Krooninen sairaus

tiivistelmä

Toimiva kytkös rakenteellisesti etuyhteydettömien reseptorit HER2 ja CXCR4 on ehdotettu rintasyöpä, mutta ei ole arvioitu ruokatorven syöpä . Esto HER2 johtaa vähenemiseen primaarisen kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden ortotrooppinen mallin ruokatorven karsinooma. Kemokiinireseptori CXCR4 on ollut mukana metastaattisen levittäminen erilaisten kasvainten ja korreloi huonon selviytymistä ruokatorven syöpä. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia korrelaatio ekspressiotasot HER2 ja CXCR4 ja arvioida involvemnent CXCR4-ilmentymisen HER2-positiiviset ruokatorven syöpä. Vaikutukset HER2-eston trastutsumabilla ja CXCR4-eston kanssa AMD3100 on ensisijaisen kasvaimen kasvuun, metastaattisen itseohjautuva, ja reseptorin ilmentymisen arvioitiin

in vitro

ja käytettäessä potilaalle tehdä malli metastasoituneen ruokatorven karsinooma magneettikuvauksista kuvantamiseen. Kliinistä merkitystä HER2- ja CXCR4-ilmentyminen tutkittiin ruokatorven syöpä potilailla. Merkittävä korrelaatio HER2- ja CXCR4-ilmentymisen primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä olemassa potilaalle tehdä mallissa. Trastutsumabi ja AMD3100 käsittely johti huomattavaan vähenemiseen ensisijaisen kasvaimen kasvua, etäpesäkkeitä ja micrometastases. HER2-ilmentyminen merkitsevästi kohonnut alle AMD3100 hoito primaarikasvaimen ja erityisesti etäpesäkkeitä. Positiivinen korrelaatio HER2- ja CXCR4-ilmentyminen oli validoitu ruokatorven syöpäpotilailla. Korrelaatio CXCR4- ja HER2-ilmaisun ja korkeus HER2-ilmaisun ja vähentäminen etäpesäkkeiden kautta CXCR4-eston viittaavat mahdollinen toiminnallinen sidos ja osassa kasvaimen leviämisestä HER2-positiiviset ruokatorven syöpä.

Citation: Gros SJ, Kurschat N, Drenckhan A, Dohrmann T, Forberich E, Effenberger K, et ai. (2012) osallistuminen CXCR4 kemokiinireseptori in metastasoituneen HER2-positiivinen ruokatorven syöpään. PLoS ONE 7 (10): e47287. doi: 10,1371 /journal.pone.0047287

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 elokuu 2012; Hyväksytty: 14 syyskuu 2012; Julkaistu: 17 lokakuu 2012

Copyright: © Gros et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ on tukenut avustus GR 3484 /1-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat kiinnostusta: Robert M. Hoffman liittyy AntiCancer, Inc . tohtori Pantel on Palkkiot Roche ja asiantuntijatodistajia kanssa Genentech. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Ihmisen epiteelisolujen kasvutekijän reseptori perhe ( HER, ErbB) reseptorin kinaasien on tärkeä rooli kasvaimen kasvussa ja etenemisessä [1]. Näistä reseptoreihin, HER2 on vahvin onkogeeni, ja on havaittu monistuvan ja yli-ilmentynyt noin 20% rintasyövistä [2] Rintasyövän HER2 tiedetään liittyvän huonoon ennusteeseen ja etäpesäkkeitä [3], [4]. HER2-yli-ilmentymän ja vahvistus raportoidaan ruokatorven syöpään kanssa taipumusta korkeampia positiivisuuden adenokarsinooma [5] – [10] verrattuna okasolusyöpää [6], [7], [11] – [13]

vahva yksimielisiksi HER2 tila primaarinen ja metastaattinen ruokatorven adenokarsinooma korkean tason HER2-geenin monistuma havaittu, mikä viittaa siihen, ruokatorven syöpä HER2-positiivinen primaarikasvainten ehdokkaiksi trastutsumabi hoito [14]. HER2 tiedetään lisäävän metastasoituneen potentiaalia hiiren ja ihmisen syövän solulinjoissa [15] – [18].

