Krooninen sairaus

tiivistelmä

Makrofageilla ovat soluja monia tärkeitä tehtäviä sekä synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen ja on osoitettu olla monimutkainen tehtävä kasvainprogression koska ne satama sekä kasvaimen estämiseksi (M1 makrofagit) ja kasvaimen edistäminen ( M2 makrofagit) toimintaa. Monissa ihmisen syövissä, soluttautuminen makrofagien on liittynyt huono potilaan ennustetta, ja siksi ehdotettu olevan pääasiassa M2 fenotyypin. Kuitenkin me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että lisääntynyt makrofagien tiheyden peräsuolen syöpä (CRC) on sen sijaan korreloi parannetun ennuste. Se on kiehtova kysymys, jos erilaisia ​​rooleja makrofagit erilaisissa syövissä voidaan selittää vaihtelut tasapaino M1 ja M2 makrofagi määritteitä vetämänä kasvain- tai elinspesifiseen tekijät kasvaimen mikroympäris- yksittäisten syöpiä. Täällä käytetään

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä makrofagien erilaistumista vertailla eroja ja yhtäläisyyksiä fenotyypin (morfologia, antigeeni-esitys, muuttoliike, endosytoosin, ja ilmaus sytokiinien ja kemokiinin geenit) välillä M1 /​​M2 ja kasvaimen aktivoitu makrofagit (TAM), jotka voisivat selittää myönteistä roolia makrofagien CRC. Olemme havainneet, että erittyvä tekijöistä CRC soluista indusoi TAM on ”sekoitettu” M1 /​​M2 fenotyyppi, mikä puolestaan ​​voisi edistää ”hyvä tulehdusreaktio”. Tämä viittaa siihen, että uudelleen koulutus makrofagien voisi mahdollistaa tärkeitä terapeuttisia edistysaskeleita ihmisen syövän hoidossa.

Citation: Edin S, Wikberg ML, Rutegård J, Oldenborg PA, Palmqvist R (2013) fenotyyppinen Vinoutuminen makrofagien

In vitro

eritetyt tekijät välillä peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (9): e74982. doi: 10,1371 /journal.pone.0074982

Editor: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 13 elokuu 2013; Julkaistu: 18 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Edin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Ruotsin Cancer Society (Grant no. CAN 2011/839, Palmqvist) (www.cancerfonden.se); Swedish Research Council (Grant no. B03488901, Palmqvist) (www.vr.se); Huippututkimusta Grant maakäräjien Västerbottenin, Ruotsi (Grant no. VLL-132981, Palmqvist); Cancer Research Foundation Pohjois-Ruotsissa (Grant no. AMP 10-655, Edin) (www.cancerforskningsfonden.se); ja Tore Nilssons Foundation (Edin) (www.torenilssonsstiftelse.nu). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvain mikroympäristölle soittaa useita monimutkaisia ​​ja tärkeä rooli syövän etenemistä [1]. Viime vuosikymmenen aikana, yksi pääpaino syöpätutkimuksessa on ollut merkitystä tulehduksellisten kasvain microenvironment, joka on sittemmin johtanut sisällyttämistä kasvaimeen edistävät tulehdusta ja immuunijärjestelmän veronkierron nousevina tunnusmerkkejä syöpä [2]. Lisääntynyt ymmärrys immuuni contexture – eli sijainti, tiheys ja toiminnallinen suuntautuminen immuunisolujen, ja miten tämä vaikuttaa syövän etenemiseen voisi tarjota tärkeitä työkaluja ennustamisessa potilaan ennustetta sekä uusien hoitostrategioiden [3].

