Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat sekaantuneet syövän taudin alkamisen ja etenemisen kautta niiden kyky vaikuttaa ilmaisun geenien ja proteiinien, jotka säätelevät solujen lisääntymistä ja /tai solukuolemaan. Transkriptio kolmen miRNA miR-34 perheenjäsenten hiljattain todettu olevan suoraan säädellä p53. Niistä kohdeproteiinit säätelee miR-34 ovat Notch polku proteiineja ja Bcl-2, mikä viittaa mahdollisuuteen rooli miR-34 huolto ja selviytymistä syövän kantasoluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

tarkasteltiin rooleja miR-34 p53-mutantti ihmisen haimasyövän solulinjoissa MiaPaCa2 ja BxPC3, sekä mahdollinen yhteys haimasyövän kantasoluja. Palauttaminen miR-34 ilmentyminen haimasyöpäsoluissa joko transfektiolla miR-34 jäljittelee tai infektio lentiviraalinen miR-34-MIF vaimentua Bcl-2 ja Notch1 /2. miR-34 palauttamisen merkittävästi estivät klonogeeniset solujen kasvua ja invaasiota, indusoi apoptoosin ja G1 ja G2 /M pidätys solusyklin ja herkistyneet solut kemoterapiaa ja säteily. Havaitsimme, että CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 solut on rikastunut tumorsphere muodostavien ja kasvaimen aloittamista soluja tai syövän kantasoluja /progenitorisolujen, joilla on korkea Notch /Bcl-2 ja menetys miR-34. Merkittävämpää, miR-34 palauttaminen johti 87%: n vähennys kasvaimen-aloittamisen solupopulaation, johon on liittynyt voimakas esto tumorsphere kasvun

in vitro

ja kasvainten muodostumisen

in vivo

.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että miR-34 voi palauttaa, ainakin osittain, kasvain tukahduttaa toimintaa p53 p53 puutteesta ihmisen haimasyövän soluja. Meidän tiedot tukevat näkemystä, että miR-34 voi olla mukana haimasyövän kantasolujen itseuudistumisen, mahdollisesti kautta suoraan modulaatio loppupään tavoitteiden Bcl-2 ja Notch, mikä tarkoittaa, että miR-34 voi olla tärkeä rooli haimasyövän kantasolujen itseuudistumiseen ja /tai solun kohtalon määrittämiseen. Palauttaminen miR-34 voi olla merkittävä lupaus uutena molekyylitason hoito ihmisen haimasyövän menetys p53-miR34, mahdollisesti kautta estämällä haimasyöpä kantasoluja.

Citation: Ji Q, Hao X, Zhang M, Tang W, Yang M, Li L, et ai. (2009) MicroRNA miR-34 Estää Human Haimasyöpä Kasvain-Käynnistetään solut. PLoS ONE 4 (8): e6816. doi: 10,1371 /journal.pone.0006816

