Krooninen sairaus

tiivistelmä

APE1 /Ref-1 on pääasiallinen säätelijä soluvastetta oksidatiivisen stressin

kautta

DNA-korjauksen toiminta ja yhteistyö aktivoiva aktiivisuus NF-KB-transkriptiotekijän. APE1 on keskeinen kontrolloinnissa oksidatiivisen stressin-pohjainen tulehduksia mukauttamisella sytokiinien ilmentymisen ja sen yliekspressio vastaa alkaminen chemoresistance eri kasvaimissa mukaan lukien maksan syöpä. Tutkimme toiminnallista roolia APE1 yli-ilmentymisen aikana maksan soluvaurioita liittyvä rasvahapon kertymistä ja rooli redox toiminta APE1 tulehdusprosessissa. HepG2-solut transfektoitiin stabiilisti toiminnallisia ja ei-toiminnallisia APE1 koodaavat plasmidit ja suojaava vaikutus APE1 yli-ilmentymisen kohti genotoksisten yhdisteiden tai FA kertymistä, testattiin. JHH6-soluja stimuloitiin TNF-α: n läsnä tai poissa ollessa E3330, joka on APE1 redox estäjä. IL-8-promoottorin aktiivisuus arvioitiin lusiferaasireport- määrityksessä geeniekspressiota Real-Time PCR ja sytokiinien (IL-6, IL-8, IL-12) tasot mitattiin ELISA: lla. APE1 yli-ilmentyminen ei estänyt sytotoksisuuteen aiheuttama lipidien kertymistä. E3330 hoito esti funktionaalisen NF-KB: n

kautta

muuttaminen APE1 subsellulaariset kaupan ja vähentää IL-6 ja IL-8 ilmentyminen indusoi TNF-α ja FA kertyminen kautta tukkeutumisen redox-aktivaation NF-KB. APE1 yli-ilmentyminen havaittiin maksasyöpäsolut voi heijastaa sopeutumisen soluvaurioita ja se voi olla vastuussa edelleen solun resistentiksi kemoterapiaa ja puhkeamista tulehdusreaktiota. Tehokkuuden eston APE1 redox aktiivisuuden estää TNF-α ja FA indusoiman tulehduksellisen vasteen avaa uusia näköaloja tulehduksellisten-pohjainen maksasairauksia.

Citation: Cesaratto L, Codarin E, Vascotto C, Leonardi Kelley MR, Tiribelli C, et ai. (2013) Erityiset esto Redox aktiivisuus APE1 /Ref-1 E3330 Blocks TNF-Α aiheuttama aktivaatio Il-8 Tuotanto Maksasyöpä Cell Lines. PLoS ONE 8 (8): e70909. doi: 10,1371 /journal.pone.0070909

Editor: Gordon Langsley, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale – Institut Kochi, Ranska

vastaanotettu: 11 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 15 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Cesaratto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ilmoittavat, että tutkimus näihin tuloksiin johtanut on saanut rahoitusta Euroopan unionin seitsemännen puiteohjelman (FP7 /2007-2013) avustussopimuksen Health-F2-2009-241762, projektin FLIP ja avustuksia Associazione Italiana per la Ricerca sul cancro (AIRC) (IG10269) ja Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) (FIRB_RBRN07BMCT) GT. Taloudellinen tuki tälle työlle tarjosi National Institutes of Health NCICA121168, CA114571 ja Riley Lasten Säätiö MRK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja, lukuun ottamatta Dr. Mark R. Kelley, joka on korkein tieteellinen perustaja ja konsulttina APEX Therapeutics, yritys, joka on lisensoitu IP työstään. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Alkoholittomat rasvamaksatulehdus (NASH) määritellään erilliset maksan häiriöitä potilailla ilman historian alkoholin väärinkäyttö että histologisesti muistuttaa alkoholin aiheuttama maksavaurio ja sisältää soluvaurioita, tulehdus ja fibroosi [1] ja voi kehittyä kohti maksakirroosi, maksan vajaatoiminta ja HCC [2]. Mekanismit tämän etenemisen ja patogeneesin NASH tunnetaan edelleen huonosti, vaikka oksidatiivisen stressin, syntyy seurauksena mitokondrioiden vajaatoiminta, näyttää olevan suoraan kytketty puhkeamista tulehduksellinen piirien vastuussa etenemisen tämän patologian. Yksi tärkeimmistä proinflammatoristen sytokiinien, joka näyttää olevan osallisena moduloimiseksi tulehdusreaktio useita muotoja maksavaurion on interleukiini-8 (IL-8) [3], joka on CXC-kemokiini, joka rekrytoi ja aktivoi neutrofiilit, basofiilien ja T solut [4]. Sairastavat potilaat NASH on merkittävästi kohonnut seerumin IL-8 verrattuna terveillä henkilöillä, IL-8 voi olla keskeinen rooli patogeneesissä NASH [5]. Eri Maksan