työ tulehdus ihmisen syövässä on johtanut tunnistamiseen osien immuunijärjestelmä, joka voi olla sekä hyödyllistä haitallisia potilaan ennustetta. Yksi tällainen komponentti on makrofagit luonnollinen immuniteetti. Makrofagit osoittautuneet erittäin muovia soluja, jotka voivat näyttää sekä kasvaimen estämiseksi (M1 makrofagit) ja kasvaimen edistämällä toiminnot (M2 makrofagit) tarkistetaan [4], [5]. Lyhyesti, klassisesti aktivoitu M1 makrofagit tukee adaptiivista immuunivastetta ja kohdistaa tartunnanaiheuttajia ja vaurioituneet tai muuttaa soluja. Niille on ominaista lisääntynyt ekspressio antigeeniä esittelevän molekyylejä (esim MHC-luokka II), kostimulato- reseptoreita lymfosyyttien (esim CD86 ja CD40), sekä useita pro-inflammatoristen sytokiinien (esim IL6, IL12, IL23 ja TNFa), ja on raportoitu olevan mikrobeja tappava ja kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta. Vaihtoehtoisesti aktivoitu M2 makrofagit harjoittavat haavan paranemista ja huolloissa kudosten homeostaasin ja siivouksessa ja ilmentävät korkeita hahmontunnistuksen reseptorien (esim mannoosireseptorin (MR) ja scavenger-reseptorien (esim CD163). Kuitenkin monet toiminnot M2 makrofagien voi itse asiassa olla pro-tuumorigeenisia koska ne stimuloivat solujen lisääntymisen, kudoksen uudelleen, angiogeneesiä ja kehittäminen immunosuppressiivinen ympäristön eritystä immuuni-ehkäisevästä sytokiinien (esim IL10 ja TGF), joita voidaan hyödyntää kasvava kasvain hyökätä ympäröivään kudosten ja levinnyt kaukaisiin elimiin [6]. M1 ja M2 makrofagien on erilaiset kemokiini profiileja, mikä johtaa valikoivan immuunisolujen, kuten eri osa T-lymfosyyttien. Vaikka M1 makrofagit lähinnä ilmaista CXCL9 ja CXCL10 jotka rekrytoivat lymfosyyttien T auttaja tyyppi 1 (Th1) ja sytotoksisten (Te) osajoukkoja, M2 makrofagit sijaan ensisijaisesti rekrytoida lymfosyyttien sääntelyn fenotyypin (Treg) ja T auttaja tyyppi (Th2) osajoukkoja erityksen kemokiinien CCL17, CCL22 ja CCL24 [4], [5 ], [7]. Makrofagit voivat myös erilaistua eri M2 kaltainen toimintatiloja, jotka ovat osoituksena sekä

in vitro

ja

in vivo

, tarkistetaan [4]. Todellisuudessa, muunnelmia makrofagien eri M1 tai M2 ominaisuudet näyttävät olevan loputon. M1 ja M2 makrofagi fenotyyppien olisi katseli kuin äärimmäisen toiminnallinen toteaa kirjo makrofagi phentoypes [8]. Kuitenkin M1 ja M2 luokittelu voidaan edelleen käyttää tunnistamaan tärkeimmät fenotyyppi ja tehtäviä eri makrofagien populaatioissa. Makrofagi fenotyyppi ohjataan tapahtumia kasvaimen mikroympäristössä, jossa se löytyy. Esimerkkejä makrofagin polarisoivasta tapahtumat ovat eritystä kasvain- välittäjiä, hypoksinen tai nekroottisen tekijöitä ja kudosvaurioita [9]. Makrofagi fenotyyppi vaikuttavat myös muut immuunijärjestelmän solut ja peruskudoskomponentit.

ihmisen syövissä, makrofagien tunkeutuminen on usein korreloi huonompi ennuste ja näin ollen kasvaimeen liittyvät makrofagit on ehdotettu olevan pääasiassa M2-fenotyypin [10] – [12]. Tämä ei kuitenkaan ole kaikissa syövissä. Peräsuolen syöpä (CRC), me ja muut ovat osoittaneet, että suuri määrä kasvaimeen liittyvien makrofagien korreloivat parannettua ennusteeseen [13] – [17]. Olemme edelleen tutkineet jakelua M1 ja M2 makrofagin fenotyyppejä CRC. Olemme havainneet, että numerot, M1 ja M2 makrofagit korreloivat voimakkaasti. Potilaita, joilla on suuri määrä soluttautua M1 makrofagien, oli myös suuri määrä soluttautua M2 makrofagien, ja huomattavasti parempi ennuste [18]. Kun otetaan huomioon korkea plastisuus makrofagien, yksi mahdollinen selitys sekapopulaatioon M1 ja M2 makrofagit nähdään CRC voi olla joko että kasvain erittyy tekijät CRC on potentiaalia aiheuttaa tai ylläpitää M1 makrofagin ominaisuuksia, tai että niitä ei ole ajo M2 makrofagi eriyttäminen samassa määrin kuin muissa syövissä, joissa makrofagien tunkeutuminen on selvästi haitallista potilaalle ennustetta.