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 tammikuu 2009; Hyväksytty: 05 elokuu 2009; Julkaistu: 28 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Ji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain NIH myöntää CA121830-01, CA128220-01 ja CA134655-01A1 (L. Xu.), ja NIH yliopiston kautta Michiganin Cancer Centerin Support Grant (P30 CA46592). JTD on University of Michigan Opiskelijakirjaston Research Opportunity Program (UROP) opiskelija. Rahoittajat ollut mitään roolia suunnittelussa ja tutkimuksen tekeminen, että tietojen kerääminen, analysointi ja tulkinta, ja päätös julkaista, hyväksyntää tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat konservoituneita luokka ei-koodaavan 20-22 nt pieniä RNA: ita, jotka säätelevät geenin ja proteiinin ilmentymistä sitoutumalla mRNA johtavat mRNA: n hajoamisen tai esto käännös [1], [2]. miRNA todennäköisesti säädellä erilaisten biologisten prosessien, kuten kudosten erilaistumiseen ja ylläpitoon, ja on osaltaan rooleja vaihteli tautiprosessit, kuten syöpää [2], [3], [4]. Kehittyvät todisteet osoittavat, että miRNA myös olennainen rooli kantasolujen itseuudistumiseen ja erilaistamista negatiivisesti ekspressiota säätelevät tiettyjen keskeisten geenien itseuudistumiseen ja selviytymistä, niin sanottu ”kantasolu geenit” [1], [2] , [4], [5]. Äskettäin kolme jäsentä miR-34 perheen todettiin suoraan säädellä p53 ja funktionaalisen aktiivisuuden miR-34 osoitti mahdollisen aseman tuumorisuppressorina [6], [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Olemme aiemmin raportoitu, että Bcl-2-proteiini säätelee suoraan miR-34 [10]. Raportissa He et al. osoitti, että ektooppinen ilmentyminen miR-34 indusoi solukierron pysähtymisen sekä ensimmäisen ja kasvaimen solulinjat, joka on yhdenmukainen kyky miR-34 downregulate ohjelma geenien edistää solusyklin etenemisen [11]. Olemme äskettäin osoittaneet, että ilmentyminen miR-34s jyrkästi vuonna p53-mutantin mahasyövässä soluja ja että palauttaminen miR-34 ilmentyminen esti syöpäsolujen kasvua [6]. Menetys miR-34 on yhdistetty chemoresistance syövän [13]. miR-34a on raportoitu olevan osallisena p53-välitteisen apoptoosin paksusuolen syövän ja haimasyövän [8], [9]. Chang et al. raportoi, että 15 haimasyövän solulinjoissa on vähintään 2-kertainen väheneminen miR-34a ilmentymisen verrattuna ilmentymisen normaaleissa haimatiehyen epiteelisolulinjaa [8]. Yhdessä julkaistut tutkimukset viittaavat miR-34 perheen jäsenet voivat olla tuumorisuppressoriproteiinia funktio alavirtaan p53. Lisäksi, koska yli 50% ensisijainen ihmisen syövissä ovat mutaatiot inaktivoimaan p53-toiminto, havainnot antoi kimmokkeen tutkia toiminnallisen palauttaminen miR-34 uutena lähestymistapa estää syöpiä p53 menettämisestä toiminnon.

Toinen mahdollinen rooli miR-34 syövän taudin alkamisen ja etenemisen voi olla linkki kasvaimeen aloittamista soluja tai syövän kantasolut (CSC). On raportoitu, että miR-34 tavoitteiden Notch, c-Met ja Bcl-2, geenien mukana itseuudistumisen ja selviytymistä syövän kantasolujen [10], [11], [14]. Tällä hetkellä yhteyksiä p53, loppupään kohde miR-34 ja oletettujen haimasyöpä kantasolut ovat tuntemattomia. Nykyisessä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia toiminnallisen palauttaminen miR-34 miR-34 matkii ja lentiviraalinen miR-34a ihmisen p53-mutantti haimasyöpä MiaPaCa2 soluja, samoin kuin mahdollinen linkki haimasyövän kantasolujen self -renewal. Rajata rooli miR-34 solukasvun säätelyssä ja syövän etenemiseen, ja sen mahdollinen yhteys kasvaimeen aloittamista soluja tai syövän kantasolut voivat tarjota perustan tutkia sen mahdollisuuksia uutena hoitostrategia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja normaalin ihmisen keuhkojen fibroblastisolulinjassa Wi-38 hankittiin American Type Culture Collection ja viljellään DMEM (HyClone, Logan, UT), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone, Logan, UT). mi

RIDIAN

miRNA miR34a, b, c matkii ja negatiivinen kontrolli miRNA matkivat (NC matkivat), mi

RIDIAN

miR-34-estäjät ja negatiiviset kontrollit saatiin Dharmacon (Chicago, IL) [ ,,,0],6]. Bcl-2: n 3′-UTR lusiferaasireportteriplasmidi tai sen mutantti on raportoitu aiemmin [10]. qRT-PCR-alukkeet ja vasta-aineiden Western blot kuvattu hiljattain julkaistu [6].

