Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nicotinamide fosforibosyylitransferaasin (NAMPT) on tärkeä rooli solujen bioenergetiikan. Se on vastuussa muuntaa nikotinamidi on nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi, olennainen molekyyli solun aineenvaihduntaan. NAMPT on tutkittu laajasti viime vuosikymmenen aikana johtuen rooliaan keskeisenä säätelijänä nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia vievää entsyymejä. NAMPT tunnetaan myös potentiaalinen kohde terapeuttiselle interventiolle, koska sen osallistumista tauti. Nykyisessä tutkimuksessa käytettiin maailmanlaajuisen massaspektrometria-pohjainen metabolomic lähestymistapa vaikutusten tutkiminen FK866, pieni molekyyli estäjä NAMPT tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa, aineenvaihdunnan häiriöt ihmisen syöpäsoluja. Käsittelimme A2780 (munasarjasyöpä) ja HCT-116 (peräsuolen syöpä) solulinjoissa FK866: n läsnä ja poissa ollessa nikotiinihappoa. Merkittävät muutokset havaittiin aminohappojen aineenvaihdunnassa sekä puriini- ja pyrimidiini- aineenvaihduntaa. Havaitsimme myös aineenvaihdunnan muutoksia Glykolyysivaiheen, sitruunahappokierron (TCA), ja pentoosifosfaattireitistä. Laajentavat havaitun polaaristen metaboliittien ja parantaa datan luottamusta, haimme maailmanlaajuisen metabolomiikan profilointi alusta käyttämällä sekä ei-kohdennettu ja kohdennettua hydrofiilisten (HILIC) -LC-MS ja GC-MS-analyysia. Käytimme Nerokkuus Knowledge Base helpottamiseksi projektio metabolomiikan dataa metaboliareitteihin. Useat metaboliareittiä osoitti ero vastauksia FK866 perustuu useisiin ottelut luetteloon selityksin aineenvaihduntatuotteiden. Tämä tutkimus viittaa siihen, että globaali metabolomiikan voi olla hyödyllinen väline farmakologinen tutkimuksia vaikutusmekanismi huumeiden solutasolla.

Citation: Tolstikov V, Nikolajev A Dong S, Zhao G, Kuo MS (2014 ) metabolomiikka analyysi metabolinen vaikutus Nicotinamide fosforibosyylitransferaasin (NAMPT) esto on ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (12): e114019. doi: 10,1371 /journal.pone.0114019

Editor: Ramón Campos-Olivas, Espanjan National Cancer Center, Espanjassa

vastaanotettu: 24 helmikuu 2014; Hyväksytty 4 marraskuuta 2014; Julkaistu: 08 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Tolstikov et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Eli Lilly and Company. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät ovat työntekijöitä Eli Lilly and Company ja sellaisenaan, ovat vakaumusta tai taloudellinen osallistuminen Eli Lilly and Company. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Jatkona aikaisemmassa tutkimuksessa farmakologisen eston nikotiiniamidi fosforibosyylitransferaasin (NAMPT) kuvaava metabolinen perusteella NAMPT inhibition [1], raportoimme tässä tuloksista maailmanlaajuisen metabolomiikan analyysi, joka paljasti metabolisen korjauksilla NAMPT inhibition ihmisen syöpäsoluja. Nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD) kofaktorina on välttämätöntä erilaisia ​​soluprosesseja. Nisäkkäillä, NAD voidaan syntetisoida nikotinamidi, nikotiinihappo, tai tryptofaanin [2] – [5]. In vivo pitoisuus nikotiinihappo on pieni johtuen sen nopeasta erittymistä ja aineenvaihduntaa, mikä viittaa siihen, että käyttöaste nikotiinihapon NAD biosynteesissä verrattuna nikotiiniamidi on rajoitettu nisäkkäillä [3]. De novo biosynteesissä NAD tryptofaanista tapahtuu pääasiassa maksassa [4]. Näin ollen, kahden vaiheen salvage-reitin, joka muuntaa nikotiiniamidi NAD on tärkein reitti NAD biosynteesiä nisäkkäiden [6] – [8]. NAMPT, tunnistettiin alun perin esi-B-solujen pesäkkeitä parantaa tekijä [9], on nopeutta rajoittava entsyymi, joka katalysoi ensimmäinen vaihe biosynteesissä NAD peräisin nikotiiniamidi [10], [11]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että NAMPT välittämää NAD biosynteesiä syöpäsoluissa keskeinen rooli useissa fysiologisissa prosesseissa, kuten aineenvaihdunta, energiantuotanto, selviytyminen, apoptoosin, DNA: n korjaukseen, ja tulehdus [2], [12] – [14]. On osoitettu, että NAMPT yliekspressoituu useita erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien rinta-, paksusuolen ja peräsuolen, mahan, keuhkojen, eturauhasen, ja muut syövät [15] – [18], ja sen ekspressio näyttää liittyvän kasvaimen etenemistä [19]. Solussa NAMPT on runsaasti sytosoliin ja läsnä tumassa. Se on ollut riittävästi raportoitu, että NAD liikevaihdon syövän tai lisääntyvissä soluissa on merkittävästi kasvanut terve tai ei-jakautuvat solut [1], [7]. Nämä havainnot mahdollisesta osallistumisesta NAMPT taudin on nyt tuettu erilaisia ​​lähestymistapoja syöpäsoluissa tutkimuksissa [10] – [14]. Alas-säätely NAMPT estää kasvainsolujen kasvua in vitro ja in vivo ja herkistää soluja oksidatiivista stressiä ja DNA: ta vaurioittavien aineiden [8], [15], [18], [20] – [22]. Estyminen NAMPT johtaa myös vaimennus kasvaimen kasvun ja apoptoosin induktion vuoksi NAD ehtymisen [8], [21] – [24]. Yhdessä NAMPT esimerkki lupaava terapeuttinen kohde kehittämiseen mahdollisten uusien syöpälääkkeiden.