Tässä olemme käyttäneet

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä vertailla fenotyypin (ja toiminnot) sekä kasvain aktivoitu makrofagit (TAM) CRC kuin vakiintuneiden M1 ja M2 makrofagien fenotyyppien saada parempi käsitys siitä, miten makrofagien fenotyyppi vaikuttaa kasvaimen erittyy tekijöitä ja miten tämä voisi vaikuttaa potilaiden hoitotuloksiin. Olemme havainneet, että erittyvä tekijät CRC solut eivät indusoi täydellistä M1 tai M2 makrofagi vastausta, vaan TAM on ”sekoitettu” M1 /​​M2 fenotyyppi. Lisäksi vaikka M1 ja M2 makrofagien havaittiin helposti uudelleen edjucated vastakkaiseen suuntaan, erittyy tekijöiden CRC-solut eivät kyenneet vinossa jo M1 makrofagien kohti M2 makrofageja, mutta sen sijaan ilmestyi vahvistaa M1 fenotyyppi. Yhdessä tämä voi olla omiaan luomaan ”hyvä tulehdusreaktio”, jossa kasvain esti toiminnot makrofagien hallitsevat.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ihmisen monosyyttejä saatu buffy coats anonyymien terveitä verenluovuttajia, jotka olivat antaneet tietoon perustuvan suostumuksen kirjallisesti (paikallisten ohjeiden klo veripankki, Uumajan yliopistollisessa sairaalassa). Mukaan paikallisten tutkimus- eettisen komitean (Regional Ethical Review Board Uumajassa) etiikka hyväksyntää ei vaadita tutkimaan leukosyytit eristettiin buffy coats saatu nimetön verenluovuttajien (DNR 2012-327-31M).

Cell Culture

CRC solulinjat RKO, SW480 ja Caco2 (ATCC) kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa 5% hiilidioksidissa. Esikäsitelty väliaine CRC solulinjat valmistettiin pesemällä solut fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), minkä jälkeen soluja kasvatettiin noin 90% konfluenssiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja 48 tuntia. Elatusaine kerättiin, sentrifugoitiin 3000 rpm 30 minuutin ajan ja säilytetään -80 ° C: ssa pakastimessa ennen käyttöä. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) puhdistettiin verenluovuttajien buffy coats dekstraanisedi- sedimentoitumisen ja Fiqoll-Paque gradienttisentrifugoinnilla. Monosyytit puhdistettiin edelleen PBMC: t joko 1,5 tuntia adheesion jälkeen 2 pesua lämmintä PBS, johon oli lisätty 5% FBS: ää, tai magneettiset soluerottelulla (MACS), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Miltenyi Biotec), jolloin populaation monosyyttien on noin 95%: n puhtaudella. Puhdistettu monosyytit kasvatettiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää ja antibiootteja, jota oli täydennetty 20 ng /ml M-CSF: ää, jossa väliaine vaihdettiin joka toinen päivä. Päivänä 6, monosyyttejä stimuloitiin edelleen 40 h lisäämällä 100 ng /ml LPS: ää ja 20 ng /ml IFNy (M1 makrofagit), tai 20 ng /ml IL4 tai IL10 (M2 makrofagit). Kasvaimen aktivoitu makrofagi subsets, monosyyttejä päivänä 6 inkuboitiin tuumorin alusta täydennettynä 20 ng /ml M-CSF: 40 h. Solut kerättiin ja alistettiin edelleen analyysejä. Differentioitu makrofagi fenotyypit arvioitiin kunkin Valkosolukerros virtaussytometrisellä analyysit ilmaisun M1 ja M2 tyypillisiä markkereita. Solukuoleman (apoptoosin /kuolio) kontrolloitiin virtaussytometrillä käyttämällä anneksiini V /PI-värjäys (Abcam) kuin valmistajan suosittelemia. EtOH lisättiin konsentraatiossa 5%: ssa 30 minuuttia positiivisena kontrollina solun kuolemaan.

morfologinen tutkimus 8 x 10

6 puhdistettiin mononukleaarisia soluja kuoppaa kohti siemennettiin 6-kuoppaisille viljelylevyille, puhdistettiin edelleen tarttuvuutta, ja erotellaan eri makrofagi populaatiot, kuten edellä on kuvattu. Live valokuvauksen otettu DeltaPix Invenio 3S asennettu Leitz Diavert mikroskoopilla.