transfektio miR-34 jäljittelee

MiaPaCa2-solut transfektoitiin 24 tunnin jälkeen ympätään 6-kuoppaisille levyt. miRNA jäljittelee (100 pmol) 200 ul: ssa seerumitonta, antibiootti-free, keskipitkän sekoitettiin 5 ui Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) liuotettiin 200 ui: aan samaa väliainetta ja annettiin seisoa huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Saatu 400 ui transfektion lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi 1,6 ml kasvualustaa. Kuusi tuntia myöhemmin viljelmät korvattiin 2 ml: lla tuoretta elatusainetta, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja. Western blot, solut kerättiin sen jälkeen vielä 48 h.

Lentivirusvektorikonstruktit miR-34a infektio

kissan immuunikatovirus (FIV) lentiviraalinen järjestelmä ilmentävät miR-34a (miR-34a-MIF) tai vektorisäätö (MIF), sekä lentivirus pakkausjärjestelmä, ostettiin System Biosciences (SBI, Mountain View, CA). MiaPaCa2 ja BxPC3 solut infektoitiin FIV lentiviruksen ilmentävä miR-34a (miR-34a-MIF) tai vektorisäätö (MIF), ja infektoidut solut, jotka valitaan antibioottiresistenssin (Zeocin 50 ug /ml, Invitrogen), kuten me äskettäin on kuvattu [6].

miR-34 Bcl-2-3’UTR reportterimääritys

MiaPaCa2-solut transfektoitiin 6-kuoppalevyillä 2 ug: Bcl-2: n 3’UTR lusiferaasi reportteriplasmidilla tai sen mutantti [6], [10], ja 2 ug ohjaus β-galaktosidaasi-plasmidi, kuoppaa kohti, käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Soluja myös ko-transfektoitiin 100 pmol kutakin miR-34 matkivat tai NC matkivat, kuten käyttämällä Lipofectamine 2000 Luciferase määritykset suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Kirkas-Glo Luciferase Assay System (Promega). Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin suhteessa p-galaktosidaasin aktiivisuus havaita β-galaktosidaasin määritys System (Promega). Kussakin tapauksessa mutantti Bcl-2: n 3’UTR osoittaa käyttöön muutoksia tulee siemenen täydentävien alueiden Bcl-2: n 3′-UTR [10].

Pesäkkeenmuodostusta ja klonogeenisten määritys

pesäkemuodostusta, solut transfektoitiin miR-34 jäljittelee tai NC jäljittelevät 24 tuntia, ja sitten ympätään 6-kuoppalevylle kolmena kappaleena. 0,2 ml FBS lisättiin kuoppaa kohti päivänä 5. Kun 9-10 päivää inkuboinnin levyt varovasti pestiin PBS: llä ja värjättiin 0,1% kristalliviolettia. Pesäkkeitä, joiden yli 50 solut laskettiin manuaalisesti. Pinnoitus tehokkuus laskettiin jakamalla muodostuneiden pesäkkeiden määrästä hoidetussa ryhmässä tämän hallinnassa. Sillä klonogeenisten -eloonjäämiskoe, solut transfektoitiin miR-34 jäljittelee tai NC jäljittelevät 24 tuntia, ja sitten ympätään 6-kuoppaisille levyille kolmena kappaleena haluttuun solutiheyteen (200~10,000 solua /kuoppa), jonka jälkeen röntgensäteilyn . Solun eloonjääminen käyrät piirrettiin käyttäen lineaarista-neliöllinen malli ja säteily lisälaite suhde (ER) laskettiin me aiemmin kuvattu [15], [16], [17].

