Krooninen sairaus

tiivistelmä

keuhkosyöpä kehitys liittyy kentän muutoksista, jotka voivat olla diagnostisia merkitystä. Olemme aiemmin osoittaneet, että on tärkeää kromosomi aneusomy keuhkosyövässä etenemiseen. Tässä testasimme genomista voittoja kuusi erityistä loci,

TP63

3q28,

EGFR

7p12,

MYC

8q24, 5p15.2, ja sentromeerista alueita kromosomeja 3 (

CEP3

) ja 6 (

CEP6

), voidaan antaa lisää arvoa ennusteen keuhkosyöpään. Keuhkoputken koepalanäytteistä saatiin LIFE bronkoskopia 70 koehenkilöä (27 kanssa vallalla keuhkosyövässä ja 43 yksilöille keuhkosyöpä). Kaksikymmentäkuusi koepalat kuulumaan kohtalainen dysplasia, 21 niin -kar- ja 23 karsinooma

in situ

(CIS). Neljän mikronin parafiinileikkeillä on jätetty 4-kohde FISH-määritys (LAVysion, Abbott Molecular) ja uudelleenseulottiin varten

TP63

ja CEP 3 sekvenssit. Spot lukemat saatiin 30-50 ytimiä kussakin yksilössä kutakin koetin. Lisääntynyt geenikopiomäärä 4 6 koettimien liittyi suurentunut on diagnosoitu keuhkosyöpä sekä mukauttamaton analyyseissä (riskisuhde = 11, p 0,05) ja oikaistu histologiaa grade (riskisuhde = 17, p 0,05) . Kaikkein informatiivinen 4 koettimet olivat

TP63

,

MYC

, CEP3 ja CEP6. Näiden 4 antureista tarjosi herkkyys 82% keuhkosyöpään ja spesifisyys 58%. Nämä tulokset osoittavat, että tietty sytogeneettisen muutokset läsnä preinvasive keuhkomuutoksia läheisesti liittyy diagnoosi keuhkosyövän ja voi siten olla merkitystä arvioitaessa keuhkosyövän riskiä.

Citation: Massion PP, Zou Y, Uner H, Kiatsimkul P, Wolf HJ, Baron AE, et al. (2009) Toistuva Perimän voittoja Preinvasive Vauriot biomarkkerina Risk varten keuhkosyöpään. PLoS ONE 4 (6): e5611. doi: 10,1371 /journal.pone.0005611

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 helmikuu 2009; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2009; Julkaistu: 09 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Massion et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI myöntää R01 CA102353, U01-CA85070, CA46934, Lung itiöt CA90949, CA55769, ja CA58187, sekä Landspitali-yliopistollisen sairaalan Science Fund Islannista. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

varhainen diagnoosi keuhkosyöpään uskotaan parantavan eloonjäämistä. Silti alle 25%: lla potilaista diagnosoidaan kliinisessä vaiheessa 1, jossa arvioidaan selviytyminen on noin 70% 5 vuotta. Tämä selviytyminen on selvästi korkeampi kuin eloonjäämiseen pitkälle sairaus, arviolta 15% 5 vuotta. Approaches to varhainen diagnosointi keuhkosyöpään edelleen suuren haasteen. Puhkeamista tauti prosessi on erittäin hidas (kuukausista vuosiin) eikä keinoja arvioida nopeudella taudin etenemistä prosessissa ovat käytettävissä.

Erilaisia ​​keuhkosyövän seulonta tekniikoita on tutkittu määrittää niiden hyödyllisyys varhaisessa vaiheessa tauti. Näitä ovat keuhkojen röntgenkuvauksessa, ysköksen sytologisesta ja molekyylitason biologisten merkkiaineiden eri biologisista näytteistä. Mikään näistä varhaisen havaitsemisen strategioita on todettu aiheuttavan vähenemistä syöpään liittyvän kuolleisuuden. Pieniannoksisen kierre tietokonetomografia (CT) voidaan antaa tarkka kuva anatominen laajuudesta varhaisen keuhkosyöpä [1]. Silti, vaikka houkutteleva varhaisena havaitsemisstrategiaa, [2], [3], [4], [5], [6], tulokset satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa ei tunneta. Lisäksi useimmat preinvasive vaurioista hengitysteiden keskiosaan jää huomaamatta rinnassa CT.