trastutsumabi (Herceptin®) vasta-aine-pohjainen terapia olemassa jota menestyksellisesti käytetty kliinisesti kohdistamiseen HER2 metastaattinen HER2-positiivisen rintasyövän [3], [19] – [21]. Trastutsumabi sovellus on myös dramaattinen vaikutus HER2-positiivisten rintasyöpäpotilaiden liitännäishoitona hoito [22]. On jopa näyttöä mahdollisen vastauksen HER2-positiivisen ei-rintasyövistä (esim mahalaukun syöpä) trastutsumabille [23], [24].

Merkittävä väheneminen ensisijaisen kasvaimen kasvua ja metastaaseja on aikaisemmin raportoitu käytettäessä potilaalle tehdä mallin HER2-positiivisten ruokatorven adenokarsinooma hoidettaessa trastutsumabi [25]. On osoitettu, että HER2- signalointi rintasyövän parantaa ilmentymistä CXCR4, joka vaaditaan HER2-välitteisen hyökkäys [26]. Kemokiiniryhmä CXCR4 on ehdotettu keskeinen rooli tuumorisolun homing imusolmukkeisiin ja luuytimeen ruokatorven syöpä [27]. Expression of CXCR4 korreloi merkittävästi yleistä ja kasvainspesifisiä eloonjäämisen ruokatorven syöpä ja on yhteydessä huonoon ennusteeseen [27]. Korrelaatio CXCR4 ja HER2 ja mahdollinen toiminnallinen rooli vuorovaikutuksessa niiden reittien, kuitenkin, ei ole tutkittu adenokarsinooma ruokatorveen.

Kemokiinit ovat superperheen pieniä sytokiinin kaltaiset peptidit [28], [ ,,,0],29]. Vuorovaikutuksessa kemokiinin reseptoreihin, kemokiinit aiheuttaa solun tukirangan uudelleenjärjestelyn hematopoieettisten solujen, lisätä niiden tarttuvuus, ja suora siirtyminen kotona tiettyihin elimiin. Kemokiinireseptorit ovat G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien ja CXCR4 on yksi parhaista, tunnettu siitä reseptoreihin. CXCR4 ja sen ligandi SDF-1α tärkeä rooli kohdistamisessa rintasyövän etäpesäkkeitä [30], [31]. Kemokiinin SDF-1α vapautuu suuria määriä elimiin kuten keuhko-, luu-, ja maksassa. Vetovoima SDF-1α ja CXCR4 aiheuttaa rintasyöpä solujen kulkeutumaan nämä elimet, jossa ne lisääntyvät ja muodostavat metastastes [30], [31].

Koska etäpesäke on edelleen johtava syy kasvaimeen liittyvä kuolema ja sairastuvuus on tärkeää edelleen ymmärtää monimutkainen patofysiologisia reittejä ja johtavia prosesseja metastaaseja. Metastasoitunut polkuja pahanlaatuinen kasvain taudin ovat monimutkaisia ​​ja edelleen huonosti [32] – [36].

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutukset yhden ja yhdistetty inhibitio HER2 ja CXCR4-reseptoriin polkuja, ja tutkia HER2- ja CXCR4-ekspressiotasot esteen alaisena, jotta voidaan määrittää mahdollinen osallistuminen CXCR4-ilmentymisen HER2-positiiviset ruokatorven syöpä. Lisäksi tavoitteena oli tutkia tarkemmin roolia CXCR4 ja HER2 perusterveydenhuollossa kasvaimen kasvua ja ohjautumisen etäpesäkkeitä. Lisäksi määritetään, että on tärkeää läsnäolo HER2 ja CXCR4 edustavalla potilaalla kollektiivinen, erittäin metastaattinen malli ruokatorven syöpä käytettiin arviointiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Line, solujen lisääntymistä, ja solujen vaeltamiseen

in vitro

ihmisen solulinja OE19 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Health Protection Agency, Wiltshire, UK) viljeltiin RPMI1560-alustassa (Biochrome KG, Berliini , Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [25].

