Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset ovat yhdistäneet ilmentymistä lektiininkaltainen ox-LDL-reseptori 1 (

OLR1

) kasvaimien syntyyn. Analysoimme microarray tiedot

Olr1

knockout (KO) ja villityypin (WT) hiiriin geenien solutransformaatioon ja arvioidaan vaikutukset

OLR1

yli-ilmentyminen normaaleissa nisäepiteelisoluissa (MCF10A ) ja rintasyöpä soluja (HCC1143) suhteen geenin ilmentymisen, muuttoliike, tarttuvuus ja migraatiota. Kaksikymmentäkuusi pois 238 geenejä esti kudoksissa OLR1 KO hiirillä; valtaosa OLR1 herkkien geenien sisälsi NF-KB: n sitoutumiskohtia niiden promoottoreita. Lisätutkimukset paljastivat laajan NF-kB kohdegeenien ulkopuolella muutosta liittyvän geenin allas, jossa rikastamiseen teemoja puolustus vasteen, immuunivasteen, apoptoosin, leviämisen, ja haavan paranemista. Transcriptome on

Olr1

KO hiirillä paljasti myös esto

de novo

lipogeneesiin, nopeutta rajoittavaa entsyymejä rasvahappojen nopaliinisyntaasin (

Fasn

), stearoyyli-CoA-desaturaasi (

Scd1

) ja ELOVL perheenjäsen 6 (

Elovl6

) sekä lipolyyttinen fosfolipaasi A2 ryhmä IV B (

Pla2g4b

). Tutkimuksissa verrattiin MCF10A ja HCC1143, jälkimmäinen näkyvissä 60% korkeampi

OLR1

ilme. Pakotetaan-ilmentyminen

OLR1

johti ylösajon NF-KB (p65), ja sen kohde-pro-onkogeenien mukana apoptoosin estämiseen (

BCL2

,

BCL2A1

,

TNFAIP3

) ja sääntely solukierron (

CCND2

) molemmissa solulinjoissa. Perusilmennystä

FASN

,

Scd1

ja

PLA2G4B

sekä lipogeneesiin transkriptiotekijöiden

PPARa

,

SREBF2

ja

CREM

, oli suurempi HCC1143 soluissa. Yli-ilmentyminen

OLR1

vuonna HCC1143 soluissa myös parannettu solujen vaeltamiseen, heikentämättä niiden noudattamista TNFa-aktivoitu endoteeli tai migraatiota. Toisaalta,

OLR1

neutraloivat vasta-aine inhiboi sekä tarttumisen ja transmigraatio käsittelemättömien HCC1143 soluja. Olemme päätellä, että

OLR1

voi toimia onkogeenin mukaan NF-kB kohdegeenien vastuussa jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja apoptoosin estämisestä ja

de novo

rasvansynnyn geenejä.

Citation: Khaidakov M, Mitra S, Kang BY, Wang X, Kadlubar S, Novelli G, et al. (2011) hapettuneen LDL-reseptorin 1 (

OLR1

) kuin mahdollisesta yhteydestä, dyslipidemia ja Cancer. PLoS ONE 6 (5): e20277. doi: 10,1371 /journal.pone.0020277

Editor: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia

vastaanotettu: 20 joulukuu 2010; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 26, 2011

Copyright: © 2011 Khaidakov et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

OLR1

, lektiiniä kaltaista scavenger-reseptori, on erittäin konservoitunut nisäkkäissä [1], ja se kykenee tunnistamaan useita ligandeja, kuten proteiini-osa hapettuneen LDL (ox-LDL), pitkälle edenneen glykaation lopputuotteiden, gram-positiivisia ja gram-negatiivisten bakteerien ja apoptoottisten solujen [2].

OLR1

ensisijaisesti ilmaistaan ​​verisuonten solujen ja verisuoniston-rikas elinten [3], ja sen aktivointi monenlaisia ​​ärsykkeitä osoittaa dyslipidemia, tulehdus ja vahingot käynnistää useita signa- myös MAPK, muut proteiinikinaaseja samoin transkription tekijät NF-KB ja AP-1 [4], [5].

yli-ilmentyminen

OLR1

on esitetty solukomponenttien ateroskleroottisten leesioiden [6]. Poistaminen

Olr1

in

LDLR

Knockout (KO) hiiriä johtaa paljon pienempi ateroskleroottisten vaurioiden liittyy jyrkkä vähentäminen tulehduksen aortan seinämä [7].