in vitro

malleissa, lipidien kertyminen voi stimuloida IL-8 tuotantoa [6] aktivoimalla NF-KB: n [7]. Rotan maksassa, vapaiden rasvahappojen (FA) aktivoivat NF-KB-reitin ja lisätä kuvaamaan joitakin proinflammatoristen sytokiinien (TNF-α, IL-1β, IL-6) [8], [9].

Apurinic apyrimidinic endonukleaasi /redox efektori tekijä 1 (APE1 /Ref-1) on monitoiminen proteiini, joka toimii isäntä säätelijänä soluvastetta oksidatiivisen stressin olosuhteissa ja auttaa ylläpitämään genomin vakautta. APE1 on mukana sekä pohjan leikkaaminen korjaus (BER) väyliä DNA vaurioita, joka toimii suurten apurinic /apyrimidinic (AP) endonukleaasi ja transkription geenin ilmentymisen säätelyyn redox koaktivaattoria eri transkriptiotekijöiden, kuten NF KB: n ja muiden [10], [11]. Mahalaukun epiteelisolujen APE1 on johtavassa asemassa säätelyssä puhkeamista oksidatiivisen stressin-pohjainen tulehduksellisten prosessien moduloimiseksi NF-KB: n välittämää IL-8-geenin ilmentymisen [12]. APE1 ilme on myös säädelty aikana maksan lipidien kerääntymistä NASH potilailla [13], vaikka se ei vielä tiedetä, onko tämä säätelyä on kausaalinen rooli alkamisen NASH tai liittyy suojaustarkoitusta rasva kertymistä solumyrkkyvaikutuksessa.

APE1 on yliaktiivista maksasyöpien [14], mutta toiminnallista roolia tämän yli-ilmentymisen kasvaimen synnyssä ja etenemisessä ei ole vielä selvä. APE1 redox toiminto kohdistuu kautta uutta redox-pohjainen mekanismi mukana kolme kysteiinitähdettä (eli C65, C93 ja C99) [15]. Viimeaikaiset

in vitro

tutkimukset osoittivat, että APE1 se käyttää erilaisia ​​unfolded konformaatioita riippuen redoksitilassa sen Cys-tähteitä [15]. (E) -3- [2- (5,6-dimetoksi-3-metyyli-1,4-benzoquinonyl]) – 2-nonyyli propeenihappo (E3330) on raportoitu suoraan sitoa APE1 proteiinin ja estää sen redox aktiivisuutta häiritsemättä sen endonukleaasiaktiivisuus, lisäämällä disulfidisidosten muodostamiseen liittyy redox-aktiivisen Cys65, muuttamalla laskostumisen APE1 proteiinia ja vähentämällä proteiinin redoksiaktiivinen väestöstä [16], mikä vaikuttavia APE1 subsellulaarisista ihmiskauppaa [17]. E3330 omistaa kliininen terapeuttista potentiaalia erityisenä estäjänä APE1 redox toiminto [18]. Tämän tärkeys toiminto on korostettu tulokset osoittavat, että NF-KB-välitteisen geeniekspression säätelee APE1 redox aktiivisuutta, ilman vaikutuksia IκBα hajoamiseen [19]. E3330 havaittiin myös estää selektiivisesti kasvua /kulkeutuminen ihmisen haimasyövän soluja [20], mikä viittaa siihen, että APE1 redox toiminto voisi olla hyvä ehdokas tuumorin eteneminen ja metastaasit. E3330 tukahdutetaan tulehdusreaktion aktivoida makrofageja [21], mikä viittaa mahdolliseen käyttöön E3330 vähentää tulehduksia maksan sairauksien, kuten ne, jotka liittyvät sen NASH.