Solujen proliferaatio mitattiin käyttäen LDH Sytotoksisuus Kit (PromoKine, Heidelberg, Saksa). 50000 OE19 solut ympättiin 24-kuoppalevylle, ja kasvatettiin yön yli. AMD3100 (Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa) täydennettiin elatusaineeseen ja solujen elinvoimaisuus analysoitiin 48 tunnin kuluttua.

Kasvain solujen vaeltamiseen mikrohuokoisen membraanin läpi arvioitiin perustuu Boyden kammion periaate. Soluja inkuboitiin viljelyväliaineessa 90 minuutin ajan, ja sitten maljattiin yläkammioon. Viljelyväliaineessa, joka sisälsi 500 ng /ml rekombinanttia ihmisen SDF-1α (R koronan T2-painotettu TSE rasvaa värikylläisyys: TR = lyhin; TE = 90 ms, flip kulma = 90 °, viipaleiden määrä = 20, leikkeen paksuus = 1 mm, matriisi = 448 × 448 px, FOV = 100 mm, määrä excitations = 3 ja rekonstruoitu vokselifantomeita = 0,22 /0,22 /1 mm

3. Sen jälkeen, sagittaalinen T2 TSE-sekvenssi käyttämällä rasvaa kylläisyyttä hankittiin mukaisesti seuraavat parametrit: TR = lyhin; TE = 90 ms, flip kulma = 90, määrä viipaleita = 22, leikkeen paksuus = 1 mm, matriisi = 448 × 448 px, FOV = 100 mm, NEX = 3 ja rekonstruoitu vokselifantomeita = 0,22 /0,22 /1 mm

3. Tutkiminen aika oli on noin 17 min.

Kuva-analyysi ja tilavuudenmittausmenetelmää

DICOM kuvia käsiteltiin käyttämällä ilmaista saatavilla olevat ohjelmistot Osirix®. Suurin tuumorin halkaisija mitattiin sekvenssit, jotka parhaiten visualisoida kasvain. Mittaukset tehtiin erikseen kaksi tutkijaa kullekin hiirelle ennen ja jälkeen hoidon. Lisäksi kasvaimen saatiin manuaalinen kiertolähestymistä kasvaimen vanteen kunkin viipaleen, jonka jälkeen automaattinen rakentaminen 3D kasvain kartan.

Patient kollektiivinen, immunovärjäystä ihmisen kudosten ja tietojen analysointi

potilas kollektiivinen 202 potilasta, jotka tehtiin leikkaus vuonna parantava aikomusta laitoksella kirurgian University Medical Center Hamburg-Eppendorf, tutkittiin sekä HER2- ja CXCR4-ilmaisun immunovärjäyksellä. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea kammion lääkärit Hampuri, Saksa ja kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista käyttää resektoitua näytteitä. Kun histopatologisen tutkimuksen resektio marginaalit olivat ilman kasvainta. Kasvaimen vaihe ja laatu oli luokiteltu kasvaimeen etäpesäke luokittelu International Union syöpää vastaan ​​[40]. Kasvain kudosnäytteitä, jotka oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä upotettiin Optimal Cutting Lämpötila yhdisteen (Tissue-Tek) ja leikattiin 5 mm. HER2 värjäämällä HercepTest (DAKO, Glostrup, Tanska) käytettiin protokollan mukaisesti valmistajan käyttäen 1:300 laimennus primaarisen vasta-aineen. Immunovärjäys tekee patologi (UR) jälkeen neliportainen asteikko (0,1þ, 2Þ, 3.) mukaan valmistajan ohjeiden. Leikkeet värjättiin anti-ihmis-CXCR4 monoklonaalinen vasta-aine (IgG2a, clone12G5; R Sigma, Deisenhofen, Saksa) käytettiin negatiivisena kontrollina. Vasta-aine Reaktio kehitettiin alkalisen fosfataasin anti-alkalinen fosfataasi (APAAP) tekniikka kuten toisen kanin anti-hiiri-polyklonaalista vasta-ainetta (klooni Z0259; Dako, Hampuri, Saksa) ja APAAP värjäys kompleksi (Dako), yhdessä uuden Fuchsin tahra (Sena , Heidelberg, Saksa). Visualisointiin, leikkeet vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä liuosta (Merck). Näytteet pidettiin immunopositiivisia CXCR4, kun yli 20% kaikista kasvainsolujen kuluessa jakso oli selvästi immunovärjättiin. Tulokset eivät vaihdelleet kun toinen cutpoint (e.g.5% positiivisia kasvainsoluja kuin cutpoint) testattiin. Kasvain Sitten näytteet luokiteltiin joko puuttua alhainen värjäytymistä (CXCR4-negatiivinen), jos 20% tai vähemmän kasvainsoluja ilmaistuna CXCR4, tai kohtuullisesta voimakkaaseen värjäytymistä (CXCR4-positiivinen), jos yli 20% tuumorisolujen ilmaisi CXCR4. Immunohistokemiallista analyysiä ja pisteytys suoritettiin kaksi riippumatonta tutkijat (UR, S.G.).