Olr1

kumoamisen vaimentaa myös angiotensiini II-aiheuttama kohonnut verenpaine [8]. Samoin kumota

Olr1

vähentää laajuus iskemia /reperfuusio vamma [9].

yhdistyksen välillä lihavuuden ja ateroskleroosi valtioiden ihmisillä on vakiintunut [10], [11]. Yhdistykset lihavuus on löydetty eri syöpien, kuten rinta- ja eturauhassyövän kasvaimet [12], [13], mikä viittaa mekanistinen päällekkäisiä patobiologian aterogeneesin ja kasvaimen kehittymisen. Äskettäin

Olr1

kautta toimivien NF-KB välittämän tulehduksellinen signalointi, oli vahvasti osallisena karsinogeneesissä [14].

Painopiste Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli edelleen valaista roolia

OLR1

kuten onkogeenin perustuu oletukseen, että anturi dyslipidemian ja molekyylin mukana NF-kB aktivaation,

OLR1

voi olla yhteys dyslipidemia ja syöpä. Ensimmäinen osa Tutkimus perustui mikrosiruanalyysi villityypin (WT) ja

olr1

KO hiirillä. Toisessa osassa määritellään suhde

olr1

ja apoptoosin ja lipogeneesiä geenien rintasyöpäsolulinja HCC1143 ja migraation ja adheesion näissä soluissa.

Tulokset

vertailu

OLR1

KO ja transformaatio transcriptomes

tärkeimmät havainnot analyysin microarray tietojen sydämet villityypin (WT) ja

Olr1

KO ryhmämme on raportoitu muualla [15]. Lisäanalyysissä vastaan ​​päällekkäisyyden joukko geenejä (n = 238) todettiin voimistuvan aikana muutosta kaksi isogeenisen solutyyppejä [14] osoitti, että 26 geenit tästä listasta inhiboitui

Olr1

KO transcriptome by at vähintään 20% (taulukko 1). Näistä olivat eri osien immuunivasteen (

Isg20

,

C1s

,

S1r

,

Ifrd1

) ja useita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien hyvin tunnettu onkogeenien (

JunB

,

Rel

,

Irf2

,

Crem

). Promoottori analyysi johtaa joukko geenejä [16] tunnistetaan rikastusasteet NF-KB: n sitoutumiskohtia (p 0,03), jotka sijaitsevat 500 nukleotidin lähelle transkription aloittaa sivustoja kaikissa paitsi yhdessä (

C1 s

)

Olr1

herkkä geenejä (n = 25, Fig. 1).

kaavio, joka esittää joukon päällekkäisiä geenien välillä muutosta ja

Olr1

KO transcriptomes. Vuodesta joukko 238 geenien voimistunut siirtymäkauden aikana, 26 geenejä havaittiin estyy

Olr1

KO hiirillä. Valtaosa näistä geeneistä suorittaa NF-KB sivustoja niiden proksimaaliseen promoottorisekvenssejä. Kaikkiaan 86 NF-KB: n kohdegeenien havaittiin inhiboida

Olr1

KO-hiirten rikastamiseen apoptoosin säätelyyn (p = 0,0002), proliferaation (p = 0,00003), haavan paranemiseen (p = 0,0002) , puolustus vaste (p = 0,0011), immuunivaste (p = 0,0003) ja solumigraation (p = 0,0009).