Tässä tutkimuksessa käytimme

in vitro

malleja rasvaa ylikuormitusta saatu altistamalla maksan solujen seokseen, pitkäketjuisten FA (palmitiini- (C16:0) ja öljyhappoa (C18:1) happoja, jotka ovat runsain FA maksan triglyseridien [22], [23 ]. Lisäksi tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia toiminnallista roolia APE1 yli-ilmentymisen aikana maksan soluvaurioita, jotka liittyvät lipidien kertymistä ja rooli redox toiminta APE1 tulehdusprosessissa laukaisi TNF-α ja FA kertymistä. Tuloksemme osoittavat että APE1 yliekspressio ei suojaa FA aiheuttamaa solujen vaurioita ja että APE1 ja NF-KB on keskeinen rooli TNF-α aiheuttama transkription aktivoitumisen IL-8-geenin ilmentymistä maksan syöpäsolun linjat. esto APE1 redox aktiivisuuden redox estäjä E3330 on tehokas estämään sekä TNF-α tai lipidien kertymistä indusoitiin aktivointi IL-8 ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla tukos redox-välitteinen NF-KB: n.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

tässä tutkimuksessa käytimme Huh-7 (eriytetty maksasolujen johdettu solu masolulinjassa) [24], HepG2 (eriytetty maksasyövän) [25] ja JHH6 ( erilaistumaton maksasyövän) [26] malleina maksan tuumorigeenisen prosessi. Huh-7 ja JHH6 ostettiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani) ja HepG2 ATCC. Huh-7 ja HepG2-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (EuroClone, Pero, IT), JHH6 soluja viljeltiin William keskipitkän E (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), sekä jota on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Euroclone, Milano, IT).

HepG2 solujen klooneja viljeltiin tiheydellä 70000 solua /cm

2 ja käsiteltiin eri annoksilla metyylimetaanisulfonaatin (MMS) tai 2,5 mM H

2O

2 (molemmat reagenssit jaetaan Sigma-Aldrich) 2 tunnin tai 1 h vastaavasti.

etoposidi hoitoon, HepG2 solukloonit trypsinoitiin ja 400000 solut ympättiin lasipeitinlevyille 6-kuoppaisilla viljelylevyillä. 24 tunnin kuluttua elatusaine korvattiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), kanssa tai ilman etoposidi (Sigma, St Louis, MO), 50 uM 1 tunti. (2E) -3- [5- (2,3-dimetoksi-6-metyyli-1,4-benzoquinoyl)] -2-nonyyli-2-propeenihappoa (E3330, syntetisoi) [16], liuotettiin DMSO: hon. Hoito E3330 suoritettiin seerumittomassa William keskipitkän E estämiseksi seerumin albumiinin tasoilla vaikuttaa E3330 lopulliseen konsentraatioon.

hoidon rekombinantti ihmisen TNF-α (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ) oli suoritetaan 2000 U /ml seerumittomassa William keskipitkän E minimoimiseksi seerumin indusoiman IL-8 vapautumisen.

indusoimiseksi rasva-ylikuormitusta solujen, JHH6 tai HepG2 solujen klooneja siirrostettiin tiheydellä 14000 ja 57000 solua /cm

2 vastaavasti ja 24 tunnin kuluttua solut altistettiin seoksen pitkäketjuisten FA (oleaatti ja palmitaatti) on 02:01 suhteessa. Kantaliuoksia 100 mM öljyhappoa (Sigma-Aldrich) ja 100 mM palmitiinihappoa (Sigma-Aldrich), valmistetaan DMSO, oli sopivasti laimennettuna William keskipitkän E tai DMEM korkea glukoosi, joka sisältää 60 uM albumiinin seerumia (Sigma-Aldrich) halutun lopulliset pitoisuudet. Seoksilla FA ja albumiinin, otto on funktio vapaan rasvahapon (FA), joka on monomeerinen muoto tasapainossa albumiiniin sidottu FA [27].