Virtaussytometrinen analyysi

Surface markkeri ekspressio analysoitiin virtaussytometrillä (BD FACS Calibur -virtaussytometrillä) käyttämällä R-fykoerytriini (R-PE) konjugoitua monoklonaalinen vasta-aine CD14 (klooni M5E2, BD Pharmingen) ja CD1 a (klooni HI149, ImmunoTools); Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua monoklonaalinen vasta-aine CD86 (klooni FUN-1, BD Pharmingen), HLA-DR (klooni MEM12, Abcam), ja CD40 (klooni 5C3, BD Pharmingen); Allofykosyaniini (APC) konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta vastaan, mannoosi-reseptori (MR) (klooni 15-2, Biolegend) ja CD163 (klooni 215927, R Kemokiinit PCR Array (PAH-150A, SABiosciences) mukaisesti valmistajan suosituksia. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin eri solupopulaatioiden käyttäen NucleoSpin® RNA II Kit (Macherey- Nagel). 1 ug kokonais-RNA: ta käsiteltiin DNaasi ja cDNA valmistettiin käyttämällä RT

2 First Strand kit. Jokaista analyysia varten cDNA näytteitä sekoitettiin RT

2 qPCR Master Mix jakautuen PCR array 96-kuoppalevyille ja pyöräilin reaaliaikaista PCR (ABI 7900HT, Applied Biosystems). Monistusdatan (fold-muutoksia C

t-arvot kaikkien geenien) analysoitiin SABiosciences ohjelmisto.

Tilastot

Tilastollisesti merkittävä eroja arvioitiin käyttäen 2-tailed opiskelijat n

t

testiä.

p

arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Luvut osoittavat keskimäärin 3 itsenäisen kokeen, ellei toisin mainita. Virhe palkit osoittavat keskihajonnan (SD).

Tulokset

Saat paremman käsityksen siitä, miten kasvain sinänsä vaikuta fenotyypin ja toiminta makrofagien CRC, olemme käyttäneet

in vitro solu-

kulttuurin malli tutkia vuorovaikutusta erisuuruisten ääreisverenkierron makrofagien ja CRC solulinjoissa. Eräässä

in vitro

ympäristössä, klassisesti aktivoitu M1 makrofagi- fenotyyppi voidaan saavuttaa altistamalla TLR ligandeja, kuten LPS ja Th1 tyypillisiä sytokiinin IFNy. Vaihtoehtoisesti aktivoitu M2 makrofagit erilaistua mikroympäristöjen runsaasti Th2 tyypillisessä sytokiinien (esim. IL4 ja IL13) ja joskus kutsutaan haavojen makrofagit. Vastauksena immuuni heikentävän sytokiinien (esim IL10) makrofagien hyväksymään M2 kaltainen immuuni-sääntelyn fenotyypin [4], [8].

