-YSA, Ad5T /41sSK ja Ad5KO1 verrattuna Ad5wt, mutta ei niinkään Ad5TS /41sK-IJ-YSA. Nämä tulokset vahvistavat, että Ad5T /41sSK-IJ-YSA ja Ad5KO1-HI-YSA virukset on paras merkintä kohdistaminen mahdu EphA2-positiivisia soluja. Huomattavaa on, että transduktion SK-MEL-28-soluihin YSA viruksia, mutta ei ohjaus viruksia ilman peptidiä lisääminen voisi palauttaa yli-ilmentyminen yhdistelmä-EphA2 (Fig. 6, kuva. S3), jotka osoittavat, että EphA2 välittää solun tulon YSA peptidi- viruksia sisältävät.

(A) Immunoblot puhdistettua viruspartikkeleiden syntyy genomista lisäämällä rekombinantti kuituja. (B-D) transduktio EphA2-positiivisten syöpäsolujen (B), EphA2-negatiiviset solut (C) ja EphA2-positiivisia endoteelisoluja (D), jossa genomisesti säikeen osalta modifioitujen Luc /GFP toimittaja viruksia. C8161-solut transdusoitiin kolmena rinnakkaisena, kaikki muut solulinjat transdusoitiin neljänä rinnakkaisena. Pylväät ja virhepalkkeja näyttää keskiarvot ja keskihajonnat Luc ilmaisun, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä; *

/# p 0,05, **

/## p 0,01, ***

/### p 0,001 versus 5T /41sSK (*) tai 5KO1 (

#) .

SK-MEL-28-solut transfektoitu EphA2 ekspressioplasmidilla (pcDNA-EphA2) tai kontrolli-plasmidi (pcDNA) on transdusoitiin genomisesti kuitu-modifioitu Luc /GFP toimittaja viruksia. Solut transdusoitiin neljänä rinnakkaisena, pylväät ja virhepalkkeja näyttää keskiarvot ja keskihajonnat Luc ilmaisun, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä; ** P 0,01, *** p 0,001 ilmoitettu vertailuissa. Havaitsemiseksi EphA2 ilmentymisen transfektoiduissa soluissa ks. S3.

YSA peptidi välittämää adenoviruksen transduktio haimasyövän ja melanooma ksenografteissa

in vivo

Tuotanto korkean tiitterin valmisteiden genomisesti kapsidin muokatut virukset pystyimme suorittamaan eläinkokeet tutkimaan YSA peptidin välittämä adenoviruksen transduktio

in vivo

. Tätä varten käytimme NOD-SCID-hiirten ihon alle ksenograftikasvaimissa ja PANC-1 haima- syöpäsoluja tai C8161-melanoomasoluja. EphA2 ilme

in vivo

varmistettiin kummassakin kasvainmuodoista (Fig. S4). Ensimmäisessä kokeessa, me injektoitiin eläimiin, joissa PANC-1 tai C8161 kasvaimen kasvaimen (i.t.) ja Ad5T /41sSK-IJ-YSA tai Ad5T /41sSK (Fig. 7A). Molemmissa kasvainmuodoista havaitsimme merkittävästi vahvempi transduktion Ad5T /41sSK-IJ-YSA (2,9-kertainen PANC-1 ja 5,9-kertainen C8161), mikä osoittaa, että YSA-peptidi-välitteisen transduktio on toiminnallinen

in vivo

. Toisessa kokeessa me ruiskutetaan C8161 kasvaimia i.t. jossa YSA sisältävän mainokset edustavat kutakin kuidun muodoissa (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA ja Ad5KO1-HI-YSA) tai kontrolli viruksia (Fig. 7B). Lisääntynyt transduktio for Ad5T /41sSK-IJ-YSA versus Ad5T /41sSK vahvistettiin. Ad5TS /41sK-IJ-YSA osoitti jonkin verran suurempi transduktio kuin Ad5T /41sSK-IJ-YSA. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa

in vitro

transduktion tuloksia. Kuitenkin toisin kuin

in vitro

data Ad5KO1 osoitti samanlaista transduktiotehoon kuin Ad5wt jälkeen i.t. injektio C8161 ksenografteissa paljastamaan menetys de kohdistaminen. Näin ollen kasvua transduktio YSA peptidi lisäys oli vähäinen (1,6-kertainen), mutta saavutti merkitys. Siksi ke- ja uudelleen kohdentamista mainokset erillinen merkintä kautta EphA2 jälkeen i.t. injektio

in vivo

oli parhaiten toteutettu Ad5T /41sSK kuidun muodossa. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että peptidi-välitteinen merkintä kohdistaminen käyttämällä Ad5T /41sSK kuidun muoto on toiminnallinen

in vivo

jälkeen i.t. virus injektio.