Generation of APE1 yli-ilmentävät maksan solulinjoja

sukupolven APE1 yli-ilmentävät solulinjat, joka on APE1 ekspressiovektori muodostettiin kloonaamalla EcoRI-BamHI-fragmentti pFLAG-CMV-5.1 /APE1 (Sigma, Milano, IT) osaksi p3XFLAG-CMV-14 vektorin (Sigma ). APE1

NΔ33 deleetiomutantti on tuotettu PCR: llä ja alakloonaamalla päässä täyspitkän cDNA-sekvenssin. Oikeellisuuden kloonausmenettelyssä varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Sitten HepG2-soluja transfektoitiin p3XFLAG-CMV /APE1, villityypin APE1 (APE1

WT) ja deleetiomutantin (APE1

NΔ33), joka oli aiemmin digestoitu Scal: llä (Fermentas, St. Leon Rot, UK ); 48 h transfektion jälkeen solut altistettiin valinta G418: aa (Invitrogen, Milano, Italia) 14 päivää, ja valittu hankittu resistenssi. Yksittäisiä klooneja eristettiin käyttämällä solujen kloonaus sylinterit (Sigma), siirretään ja kasvatettiin vaiheittain 24-ja 12-kuoppaisille, ja 6-kuoppaisille levyille laajennus 10

7-soluja, kun läsnä on selektiivinen antibiootti. Kontrollina käytimme solukloonien transfektoitu p3XFLAG-CMV-14 tyhjän vektorin. Genetisiiniä (G418) (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta) lisättiin solujen elatusaineeseen lopullisessa konsentraatiossa 300 ug /ml solujen kasvun aikana. Yhteensä solu-uutteet analysoitiin APE1 ilmentymisen immunoblottauksella, mikä ilmentää ilmentymisen ektooppinen merkitty WT ja mutantti-proteiinin muodon.

MTT ja solujen kasvua määritykset

määrittämiseksi elinkelpoisuuden HepG2-solut yli-ilmentävät APE1 proteiinia, 3 (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5 difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) suoritettiin [28]. HepG2-ohjaus ja yli-ilmentävät APE1 kloonia ympättiin 96 multi-kuoppaisille levyille tiheydellä 70000 solua /cm

2 kuhunkin kuoppaan. Seuraavana päivänä, soluja inkuboitiin MMS tai H

2O

2 esitetyllä. Käsittelyjen jälkeen, kussakin kuopassa 1/10 tilavuus MTT-liuosta (4 mg /ml PBS: ssä) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Sitten supernatantti poistettiin, ja yhtä suuri määrä DMSO: ta lisättiin soluihin ja MTT-formatsaanin liuotettiin pipetoimalla. Absorbanssi mitattiin ELISA-levylle lukijaa (EL808 Ultra mikrolevylukijaa Bio-tek Instruments, Winooski, VT), jossa on testi ja viite aallonpituudella 570 ja 630 nm, vastaavasti.

trypaanisinieksluusiolla kokeissa solujen trypsinoitiin, suspendoitiin uudelleen 0,08% w /v trypaanisinisen (Sigma) täydellisessä väliaineessa, ja laskettiin sen jälkeen 3-5 min inkubaation jälkeen.

Data ilmaistiin prosentteina eloonjääneiden solujen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

MTS-määritys

päivä ennen käsittelyä, JHH6 soluja siirrostettiin tiheydellä 26000 solua /cm

2. Arvioida vaikutuksia hoidon kannalta solujen elinkelpoisuuden, CellTiter 96

® AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, Madison, WI) käytettiin mukaan valmistajan ohjeiden. Tämä määritys sisältää uuden tetratsoliumyhdisteen, [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium, sisäinen suola; MTS], että biopelkistävät solut värilliseksi formatsaaniksi tuote, joka on liukoinen solun elatusalustaan ​​ja se voidaan mitata lukemalla absorbanssi 490 nm: ssä.

niilinpunavärjäys

rasvapitoisuutta viljeltyjen solujen määritettiin fluorometrisesti käyttäen niilinpunavärjäys (Sigma-Aldrich, Milano, IT), elintärkeä lipofiilinen ja selektiivinen fluoresoiva tahra solunsisäiseen lipidipisaroita kertymiseen [29].