OLR1

poisto aiheuttaa laajaa esto NF-KB: n kohdegeenien

Lisätietoja haku NF-KB geenien luettelon avulla kootaan saatavilla web-pohjainen tietokantojen ja kirjallisuudesta paljasti, että esto p65-alayksikön havaittu

Olr1

KO transcriptome täydennettiin säätelyä estävän

Ikbα

alayksikköä (1,36-kertainen, p = 0,002, taulukko 1) ja liittyy huomattava downregulation useita (n = 61) NF-KB: n kohdegeenien (taulukko 2). Yhdistetty joukko

Olr1

herkkiä NF-KB kohdegeenien näkyy rikastumista varten apoptoosin säätelyyn (p = 0,0002), lisääntymistä (p = 0,00003), haavan paranemista (p = 0,0002), puolustus vaste (p = 0,0011 ), immuunivaste (p = 0,0003) ja solumigraation (p = 0,0009) (kuvio 1). Niistä liittyvien geenien apoptoosin (n = 11) ja soluproliferaatiota (n = 12), 6 ja 5, vastaavasti, olivat negatiivisia sääntelyviranomaisten (David bioinformatiikan Database, 17).

OLR1

poisto tukahduttaa lipogeneesiin geenien

microarray löydökset validoitu valittuja geenejä käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR. Useimpien testattujen geenien transkription muutokset

Olr1

KO havaittu mikrosiruja varmistettiin (kuvio 2A). Lisäksi,

Olr1

poisto johti eston keskeisten entsyymien lipogeneesiin (kuvio 2B), mukaan lukien ATP-sitraattilyaasi (

Acly

), asetyyli-koentsyymi A: karboksylaasi alfa (

Acaca

), rasvahappojen syntaasia (

Fasn

), stearoyyli-CoA desaturaasi 1 (

Scd1

) ja ELOVL perheenjäsen 6 (

Elovl6

). On etua, että yksikään

Olr1

-sensitive rasva-aineenvaihduntaan liittyvien geenien suorittaa NF-KB: n sitoutumiskohtia niiden promoottoreita. Tämä viittaa siihen, että vaikutukset

Olr1

lipogeneesiin voi olla riippumaton sen NF-KB signalointi arm. Toisaalta, useita rasva-aineenvaihdunnan transkriptiotekijät, mukaan lukien steroli säätelyelementti sitova tekijä 2 (

Srebf2

), cAMP-vaste-elementti modulaattorin (

Crem

), peroksisomiproliferaattoriaktivoitua reseptorien alfa- ja gamma (

PPARa

ja

PPARg

) sekä CCAAT /tehostajana sitovan proteiinin (C /EBP) beeta, havaittiin vaimentua sisään

Olr1

KO hiiret (kuvio 2B ).

. qPCR validointi valittuja geenejä päällekkäisistä setti (taulukosta 1); B. ilmentäminen lipogeneesiin geenien ja transkriptiotekijöitä

olr1

KO hiirillä. Valkoiset pylväät – microarray data; mustat palkit – qPCR tiedot. Kaikki P-arvot 0,05.

vaikutukset

OLR1

yliekspressio normaaleissa epiteelin ja syöpäsolujen

transfektio MCF10A ja HCC1143 solujen

OLR1

ekspressiovektori johti 5-8-kertainen

OLR1

ilmaisua, joka on alueella OLR1 ylösajon. Epiteelisoluissa altistetaan ox-LDL: [18]. Tämä johti vaatimaton säätelyä

RELA

(p65) ja merkittävä nousu RNA viestin

BCL2, BCL2A1, TNFAIP3 ja CCND2

(kuvio 3B). Verrattuna MCF10A soluihin, HCC1143 soluilla lisääntynyt tyvi tasot

OLR1

(59%, p 0,05),

FASN

(24%, p 0,03),

Scd1

(21%, p 0,01) ja

PLA2G4B

(153%, p 0,01) (kuvio 3C). Vastausta lipogeneesiin geenien

OLR1

transfektion vaihteli näissä solulinjoissa (kuvio 3D). Vuonna MCF10A soluissa, yli-ilmentyminen

OLR1

merkittävästi stimuloi transkription

Scd1

(37%, p 0,02),

ELOVL6

(38%, p 0,05) ja

PLA2G4B

(153%, p 0,02) samanaikainen säätelyä

CREM

, kun taas HCC1143 soluissa

CREM

transkriptio laski ja

Scd1

ja

PLA2G4B

estyi verrattuna kontrolliviljelmiin transfektoitu tyhjällä vektorilla.