Quantitative reaaliaikainen RT PCR (qRT-PCR) B

qRT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, ilmentymistasojen mahdollisten miR-34 kohdegeenien [6]. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun miR-34 matkivat transfektio MiaPaCa2 solujen miR-34 matkii (100 pmol per kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä), ilmentymistä mahdollisten kohdegeenien mitattiin qRT-PCR: llä SYBR Green PCR System (TaqMan) . Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin transfektoiduista soluista käyttäen TRIZOL (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Sillä qRT-PCR, 1 ui geenin alukkeiden kanssa SYBR Green (Applied Biosystems) 20 ul: ssa reaktioseosta tilavuus on sovellettu. Alukkeet suunniteltiin: Bcl-2, eteenpäin, 5′-CAT GCT GGG GCC GTA CAG-3 ’, kääntää, 5′-GAA CCG GCA CCT GCA CAC-3′; HMGA2, eteenpäin, 5’-TTT GTA ATC CCT TCA CAG TCC-3 ’, kääntää, 5′-TTT CTC ACC CGC CCA C-3′; Notch1, eteenpäin, 5’-ATC CAG AGG CAA ACG GAG-3 ’, kääntää, 5′-CAC ATG GCA ACA TCT AAC CC-3′; Notch2, eteenpäin, 5’-GGA CCC TGT CAT ACC CTC TT-3 ’, kääntää, 5′-CAT GCT TAC GCT TTC GTT TT-3′; Notch3, eteenpäin, 5’-TGA TCG GCT CGG TAG TAA TG-3 ’, kääntää, 5′-CAA CGC TCC CAG GTA GTC A-3′; Notch4, eteenpäin, 5’-TGC GAG GAA GAT ACG GAG TG-3 ’, kääntää, 5′-CGG GAT CGG AAT GTT GG-3′; β-aktiini, eteenpäin, 5’-ATG CAG AAG GAG ATC ACT GC-3 ’, kääntää, 5′-TCA TAG TCC GCC TAG AAG CA-3’. Kaikki reaktiot TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) suoritettiin sen Mastercycler Realplex 2 (Eppendorf, Westbury, NY). Kohdegeenin mRNA-tasot normalisoitiin Actin mRNA seuraavalla kaavalla: [2- (C

T

tavoite – C

T

Actin)] x 100%, jossa C

T on kynnys aikana. Suhteellinen ekspressio laskettiin jakamalla normalisoitu kohdegeenin ilmentymisen käsitellyn näytteen kanssa, käsittelemättömään kontrolliin, jossa arvo NC jäljittele asetettu 1 mielivaltainen yksikkö. Sillä kohdegeenien ilmentymistä lajitellut solut, data normalisoitiin kuin Actin (set Actin = 1000 mielivaltainen yksikkö).

kaspaasi-3 aktivaatiomääritys

Caspase aktivaatio transfektoiduista MiaPaCa2 solut määritettiin ohjeiden mukaisesti kaspaasi-3 aktivaatiomääritys kit (BioVision, Mountain View, CA). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin ja koko solulysaatit (20 ug) inkuboitiin 25 uM fluorogeenisen substraatin DEVD-AFC reaktion puskuria (joka sisälsi 5 mM DTT) 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Proteolytic vapautuminen AFC tarkkailtiin Aex = 405 nm ja Aem = 500 nm käyttäen fluoresenssi mikrolevylukijaa (BMG LABTECH, Durham, NC). Suhteellinen kaspaasi-3 aktivaatio laskettiin normalisoimalla fluoresenssisignaali kaikista testi- näytteessä, joka on NC matkivat tai MIF ohjaus asetetaan 100 mielivaltainen yksikkö [16].

Cell sytotoksisuusanalyysin

MiaPaCa2 soluja transfektoitiin miR-34 matkivat tai NC jäljittelevät 24 tunnin ajan, päällystetty 96-kuoppalevyille (5.000 solua /kuoppa), ja sitä käsiteltiin laimennettiin sarjassa kemoterapeuttisten aineiden, kolmena rinnakkaisena. Sen jälkeen, kun 96 tunnin inkuboinnin 20 ul /kaivo CCK-8-reagenssia lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1-3 tunnin ajan. Optinen tiheys mitattiin 450 nm: ssä ja 650 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (BMG LABTECH, Durham, NC). IC

50, lääkeaineen pitoisuus, joka estää 50% solukasvua on laskettu GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA), kuten me aiemmin on kuvattu [18].