tarkastaminen M1 ja M2 makrofaagianalyysi populaatiot

Puhdistettu monosyyttejä oli eriyttää kiinnittynyt makrofageja stimuloimalla sytokiini M-CSF 1 viikko ja edelleen eriytetty lisäämällä LPS ja IFNy (M1), ja IL4 tai IL10 (M2 makrofagit). Kuten kuviossa 1A, M1 makrofagit, yleensä näkyy entistä pyöreä morfologia taas M2 makrofagit olivat pitkänomainen. Makrofagit ajetaan läsnä ollessa M-CSF yksinään osoitti myös pitkänomainen morfologia paremmin muistuttaa M2 fenotyyppi, vaikka vähemmän selvä, että eri populaatioiden M2 makrofageissa. Tutkii tarkemmin morfologiaan, IL4 kannustanut M2 makrofagit osoitti selvin venymä, jossa etenkin pitkiä ulokkeita (kuvio 1A). IL10 stimuloi makrofageja olivat samanlaisia ​​kuin M-CSF stimuloi makrofageja, lukuun ottamatta on hieman enemmän kiinnittynyt. Sulkea pois, että morfologisia eroja välillä nähdään M1 ja M2 makrofagit eivät lisääntyneen apoptoosin tai nekroosin, olemme analysoineet sitova anneksiini V solun pinnan fosfatidyyliseriinin ja sekä propidiumväriä jodia (PI) ottoa, vastaavasti. Kuten kuviossa 1B, eri makrofagi fenotyyppejä sisälsi kohtuullisen alhainen apoptoottisten ja nekroottisten solujen, vastaavasti. Kun tarkastellaan ilmaus M1 tai M2 tyypillisiä markkereita virtaussytometrialla, M1 makrofagit osoitettiin ilmentävän korkeita solun pinnan tasoja luokan II MHC-reseptorin HLA-DR, sekä T-solujen kostimuloiva reseptoreihin, CD86 ja CD40, mutta alhaisempi tyypillinen M2 markkereita, CD163 ja MR (kuvio 1C). M2 makrofagit sijaan ilmaistu korkeita CD163 ja MR, kun taas osoittaa alhainen ilmaus M1 markkereita (kuvio 1 C). Kaksi M2 väestö voisi puolestaan ​​erottaa että IL4 stimuloi makrofagien osoitti korkeampaa ilmaisua MR, kun taas IL10 stimuloi makrofageja ilmaistuna korkeampi CD163 (kuvio 1 C). Lisäksi kaikki makrofagi alatyyppejä havaittiin tyypillisesti ilmaista monosyytti /makrofagi CD14 (kuvio 1 C). CD1a, markkeri dendriittisolujen monosyyttistä alkuperää olevia soluja, ei ollut esitetty joko makrofagin populaatioiden (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Morfologiset arviointi makrofagien fenotyyppejä. (B) Apoptosis ja kuolion makrofagien populaatioiden arvioitiin värjäämällä anneksiini V: n ja PI, vastaavasti, ja sen jälkeen virtaussytometrialla. Näkyy on prosentti nekroottisten /apoptoottiset solut (keskiarvo ± SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) Expression of solunulkoisen merkkiaineita makrofagi väestön arvioimana immunovärjäyksellä ja virtaussytometria. Suhteellisen keskimääräisen flourescense intensiteetti (MFI) ± SD kolmesta tai useammasta itsenäisestä kokeesta on esitetty, jossa kukin näyte normalisoitiin suhteessa sen vastaavaan isotyyppikontrolli. Merkitykselliset tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty * (p 0,05), ** (p 0,01), tai *** (p 0,001), ei-merkitsevä

p

arvot ilmaistaan ​​ns

muutto M1 ja M2 Makrofageilla

tutkia, onko kasvain erittyy tekijöitä jotenkin edullisesti makrofagien tietyn fenotyypin, katsoimme leviämiskyky M1 ja M2 makrofagit käytettäessä

in vitro

solussa migraatiokokeessa. Olemme havainneet, että M1 makrofagit oli hyvin alhainen leviämiskyky kohti RPMI vertailualustassa, kun taas M-CSF stimuloi ja M2 makrofagien siirtyneet enemmän kohti keskipitkän yksin (kuva 2). Kun mahdollistaa eri alaryhmien makrofagien siirtyä kohti ilmastoitu mediaa RKO tai SW480 CRC solulinjojen, huomasimme, että ensisijaisesti IL4 stimuloi M2 makrofagit osoittivat lisääntynyttä siirtymistä tuumorin mediaa, mikä viittaa siihen, että kasvaimen erittyvän tekijät mieluiten rekrytoida makrofageissa haavan paranemista fenotyyppi (kuvio 2).

Migration makrofagien fenotyyppien arvioitiin Boyden kammion kokeissa, joissa makrofagit annettiin siirtyä kohti Esikäsitelty väliaine RKO tai SW480 CRC solulinjoja tai viljelyväliaine ohjaus (RPMI + 10% FBS) . Mean numerot vaeltavien solujen (n) ± SD esitetään. Merkitykselliset tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty * (p 0,05), ei-merkitsevä