Tilastollinen analyysi suoritettiin tavallisella tietokoneella SPSS for Windows (versio 11.5.1, SPSS Inc., Chicago, IL). Korrelaatiot laskettiin rajat taulukoita ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin Fisherin testi p-arvo kaksipuolisia testejä 0,05.

Tilastotiedot analyysi

Tilastotiedot analyysi

in vivo

data suoritettiin käyttäen PASW Statistics 18 (SPSS Inc., Chicago, USA) tavallisella tietokoneella, jossa on quadcore prosessori. Määrittämiseksi merkitystä koskevista eroista kasvaimen kasvun ja reseptorin ilmentymisen, ei-parametriset Mann-Whitney-Wilcoxonin-testiä käytettiin. Fisher’s-Tarkka-Testi Count-Data käytettiin määritykseen merkityksen etäpesäkkeitä. Sillä korrelaatio MRI kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino Pearson-kertoimen ja korrelaatiota HER2- ja CXCR4-ilmaisun Spearman’s-rank-korrelaatio-kerrointa käytettiin.

Tulokset

Tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia mahdollista vuorovaikutusta HER2- ja CXCR4-reseptorit ja niiden ekspressiotasot hoidon aikana niiden estäjiä, jotta voidaan määrittää vaikutusta CXCR4-ilmentymisen HER2-positiiviset ruokatorven syöpä.

in vitro

proliferaatio ja migraatio ruokatorven OE19 solujen

tutkimiseksi vaikutusten CXCR4- ja HER2-reseptoreihin soluproliferaatioon

in vitro

OE19 soluja käsiteltiin AMD3100 ja trastutsumabi vastaavasti. Vaikka oli odotettavissa, että trastutsumabi hoito johtaa solujen kasvun vähenemistä, vaikutus hoidon AMD3100 ei ole määritelty. Cell kulkeutumista CXCR4-positiivisten solujen kuitenkaan pitäisi vaikuttaa kemoatrak- SDF-1α.

in vitro

soluproliferaatiomäärityksissä toistettavasti osoittivat merkittävää vähenemistä solujen lisääntymisen alle HER2- ja CXCR4 -reseptorin estäminen hoidon jälkeen trastutsumabi (p = 0,005) sekä AMD3100 (p = 0,02) (kuvio 1A). Kuten odotettua, hoito trastutsumabi johti vahvempi vähentäminen leviämisen kuin hoidon AMD3100. Vuonna migraatiokokeessa annoksesta riippuva vaikutus solujen vaeltaminen ei voitu havaita hoidon jälkeen SDF-1α (kuvio 1 B). Kemotaksista CXCR4-positiivisia OE19 soluja voitaisiin siis indusoida SDF-1α (kuvio 1C). Tulokset toistetaan useita pitoisuuksia (tuloksia ei ole esitetty).