Solusykli ja apoptoosin analyysi

solusyklin ja apoptoosin analyysi virtaussytometrialla, MiaPaCa2-solut transfektoitiin miR-34 jäljittelee tai NC jäljittelevät 6-kuoppalevyillä, trypsinoitiin 24 tuntia myöhemmin ja pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja kiinnitettiin 70% etanolilla jäissä . Sentrifugoinnin jälkeen solut värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia ja 0,1 ug /ml RNaasi A, ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen FACStar Plus ™. Kukin histogrammi oli rakennettu dataa ainakin 5000 tapahtumissa. Tiedot analysoitiin laskea osuus solupopulaation kussakin vaiheessa käyttäen CellQuest-ohjelmaa, sekä% soluista osa-G1 (Becton Dickinson) [18].

CD44 ja CD133 värjäys ja solujen lajittelu

MiaPaCa2-soluja inkuboitiin PE-konjugoidulla anti-ihmis-CD133 /1-vasta-aineen ja APC-konjugoidun anti-humaani-CD44-vasta-aine (Miltenyi Biotec, Aubum, CA, USA) PBS: ssä, joka sisälsi 2% FBS: ää. Isotyyppiyhteensovitettu hiiri immunoglobuliini toimivat vertailuryhmänä. Virtaussytometriaa, näytteet analysoitiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä ja CellQuest-ohjelmaa (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Solujen lajittelu virtaussytometrialla, näytteet analysoitiin ja lajitellaan BD FACSVantage SE (BD Biosciences). Alikvootit CD133

+ ja CD133

– lajitellut solut arvioitiin puhtauden kanssa FACSCalibur koneen ja CellQuest ohjelmistojen (BD Biosciences), käyttäen PE-konjugoidulla anti-ihmisen CD133 /2-vasta-aine (Miltenyi Biotec) [19].

Tumorsphere kulttuuri

järjestetty MiaPaCa2 solut suspendoitiin seerumittomassa elatusaineessa DMEM, joka sisälsi 1% N2 täydennys, 2% B27 täydentää, 1% antibotic-antimykootti (Invitrogen), 20 ng /ml ihmisen FGF-2 (Sigma), ja 100 ng /ml EGF: ää (Invitrogen), ja maljattiin 24-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyt (Corning) 2000 solua per kuoppa. 7-10 päivää myöhemmin, levyt analysoitiin tumorsphere muodostumista ja kvantitoitiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus) on 100X, 200X, ja 400 x suurennuksilla. Myöhempinä kvantifiointi solujen määrä per tumorsphere, tumorspheres kerättiin 40 um seulan (BD Biosciences, San Jose, CA) ja erottaa toisistaan ​​trypsiinillä tehdä yksisolususpension. Elinkelpoiset solut laskettiin käyttämällä trypaanisinieksluusiolla.

Eläinten malli ja in vivo kasvaimen muodostumiseen tutkimus

viidestä kuusiviikkoisilla naaras kateenkorvattomiin NCR-nu /nu nude-hiiriä hankittiin NCI. MiaPaCa2-solut transfektoitiin miR-34a matkivat tai NC jäljittelevät 24 tunnin ajan. Solut kerättiin ja ympätty paljaisiin hiiriin ihonalaisesti (s.c.) molemmilla kyljissä, kun alkoholin valmistuksen iho, käyttäen steriiliä 22 neulan kanssa 0,2 ml solususpensiota 1 x 10

6 solua, jossa on manuaalinen pidättyvyyttä. Kasvain koot mitattiin käyttämällä paksuus. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: (pituus x leveys

2) /2. Päivänä 38, kaikki kasvaimet kerättiin mittaamiseksi kasvaimen painot. Kaikki eläinkokeet tehtiin protokollan mukaisesti hyväksynyt University of Michigan suuntaviivat käytön ja hoidon Animals.