Molecular havaitseminen strategioita hengitysteiden yksilöt haastavat koska suhteellisen vaikea saada, vähäisyys kudosten ja puute molekyylitason muutoksia ennakoivaa syövän. Vaikka molekyylibiologian keuhkosyöpään on tutkittu laajalti, ei ole luotettavia diagnostisia molekyylipaino korreloi olemassa [7]. Keuhkosyöpä kehitys on tyypillistä peräkkäisten kertyminen epigenetic ja geneettisten poikkeavuuksien somaattisten solujen [8]. Näitä poikkeamia sisältävät yhden nukleotidin pistemutaatioita, muutokset kromosomissa kopiomäärä [9], [10], ja erityisiä genomista lisäyksiä tai deleetioita, jotka patogeneesiin keuhko kasvaimen kehittymistä ja etenemistä aktivoitumisen kautta onkogeenien ja inaktivaation tuumorisuppressorigeeneille [11], [12], [13], [14], [15], [16].

Koska kaikki preinvasive vauriot kehittyvät invasiivisia kasvaimia, on tärkeää tunnistaa molekyyli tekijöihin ajo kohteena on invasiivisia fenotyyppi [16]. Fluoresenssi in situ -hybridisaatio on nousemassa potentiaalisesti hyödyllinen kliininen väline arvioitaessa diagnoosi, ennuste, ja hoitovaste keuhkosyövässä [17], [18], [19], [20], [21], [22] . Kromosominen aneuploidia- on todettu tiiviisti diagnoosin keuhkosyöpään. Äskettäin testasimme voitto Kopiomääränä kaksi neljästä valittujen DNA-kohteisiin, pitää heijastaa genomin epästabiilisuuden ja markkeri keuhkosyövän riskiä kehittäminen [10], [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme arveltu, että valitun joukon sytogeneettisen muutoksia preinvasive Muutokset saattavat olla parempi ennustaja keuhkosyöpään. Niinpä määritettiin ovatko tulokset sytogeneenisuustutkimuksiin olivat yhteydessä taudin etenemistä valitut henkilöt. Valitsimme kuusi DNA-kohteiden yleisesti monistettiin keuhkosyövän [12], [14], [15], [24], [25] mukaan lukien kaksi sentromeerisen antureista (CEP3 ja CEP6) ja neljä antureista alueille usein genomivahvistuksen eli 3q28 (

TP63

) [11], [13], 5p15.2 (D523 ja D5S721 markkereita) [26], 8q24 (

MYC

) [27], ja 7p12 (

EGFR

) [28]. Näillä validoitu FISH antureista, teimme määrällinen arviointi ydin- edustus genomisen lokuksen kopioida numeron preinvasive vaurioita ja niiden yhdessä diagnoosi invasiivisia keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasjoukko ominaisuudet

Potilaspopulaatiosta 70 aiheita palvelukseen yliopistossa Colorado Cancer Center (UCCC), British Columbia Cancer Agency (BCCA) ja Islannin yliopiston Hospitals (UIH). Tämä populaatio edustaa potilaiden alaryhmässä aiemmin tutkittu [23] ja se sisältää kaikki aiheita, jotka tutkimuksesta diagnosoitu kohtalainen dysplasia (4 keuhkosyöpää, 22 valvonta), -kar- (6 keuhkosyöpää, 15 ohjaa) tai karsinooma

vuonna situ

(17 keuhkosyöpään, 6 kontrollit), joille keuhkoputken kohdat olivat saatavilla.

tutkituista olivat kaikki katsotaan olevan suuri riski keuhkosyöpään perustuu historiaan vähintään 30 pack -vuotias tupakoinnin ja spirometriaparametreille todisteita ilmavirtauksen ahtauma dokumentoi FEV1 /FVC-suhde on alle 75% ja FEV1 on alle 70% ennusti. Entiset tupakoitsijat määriteltiin sellaisina lopettaa vähintään vuotta ennen aika ilmoittautuminen. Pack-vuotta määriteltiin keskimäärin pakkausta savustettu päivässä kerrottuna määrä vuosia savustettu. Joustava kuituoptinen bronkoskopia suoritettiin sekä autofluorisaatiota ja valkoinen valo tarkastelu hengitysteiden käyttämällä joko Xillix LIFE II tai OncoLIFE järjestelmä on UCCC ja BCCA sivustoja; valkoinen valo tutkimus yksin suoritettiin klo UIH. BCCA tapauksia oli diagnosoitu ennakoiva tutkimus varhaisen keuhkosyövän käyttäen autofluorisaatiota ja valkoisen valon bronkoskopian tai henkilöä kirjattiin osana kaksi National Cancer Institute sponsoroi kemopreventiota tutkimuksissa. Näihin sisältyy 27 potilasta, joilla kliininen diagnoosi invasiivisen karsinooman (yleisempiä tapausta) ja 43 potilailla, jotka pysyivät ilmaiseksi invasiivisia kasvain vähintään yhden vuoden seuranta (valvonta). Yksityiskohtaisen kyselyn saatujen tietojen henkilökohtainen haastattelu oli käytettävissä kaikissa koehenkilöistä, mukaan lukien demografiset ominaisuudet ja tupakointi historiaa. Tutkimuksen hyväksyi paikallinen Institutional Review Laudat Vanderbilt University, University of Colorado Health Sciences Centerissä, BCCA- University of British Columbia Clinical Research Ethics Board, National bioetiikkaneuvoston Islannin ja Islannin Data Processing komissio.