Nämä solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai

OLR1

cDNA: ta (Origene, Rockville, MD) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transfektiotehokkuuden (70-80%) arvioitiin käyttämällä GFP-vektorilla. RNA uutettiin 48 tuntia transfektion jälkeen, muunnettiin cDNA: n ja geenien ilmentymistä määritettiin kvantitatiivisella PCR: llä. A. tehokkuus transfektion (transfektoitujen solujen GFP-vektori). B. Kvantitatiivinen PCR juoni. Huomaa parantamista OLR1 ilmentymisen sekä ohjaus ja OLR1-transfektoidut viljelmät vastauksena ox-LDL. C. Expression liittyvien geenien apoptoosin ja leviämisen. Jotta voidaan edistää

OLR1

signaloinnin vaativat OLR1-ligandi-vuorovaikutuksen,

OLR1

transfektoituja soluja käsiteltiin 40 ug /ml ox-LDL: ää 24 tunnin ajan; kaaviot edustavat verrattuna käsittelemättömään kontrolliin transfektoitu tyhjällä vektorilla; D. Basal ilmaus

OLR1

,

PLA2G4B

ja lipogeneesiä geenien normaalin ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen (MCF10A) ja rintasyövän soluja (HCC1143); E. ilmentäminen

OLR1

,

PLA2G4B

ja lipogeneesiä geenien MCF10a ja HCC1143 transfektoitujen solujen OLR1 käsiteltiin protokollan mukaisesti edellä kuvatulla tavalla. F. ilmentäminen lipogeneesiä transkriptiotekijöitä MCF10a ja HCC1143 transfektoitujen solujen OLR1 ja käsiteltiin protokollan mukaisesti edellä kuvatulla tavalla. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (*) P 0,05 verrattuna vastaaviin valvonta; (†) – p 0,05 verrattuna MCF10A.

yli-ilmentyminen

OLR1

helpottaa haavan paranemista, mutta sillä ei ole vaikutusta tarttumista

Se on ollut ilmoitti, että inhibitio

OLR1

käyttämällä siRNA aiheutti hidastanut kasvaimen kasvua

in vivo

ja syöpäsolujen muuttoliike

in vitro

[14]. Jotta voitaisiin arvioida vaikutuksia

OLR1

voimistumista, transfektoimme HCC1143 soluja joko tyhjällä plasmidilla tai

OLR1

ekspressiovektoriin ja testattu muuttoliikettä haavan paranemista määritys (kuvio 4A). Yli-ilmentyminen

OLR1

vahvistettiin käyttäen qPCR. Solut, joissa ilmen- tymisen lisääntymisen

OLR1

silloitettu haavat paljon nopeammin kuin kontrolliviljelmiin (p 0,001). Sen sijaan, tarttuvuus ja migraatiota on

OLR1

transfektoitujen syöpäsolut eivät poikenneet kontrolliarvoihin (ei esitetty).

. Haavojen parantumisen määritys. Ylempi paneeli – edustavat kuvat haavan paranemista määritys suoritettiin käyttäen HCC1143 soluja transfektoitiin joko tyhjällä plasmidilla tai

OLR1

cDNA vektori; Alempi paneeli – kaaviokuva, joka esittää etäisyyden reunojen haavan jälkeen 36 tunnin inkubaation jälkeen. (*) – P 0,01; B. Adhesion määritys. Ylä paneelin edustavat kuvat kiinnittyneet ei-transfektoituja HCC1143 solujen ladattu CellTracker Red CMTX (Invitrogen, Carlbad, CA) ja laitettiin ei-aktivoida tai aktivoida (50 ug /ml oxLDLssä, 4 tuntia) konfluentteja HUVEC transfektoitu OLR1 Äänenvaimennin tai salattu siRNA. Alempi paneeli – graafinen esitys Tarttuvien solujen lukumäärä keskimäärin useilta näkökenttien kolmena rinnakkaisena viljelmänä. (*) – P 0,05 verrattuna ei-aktivoidun ohjaus ( ”scrRNA”); (†) – p 0,05 verrattuna salattu RNA; C. Kolorimetrinen migraatiota määrityksessä. Ylempi paneeli – todentaminen yhtymäkohta HUVEC kalvoilla värjäämällä solut CellTracker Red CMTX. Alempi paneeli – absorbanssiarvot tahra uutettu soluista vaeltaneet kautta TNFa-aktivoidun endoteelin yksikerroksista läsnäollessa

OLR1

neutraloiva vasta-aine tai ihmisen IgG (Control).