Effect of trastutsumabi ja ADM3100 käsittely proliferaatiota (%) on OE19 solujen verrattuna kontrolliin, että laktaatti-dehydrogenaasi määrityksessä. -Reseptorin esto johtaa vähentyneeseen solujen lisääntymistä. Se osoittaa merkittävä väheneminen solujen lisääntymisen alle HER2- ja CXCR4-reseptorin esto hoidon jälkeen trastutsumabi (p = 0,005) sekä AMD3100 (p = 0,02) verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. B mikroskooppinen arviointi osoittaa annoksesta riippuvaa vaikutusta SDF-1α-stimuloitujen solujen muuttoliikkeen OE19 soluissa. CA asiaa vaikutus SDF-1α solun siirtymä havaitaan 250 ng /ml verrattuna stimuloimattomiin soluihin (kontrolli).

In vivo

leviämisen ensisijainen kasvain potilaalle tehdä mallin

tutkimiseksi edelleen käyttäytymistä paikallisten ja metastasoituneen ruokatorven kasvainten kasvua

vivo

OE19 soluja istutettiin ortotooppisesti NMRI /nu hiirille. Kaikki hiirille kehittyi ensisijainen kasvaimia implantointikohdassa kuten on esitetty MRI kahden viikon kuluttua implantaatiosta. Ruumiinpainon hiiret olivat 18,5-26,3 g alussa ja 22,5-32,7 g päättyessä kokeen. Keinot painoon kunkin terapeuttisen ryhmän alussa ja kokeiden päättyessä on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Mitään merkittävää vaihtelua ei havaittu. Hiiret satunnaistettiin kahden viikon kuluttua istuttaa terapeuttinen ryhmiin. Olemme aiemmin osoittaneet, että kasvaimen kokoa kahden viikon kuluttua implantaatiosta vastasivat toisiaan ryhmien [37]. Tuolloin kokeiden päättyessä, MRI scan suoritettiin välittömästi ennen dissecting eläimiä. Kaikki eläimet lopussa pisteen tutkimuksen ilman vakavia laihtuminen tai muita merkkejä kasvaintauti. Kasvaimen painot tallennettiin ja antoi arvojen 0,01-3,9 g. Kasvaimen volumetry suoritettiin ja vahvistettiin tuumorin paino tulokset (taulukko 1). Vaikka paino arvojen valvonnassa, trastutsumabi hoidetussa ryhmässä, ja trastutsumabi /AMD3100 saaneessa ryhmässä olivat homogeenisia, arvot vaihtelivat voimakkaammin sisällä AMD3100 hoidetussa ryhmässä. Kasvain painot kontrolliryhmässä olivat huomattavasti korkeammat kuin trastutsumabilla saaneilla (p 0,0001) ja trastutsumabi /AMD3100 saaneilla (p 0,0001) ryhmiä. Kasvain painot AMD3100 hoidetussa ryhmässä olivat huomattavasti korkeammat kuin trastutsumabilla saaneilla (p = 0,04) ja trastutsumabi /AMD3100 saaneilla (p = 0,02) ryhmiä (kuvio 2A). Vaikka vaikutus AMD3100 ensisijaisen kasvaimen paino ei ollut yhtä merkittävä kuin vaikutus trastutsumabi, joka on voimakas vaikutus päästiin AMD3100 hoito yksinään verrattuna käsittelemättömän ryhmän. Kasvain painot klo ruumiinavauksen korreloi merkittävästi äänenvoimakkuuden mitataan MK (korrelaatiokerroin: 0,837, p 0,01). Edustavia esimerkkejä magneettikuvia kasvaimen arvioinnin kanssa ja ilman hoitoa on esitetty kuvassa 2B.