Histologia ja valinta alueet kiinnostavat

Kaikki koepaloja saatu bronkoskopia pisteytettiin mukaan viimeisimmän WHO: n luokituksen [29]. Koepaloja diagnosoinnissa vaihtelevat kohtalainen dysplasia sinoomaan

in situ

valittiin FISH-analyysillä. Diagnostic alueilla yksittäisten koepalat tarkistetaan ja kuvattiin patologi (WAF), joka merkitsi kiinnostavia asioita erityisen tarkastelun FISH.

FISH varten CEP3, TP63 (3q28), D523, D5S721 (5p15. 2), CEP6, EGFR (7p12), ja MYC (8q24) B

neljä mikronin parafiinileikkeillä alun perin toimitettiin 4-kohde FISH-määritys (LAVysion, Abbott Molecular, Des Moines, IL), mukaan lukien sekvenssit kattaa DNA-markkereita D523 ja D5S721 at 5p15.2, sentromeerin 6,

EGFR

geenin 7p12 ja

MYC

geenin 8q24, kuvatun protokollan mukaisesti muualla [23]. Kaikki osiot analysoitiin FISH olivat peräkkäisiä vastaaviin H 0,01), se ei ollut

EGFR

ja 5p15.2 . Kun nämä suhteet analysoitiin mukaan solujen osuus, jotka sisälsivät enemmän kuin kaksi kappaletta jokaisen yksittäisen markkerin, havaitsimme yhdistysten rajoittuu näihin samaan 4 markkereita. Mielenkiintoista, monistaminen sekvenssien havaittiin yhteensä 8 yksilöitä, neljälle testatuista tavoitteista:

TP63

, 5p15.2,

EGFR

ja

MYC

. Monistus edustivat pk koko klustereita signaaleja (EGFR) tai yli 50% soluista kuljettavat yli 5 kappaletta signaalien (MYC, 5p15.2 ja TP63). Kuvat ovat esitetään kuvassa 1.

Interphase ytimet värjättiin sinisellä DAPI näytä lisääntynyt kopiomäärä

TP63

IVY (A). Segmentoitu kuvia 4-väri hybridisointimäärityksillä kanssa LAVysion koettimen -kar- vaurioita, jotka osoittavat korkea kopio numerot 5p15.2 genomin alueella (vihreitä pisteitä) (B);

EGFR

geenimonistuman (klusteroitu punaiset täplät) (C); ja suuria kopioiden lukumääriä on

MYC

(keltaisia ​​pisteitä) (D). Kaikki osiot analysoitiin FISH olivat peräkkäisiä H so suuret kuviot ovat laimentaa useita muunnelmia [10], [37], [38]. Genominen muutoksia hengitysteiden epiteelin esiintyä sekä stokastisesti ja myöhemmin klonaalisen tavalla. Klonaalisia (sama muutos 2 tai enemmän soluja) ja ei-klonaalisia muutoksiin liittyvät tupakoinnin historiaa osallistuvat kasvaimen aloittamista prosessi. Jotkut muutokset voi ilmoittaa riskin paremmin kuin toiset. Tähän mennessä suurin osa näistä muutoksista on pidetty seurauksia eikä syitä keuhkosyöpä kehitystä. Jotkut näistä matalan tason poikkeamia on kutsuttu kohina mutta saattaa heijastaa mitta todellisen epävakautta. Non-klonaalisia kromosomaalisia muutoksia (NCCAs) kuten vialliset mitoosi lukuja, kromosomi pirstoutumista, missegregation tai ei-toistuvat genomista muutoksiin osoittaa dynaaminen prosessi johtaa epävakauteen [39]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että tiheä ei-koodaavan sentromeerisen muutoksia (CEP3 ja CEP 6) oli itsenäisesti liittyy diagnoosi keuhkosyöpään (taulukko 2), ja näin ollen eivät liity erityisesti kasvaimien syntyyn, se on todennäköisesti osa genomisen epävakaus mukana tulevan sairaudesta.