Kuitenkin pohjapinta tarttuvuus ja migraatiota ei-transfektoituja HCC1143 solut merkittävästi vaimentunut, kun OLR1 estyi tai neutraloida endoteelisolujen käyttämällä siRNA tai esikäsittelyä soluja

OLR1

neutraloivan vasta-aineen (kuvio 4BC).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa esitetään useita mahdollisia yhteyksiä

OLR1

ja alttiutta syöpään. Ensinnäkin mikrosirun tietokanta hiirten

Olr1

kumoaminen näytteillä vähentynyt selvästi ilmentymisessä NF-kB kohdegeenien mukana solutransformaatioon [14], sekä geenit liittyvät rasvanmuodostukseen. Toinen, yli-ilmentyminen

OLR1

ihmisen syövän solulinja osoitti merkittävää voimistumista useiden geenien onkogeenisella ominaisuuksia ja merkittävä kasvu solujen vaeltamiseen.

microarray-analyysi osoitti, että suurin osa geenien raportoitu voimistuvan aikana solun transformaatio (mutta inhiboitui

Olr1

KO-hiiret) suorittaa NF-kB sitoutumiskohtia niiden promoottorien (taulukko 1). Lisäksi merkittävä osa NF-kB kohdegeenien ulkopuolella muutosta liittyvien allas, etenkin mukana apoptoosin säätelyyn, proliferaatio ja migraatio, myös alassäädetty

Olr1

KO transcriptome (taulukko 2 ). Hiiren

Olr1

KO microarray, sekä B-solu- leukemia /lymfooma 2 kaltainen proteiini A1 (

Bcl2a1

) ja

Bcl2

olivat kopiointia estyy.

Bcl2a1

on ylävirran negatiivinen säätelijä mitochondriocentric apoptoositavan

kautta

ehkäisy sytokromin c vapautumisen sytoplasmaan, joka tarvitaan aloittamaan apoptoottisen Cascade. On raportoitu, että tehostettu synteesi

BCL2A1

ja

BCL-XL

ovat syynä noin 1000 kertaa suurempi vastus osajoukkoja kroonisen lymfosyyttisen leukemian soluja [19]. TNFa-indusoidun proteiinin 3 (

TNFAIP3

) on keskeinen säätelijä tulehduksen ja immuniteetin mukana kehittämässä erilaisia ​​autoimmuunisairauksia ja se on myös desensitizes solujen TNFa-indusoidun sytotoksisuuden ja sen osoitettiin olevan anti-apoptoottisen rinta- syöpä MCF7S1 soluihin [20]. Inhibitio

TNFAIP3

kompromisseja kasvua ja selviytymistä glioblastooma kantasolujen

kautta

estämällä solusyklin etenemisen ja NF-KB: n aktiivisuuden, ja lisää elinaikaa hiirillä, joihin glioblastome ksenografteja [21].

Havaitsimme merkittävä väheneminen

Ccnd2

viestin

Olr1

KO hiiret ja sen moni-kertaiseksi säätelyyn ylöspäin

OLR1

siirtogeenisiä HCC1143 soluja. Sykliini D2 on erittäin konservoitunut säätelijänä sykliiniriippuvaisten kinaasien 4 ja 6 vastaa G1 /S siirtyminen. Tämä geeni epigeneettiseltä vaimennettu useimmissa rintasyövistä [22]. Sen yli-ilmentyminen LNCaP-soluissa aiheuttaa esteeksi proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin [23]. Lisäksi