p

arvot ilmaistaan ​​ns

fenotyyppi Kasvain aktivoitu makrofagit (TAM) B

morfologia ja solunpintafenotyyppi of TAMeja eriytetty läsnä vakioitua elatusainetta RKO, SW480 tai Caco2 CRC solulinjoissa analysoitiin kuviossa 3A ja B, vastaavasti. TAM oli pitkänomainen, jolloin morfologia enemmän muistutti M2 makrofagi populaatioiden (Vertaa kuviot 3A ja 1A). Tarkasteltaessa ilmaisun M1 ja M2 erityisiä solunpintamarkkereiden, TAM havaittiin myös jakaa enemmän yhtäläisyyksiä M2 makrofagien (kuvio 3B). Kuitenkin TAM fenotyyppi ei ollut yhtä selvä kuin se, että M2 makrofagit, koska korkea ekspressio joko MR (kuten IL4 stimuloiduissa M2 makrofagit) tai CD163 (kuten IL10 stimuloiduissa M2 makrofagit) ei yleensä nähty. Poikkeuksena oli makrofagit aktivoituvat vakioitua elatusainetta SW480-soluja, jotka näytetään korkean ilmentymisen MR samanlainen kuin IL4 stimuloitu M2 makrofageissa (kuvio 3B). Nämä tiedot siksi viittaavat siihen, että SW480-solut voivat vääristää makrofagit kohti lausutaan M2 fenotyypin, kun taas RKO tai Caco2 soluja ei indusoi merkittäviä muutoksia M-CSF stimuloi makrofagien, ainakaan muutoksia, havaittu täällä.

( A) Morfologiset arviointi makrofagien stimuloidaan medium (Cm) alkaen RKO, SW480 tai Caco2 solulinjoista. (B) ilmentäminen solunulkoisen markkereita arvioitiin immunovärjäyksellä ja virtaussytometria makrofageissa M1 ja M2 alatyyppi tai makrofageissa stimuloidaan medium (Cm) CRC: tä solulinjoista. Suhteellisen keskimääräisen flourescense intensiteetti (MFI) ± SD kolmesta tai useammasta itsenäisestä kokeesta on esitetty, jossa kukin näyte normalisoitiin suhteessa sen vastaavaan isotyyppikontrolli ja M-CSF-stimuloitujen kontrollinäyte asetetaan 1.

endosytoosin Kapasiteetti M1 /​​M2 Makrofagi populaatiot ja TAM

endosyyttisissä toiminta eri osa M1 ja M2 makrofageja sekä TAM, tutkittiin myös meidän

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä . Solut erotellaan eri makrofagien fenotyyppejä, ja seurattava niiden kyky endocytose leimattu fluoresoivasti dekstraani. M1 makrofagit osoitettiin olevan pienempi endosyyttisissä kyky verrattuna M2 makrofageihin, noin 20% M1 verrattuna 50-100% M2 makrofagien, jossa IL10 stimuloitiin M2 makrofagit näyttää korkeimman endosyyttistä kyky (kuvio 4). Tutkiakseen, kuinka kasvain erittyy tekijät vaikuttavat makrofagi endosytoosin vertasimme että M1, M2 ja TAM (kuva 4). Tämä analyysi osoitti, että endosytoosin FITC-dekstraanin of TAMeja enemmän muistutti M2 makrofagit.

Endocytosis mukaan M1 ja M2 makrofagien tai makrofageja stimuloidaan medium (Cm) alkaen RKO, SW480 tai Caco2 CRC solulinjojen arvioitiin mittaamalla FITC-dekstraanin virtaussytometrialla. Kuvassa näkyy prosenttia suhteessa endosytoosin (keskiarvo ± SD) kanssa endosytoosin IL10 kannustanut M2 makrofageja asetetaan 100%. Tilastollisesti merkittäviä eroja on merkitty * (p 0,05) tai ** (p 0,01). Kaikki muut erot testattiin mutta löytyi ei-merkitsevä (ei esitetty kuvassa).

makrofaagianalyysi Plasticity

Makrofageilla tiedetään olevan muovikennosta hyväksyen eri muotoisia riippuen tekijöistä ympäristö, jossa ne esiintyvät. Kun analysoidaan plastisuus meidän

in vitro

soluviljelmässä, M1 ja M2 makrofagit todellakin todettu olevan erittäin muovia luonteeltaan, koska eriytetty M1 makrofagit voitaisiin ajaa kohti M2 fenotyyppiä, ja päinvastoin, kuten arvioitu morfologiset tutkimuksen ja ekspressio M1- ja M2-tyypillinen makrofagin markkereita (kuvio 5). Morfologia M1 makrofagien jotka saivat M2 ärsykkeet osoitettiin siirtyä entistä pitkänomainen M2 ulkonäkö (kuvio 5A), vaikka ei täysin. Toisaalta M2 makrofageja näytti nopeammin hyväksyä kierros morfologiaa M1 makrofagien, kun siihen kohdistuu vastakkaisen ärsykkeisiin (kuvio 5A). Kun analysoidaan ilmaus M1 ja M2 markkereita, että tapahtuu siirtymistä fenotyypit näkyi myös, koska M1 tyypillinen markkereita havaittiin olevan alas-säädellä M2-ärsykkeiden ja päinvastoin (kuvio 5B). On ehdotettu kirjallisuudessa että TAM ovat vinossa kasvain erittyy tekijät kohti M2 fenotyyppiä [10] – [12]. Tämä ei selvästi heijastunut