kantaliuokset Nile Red (100 tai 1000 ug /ml) asetonissa valmistettiin ja säilytettiin valolta suojattuna. Värjäys on tehty kiinteän soluja (1,5% glutaraldehydi, 5 min). Yksisolukerrokset pestiin kahdesti PBS: llä, käsiteltiin 5 minuutin ajan 0,1% Triton X-100 PBS: ssä ja inkuboitiin 1 tunnin ajan Nile Red ratkaisu aikaansaamaan 1:100 laimennos PBS: ssä. Jälkeen Nile Red hoidon, tumat värjättiin inkuboimalla 5 minuuttia 300 nM Liuosta, jossa oli 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) (Sigma) PBS: ssä. Yksittäiskerroksia pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä ja käytettiin fluoresenssimikroskopiaa. Immuunifluoresenssivasta kuvat kerättiin konfokaalisella mikroskoopilla (Leica DM IRB /E, Wetzlar, Saksa) viritysaallonpituudella, 450-500 nm ja emissio aallonpituudella 528 nm.

valmistaminen yhteensä solu-uutteiden

valmistamiseksi kokosoluliuotteissa solut kerättiin trypsinisaatiolla ja sentrifugoitiin 250 x

g

5 min 4 ° C: ssa. Supernatantti poistettiin ja pelletti pestiin kerran jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja sitten sentrifugoitiin uudelleen kuten edellä on kuvattu. Solupelletti suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, ja 1% (paino /tilavuus) Triton X-100, jota oli täydennetty 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Sigma), 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 1 mM NaF ja 1 mM Na-

3Vo

4, solutiheydessä 10

7 solua /ml 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kun oli sentrifugoitu 12000 x

g

30 min 4 ° C: ssa, supernatantti kerättiin kokosolulysaattia. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA).

Western blot-analyysi

osoitettujen määrien solu-uutteet elektroforeesi 12% SDS -SIVU. Sitten proteiinit siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Schleicher Molecular Probes, Monza, IT). Valmisteet pestiin sitten PBS: llä kolme kertaa 5 min kukin pimeässä. Tumat vastavärjättiin 5 min inkuboinnin 300 nM Liuosta, jossa oli 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) (Sigma) PBS: ssä. Valmisteet pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä 5 min. Objektilasit sitten asennettu liukuu anti-fade-reagenssia. Peitinlasit visualisoidaan Leica TCS SP laser-skannaus konfokaalimikroskoopilla (Leica, Wetzlar, Saksa), joka oli varustettu 488 nm: n argonlaserilla, joka on 543 nm HeNe laser, ja 63x öljyä fluoresenssin tavoite.

for γ-H2A.X immunofluoresenssilla kokeissa, ohjaus ja etoposidi-käsitellyt solut pestiin PBS: llä, kiinteä 20 min 4% (paino /tilavuus) paraformaldehydillä PBS: ssä, ja läpäiseviksi 5 minuutin ajan 0,25% (paino /tilavuus) Triton X-100 PBS: ssä. Objektilasit blokattiin 10% (v /v) FBS: ää PBS: ssä, 4 ° C: ssa, yön yli, inkuboitiin 2 h huoneen lämpötilassa anti-γ-H2A.X-vasta-ainetta (Stressgen, Ann Harbor, MI) ja pestiin 0,1 % (paino /tilavuus) Triton X-100 PBS: ssä. Anti-γ-H2A.X-vasta-ainetta käytettiin 1:500 laimennus. Havaitsemista varten, soluja inkuboitiin Alexa Fluor-488-leimattua anti-hiiri-vasta-ainetta (Invitrogen, Monza, IT). Tumat vastavärjättiin inkuboimalla soluja 0,3 ug /ml propidiumjodidia (PI) 5 min, 37 ° C: ssa. Solut pestiin ja asentaa Mowiol

® 4-88 (Sigma) täydennetty 01:05 DABCO (Sigma) anti-fade reagenssi. Kuvat kerättiin käyttämällä -konfokaalimikroskoopilla.

kvantifiointi γ-H2A.X pesäkkeitä toteutettiin BD Pathway 855 käyttäen 20X tavoite. Automatisoitu kuva-analyysi suoritettiin muokattavissa ja erittäin joustava ohjelmistotyökaluja. Nuclear rajoja luotiin käyttäen Hoechst kuvia. Γ-H2A.X kuvat hankittiin ja tiedot intensiteetti analysoitiin BD Pathway ™ -järjestelmän sisällä ydinvoiman rajojen.

Transient transfektiokokeis-

Rakenteet ihmisen IL-8-promoottori, – 1498 /+ 44 hIL-8 /Luc ja -162 /+ 44 hIL-8 ΔNF-KB /Luc, ystävällisesti toimittanut Dr. SE Crowe [30].