Olr1

poisto näytti vaarantaa koko teknologisen ketju

de novo

lipogeneesiin, mukaan lukien synteesi tyydyttyneiden C16 ja C18 rasvahappojen (

Fasn

ja

Elovl6

), ja niiden muuntaminen rahoitustilinpitoa (

Scd1

). Monet syövät, mukaan lukien ne, joihin liittyy eturauhas- ja rintasyövän [24], [25], lähes yksinomaan

de novo

synteesi riippumatta ravitsemuksellista tilaa. Siirtyminen

de novo

lipogeneesiin tapahtuu aikaisin ja on edellytys tehokkaalle muutosta. Novel vaikutukset

OLR1

rasva-aineenvaihduntaan voisi selittää paljon sen raportoitu pro-onkogeenistä aktiivisuutta. Esimerkiksi ekspressiotaso

FASN

positiivisesti korreloi huono syövän ennusteeseen [26], sen genomivahvistuksen on yhteinen esiintyminen tietyissä syövissä [27], ja sen yli-ilmentyminen edistää muutosta epiteelisolujen [28 ]. Samoin, yli-ilmentyminen

Scd1

on havaittu useita erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien rintasyöpä [29]; sen ylössäätely liittyy muutos ja sen knock-down johtaa vähentynyt soluproliferaatioon, menetys kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja heikentynyt apoptoosin [30]. On huomionarvoista, että verrattuna MCF10A soluihin, yli-ilmentyminen

OLR1

vuonna HCC1143 solut eivät herättävät odotettua aktivointi rasvanmuodostukseen geenejä. Tämä voidaan selittää maksimaalisesti lisääntynyt perusilmennystä näiden geenien HCC1143 soluissa lähtötilanteessa (kuvio 3D).

Koska useimmat geenit yläreguloituja

OLR1

-TG HCC1143 solut ovat toiminnallisesti pleiotrooppisia, arvioimme kumulatiivinen tulos heidän säätelyä haavojen paranemiseen, tarttuvuus ja migraatiota määrityksissä (kuvio 4). Erityisesti solujen kulkeutumista nähtiin lähes kaksinkertaistaa ohjaus arvo soluissa yli-ilmentyminen

OLR1

, mikä viittaa vahvasti siihen rooli tämän molekyylin rintasyövän kasvua. Toisaalta, esittäminen

OLR1

pinnalla syöpäsolujen eivät näytä olevan välttämättömiä kiinnittyminen aktivoitua endoteelisolujen tai migraatiota. Taso

OLR1

endoteelisoluissa kuitenkin näyttää olevan tärkeä, koska lisäksi neutraloivien

OLR1

vasta keskipitkällä tai esto OLR1 transkription merkittävästi heikentynyt tarttuvuus ja migraatiota in ei- transfektoidut syöpäsoluja. Tämä osoittaa, että

OLR1

mahdollisena mekanismi syöpäsolujen-endoteeli vuorovaikutuksia, kuten kasvainsoluja on ominaista runsaasti

OLR1

ligandin phophatidylserine on solukalvoissa [31].

Yhteenvetona meidän tietoja useista lähestymistavoista siirtogeenisiä hiiriä ja ihmisen normaalia epiteelin ja syöpäsolujen linjojen mukaan

OLR1

on useita pro-onkogeenisiä toimet perustuvat: a) NF-KB: n signalointireitin aiheutuvat estämisessä apoptoosin ja proliferaation; b) aktivointi de novo lipogeneesiin, ja c) tehokkaampi tarttuvuus ja migraatiota vuoksi säätelyä

OLR1

vuonna endoteelin. Uskomme, että nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että

OLR1

voi toimia linkkinä lihavuuden ja alttiutta sairastua rintasyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

C57BL /6-hiiret saatiin Jackson Laboratories. Homotsygoottinen

Olr1

KO-hiirissä kehitettiin C57BL /6-taustalla, kuten aiemmin on kuvattu [17].

Olr1

KO hiiret osoittivat täydellistä puuttumista

Olr1

määritetty RT-PCR ja immunovärjäystä, ja sitoutuminen oxLDL verisuonen sisäkalvon oli täysin poissa näillä eläimillä. Kaikki eläimet saivat inhimillinen hoito noudattaen Public Health Service valiokunnalle inhimillinen hoito ja käyttö Laboratory Animals julkaissut National Institutes of Health. Esillä olevissa tutkimuksissa hyväksyttiin UAMS Animal Care ja käyttö hyväksyntänsä numero 2484, marraskuussa 2007.