NAD on substraatti dehydrogenaaseja, poly (ADP-riboosi) polymeraasit, sirtuins, mono (ADP-ribosyyli) transferaasien, ja ADP-ribosyl cyclases [2], [4], [12]. Useimmissa syöpäsoluja, poly (ADP-riboosi) polymeraasi, joka on keskeinen proteiini tarvitaan DNA: n korjaukseen, joka on myös mukana apoptoosin, aktivoituu johtuen DNA-vaurioita ja genomin epävakautta [2], [25] – [27]. Aktivoituminen poly (ADP-riboosi) polymeraasin johtaa NAD ehtyminen syöpäsoluissa [2], [8], [25] – [27]. Tämän seurauksena, alas-säätely NAMPT herkistää syöpäsolut DNA: ta vaurioittavien aineiden ja apoptoosin [10], [21]. Samoin SIR2 proteiini toimii myös keskeinen alavirtavaikuttajainhibiittorit NAMPT, joka säätelee erilaisia ​​solun toimintoja, kuten selviytymisen ja tulehdus [28] – [30]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että SIR2 proteiinit säätelevät sytokiinien tuotantoa [30], mikä puolestaan ​​vähentää NAD tasoilla eston NAMPT. Lisäksi NAMPT estäjä on esitetty anti-inflammatorisia vaikutuksia eläinmalleissa tulehdusta [20], [30]. Lopuksi, avain vaikutusmekanismi NAMPT esto on saarron Glykolyysivaiheen on glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasin askel vastaa Adenosiinitrifosfaatti (ATP) väheneminen, aineenvaihdunnan häiriön, ja myöhemmät kasvaimen kasvun estäminen [1]. Kuitenkin miten modulointi NAMPT aktiivisuus syöpäsoluja vaikuttaa solujen aineenvaihduntaan ulkopuolella energia-aineenvaihdunnan kuten aiemmin raportoitu [1], on edelleen tuntematon. FK866, pieni molekyyli estäjä NAMPT, on tehty laajoja tutkimuksia [2], [21], [31]. Molekyyli on yhteistyössä kiteytetään ja todettu sitoutua nikotiiniamidijohdannaiset sitova taskussa NAMPT, mikä osoittaa sen mekanismi kilpaileva estäjä NAMPT suhteen nikotinamidi [32]. Useat tutkimukset viittaavat myös siihen, että FK866 nimenomaan estää NAMPT solussa ja osoittaa antituumorivaikutuksen prekliinisissä kasvainmuodoista [11], [14], [20], [30], [32] – [35]. Näin ollen, FK866 näyttää olevan ihanteellinen väline molekyyli arvioimiseksi fysiologinen tehtävä NAMPT solussa. Nykyisessä tutkimuksessa halusimme edelleen arvioida globaaleja vaikutuksia NAMPT inhibition FK866 syövän aineenvaihduntaan käyttäen maailmanlaajuinen massaspektrometriaa perustuvan metabolisen profiloinnin. Olemme valinneet kaksi ihmisen syövän solulinjat, jotka eroavat siinä, miten ne käyttävät nikotiinihapon ja nikotiiniamidin NAD muodostumista, olettaen, että lisäksi nikotiinihapon kasvualustaan ​​voidaan poistaa NAMPT inhibitio yhdessä solulinjassa, mutta ei toisessa. Olemme havainneet, että inhibitio NAMPT by FK866 tuloksia muuttaminen lukuisia metaboliatiet kaukana energia-aineenvaihduntaa. Siksi globaali massaspektrometrian perustuvan metabolinen profilointi lähestymistapa on hyödyllinen väline Mekaaniset tutkimukset huumeiden toimia ja tunnistaa mahdolliset farmakodynamiikalla markkereita.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma

Kumpikin kaksi solulinjoja käsiteltiin 5 ja 50 nM FK866 (0,1% DMSO) ja 0,1% DMSO: ta kanssa ja ilman nikotiinihapon (10 uM) 24 tunnin ajan. Kukin ryhmä sai virtansa 6 biologisia rinnakkaista. Solulinjoja, joita ei ole käsitelty huumeiden ja nikotiinihapon toimivat kontrolleina.