Yksi päivä ennen transfektiota, JHH6 soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä tiheydellä 31000 solua /cm

2. Sitten solut transfektoitiin väliaikaisesti 200 ng kokonais-DNA: ta (hIL-8 /Luc-promoottorin ja PRL-CMV Renilla lusiferaasin konstruktien suhde 49:1) kuoppaa kohti, käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti valmistajan ohjeita. Transfektioreagenssi poistettiin 4 h transfektion jälkeen, ja soluja inkuboitiin täydellisessä elatusaineessa 16 h. Seuraavana päivänä solut pestiin kahdesti PBS: llä, esikäsitelty E3330 seerumittomassa William keskipitkän E ja sitten käsiteltiin TNF-α raportoitu tekstissä. Lopuksi solut hajotettiin Dual-Glo

®Luciferase Assay System (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden. Luminesenssi signaalit kvantitoitiin käyttäen moduuli

TM II Microplate Multimode Reader (Turner Biosystems Inc., Sunnyvale, CA). Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Reaaliaikainen PCR

Yhteensä solujen RNA uutettiin käyttämällä SV Kokonais-RNA Isolation System (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksijuosteinen cDNA saatiin käyttämällä iScript

TM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Real Time kvantitatiivinen PCR suoritettiin kanssa CFX96

TM Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad Laboratories); Käytetyt alukkeet olivat: IL-8 5′-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3 ’, IL-8 Rev 5′-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3′; 18S varten 5’-CTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAG-3 ’, 18S Rev 5′-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTC-3′; GAPDH varten 5’-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3 ’, GAPDH Rev 5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3′; HPRT varten 5’-AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG-3 ’, HPRT Rev 5′-GTCTGGCTTATATCCAACACTTCG-3’.

cDNA monistettiin 96-kuoppaisilla levyillä käyttäen alukkeita IL-8, 18S, GAPDH ja HPRT erillisissä kuopissa käyttäen 2X iQ

TM SYBR

® Green Supermixiä (Bio-Rad Laboratories) [100 mM KCI; 40 mM Tris-HCl, pH 8,4; 0,4 mM kutakin dNTP: tä; 50 U /ml iTaq DNA-polymeraasi; 6 mM MgCl

2, SYBR Green I, 20 nM fluoreseiini, ja stabilointiaineita] ja 300 nM erityinen merkityksensä ja anti-sense-alukkeita: n lopullisessa tilavuudessa 15 ui kuhunkin kuoppaan. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Näyte ilman malli, negatiivisena kontrollina, ja näyte, jossa ei ole retro-transkriptoituun mRNA: han sen sijaan, että templaatti-cDNA, kontrollina genomisen DNA-kontaminaation, otettiin mukaan. Pyöräily parametrit olivat: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 s ja pariutumis /pidennys 60 ° C: ssa 30 s (toistetaan 40 kertaa). Sen tarkistamiseksi spesifisyyden vahvistus, sula-käyrä analyysi suoritettiin heti vahvistusta protokollaa.

Liukoinen sytokiinien määrittämiseen

IL-8 ja IL-12-proteiinin tasot TNF -α-käsitellyn soluviljelmäsupernatantin kvantifioitiin käyttäen FlowCytomix iinianalyysikitissä (Bender MedSystems, Atlanta, GA), mukaan valmistajan protokollaa.

tilastollinen

tilastollinen analyysi biologiset tiedot oli suoritettiin käyttäen Microsoft Excel tietojen analysointi ohjelma Opiskelijan

t

-testi analyysi. P 0,05 tai P 0,01 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression kohdunulkoisen APE1

WT proteiinia antaa maksan solujen suoja kohti genotoksinen vaurioita

Ensimmäinen tutkittiin biologisia vaikutuksia APE1 yli-ilmentyminen on maksan soluihin käyttämällä HepG2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät ektooppinen muodossa villityypin proteiinin (APE1