(A, B) 2 x 10

10 vp genomisesti kuitu-modifioitu, EphA2 kohdistetut Luc /GFP toimittaja ja valvonta virukset injektoitiin kasvaimen osaksi NOD-SCID kuljettaa tuumoriksenografteja ( n = 6-9 kasvaimia per ryhmä). Lusiferaasireportterigeenin ilmentyminen kasvaimissa kvantitoitiin 3 päivää sen jälkeen, kun virus injektion. Pylväät ja virhepalkkeja näyttää keskiarvot ja keskihajonnat, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä. * P 0,05 versus 5T /41sSK,

# p 0,05 ja

### p 0,001 versus 5KO1.

YSA peptidi välittämää adenoviruksen transduktion koepaloja ihmisen melanooman etäpesäkkeiden

tutkimme seuraavaksi EphA2 kohdistettuja mainoksia johtaa lisääntyneeseen transduktio paitsi yksikerroksisessa kasvainsoluviljelmiä ja kasvainsolujen ksenograftien, mutta myös juuri biopsoidun kasvain materiaalia potilaista. Nämä kliinisesti merkityksellisempää substraattien suhteen kasvainsolun fysiologiaan ja läsnäolo kasvain microenvironment. Koepaloja melanooman etäpesäkkeiden leikattiin elävää kudosta viipaleiksi heti leikkauksen jälkeen ja myöhemmin transdusoitiin genomisesti kapsidi-modifioitu, YSA sisältäviä mainoksia, jotka edustavat kunkin kuidun muodoissa tai ohjaus viruksia. EphA2 ekspressiota havaittiin elävää kudosta viipaletta kaikki biopsiat saadaan 5 potilasta. Kuitenkin ilmaisu vaihteli potilaiden ja oli heikompi kuin yksikerrosviljelmissä (Fig. S5a). Tämä oli odotettavissa, koska koepaloja sisältävät seoksen soluja, joista vain osa on kasvainsoluja. Havaitsimme vahvin transduktiotehon määritettynä GFP: n ilmentymisen virusten varalta YSA peptidin ja valvontaa viruksen kotoperäisten HAdV-5 kuitua, vahvistaa YSA peptidi-välitteisen transduktion (Fig. S5B). Kuten GFP signaalit 2D valokuvia ei määrällisesti edustaa transduktiotehoon, osittain johtuen ryppyinen muoto viipaleet jälkeen 3 päivää kulttuurin, me määrällisesti lusiferaasiekspressio näiden viipaleiden (Fig. 8A) ja koepalat neljä ylimääräistä potilaista (Fig. 8B-E, yksi koepala tuotti vain tarpeeksi viipaleita transduktion Ad5T /41sSK-IJ-YSA ja Ad5T /41sSK). Huomaa, että lusiferaasi lukemat ovat korkeat, koska teimme suuritiitterinen transductions mahdollistaa seurannan GFP: n ilmentymisen. Havaitsimme selvästi lisääntynyt transduktio for Ad5T /41sSK-IJ-YSA verrattuna Ad5T /41sSK 5 5 koepaloja (merkittävyys saavutettiin 3 koepaloja kanssa 4.3- 576-kertainen eroja, ei jäljellä koepaloja niukan materiaalin) . Voimakkaimmin kasvu transduktio havaittiin koepalan joka osoitti voimakkainta EphA2 ilme. Ad5TS /41sK-IJ-YSA osoitti suurempi transduktio kuin Ad5T /41sSK 4 4 koepaloja, mutta oli pienempi kuin Ad5T /41sSK-IJ-YSA 3 4 koepaloja, jotka oli vastakkaisesti tuloksiin yksikerrosviljelmissä. Lopuksi, transduktio melanooman elävän kudoksen siivut Ad5KO1-HI-YSA oli voimakkaasti noussut verrattuna Ad5KO1 4 4 koepaloja (2,1-kertainen 17,1-kertaiseksi, merkittävää 2 koepaloja). Nämä tulokset vahvistavat uudelleen kohdistetun adenoviruksen transduktio välittämiä liitetyn YSA peptidi Ad5T /41sSK-IJ-YSA ja Ad5KO1-HI-YSA myös kliinisesti merkittävää Tuumorinäytteiden materiaalia.