Syöpäsolut

A2780 (NCI DCTD), munasarjojen syövän solulinja, ja HCT-116 (ATCC), joka on peräsuolen syövän solulinja, viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen 30-2001) ja McCoys 5a (Hyclone SH30200), vastaavasti, kun läsnä on 10% FBS: ää. Solut ympättiin 6-kuoppaiselle viljelylevylle tiheytenä 1,0 x 10

6 solua kuoppaa kohti ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia ja käsiteltiin sitten FK866 DMSO eri pitoisuudet 24 tuntia. FK866 syntetisoitiin, kuten on kuvattu aiemmin [36], [37]. Osana tutkimusasetelma, soluja kasvatettiin myös ja käsiteltiin nikotiinihapon (10 uM) ja FK866 24 tuntia ennen sadonkorjuuta. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin mittaamalla proteiinin kokonaismäärästä käyttäen CytoScan SRB Sytotoksisuusmääritys Kit (Cat. No. 786-213, G-Biosciences, St. Louis, MO). 24 tunnin kuluttua hoidon alusta poistettiin ja ennalta jäähdytetty -20 ° C: ssa; Seuraavaksi 500 ui 80%: ssa metanolia, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut kaavittiin ja kerättiin -20 ° C: ssa 1,5 ml: n eppendorf-putkiin. 60 minuutin kuluttua, Eppendorf putket sentrifugoitiin 5 minuuttia 14.000 kierrosta minuutissa ja asetetaan supernatantti uusiksi putkiin tarkempaa analysointia.

Metabolomiikka Analysis

Analyysit suoritettiin käyttämällä ei-kohdennettu ja kohdennettuja protokollia käyttäen GC-TOF-HRMS, hydrofiilinen (HILIC) -LC-HRMS ja HILIC-LC-MS /MS-laitteiston toteutettavasta aiemmin raportoitu menetelmiä [38] – [40]. Standardi laadunvalvonta (QC) näyte, joka sisältää seosta, aminohapot ja orgaaniset hapot, injektoitiin päivittäin seurata massaspektrometriin vasteen. Yhdistetyt QC näyte saatiin ottamalla alikvootti saman tilavuuden kaikki näytteet tutkimuksesta. Yhdistetyt QC näytettä injektoitiin päivittäin erän analysoiduista näytteistä, ja käytettiin määrittämään optimaalisen laimennuksen erän näytteitä ja vahvistaa metaboliitin tunnistamista ja piikkien integroinnin (S1 File). Supernatanteissa solu-uutteet jaettu kolmeen osaan: 75 ui GC-TOF-MS-analyysi, 175 ui ja HILIC-LC /MS-analyysi, ja 175 ui varten HILIC-LC /MS /MS-analyysi.