Huomattavat erot kasvaimen painot välillä ohjaus ja trastutsumabi-käsiteltyjen ryhmien (p 0,00), ohjaus ja yhdistelmä trastutsumabin /AMD3100 käsiteltyä ryhmää (p 0,00), trastutsumabia ja AMD3100 hoidetuissa ryhmissä (p = 0,04), ja AMD: n ja yhdistelmä trastutsumabilla /AMD3100 hoidetuissa ryhmissä (p = 0,02). Vaikka vaikutus AMD3100 ensisijaisen kasvaimen paino ei ollut yhtä tärkeä kuin vaikutusta trastutsumabi, joka on voimakas vaikutus päästiin AMD3100 hoito yksinään verrattuna käsittelemättömän ryhmän. B MRI-pohjainen kasvain volumetry vahvistivat tulokset kasvaimen painoa. Kasvain painot klo ruumiinavauksen korreloi merkittävästi tilavuusmenetelmällä toimenpidettä MK (korrelaatiokerroin: 0,837, p 0,01). C mikrometastaasien maksassa ja keuhkoissa hoidon jälkeen AMD3100 ja trastutsumabi, analysoitiin reaaliaikaisella PCR tason mukaan ihmisen

GAPDH

. AMD3100 ja trastutsumabi-käsitellyistä hiiristä osoittivat, joiden keskimääräinen delta-ct-arvo -2 ja -3 vahva vähennykset keuhkometastaasitestissä 75 lähes 100%. Lisäksi trastutsumabi hoidetuissa hiirissä oli vahva väheneminen maksan etäpesäke edustaa keskimäärin delta-ct-arvo on -3. AMD3100 /trastutsumabi yhdistelmä ryhmä oli alennettua keuhkojen (delta-ct -2), ja maksan (delta-ct -3) etäpesäke. D Disseminated kasvainsoluja havaittiin sytokeratiinia ja HER2 immunhistochemical värjäystä. Kuvio 3B esittää luuytimen näyte. Ihmisen solu on vahva positiivisuus HER2 on havaittavissa (punainen).

* Tilan puutteen vuoksi, AMD3100 lyhennettiin AMD

Kuviot 2a ja c

.

metastasoituneen potentiaalin ruokatorven kasvainsolut

in vivo

päättymisestä

in vivo

kokeessa, mahdollisesti metastaattisen kudokset (keuhkot, maksa ja imusolmukkeiden) otettiin näytteet ja histologisesti tutkittiin arvioida metastaattisen leviämisen ruokatorven kasvain kussakin testiryhmässä. Lisäksi, mikrometastaasien maksassa ja keuhkoissa havaittiin mRNA: n ekspressio ihmisen

GAPDH

geenin reaaliaikaisella PCR-analyysillä kokonais-RNA: sta.

Kontrolliryhmässä laaja metastasoituneen leviäminen havaittiin keuhkojen , maksa ja imusolmukkeiden. 20% eläimistä oli aggressiivinen metastaaseja kaikkiin osastoihin kuten keuhko-, maksa- ja useita imusolmukkeiden. Sen sijaan AMD3100 käsitellyn ryhmän osoitti vähemmän etäpesäkkeitä ja vain yksi eläin ilmaisi erittäin aggressiivinen metastaattinen leviäminen kolme osastoa (keuhko-, maksa- ja imusolmukkeiden). Vaikka metastaattinen levisi yhdistelmähoito ryhmä ei ollut merkittävästi alempi kuin trastutsumabi hoidetussa ryhmässä, etäpesäke esitteli solitarily.

Tutkiessaan yleistä metastaattisen leviäminen H.E. ja immunohistologisia värjäytyminen oli merkittävästi pienempi metastaaseja löytyy trastutsumabi hoidetussa ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (p = 0,002). Erityisesti merkittävä väheneminen keuhkojen etäpesäkkeet voitiin havaita verrattuna kontrolliryhmään jälkeen AMD3100 trastutsumabi ja yhdistelmähoito sekä maksaan jälkeen trastutsumabi ja kombinaatio (kuvio 2C). Micrometastic arvot on esitetty delta-ct-arvoja kontrolli- ja testiryhmään.