WT) tai sen deleetiomutantti (APE1

NΔ33), jolta puuttuu ensimmäiset 33 jäämät [31]. Solun klooneja, joissa endogeeninen APE1 proteiini on koekspressoitiin kohdun Flag-merkityn rekombinantti APE1 proteiinia, ovat yli-malli testata rooli toiminnallisia ja ei-toiminnallisia APE1 proteiinien lipidien aiheuttamaa sytotoksisen vaikutuksen ja jäljittelee kunnossa löydetty edennyt pitkälle maksasyövän etenemisen (Fig. 1A) [14]. Me tyypillistä solun malleja APE1 lokalisointia immunofluoresenssianalyysin avulla, joka osoittaa, että samalla tavalla kuin endogeeninen proteiini, kohdunulkoinen APE1

WT lokalisoitu pääosin ydin- osastoon HepG2 solukloonien, kun taas APE1

NΔ33 mutantti osoitti yleiseurooppalainen -cellular jakelu sekä sytoplasman ja ydinvoiman osastoja, seurauksena ei ole, että bi-partite NLS-sekvenssi [32], ja kuten on jo havaittu muissa solujärjestelmissä (Fig. 1 B) [33].

Panel V:

Western Blot-analyysi koko solu-uutteita HepG2 vakaa solukloonien.

stabiilisti transfektoidut kloonit on saatu kuten on kuvattu osassa Materiaalit ja menetelmät. Kaksitoista mikrogrammaa proteiinia uutteet erotettiin 12% SDS-PAGE ja sen jälkeen siirrettiin NC kalvo. Kalvo immunoblotat- anti-APE1 vasta-aine. Ilmoitetut arvot yläpuolella viittaavat suhteet kaistaintensiteettejä välillä ektooppisesti-ilmaistaan ​​ja endogeenisen APE1 mitattuna densitometria. Ektooppinen Flag-leimatun rekombinanttiproteiinin sekä APE1

WT ja APE1

NΔ33 solukloonien on ilmaistu samassa määrin eri päivinä soluviljelmässä. a: kloonit jälkeen kuudennen

in vitro

passage; b: kloonit jälkeen kymmenentenä

in vitro

passage. Paneeli B:

APE1 paikannuksen HepG2 solukloonien.

HepG2 solun klooneja kiinteät ja immunovärjättiin histoni H3 (punainen) ja Flag-merkittyä APE1 jossa α-Flag-vasta-ainetta (vihreä). Sulautunut kuvia (keltainen) osoittaa lokalisoinnin APE1

WT solussa ytimiä ja rinnakkaispaikantumisen kanssa histoni H3. APE1

NΔ33 Deleetiomutantin colocalizes kanssa histoni H3 sisällä soluytimet mutta osoittavat myös sytoplasmisen positiivisuuden. Paneeli C:

kasvukäyrä HepG2-solujen klooneja.

HepG2 tyhjä klooni, APE1

WT-klooni ja APE1

NΔ33 kloonin solut siirrostettiin kuhunkin kuoppaan 24-kuoppalevylle, ja solujen kasvua tarkkailtiin joka toinen tai kolmas päivä kuten, trypaanisinieksluusiolla. APE1

NΔ33 soluja (kolmio) kasvoivat hitaammin kuin APE1

WT (neliö) ja tyhjä klooneista (piste). Paneeli D:

Cell kasvua MTT kolorimetrisellä määrityksellä.

Kolmekymmentä tuhatta solua ohjaus (tyhjä klooni), APE1

WT ja APE1

NΔ33 klooneja siirrostettiin neljänä kuoppiin 96-mikroviljelylevyillä levy. Solujen elinkelpoisuus mitattiin 72 tunnin jälkeen viljelyn. MTT-analyysi osoitti myös, että APE1

NΔ33 solun klooni on alhaisempi leviämisen kuin tyhjä ja APE1

WT klooneja. Data, joka ilmaistaan ​​prosentteina solujen elinkelpoisuuden suhteen ohjaus- tyhjä klooni, ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Paneeli E

: vaikutus MMS elinkelpoisuudesta HepG2 solukloonien.