näyte Johdannaisten ja GC-TOF-HRMS analyysi

uutteet kuivattiin käyttämällä SpeedVac Concentrator Savant DNA120 (ThermoScientific, San Jose, CA), jonka hauteen lämpötila asetetaan alle 30 ° C. Pre-jäähdytetty näytteitä edelleen kuivattiin 1 tunti käyttäen Free-Zone lyofilisaattori (Labconco, Kansas City, MO). Kuivattu näyte johdannaisen kanssa metoksiamiinihydrokloridia pyridiini ja N-metyyli-N-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidia suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Tong et ai. [37]. Kaasukromatografia suoritettiin käyttäen Agilent 7890A kaasukromatografi (Agilent, Palo Alto, CA) käyttöliittymät korkearesoluutioisen aika-of-lennon Pegasus GC-HRT massaspektrometriä (Leco, St. Joseph, MI). Automatisoitu injektiot suoritettiin käyttäen MPS2 ohjelmoitava robotti monikäyttöinen näytteenottaja (Gerstel Muhlheim an der Ruhr, Saksa). GC-järjestelmä oli varustettu Gerstel termostaatilla varustettu suutin, jäähdytetään injektiojärjestelmä (malli CIS 4). Automatisoitu liner vaihto (ALEX) (Gerstel) käytettiin poistamaan ristikontaminaation päässä Näytematriisin joka oli tapahtumassa välillä näyte kulkee. Useita deaktivoitu hämmentynyt vuorauslevyjen GC syötössä käytettiin. Gerstel injektori ohjelmoitiin varten seuraavassa järjestyksessä: alkulämpötila 50 ° C, pidetään 0,1 min, lisätä lämpötilaa nopeudella 10 ° Cs-1 lopulliseen lämpötilaan 330 ° C, ja pitoaika 15 minuuttia). Injektiot 1 ui tehtiin splitless tilassa. Kromatografia suoritettiin RTX-5Sil MS sarake (pituus: 30 m; ID: 0,25 mm; df: 0,25 um), jossa on Integra-Guard sarake (Restek, Bellefonte, PA). Helium kantokaasun käytettiin jatkuvaa 1 ml min-1. GC Uunin lämpötila oli ohjelmoitu, että seuraava sekvenssi: 50 ° C alkulämpötilan kanssa 1 minuutin pitoaika ja sitten pasiteettia 10 ° C minuutissa lämpötilaan 140 ° C, sitten ramping 4 ° C per minuutti, jotta 240 ° C, ja sitten ramping 10 ° C minuutissa lämpötilaan 300 ° C 8 minuutin pitoaika. Sekä siirtolinjan ja lähteen lämpötilat olivat 250 ° C. Ion-lähde toimi -70 kV hehkulangan jännitettä. Jälkeen liuotin viiveellä 500 sekuntia, massaspektrit hankittiin 2,4 spektrit sekunnissa louhinta taajuudella 2 kHz ja massa erilaisia ​​60-520 m /z. Resoluutio oli asetettu 25 K. Mass tarkkuus säädeltiin PFTBA tuning at sub-ppm tasolla koko ajon ajan. Standardi QCS ja yhdistettyä näytettä QCS niitä käytetään mittaamaan GC-TOF-HRMS tiedonkeruu (S1 File) [41] – [43]. Massaspektrometriparametrit kalibrointi suoritettiin päivittäin avulla myyjä protokollaa. Mass tarkkuus oli rutiininomaisesti yllä sub-ppm tason resoluutiolla 30-40 K. Tietojen analysointi suoritettiin myyjän ohjelmisto ChromaTof (LECO, St. Joseph, MI) ja AnalyzerPro (SpectralWorks Ltd, Runcorn, UK) käyttämällä uusinta NIST-MS-tietokanta (https://chemdata.nist.gov/).

HILIC-LC-MS /MS-analyysi

uutteet käytettiin ilman eri johdannaisten. HILIC-LC-MS /MS-tiedonkeruu- ja käsittely seurattiin käyttämällä standardia QCS [42], [43] ja yhdistettyä näytettä QCS (S1 File). Nestekromatografia suoritettiin käyttäen Nexera UPLC järjestelmän (Shimadzu, Columbia, MD) yhdessä Triple Quad 5500 System (AB Sciex, Framingham, MA). HILIC erotukset saavutetaan käyttämällä polyamiini-sidottua polymeerimateriaalia silikageelipylväässä (apHera NH2 Polymer), jossa on 150 x 2 mm, 5 um partikkelikoko, joka on varustettu esikolonni (apHera NH2 Polymer), jossa on 10 x 2 mm, 5 um hiukkaskoko (Supelco, Bellefonte, PA). Liikkuvat faasit olivat asetonitriili (A) ja 50 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 9,4, säädetään ammoniumhydroksidilla) (B) virtausnopeudet 0,25 ml /min 30 ° C: ssa. Kun 3 minuutin määrityskerralla samanaikaisesti 15% B, kaltevuus 30% B tehtiin 12 minuuttia ja gradientti 60% B tehtiin 15 minuuttia. Sen jälkeen, gradientti 75% B tehtiin 21 minuuttia ja gradientti 98% B: valmistui 22 minuuttia. Sen jälkeen pylväs pesun, ajo päättyi 98% B 29 minuutin ajan. Pylvään tasapainotus liikkeellelähdön puskurin kesti 6 minuuttia ennen seuraavaa injektiota. Tietojen hankinta suoritettiin käyttäen ajoitettu MRMs. Yhteensä lista sisälsi yli 200 MRM siirtymiä syntyy aitoja standardeja positiiviset ja negatiiviset tiloissa [43] (S1 File).