Disseminoitunut kasvainsolujen luuytimen

läsnäolon määrittämiseksi levittää kasvainsoluja luuytimessä, levittää kasvainsoluja (DTC) eristettiin luuytimestä hiirten tiheysgradienttisentrifugaatiolla ja visualisoitiin kromogeenina immunovärjäyksellä. Havainto sytokeratiinin-positiivisten DTC luuytimessä osoitti laajuus kasvaintauti (kuvio 2D).

CXCR4 ja HER2 ilmaisun profiilia OE19 solujen

in vivo

Ensinnäkin, OE19 soluja tutkittiin niiden ilmentyminen CXCR4 ja HER2. Ei vain HER2-yli-ilmentymän lisäksi myös vahvistus sen geeni on kliinistä merkitystä, mikä

Her2

-amplification tila todennettiin. OE19 solut osoittivat voimakasta ilmaus CXCR4- ja HER2-reseptoreihin immuunivärjäykseen (kuvio 3A) sekä monistuminen

Her2

-geenin kalassa (kuvio 3B). Semiquantitive mRNA-analyysi osoitti ekspressiota

CXCR4

ja

Her2

verrattuna MDA-MB-231 ja SKBr-3-solulinjojen (kuvio 3C).

CXCR4-ilmentymisen OE19 solut määritetään fluoresenssin immunovärjäyksellä (lgG1-ohjaus) B vahvistus

Her2

-amplification määrittää fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla (punainen:

Her2

-geenin lokuksen, vihreä viite

Senttihuutokauppojen 17

-loci) C

CXCR4

ja

HER-2

mRNA-ilmentymisen analyysi ruokatorven syöpä solulinjan OE19 verrattuna MDA-MB-231 ja SKBr-3-solulinjojen ja null ohjaus (nc). D CXCR4 ja HER2 ekspressiotaso analyysi määrittää immunovärjääminen primaarikasvaimen, maksa-, keuhko- ja imusolmuke. Kuvat ovat näkyvät kudoksista käsittelemättömän eläimen (suurennus x 100). E intensiteetti HER2- ja CXCR4-ilmentyminen teki vuonna primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä. Positiivisuus-tulokset primaarituumorin ja vastaavat etäpesäkkeitä oli sovitettu arvioimaan esiintyminen ja korrelaatio primaarituumorin ilmaisun ja että sen omaa etäpesäkkeitä välillä terapeuttisen ryhmissä. Trastutsumabi hoito johti poissaoloon etäpesäkkeitä ja näin ei voitu sisällyttää.

* Tilan puutteen vuoksi, AMD3100 lyhennettiin AMD

Kuva 3e

.

Korrelaatio CXCR4- ja HER2-ilmaisun että potilaalle tehdä

in vivo

mallissa

Toiseksi primäärikasvain ja metastaattinen kudokset potilaalle tehdä mallista tutkittiin CXCR4- ja HER2-ilme. CXCR4- ja HER2-ilmentymistä havaittiin kaikissa kasvain-kudoksista, mukaan lukien ensisijainen kasvain, maksan, keuhkojen ja imusolmukemetastaaseja (kuvio 3D). HER2-ilmentyminen korreloi merkitsevästi CXCR4-ilmentyminen (korrelaatio tehokas 0,490, p 0,01).

Korkeampi intensiteetti HER2-ilmentymisen etäpesäkkeitä verrattuna primaarikasvaimen

edelleen arvioida merkitystä HER2 – ja CXCR4-korrelaatio, piste pisteeltä kaavio suunniteltiin (kuvio 3E), jossa kukin metastaattinen asia oli merkitty, mikä osoittaa sekä intensiteetti ilmaus etäpesäkkeiden (y-akseli) ja intensiteetti ilmaus omassa primaarikasvaimen (x-akseli). Mukaan hoitoryhmässä erilaisia ​​symboleja on käytetty. Ensimmäinen kaavio näyttää HER2-intensiteetti, toinen CXCR4-intensiteetin.