Sen sijaan, erityisiä genomista lisäyksiä tai deleetioita [12], [15], [40] on patogeneesiin kasvaimen kehityksen osittain aktivoitumisen kautta onkogeenejä [41] ja inaktivoitumisen tuumorisuppressorigeeneille. Jotkut genomista allekirjoitukset näyttävät säilyvän jälkeen kasvainten kehittymiseen, koko eteneminen [42] ja niiden histologia erilaistumista. Preinvasive vauriot ovat osoittaneet kopioluvun muutoksia useiden kromosomaalisten alueiden kuten 3q28, 5p15 ja 8q24 [10], [13], [23], [43], [44] ja nämä muutokset löydettiin myös. Genominen epätasapaino on laajalti tutkittu invasiivisia NSCLCs käyttämällä CGH tai SNP array menetelmät ja lukuisia loci havaittiin yleisesti täydentää tai yliedustettuna jompikumpi tai molemmat okasolusyöpä ja adenokarsinooma keuhkojen [14], [15], [24], [25 ], [45], [46], [47], [48], [49]. Jos jotkut heistä osoitettu olevan aikaisin tapahtumia, tämä voi parantaa testin suoritustaso yhteydessä diagnoosi keuhkosyöpään.

Oletimme, että genomista muutokset

TP63

, 5p15.2,

EGFR

,

MYC

, CEP 6 ja CEP 3, voi tarjota mitta riskinarvioinnin. Lisääntynyt kopiomäärä (yliedustus tai vahvistus) on teknisesti luotettavampi löytämiseksi vähemmän vääriä positiivisia kuin genomista menetys, lähinnä silloin, kun käytetään kalojen määritystä leikatuille näytteille näytteille ydin- katkaisu, joten olemme keskittyneet loci jotka olivat mukana genomista vahvistuksen. Leikattu off ”normaaleihin” copy vahvistuksenkertojan asetettiin ≤2 kopiota ydin perustuu siihen, että normaali disomic soluissa on kaksi kopiota genomista kohde- ja nämä solut leikattiin 4 um, joka syntyy katkaistu ytimiä. Vaikka tämä arvo ei saa optimaalista katkaista käyttää, se on konservatiivinen ja vakuuttaa, että näytteet luokitellaan näytteille genomista voitto ovat todella epätavallista.

TP63

on houkutteleva kohde sijaitsee kärjessä yksi yleisimpiä alueen monistamisen keuhkosyöpään.

TP63

on homologi p53, joka on tärkeä rooli kehityksen ja oncogenesis säätelemällä lisääntymistä ja erilaistumista. Kiinnostus

TP63

johtuu tästä ”kaksi geenit yhdessä” konseptin ja -antagonisteja ominaisuuksia, jotka voivat olla mukana kasvainten kehittymiseen [50].

TP63

on monimutkainen geeni, joka on useita transkription isoformeja, joista jotkut ovat tuumorisuppressoreilla (

TP63

isoformit), kun taas toiset ovat onkogeenien (Δ

TP63

; dN

TP63

) [11] kantavassa TA

TP63

isomuodot voi sitoutua DNA: ta p53: een reagoiva elementit ja siksi ”p53-like”. Dn

TP63

kykenee hallitseva kielteisiä vaikutuksia yli p53 ja ehdotetaan onkogeenisia. Olemme havainneet, että on olemassa varhainen ja usein genomivahvistuksen on

TP63

kehittämisessä squamous keuhkon ja että potilaat, joilla NSCLC osoittaa vahvistusta ja yli-ilmentyminen

TP63

ovat pidensi elinaikaa [13 ]. ΔΝ

TP63

α silmukointivariantti on yleisimmin ilmaistuna isoformi levyepiteeleissä [11], [13]. Kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden

TP63

isoformit saattavat selittää, miksi näemme vahvistusta ja yli-ilmentyminen tämän proteiinin.