HILIC-LC-HRMS analyysi

uutteet käytettiin ilman eri johdannaisen. Standardien QCS ja yhdistettyä näytettä QCS niitä käytetään mittaamaan HILIC-LC-HRMS tietojen hankinta, kuten aiemmin on kuvattu (S1 File) [42] – [44]. Nestekromatografia suoritettiin käyttäen WATERS UPLC järjestelmä (WATERS, Milford, MA) yhdessä Triple TOF 5600 System (AB Sciex). HILIC erotukset saavuttaa käyttämällä edellä kuvattuja protokollia. Information Dependent hankinta koetta käytettiin tiedonkeruu sisällä 70-800 m /z, massa-alue positiivisten ja negatiivisten ionien erikseen. Tiedot käsiteltiin käyttäen MarkerView versiota 1.2.1-ohjelmisto (AB Sciex). Lisäystasot yhdistettyä näytteitä kaupallisesti saatavilla aitoja standardeja sallitaan tunnistamiseen näytteen komponentteja. Tiedot kerättiin positiivisia ja negatiivisia ioneja erikseen sisällä 70-800 m /z, massa-alue, täytäntöön koe tarkoituksena hajottamatta kaikki ionit ylittää valitun kynnyksen, kun hakee liikkuvan pirstoutumista energiaa. Massaspektrometriparametrit kalibrointi suoritettiin päivittäin käyttäen myyjä protokollaa positiivisia ja negatiivisia ioneja. Mass tarkkuus rutiininomaisesti säilyy 5 ppm tasolla resoluutiolla 20 30K. Komponentti tunnistus saatiin aikaan lisäystasot aitoja standardeja saatavilla. Tuntematon komponentit tunnistettiin käyttäen kalibroida spektriarvot avustuksella PEAKVIEW versio 1.2.0.3 ohjelmisto (AB Sciex). Erä uudelleenkalibrointi suoritettiin käyttämällä aikaisemmin tunnistettu osilla on eri massat ja retentioajat sisäisinä standardeina. Tämä protokolla mahdollisti rutiini saavuttaminen 2-5 ppm massan tarkkuuden poikkeama emoionien ja niiden fragmentit (S1 File). METLIN (https://metlin.scripps.edu/index.php), HMDB (https://www.hmdb.ca/), MASSBANK (https://www.massbank.jp/), NIST-MS (http : //chemdata.nist.gov/), IDEOME (https://mzmatch.sourceforge.net/ideom.php), mzCloud (https://mzcloud.org/), ja talon luotu HRMS ja HRMS /MS tietokantoja käytettiin alkuainekoostumuksen tehtävän, spektritiedot vertailuja, ja yksityiskohtaisen käsikirjan tulkintaa. Tämä löytö protokolla sallittu merkinnästä aineenvaihduntatuotteita, jotka eivät olleet kaupallisesti saatavilla (S1 File). Selityksin varustettu tietoja käsitellä edelleen MarkerView versio 1.2.1 ohjelmisto (AB Sciex) laskemiseksi aineenvaihduntatuotteen piikin pinta-ala. Tunnistamaton ominaisuuksia rutiininomaisesti ulkopuolelle huippu luettelosta. HILIC-LC-HRMS tietoja käytettiin selventää ylikuulumisen havaittu HILIC-LC-MS /MS-analyysi, ja sitä käytettiin mittaamiseen metaboliitteja, jotka oli pitoisuus on yli lineaarinen alue aikana HILIC-LC-MS /MS-analyysi . Sitä käytettiin myös tehtävän retentioajat isomeerien (S1 File).

Data Processing ja Tilastollinen analyysi

GC-MS-analyysin kanssa käyttämällä ChromaTof sallittu huippu luetteloita sukupolvi, jotka uutetaan edelleen poikki lomakkeissa ja yhdistetty pääluettelon. Lisäksi tietojenkäsittely suoritettiin AnalyzerPro ja matriisi analysaattorin add-on käytetty muodostamaan matriisiin tavoite kirjasto. NIST-MS tietokantaa käytetään tuottamaan tätä kirjastoa. Tämä protokolla johti sukupolven useita tuhansia ominaisuuksia. Tietoja suodatettiin edelleen, kuten on kuvattu Chan et ai. [41] ja Dunn et al. [42] ja sulautetaan generoidaan ChromaTof apua. Manuaalinen tarkastus ja kaksoiskappaleet poisto suoritettiin muodostaa lopullisen aineenvaihduntatuotteita huippu pöytä tunnistetaan ja mitataan GC-MS-menetelmällä. Mediaanitiedoissa normalisointi (rivi skaalaus), logaritminen muunnos, ja data skaalaus (Pareto) GC-MS ja LC-MS-tulokset tehtiin käyttäen MetaboAnalyst version 2.0 ohjelmisto [45], jotta kompensoimiseksi välisiä ja instrumentaali vaihtelua. Lopullinen metaboliitin huippu taulukko rakennettiin yhdistämällä tiedot hankittu kaikki menetelmät. Peak lista, tuotettu LC-MS /MS-menetelmällä, toimi perustana tietojen yhdistämällä ja integraatio (S1 File). Kopiot otettu käyttöön täydentävän menetelmiä (GC-HRMS ja HILIC-LC-HRMS) poistettiin jälkeen manuaalinen tarkastus. Aineenvaihduntatuotteen intensiteetit yksittäisistä näytteistä normalisoituivat vastaaviin proteiinipitoisuuteen ennen edelleen tilastollinen analyysi. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttämällä yhden ja usean lähestymistapoja. MetaboAnalyst versio 2.0 [45] ja JMP versio 11 paketteja käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Dunnettin monivertailutesti suoritettiin vertailutuloksia ryhmien välillä, jotka on määritelty tutkimuksen suunnittelun seuraavasti: kontrolli (nimetty -NA) ja käsiteltyjä soluja (nimetty + NA, 50 nM-NA, 5 nM-NA, 50 nM + NA, 5 nM + NA). Luvut, jotka sisältävät esimerkkejä ANOVA tuloksilla on graafista tietoa selittää seuraavasti: ryhmien välisten erojen katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun p 0,05. Grand keskiarvo on esitetty vaakasuora viiva sijaitsee paneelin (Fig. 1). Y-akseli esittää normalisoitua, log muuttaneet, ja skaalata piikin pinta. Kokeellinen ryhmiä eri käsittelyt edelleen luokitella käyttämällä valvomattoman hierarkkinen klusterointi, pääkomponenttianalyysi ja ohjattu monimuuttujamenetelmin osittainen pienimmän neliösumman-erotteluanalyysi (S3 File).