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä, koska selvä M2 väestö ei yleensä aiheuttama erittyvä tekijöistä CRC soluista. Koska muovi käyttäytymisen näyttämät makrofagien väestön pyrimme tutkimaan jos eriytetty M1 makrofagit voivat vaikuttaa kasvain erittyy tekijät. Kuitenkin elatusaine CRC soluista ei kyennyt vinossa jo eriytetty M1 makrofagit kohti M2 fenotyyppiä. Sen sijaan, elatusaine CRC-solujen lisääntynyt ilmentyminen M1 markkerin CD86, ja vähentää että M2 markkerin CD163, ja siten näyttivät vahvistaa M1 fenotyypin (kuvio 5C). IL4 tai IL10 stimuloidaan M2 makrofagit eivät vaikuttaneet eritetyt tekijät CRC-soluja (tietoja ei esitetty). Tämä viittaa siihen, että kasvaimen eritetyt tekijät eivät yksinään pysty siirtämään vahvistetun M1 makrofagi fenotyyppiä kohti M2 fenotyyppi CRC.

morfologia ja ilmentyminen solunulkoisen markkereita arvioitiin makrofageissa erillisiä M1 tai M2 alatyyppejä ennen ja jälkeen stimulaatio kohti vastakkaista fenotyyppiä tai stimulaation ehdollistuneesta media (Cm) alkaen RKO, SW480 tai Caco2 CRC solulinjoista. (A) Morfologiset arviointi makrofagien fenotyyppejä. (B) ilmentäminen solunulkoisen merkkiaineita makrofagi väestön arvioimana immunovärjäyksellä ja virtaussytometria. (C) eriyttäminen M1 makrofagien stimulaatio medium (Cm) CRC: tä solulinjoista. Suhteellisen keskimääräisen flourescense intensiteetti (MFI) ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty, jossa kukin näyte normalisoitiin suhteessa sen vastaavaan isotyyppikontrolli ja M1 tai M2 (IL10) stimuloivat makrofagi näyte asetetaan 100%. Merkitykselliset tilastollisesti merkitseviä eroja on merkitty * (p 0,05), ei-merkitsevä

p

arvot ilmaistaan ​​ns

sytokiiniekspressiota M1 ja M2 makrofagien ja TAM populaatiot

on ilmeistä, että yksinkertaistettu erillistä määritelmää M1 ja M2 makrofagit ei koske kaikkia makrofagien käytettäessä

in vivo

ympäristössä. Kuitenkin analysoida eroja, jotka johtuvat kasvaimen erittyy tekijät yksin, me taas hyödyntää meidän