Tilastollinen

Kaksisuuntainen ANOVA ja kaksisuuntainen

t

-testaukset käytettiin analysoimaan

in vitro

ja

in vivo

dataa Prism 5.0 ohjelmistoa (GraphPad, San Diego, CA).

P

0,05 määriteltiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of miR-34s ihmisen haimasyövän solulinjoissa

tutkinut joukkoa ihmisen haimasyövän solulinjoissa, MiaPaCa2, BxPC3, Capan1, Capan2, Panc-1, ja normaalin ihmisen keuhkojen fibroblastisolulinjaa WI-38, mir-34a, b, c ilmaisua. Olemme myös arvioitiin rinnakkain ilmaisun oletettujen miR-34-säänneltyjen kohde- geenien ja proteiinien, käyttäen alukkeita ja menetelmiä kuten on kuvattu äskettäin [6]. MiaPaCa2 ja BxPC3 solut ovat hyvin alhaiset ekspressiotasoja sekä ensimmäisen että kypsä miR-34a, b, c mutta korkea MIR-34 kohdegeenien

BCL2

ja

Notch1

, ja eri tasoilla ja

Notch2-4

(kuvio 1). Niillä on myös alhainen ekspressiotasot p21 (kuva 1

C

), toinen mRNA tavoite p53, sopusoinnussa solulinjan n p53-mutantin asemaa. Näiden tietojen perusteella ja havaintomme, että ne ovat erittäin tuumorigeenisemmiksi ja toistettavasti muodostavat tumorspheres

in vitro

valitsimme kaksi solulinjoja Nykyisessä tutkimuksessa.

, Western blot-analyysi.

B

, qRT-PCR-analyysi suhteellisten ekspressiotasot miR-34s.

C

, qRT-PCR analyysi ekspressiotasot miR-34 kohdegeenien ihmisen haimasyövän solulinjoissa sekä normaalissa ihmisen fibroblasti Wi-38 soluihin. Solut lyysattiin poimia koko RNA qRT-PCR, data normalisoitiin kuin Actin ja suhteellinen tasot näkyvät (Actin = 1000). Huomautus p21 on kohdegeenin p53.

miR-34 palauttaminen transfektoimalla MiaPaCa2 solujen miR-34 jäljittelee

vaikutusten tutkiminen miR-34 palautettiin haimasyöpä solut, me transfektoitiin MiaPaCa2 solut miR-34 jäljittelee tai määrittelemätön ohjaus miRNA matkivat (NC matkivat). Western blot -analyysi (kuvio 2

) osoitti, että transfektio miR-34 jäljittelee vaimentua ilmentymisen kohdegeenien, Bcl-2, Notch1 ja Notch2 proteiinitasolla, mutta sillä ei ollut vaikutusta Bcl-xL: n ja Mcl -1 ilmaisu, joka osoittaa kohdegeenin knock-down by miR-34 jäljittelee vaikuttaa selostukset kätkeminen miR-34 kohdesivustot. miR-34a, miR-34b ja miR-34c jäljittelee kaikilla oli vastaavaa toimintaa. Kuva 2

B

esittää qRT-PCR-analyysi mahdollisista kohdegeenien; miR-34 jäljittelee esti voimakkaasti

BCL2

ja

Notch1

geenin ilmentymisen, sopusoinnussa Western blot tiedot. He myös esti ilmentymistä p21 (kuvio 2

B

), toinen tavoite p53, mutta on rajallinen vaikutus Notch3 ja cMET. Mielenkiintoista, Notch2 lauseke eston proteiinin tasolla miR-34 ei liittynyt estämällä mRNA-tasolla, kanssa aiemmissa raporteissa, että miRNA estää kohdegeenin ilmentymisen transkription jälkeen, tai ilman mRNA: n hajoamisen [11], [20 ].