Grand keskiarvo on esitetty vaakasuora viiva sijaitsevat paneelissa . Y-akseli esittää normalisoitua, log muuttaneet, ja skaalata piikin pinta. Dots edustavat näytteet. Ryhmä tarkoittaa esitetty vaakasuora viiva laatikon sisällä.

Pathway ja Network Analysis

Tunnistetut aineenvaihduntatuotteiden alistettiin IPA-analyysi (Ingenuity System, Redwood City, CA). Liittyminen määrä havaittujen aineenvaihduntatuotteiden (HMDB, pubchem, ja Kegg Tunnisteet) listattiin MS Excel ja tuoda IPA kartoittaa kanoninen reittejä ja tuottaa verkkojen vuorovaikutuksessa biologisten kokonaisuuksien. Toimitettu tietoja kuin kertainen muutos arvot (suhteet) laskettu suhteessa verrokkiryhmään (nimetty -NA). Kattava polku ja verkon analyysit tehtiin. Alavirran biologiset prosessit pisteytettiin mukaisesti ja ontologian tuen avulla Ingenuity Knowledge Base (https://www.ingenuity.com/science/knowledge-base). IPA analyysi asetukset olivat seuraavat:

Viite asettaa: Ingenuity Knowledge Base (endogeenisten kemikaalit).

Suhde ovat: suorat ja epäsuorat.

Sisältää endogeenisen kemikaaleja.

Filter yhteenveto: Tarkastellaan ainoastaan ​​suhteissa, joissa luottamus on kokeellisesti havaittu tai korkea (ennustettu).

Analyysi asetus mukana kerättyjä ihmisen soluista.

P-arvo selitys on seuraavasti: mittana todennäköisyyttä, että yhdistyksen välillä joukko aineenvaihduntatuotteiden aineisto ja siihen liittyvä toiminta johtuu satunnainen -alueella. Pienempi p-arvo, sitä epätodennäköisempää on, että yhdistys on satunnainen ja sitä merkittävämpi yhdistyksen. Yleensä p-arvot 0,05 osoittaa tilastollisesti merkitsevä, ei-satunnainen -alueella. IPA käyttää aktivointi z-algoritmi tehdä ennusteita. Z-algoritmi on suunniteltu tuottamaan joko ennusteen aktivointi tai esto (tai ei ennustaminen), sekä vähentää mahdollisuutta, että satunnaisen datan tuottaa huomattavia ennusteita.

Tulokset

vaikutusten arvioimiseksi on NAMPT estäminen syövän aineenvaihduntaan, käytimme kahta eri solulinjoissa: A2780, joka on NARPT-negatiivinen solulinja, joka voi vain hyödyntää NAMPT välittämää nikotiiniamidi koulutusjakson NAD biosynteesin, ja HCT-116, joka on NAPRT-positiivinen solu line, joka voi käyttää sekä NAMPT välittämää nikotiiniamidi ja NAPRT välittämä nikotiinihappoa väyliä NAD biosynteesiä. Koska HCT-116 voidaan käyttää nikotiiniamidi ja nikotiinihappo NAD muodostumista, lisäksi nikotiinihapon kasvualustaan ​​voidaan poistaa NAMPT inhibitio HCT-116, mutta ei A2780. Siksi nikotiinihappo käytettiin nykyisen tutkimuksen, jossa arvioidaan spesifisyyttä NAMPT estäjien.

Aminohapot Aineenvaihdunta

Käyttämällä globaalin metabolomiikan protokollia, havaitsimme merkittäviä muutoksia aminohappo aineenvaihdunnan päälle NAMPT esto kanssa FK866 molemmissa solulinjoissa, lukuun ottamatta glysiinin ja seriinin aineenvaihdunta, arginiini aineenvaihduntaa ja histidiini aineenvaihduntaa (S2-S5-tiedostot). Kuten on esitetty kuviossa. 1 alaniini ja aspartaatti aineenvaihduntaa vaikuttivat merkittävästi. Lääkkeen annoksesta riippuvainen aiheuttamat muutokset aspartaatti, alaniini ja N-karbamoyyli-aspartaatti tasoja on havaittu. Lisääminen nikotiinihapon poistetaan kokonaan näitä vaikutuksia havaittiin HCT-116, mutta ei A2780 (Fig. 1, S4 Tiedostojen ja S5 Files), mikä osoittaa, että nämä vaikutukset johtuivat NAMPT eston. On mielenkiintoista, että asparagiini ja glutamaatin tasot eivät muuttuneet merkittävästi. Marginaalinen lasku glutamaatti ja glutamiinipitoisuuksia HCT-116-solujen havaittiin myös. Nousuja treoniini tasot havaittiin (S2 File) ja käänteinen nikotiinihappohoitoon HCT-116-solut, tukee yhteyden aspartaattiin, mikä on lähde treoniinin biosynteesin.