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä tarkastella mahdollisia eroja ja samankaltaisuuksia sytokiinien ja kemokiinin ekspressiokuvioiden M1 ja M2 makrofagien tai TAM populaatiot. Tätä varten käytimme PCR-pohjainen sytokiini- ja kemo- geeniekspression array (tulokset esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa S1). Valitut kiinnostavat geenit on esitetty kuvassa 6. Kuten odotettua, M1 makrofageja havaittiin ilmentävän korkeampi proinflammatoristen sytokiinien, IL1, IL6, IL12, IL23 ja TNFa, jotka eivät ole ilmaisseet M2 makrofagit (kuvio 6A) . Immuunijärjestelmän sääntely sytokiinien IL10 ja TGF pääosin ilmaisseet M2 makrofagit, erityisesti IL10-johdettu M2-kaltainen immuuni-sääntelyyn makrofageissa (kuvio 6A). Kun tarkastellaan sytokiinien ja kemokiinin ilmentämiskuviota TAMeja oli selvää, että kukin CRC solulinja indusoi yksilöllisen ilmaisun kuvio. Kun verrataan geeniekspressioprofiili M1 ja M2 makrofageja, että eri TAM, TAM havaittiin ilmentävän korkeampi pro-inflammatoristen sytokiinien kuin M2 makrofageja, vaikka se useimmissa tapauksissa oli paljon alhaisempi kuin M1 makrofageissa. Yksi poikkeus oli TNFa, jonka havaittiin ilmaistaan ​​TAMeja samanlaisiin tasoihin M1 makrofageihin. Immuuni-sääntelyyn kemokiinien IL10 ja TGFβ2 ilmaistiin myös eri TAM, joissakin tapauksissa jopa suurempi määrin kuin M2 makrofagit. Olemme pyrkineet tutkimaan eroja kemotaktinen indusoiman M1 tai M2 makrofagien ja TAM ymmärtää, miten kasvain CRC vaikuttaa makrofagien indusoiman palkkaamalla immuunisolujen (kuvio 6B). Kun tarkastellaan tekijöitä, jotka ensisijaisesti rekrytoi lymfosyyttien Th1 tyypin (esim CXCL9 ja CXCL10), TAM stimuloida vakioitua elatusainetta RKO tai Caco2 solujen havaittiin ilmaista korkeampi kuin M2 makrofageja, mutta silti hyvin pieniä määriä verrattuna ilmaus näihin asioihin M1 makrofagit. Kemotaktinen tekijä neutrofiilien CXCL2 [19] erittyi TAMeja kannustanut vakioitua elatusainetta SW480 soluista. Tämä viittaa siihen, että vaikka vaikutukset olivat vaatimattomia, joitakin ominaisuuksia M1 makrofagien löytyy myös TAMeja. Kun tarkastellaan tekijöitä, jotka rekrytoida lymfosyyttien Treg ja Th2-tyypin (esim CCL17, CCL18, CCL22 ja CCL24), jotka on ilmaistu pääasiassa M2 väestöstä, näitä havaittiin ei voi ilmaista TAM, lukuun ottamatta CCL24 in TAMs kannustanut vakioitua elatusainetta SW480 soluista. Tämä viittaa siihen, että kaikki M2 ominaisuudet löytyvät TAMeja. Lopuksi, me katsoimme geenejä, jotka korkeammin ilmaistaan ​​TAMeja yleensä verrattuna että M1 tai M2 makrofageja. Monosyytti houkutella kemotaktinen tekijä CCL2 on havaittu olevan erittäin ilmentyy kaikissa TAM populaatioissa. Myös täydentää proteiini C5 havaittiin olevan erittäin ilmaistaan ​​TAMeja erityisesti. Yhdessä tämä viittaa siihen, että kasvain erittyvän tekijät indusoi TAM on ”sekoitettu” fenotyyppi, joitakin ominaisuuksia, jotka ovat TAM erityisiä ja joitakin piirteitä, jotka voivat olla samanlaisia ​​tai erilaisia, että M1 tai M2 makrofageissa.

Geenien ilmentyminen oli tutkittu M1 ja M2 makrofagien tai makrofageja stimuloidaan medium (Cm) alkaen RKO, SW480 tai Caco2 CRC solulinjoja käyttämällä sytokiini Kemokiini PCR Array. (A) Expression of pro-inflammatorisia ja anti-inflammatorisia sytokiineja. (B) ilmentäminen kemotaktisten tekijöiden. Näkyy on taittaa geenin ilmentymisen, jossa IL4 kannustanut M2 makrofageja asetettu 1.

Keskustelu

Aikaisemmassa tutkimuksessa, jossa analysoitiin M1 ja M2 makrofaagien jakelu potilaan kohortin CRC olemme havainneet, että lisääntynyt tunkeutumisen makrofageissa M1 fenotyypin voidaan korreloi parannetun selviytymisen CRC potilailla [18]. Kuitenkin soluttautuminen M1 makrofagien havaittiin myös liitettävä soluttautuminen M2 makrofageissa. Kasvainsolut tiedetään tuottavat tekijöitä, jotka vaikuttavat makrofagien fenotyyppi ja siten myös makrofagien vasteena kohti kasvain, ehdotti suosia kasvaimen invaasion ja metastaasin [12], [20]. Mahdollisia selityksiä myönteistä roolia makrofagien nähty ennusteen CRC, voisi olla joko että CRC jotenkin yllä jatkuvaa M1 makrofagin reaktio, eli tehottomammin vinossa makrofagin reaktio kohti M2 vasteen kuin muut syövät jossa tunkeutuminen makrofagien on huono prognostinen markkeri