(A-E) Living kudos viipaleita melanooman etäpesäkkeiden 5 eri potilasta transdusoitiin 10

10 vp /viipale genomisesti kuitu-modifioitu, EphA2 kohdistetut Luc /GFP toimittaja ja valvonta virukset. Määrä transdusoidut viipaletta kohden virus oli riippuvainen koko biopsia ja se oli n = 4 (A, B), n = 3 (C), n = 2 (D) ja n = 5 (E). Lusiferaasireportterigeenillä ilmentyminen kvantifioitiin 3 päivää transduktion jälkeen. Sarakkeet (A-E) ja virhepalkkeja (A, B, C, E) osoittavat keskiarvot ja keskihajonnat, vastaavasti. RLU, suhteellinen luminesenssi yksikköä. *

/# p 0,05 versus 5T /41sSK (*) tai 5KO1 (

#).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa perustaa solutyyppispesifiselle Ad solun tulon funktionaalinen peptidiligandin työntämistä de kohdistetun kimeerisiä kuitu telineen, joka sisältää lyhyen HAdV-41 kuidun akselin ja nuppi (Ad5T /41sSK). Lisäksi kuvaamme Ad-vektorit entry-suunnattu erittäin merkityksellinen yleiseurooppalainen syövän pintamerkkiaine EphA2 Genomin insertoimalla koodaavan geenin kimeeristä kuidun tai CAR sitovan-ablatoitu HAdV-5 kuitu YSA peptidiligandin. Transduktio EphA2-positiivisten solujen

in vitro

oli kasvoi jyrkästi peptidiligandin paikoilleen sekä kuidun muodossa (jopa 236-kertaisesti), mikä korostaa tehoon YSA peptidi uudelleen kohdistamista virus- solusitoutumisen ja merkintä . Olemme aiemmin tunnistettu EG, HI ja IJ silmukat Ad5T /41sSK alueiksi toiminnallinen insertion RGD4C-peptidi, joka sitoutuu laajasti ilmaistuna integriineihin [14]. Täällä vahvisti toteutettavuuden insertiokohtiin käyttäen EphA2 sitova YSA peptidi. Toisin kuin RGD-peptidi, joka osoitti erinomaisen aktiivisuuden HI silmukka, havaitsimme samanlaista toimintaa kunkin kolmen silmukoita YSA peptidin (Fig. 2), paljastaa, että insertiokohdat vaikuttavat peptidi-reseptori vuorovaikutuksia eri riippuvainen peptidin . Kun YSA peptidi, voisimme osoittaa ensimmäistä kertaa, että kimeerinen Ad5T /41sSK kuitu helpottaa solutyyppispesifiselle Ad transduktio käyttäen paneelia EphA2-positiivisten ja EphA2-negatiiviset solut (kuviot. 2 ja 5). Peptidi kilpailun ja yhdistelmä-reseptorin ilmentymisen tutkimukset osoittavat selvästi, että transduktio on peptidi-spesifisten ja välittyy EphA2 (kuviot. 3 ja 6). Nämä tulokset luoda perusteet tulevaisuuden tutkimuksiin, olisi tutkittava, onko edelleen ligandi peptidit ovat toiminnallisia Ad5T /41sSK kuidun rakennustelineet, joka mahdollistaa viruksen pääsyn kohdistaminen kautta muun pinnan markkereita.

osoittaa, että käyttöönotto modifioidun kuitujen viruksen genomin, joka korvasi natiivin kuitu, on mahdollista (Fig. 5) lisäksi Pseudotyypitys kautta kaksivaiheinen transfektion /superinfektio protokollaa, kuten myös käytetty edellisessä tutkimuksessa ([14], kuviot. 2-4). Havaitsimme tehokas kuitu trimerointiin, virus tuotanto ja kuitujen sisällyttäminen viruspartikkelit varten genomisesti muokatut virukset kanssa 5T /41sSK kuidut (ja KO1 kuidut, katso alla).