Mielenkiintoista, tasot N-acetylglutamine kohosivat molemmissa solulinjoissa hoidetuilla FK866 ja ainoastaan ​​vaikutuksia HCT-116 pelastettiin lisäämällä nikotiinihappoa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin lysiinin, N-asetyyli-lysiini, fenyylialaniini, tryptofaani, tyrosiini, leusiini, isoleusiini, metioniini, SAM, ja proliini (S3 File, S4 tiedosto ja S5-tiedostot). SAM on tiedetään osallistuvan kysteiinin ja metioniinin metaboliassa, arginiini ja proliini aineenvaihduntaa, biosynteesissä aminohappoja, ja transmetyloinnin, transsulfuration, ja aminopropylation. Todettiin, että korjauksilla SAM tasot ovat silmiinpistävän samanlaisia ​​muutoksia aspartaattitasoja (S3 File, S4 Tiedostojen ja S5-tiedostot). Lopuksi, NAMPT inhibitio johtaa myös muuttaa polyamiinin aineenvaihduntaa, koska spermiini ja spermidiini tasot olivat koholla annoksesta riippuvaisella tavalla käsittelemällä FK866. Lisääminen nikotiinihapon poisti kokonaan havaitut vaikutukset HCT-116-soluissa, mutta ei A2780 soluissa (S3 File, S4 Tiedostojen ja S5-tiedostot). Siten NAMPT esto näyttää hämmentää useita aminohappo reittejä ja jotkut vaikutukset näyttävät olevan solulinjan erityinen.

puriini ja pyrimidiini Metabolism

Koska useat vaiheet puriini- ja pyrimidiinin biosynteesin vaativat NAD ja välituotteita, jotka ovat peräisin hiilihydraattiaineenvaihdunta arvioimme vaikutuksia NAMPT estoa nukleotidin liittyviä metabolism.As kuvassa. 2 ja S3 File, S4 tiedosto ja S5 tiedostot, havaitsimme muutokset tasolla puriinien vasteena FK866 hoitoa, koska oli annoksesta riippuva nousu tasolle adeniinin, sytidiinin, sytosiini, adenosiini, 1-methyladenosine, inosiini, adenosiini monofosfaatti (AMP), adenosiinidifosfaatin (ADP), inosiinimonofosfaattidehydrogenaasin (IMP), inosiini difosfaatti (IDP), sytidiinin difosfaatti (CDP), deoksiguanosiini difosfaatti (dGDP), 5-aminoimidatsoli-4-karboksamidin ribonukleotidi (AICAR), AICAR 3 ’ , 5’-syklistä fosfaattia, N-formylglycinamide ribonukleotidi-, orotidiini, puriini, tymidiini ja uridiini molemmissa solulinjoissa, on samanlainen kuin nousu aminohappojen tasolla. Mielenkiintoista, lisäksi nikotiinihapon merkittävästi vähentynyt kohonneita inosiini molemmissa solulinjoissa (Fig. 2, S2 Tiedosto, S3 tiedosto, S4 Tiedostojen ja S5-tiedostot). Tasot ksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasin ei muutettu A2780 soluissa, mutta kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla HCT-116-soluissa, mikä viittaa solulinja erityinen ero ksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasin liittyvissä aineenvaihduntaan. Oli annosriippuvainen väheneminen 7-methylguanosine, deoksiadenosiini, deoksiuridiinista, guanosiinimonofosfaatti (GMP), sytidiinin monofosfaatin (CMP), deoksisytidiiniin monofosfaatin (dCMP), deoksiadenosiinista monofosfaatin (dAMP), ja uridiinitrifosfaatin (UTP) tasot. Nämä vaikutukset johtuivat NAMPT esto, koska lisäksi nikotiinihapon poistetaan nämä vaikutukset HCT-116-solut, mutta ei A2780-soluissa. Mielenkiintoista on, että hoito 5 nM FK866 lisääntynyt dCMP tasoilla, jotka ovat verrattavissa 50 nM FK866 A2780-soluissa. Jälleen oli solulinja erityinen vaikutus havaittiin koska NAMPT esto vähensi tasoilla syklisen AMP ja AICAR ribotide A2780 soluissa, mutta ei HCT-116-solut (S2 File, S3 tiedosto, S4 Tiedostojen ja S5 Files).