HepG2 solun klooneja käsiteltiin 2 h 1,6 tai 2,0 mM MMS ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT kolorimetrisellä määrityksellä. Kun soluja käsiteltiin 2,0 mM MMS, solujen elinkelpoisuuden oli merkittävästi vähentynyt APE1

NΔ33 solun klooni, mutta ei APE1

WT klooni, mikä viittaa siihen, että kohdunulkoinen ilmaus APE1

WT suojaa soluja vastaan ​​multimediaviestin aiheuttama citotoxicity. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Paneeli F:

vaikutus H

2O

2 elinkelpoisuudesta HepG2 solukloonien

. HepG2 solujen kloonit käsiteltiin 2,5 mM vetyperoksidia 1 h, sitten solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määritystä. Altistumisen jälkeen 2,5 mM H

2O

2 mitään merkittävää laskua solujen elinkykyisyys havaittu APE1

WT klooni verrattuna tyhjä ja APE1

NΔ33 solukloonien. Histogrammit esittävät keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Paneeli G:

kvantifiointi γH2A.X pesäkkeitä vastauksena etoposidia hoitoon.

ΓH2A.X pesäkkeet todettiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä ja kvantifioidaan kuva-analyysi. Soluja käsiteltiin etoposidia (50 uM) 1 h ja määrä kaksijuosteisen DNA katkoksia (DSB: t) määritettiin eri aikoina vapautumisen (0 h, 15 h ja 24 h). γH2A.X pesäkkeitä tasot ovat edelleen huomattavasti korkeampi kuin tarkastuksia 15 h ja 24 h etoposidi käsitelty APE1

NΔ33 solun klooni (kolmio). DNA-vaurioita oli heikompaa APE1

WT klooni (neliö) kuin tyhjä (piste) ja APE1

NΔ33 solun klooneja, mikä viittaa siihen, suojaava rooli APE1 yli-ilmentymisen DNA korjaukseen.

Sitten arvioimme vaikutus yli-ilmentyminen APE1

WT ja APE1

NΔ33 toiminnallinen mutantti solujen elinkelpoisuuden. Yli-ilmentyminen APE1

WT aiheutti kasvanutta solujen määrä, kun taas ekspressio APE1

NΔ33 proteiinin muodossa osoitti ilmeistä vajaatoiminta solujen kasvun kontrolliin verrattuna solu- klooni (Fig. 1 C). Ohjaus solut osoittivat väli- fenotyyppi ilmentymisen vuoksi vain endogeenisen APE1 proteiinia. Solujen elinkelpoisuuden määritykset, arvioitiin MTT-analyysi osoitti, että alentunut leviämisen havaittu APE1

NΔ33 mutantti liittyy alennettu solujen elinkelpoisuuden suhteen APE1

WT ilmentävän kloonin (Fig. 1 D). Nämä tulokset tukevat sitä päätelmää, että NΔ33 häviämämutantilla voi toimia hallitseva negatiivinen muoto APE1 suoraan vaikuttavien solujen elinkykyä, kuten myös nähty muissa syöpäsolujen mallit [17], [34].

sitten testataan kyky APE1 yliekspression suojaamaan soluja genotoksinen hoitoja, kuten on kuvattu muiden solumalleja [35], [36], [37] mutta ei koskaan maksasoluissa. Tätä varten APE1

WT ja APE1

NΔ33 solun klooneja käsiteltiin DNA alkylointiaineen metyylimetaanisulfonaatin (MMS) [38], jossa on vetyperoksidia (H

2O

2) tai etoposidia , joka indusoi kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) DNA. Solukloonit inkuboitiin kasvavia annoksia MMS 2 h, ja solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Käsittelyllä 2,0 mM MMS, solujen elinkelpoisuus oli merkittävästi pienentynyt APE1

NΔ33 ilmentävän kloonin verrattuna APE1

WT ja ohjaus klooneja (Fig. 1 E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun kyseessä on H

2O

2, kuten genotoxicant (Fig. 1 F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että stabiilisti yli-ilmentynyt APE1

WT suojaa soluja vastaan ​​genotoksisuuden aiheuttama alkyloimalla hoitoon ja oksidatiivisen stressin, kuten jo havaittu muissa solulinjoissa [36].

DNA: n tapauksessa kaksoisjuosteiden break-analyysi, soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan 50 uM etoposidin, estäjä topoisomeraasi II: n, joka aiheuttaa sytotoksisen DSB muodostumisen [39]. Koska fosforylaation tapahtuvaan S139 on H2A.X, kutsutaan γH2A.X, on tärkeää aikana DNA double-strand korjaus ja pidetään markkerina DSB soluvaurioita [40], analysoitiin kinetiikka etoposidi-indusoidun DSB korjaamiseen eri solukloonit.