MYC

on myös tärkeä onkogeenin keuhkosyöpä. Se ilmaistaan ​​useita NSCLCs [51]. Geenin monistuminen klo 8q24 ja tuloksena lisääntyneen ilmentymisen

MYC

on yleinen esiintyminen karsinoomia [48], [52], [53]. Se johtaa lisääntyneeseen muodostumiseen

MYC

: Max heterodimeerin transkriptiotekijöitä, jotka muuttavat geenien ilmentymistä suurelta osin rekrytoimalla histoni-modifioivia entsyymejä [47].

tiedot viittaavat siihen, että havaitut muutokset varten 5p15 ja

EGF R

olivat vähemmän ennakoivaa syövän, mutta nämä muutokset näyttänyt tapahtuvan aikaisemmin dysplastic prosessi, ainakin tupakoitsijoilla. Niistä 20 keuhkoputken yksilöitä, joilla on normaali histologia alkaen tupakoimattomia, yksikään ei ole koholla

EGFR

tai 5p15 kopioluku. Keskimääräinen kopioluku näissä 20 näytteet olivat 1,77 (STD 0,53) ja

EGFR

ja 1,73 varten 5p15 [10]. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa myös havainto usein

EGFR

mutaatioita (24-43%) löytyy hengitysteiden epiteelin kasvainten läheisyydessä [54], [55], ja jossa tiedot osoittavat usein aikaisin tapahtumia on 5p in levyepiteelikarsinooma erilaistumiseen keuhkosyövän [55], [56].

suunnittelu sisältyy valvonta, jotka eivät esittäneet keuhkosyöpä vähintään 12 kuukautta endobronkiaalinen koepala. Koska genomin epästabiilisuuden tapahtuu ei ainoastaan ​​tapauksissa, mutta myös muun valvontaa, jotkut näistä korkean riskin ohjaimet voivat lopulta keuhkosyövän myöhemmin ja meidän poikkipinta tutkimuksen suunnittelu ei käsitellä tätä riskiä. Muita rajoituksia Tutkimusmenetelminä luonne tutkituissa kudoksissa, suhteellinen pieni otoskoko (vaikka tutkimus 70 täysin selityksin korkealaatuista preinvasive vaurioiden tarvitaan kolme keskuksissa ja on yksi suurimmista tähän mennessä raportoiduista), ja kyvyttömyys tutkia näitä näytteitä ”muutos ajan mukaan.

käyttö keuhkoputkien koepaloja arvioimiseksi keuhkosyövän riski on todennäköisesti ole optimaalisen kliinisen käytön, vaikka se voi olla hyödyllistä ennakoida tulevia syövän henkilöillä, jotka sattuvat käymään koepala osoittaa korkealaatuista keuhkoputken preneoplasian. Tämäntyyppinen molekyylitason analyysi voi olla siirtyä korvike kudoksen hengitysteissä myös histologisesti normaalin ilmatien epiteelin. Pieni koko preinvasive vaurioita ja mahdollinen terapeuttinen vaikutus koepaloja tekevät arvioinnin etenemisen nopeus poikkeavuudet näissä kudoksissa melko haastavaa. Poikittaistutkimukset mahdollistavat tutkimuksen yhdistyksen välillä muutokset ja sairaustilasta. Silti todistaa kliinistä hyötyä, ehdokas biomarkkerit edellyttää lisävalidointia prospektiivisissa kohorttitutkimukset.

tarkkuus meidän sytogeneettisten allekirjoitus voidaan parantaa eri tavoin. Genome laaja kopioluku korjauksilla invasiivisia ja preinvasive vauriot voivat sallia valinnan alueista tarkemmin liittyy diagnoosi keuhkosyöpään. Määrän lisääminen tavoitteiden tutkittu pienessä kudosnäytteistä on haastavaa mutta uudemmat teknologiat voivat auttaa saavuttamaan tämän tavoitteen. Lopulta jalostus perimän allekirjoitus havaitaan preinvasive vaurioita, joka ennustaa, joka todennäköisesti kehittää keuhkosyöpä olisi erittäin informatiivinen. Tässä yhteydessä toistuva mittaamiseen, muutosten ja nopeus sen kerääntyminen voi olla erityisen arvokasta ennustettaessa todennäköisyyttä sairastua keuhkosyöpään.

Tässä tutkimuksessa hyödynnettiin edistysaskeleet keuhkosyövän molekyyligenetiikan ja osoittivat, että on vahvan yhteyden kohdennettua genomista muutoksia preinvasive keuhkoputkien vaurioita ja diagnoosi keuhkosyöpään. Nämä muutokset voidaan luotettavasti arvioida FISH, ja sillä saattaa olla tapa mitata riskiä sairastua keuhkosyöpään. Ennustearvo Näiden muutosten ansaitsee lisäarviointia hengitysteiden epiteelin korkean riskin yksilöiden pitkittäistutkimuksissa.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää UCCC sytogenetiikka Core tekniseen tukeen.