Grand keskiarvo on esitetty vaakasuora viiva sijaitsevat paneelissa. Y-akseli esittää normalisoitua, log muuttaneet, ja skaalata piikin pinta. Dots edustavat näytteet. Ryhmä tarkoittaa esitetty vaakasuora viiva laatikon sisällä.

kreatiini Aineenvaihdunta

NAMPT esto johti annosriippuvainen lisääntyminen kreatiini ja kreatiniinipitoisuus molemmissa solulinjoissa samanlainen aminohappoja tasoilla. Tämän mukaisesti, lisäämällä nikotiinihapon lakkautetaan näitä vaikutuksia HCT-116-soluissa, mutta ei A2780 soluissa (S2 File, S3 tiedosto, S4 Tiedostojen ja S5 Files).

lipidiaineenvaihdunnan

rasvahappo biosynteesin vaatii suuren määrän NADP /NADPH johdettu NAD ja sitraattia (a TCA väli); havaitsimme merkittäviä muutoksia rasva-aineenvaihduntaan vastauksena FK866 hoitoon. Palmitiini- ja steariinihappo tasot olivat koholla annoksesta riippuvaisella tavalla molemmissa solulinjoissa. Mielenkiintoista, lisäksi nikotiinihapon lakkautti nämä vaikutukset molemmissa solulinjoissa. Käsittely FK866 johti kohonneeseen koliini, fosforyylikoliinin, ja phoshatydylglycerol HCT-116-soluissa, mutta ei A2780 soluissa. Nämä vaikutukset havaittiin HCT-116-solut olivat seurausta NAMPT eston koska vaikutukset poistettiin lisäämällä nikotiinihapon kasvualustaan. Mielenkiintoista on, havaitsimme vahvaa annoksesta riippuva nousu glycerophosphocholine ja glyseroli-3-fosfaatti-tasot A2780 soluissa, mutta ei HCT-116-solut. FK866 käsittely johti myös merkittävästi annosriippuvaisen laskun lyso-PC ja PC tasot havaittiin A2780 soluissa, mutta marginaalinen muutoksia HCT-116-solut (S2 File, S3 tiedosto, S4 Tiedostojen ja S5 Files).

Nämä havainnot olisivat voineet ilmentää solu linjakohtaiset ero näiden tiettyjen metaboliareitteihin. Lopuksi, NAMPT inhibitio myös vaikutti merkittävästi karnitiinin aineenvaihduntaa annoksesta riippuvalla tavalla (Fig. 3).

Grand keskiarvo on esitetty vaakasuoran viivan sijaitsee paneelin. Y-akseli esittää normalisoitua, log muuttaneet, ja skaalata piikin pinta. Dots edustavat näytteet. Ryhmä tarkoittaa esitetty vaakasuora viiva laatikon sisällä.

karnitiini on tärkeä molekyyli säätelyyn solujen energia-aineenvaihdunnan rasvahappojen ja glukoosin. Karnitiini on mukana pitkäketjuisten rasvahappojen kuljetus koko sisäkalvon mitokondrioita, ja se helpottaa kuljetusta ketjun lyhentää asyyliryhmät tuotettu peroksisomeissa mitokondriot edelleen energian tuotantoon. Cell-specific muutoksia karnitiinia aineenvaihduntaan havaittiin, viitaten eri vaikutus FK866 hallinnon karnitiinin biosynteesin ja hajoamista. Acetylcarnitine peräisin asetyyli-CoA, universaali hajoamistuote kaikki ravinnon. Acetylcarnitine muutoksia havaittiin olevan samanlainen kuin asetyyli-CoA muuttuu (S2 File, S3 tiedosto, S4 Tiedostojen ja S5-tiedostot). Butyrylcarnitine voivat olla peräisin sekä rasvahapoista ja aminohappoja. Sen muutoksia todettiin olevan annoksesta riippuvainen, mikä saattaa kuvastaa havaitun muutoksia aminohappoja ja rasvahappoja aineenvaihduntaa.

Glykolyysi, pentoosifosfaattireitistä, ja TCA Cycle

Äskettäin osoitettiin, että NAMPT esto vaimentaa glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasin aktiivisuuden, mikä puolestaan ​​vaikuttaa Glykolyysivaiheen, pentoosifosfaattireitistä, ja TCA sykli ja niiden loppupään reittejä syöpäsoluissa [1]. Tulokset Tämän tutkimuksen ovat yhtäpitäviä niiden kanssa edellisessä tutkimuksessa [1] (S2-S5 Filess).

Clustering Analysis

edelleen ymmärtää aineenvaihdunnan yhteyden ja kaapata maailmanlaajuinen vaikutukset, teimme valvomattoman hierarkkinen klusterin analyysi. Kuva. 4 esittää valitun aineenvaihduntatuotteiden lämpöä karttoja. Väri voimakkuudet kartoissa että NAMPT inhibitioastetta FK866 on soluspesifisen ja Fig. Kuvio 4 esittää nikotiinihappohoitoon. Kuva. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.