Mielenkiintoista on, korkeampi ilmentyminen HER2 ja CXCR4 näkyi etäpesäkkeitä kaikkien terapeuttisten ryhmien verrattuna niiden ensisijainen kasvaimia. Intensiteetti HER2- ilmaisun (pisteet 1-3) primaarikasvainten ja niiden etäpesäkkeiden sovellettiin ensimmäisessä kaaviossa kuvassa 3E. Kuvaaja osoitti, että intensiteetti HER2-positiivisuus immunovärjäyksellä vaihtelee kudosten hoitoryhmässä. Vaikka HER2-positiivisuus primaarituumorin kontrolliryhmässä rajoittui kevyemmin (pisteet 1), etäpesäkkeitä ilmaisi HER2 ollenkaan intensiteettiä. Under AMD3100 hoito on kuitenkin HER2 vasta ilmaistu vahvempi intensiteettiä (pisteet 2 + 3), primaarikasvaimen. Etäpesäkkeitä AMD3100 hoidetussa ryhmässä ilmaista HER2 lähes yksinomaan korkeimmalla intensiteetti (pisteet 3).

Haettaessa intensiteetti tulokset CXCR4-positiivisuus (tulokset 1-3) ensisijaisen kasvaimia ja niiden metastaasit toisen kaavion kuvassa 3E, tulokset kontrolliryhmässä vaihteli kevyempi ja keskipitkän intensiteetit (pisteet 1 + 2). Vaikka intensiteetti CXCR4-ilmentymisen tasot ensisijainen kasvaimia AMD3100 käsitellyssä ryhmässä saavutettiin korkeampi ekspressiotasoja (pisteet 3), intensiteetti metastaattisen CXCR4-ilmentyminen ei ainoastaan ​​siltä osin kuin keskitasoiset (pisteet 2).

molemmissa kaavioissa, trastutsumabi-hoidetussa ryhmässä ei voitu arvioida tällä tavoin, koska ei ollut etäpesäkkeitä. Yhdistetyn hoidon ryhmässä oli vain kaksi metastaattinen tapauksissa tekemällä arviointi tilastollisesti luotettavia.

lisääntymisen merkkejä HER2-ilmentymistä AMD3100 hoito

väitä näin, että ilmaus CXCR4 ja /tai HER2, niiden vastaavat reittejä ja niiden vuorovaikutus ovat mukana välittämässä kasvainprogression ja metastaattinen itseohjautuva, kukin terapeuttinen ryhmä arvioitiin erikseen intensiteettiä HER2- ja CXCR4-ekspressiotasot. Käyttämällä samaa kaavio (kuvio 3E) intensiteetti HER2- ja CXCR4-ilmentymistä verrattiin hoitoryhmien välillä. Verrattuna kontrolliryhmään, HER2-intensiteetit etäpesäkkeiden ja ensisijainen kasvain AMD3100 käsitellyn ryhmän edustaa korkeammat pisteet kaikkialla.

Kun tilastollisesti vertaamalla HER2 ilmaus primaarituumorin ja etäpesäkkeitä välillä terapeuttisten ryhmien huomattavasti suurempi HER2-ilmentymistä havaittiin trastutsumabi-hoidetussa ryhmässä (p = 0,003), ja AMD3100-hoidetussa ryhmässä (p = 0,003) verrattuna kontrolliryhmään. Kun tarkastelun CXCR4-ilmentymisen, huomattavasti suurempi ekspressio havaittiin trastutsumabi-hoidetussa ryhmässä (p = 0,003) ja suurempi ilmaisun AMD3100-hoidetussa ryhmässä (p = 0,065), verrattuna kontrolliryhmään. Yhdistetty hoito ryhmä (trastutsumabi /AMD3100) kumpikaan osoitti merkittävää HER2-ilmentyminen tai CXCR4-ilmentymisen eroja verrattuna kontrolliryhmään.

validointi CXCR4- ja HER2–parin ihmisen ruokatorven syöpä

edelleen vahvistaa korrelaatiota HER2 ja CXCR4 joka löydettiin

in vivo

tutkimuksissa primäärikasvain kudoksia 202 potilasta tutkittiin sekä HER2- ja CXCR4-ilmaisun immunovärjäyksellä.