Microarray Analysis

Yhteensä RNA sydän eristettiin WT hiirillä ja

Olr1

KO hiiret. Mikrosiruanalyysi suoritettiin Affymetrix Mouse Genome GenChip 430 2,0 geeniekspression array (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA) ja analysoitiin käyttäen Affymetrix Microarray Analysis Suite (MAS) 5,0 laadun arvioimiseksi RNA ja hybridisaatio. Log pohja 2 transformaatio levitettiin tiedot ennen taulukot normalisoituivat. Kaikki arvot kunkin matriisin normalisoitiin 75. prosenttipiste arvoa matriisin, joka mielivaltaisesti asetettu intensiteettiminimi 100. Geenien ilmentyminen merkintä, EASE (kuten kuvataan https://apps1.niaid.nih.gov/David) analyysi tehtiin merkittäviä geenejä tunnistettiin yksi näyte

t

-testi. Lisäksi Gene ontologia (GO) ehdot https://www.geneontology.org) varten biologisten prosessien ja solukomponenttiin tunnistettiin ehdottaman GO Consortium. Kaikki microarray data on MIAME mukainen ja että raaka data on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta (ArrayExpress) jäljempänä on MGED Society verkkosivuilla https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html (liittymistä numero E -MTAB-473).

reagenssit ja solulinjoissa

Kaikki reagenssit, ellei toisin mainita, hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Ihmisen rintasyövän solulinjaa HCC1143 oli ystävällinen lahja Dr. A. Basnakian (University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock AR). Nisäkäsilmentämisvektoriin (pCMV5-XL5) ihmisen

OLR1

cDNA saatiin Origene (Rockville, MD). Äänenvaimennin Valitse validoitu siRNA kohteeseen OLR1 (s9843) ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Soluja viljeltiin käyttäen normaaleja RPMI 1640 kasvualustaan, jota oli täydennetty naudan sikiön seerumilla (10%) ja ampisilliini /streptomysiiniä. Korkea TBAR ox-LDL (90 nmol MDA /mg proteiini) ostettiin Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, MA). Ihmisen IgG hankittiin Abcam (Cambridge, MA).

reaaliaikaiset kvantitatiiviset PCR

Solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai

OLR1

ekspressiovektoriin. Transfektion tehokkuus vahvistettiin rinnakkain kokeissa GFP-plasmidin. Osa transfektoiduista viljelmät (kaikki kolmena rinnakkaisena), käsiteltiin oxLDL (40 ug /ml) 24 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta ja RNA. RT qPCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7900 reaaliaikainen PCR-järjestelmä. qPCR erityisiä alukkeet suunniteltiin käyttäen Probe-Finder (https://www.roche-appliedscience.com) web-pohjainen ohjelmisto. Kaikki qPCR reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 15 ui, joka sisälsi 1 x SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 300 nM kutakin geenin spesifisiä alukkeita, 100 ng cDNA: ta, steriiliin deionisoituun veteen. Standardi pyöräily ehto oli 50 ° C 2 min, 90 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 62 ° C 1 min. Tulokset analysoitiin SDS 2,3 suhteellista kvantifiointia Manager-ohjelmisto. Vertaileva raja syklit arvot normalisoitiin GAPDH viite geenejä. qPCR suoritettiin kolmena kappaleena varmistamiseksi määrällisiä yksityiskohdat.

Transfektio protokollan

Solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai

OLR1

cDNA konstruktit (Origene, Rockville, MD) käyttäen lipofektamiinia 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti valmistajan ohjeiden vähäisin muutoksin. Alustavissa kokeissa olemme päättäneet, että suurempi transfektion tehokkuus saavutetaan soveltamalla 2:01 suhde DNA lipofektamiini suhteessa ehdotettu DNA-pitoisuudesta suositellaan yleisen protokollan. Näitä olosuhteita käyttäen, rutiininomaisesti havaittiin 70-80% transfektiotehokkuuden.