, miR-34 palauttaminen down-regulation kohde- proteiinien Bcl-2, Notch1 ja Notch2, eikä vaikutuksia Mcl-1. MiaPaCa2-solut transfektoitiin miR-34 jäljittelee tai ei-spesifinen ohjaus miRNA matkivat (NC matkivat) (100 pmol per kuoppa 6-kuoppaisille levyille Lipofectamine 2000) 48 tunnin ajan, sitten kerätään Western blot-analyysi.

B

, Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi mahdollisen kohdegeenien ”mRNA-tasot, kun miR-34 matkivat transfektiota MiaPaCa2-soluissa. **

P

0,01, ***

P

0,001, Opiskelijan

t

-testi, n = 2.

C

, Bcl-2: n 3′-UTR Luciferase Reporter Assay osoittaa, että transfektoidut miR-34 jäljittelee ovat toimivia. MiaPaCa2-solut ko-transfektoitiin Bcl-2: n 3’UTR Luciferase Reporter tai sen mutantti, b-gal vektori, yhdessä joko miR-34 jäljittelee tai NC matkivat. Lusiferaasianalyysi suoritettiin 24 tunnin kuluttua transfektion käyttäen Kirkas-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin suhteessa b-gal-aktiivisuus. Virhepalkin osoittaa s.e.m.

Sen arvioimiseksi, onko transfektoidut miR-34 jäljittelee ovat toimivia, toteutimme Bcl-2 3’UTR toimittaja määrityksessä äskettäin kuvattu [6], [10]. Transfektoituja miR-34 jäljittelee inhiboi lusiferaasireportterigeenin ilmentyminen, jota ohjataan Bcl-2 3’UTR promoottorialueella (kuvio 2

C

). Kuitenkin mutaatio Bcl-2: n 3’UTR komplementaarinen miR-34 siementen sekvenssi poistetaan tämä vaikutus, mikä osoittaa, että havaittu aktiivisuus on sekvenssispesifistä. Tulokset osoittavat, että transfektoidut miR-34s ovat toimivia ja vahvistaa, että Bcl-2 on välittömänä kohteena miR-34, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [8], [10], [21].

arvioimiseksi pitkän aikavälin vaikutuksia miR-34 palauttaminen, myös palveluksessa lentiviraalinen järjestelmä ilmaista miR-34a. Kissan immuunikatovirus lentiviruksen ilmentävä miR-34a (miR-34a-MIF), tai vektorisäätö (MIF), käytettiin infektoimaan MiaPaCa2 ja BxPC3 solujen ja tartunta-solupopulaatio oli valittu kautta zeosiiniresistenssin [6]. Kuvassa S1 esittää luonnehdinta ilmaisun muutoksia miR-34a-MIF-solut. Western blot-analyysi paljasti, että Bcl-2-proteiini säädellä vähentävästi miR-34a-MIF-solut verrattuna MIF vektorisäätö soluja (kuvio S1

), sopusoinnussa qRT-PCR analyysi Bcl- 2 mRNA tasolla (Kuva S1

B

). Bcl-2: n 3′-UTR Luciferase Reporter Assay osoitti, että miR-34a on toiminnallinen miR-34a-MIF-solut (kuvio S1

C

).

miR-34 palauttaminen estää MiaPaCa2 solu klonogeeniset kasvua ja johtaa kaspaasi-3 aktivaation ja apoptoosin

Kun validointi, että transfektoidut miR-34 jäljittelee olivat toiminnallisia, toteutimme klonogeeniset määritys vaikutusten tutkimiseksi miR-34 palauttaminen solun kasvuun. Kuten kuviossa 3

A-B

, miR-34 palauttaminen inhiboi merkittävästi klonogeenisten solujen kasvua, miR-34a matkivat indusoivan 80%: n inhibitio pesäkkeiden muodostumisen verrattuna NC jäljitellä (18,3 ± 3,8 pesäkettä /hyvin vs. 95,3 ± 1,8% pesäkkeistä /kuoppa). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin miR-34a-MIF-solut, jotka kasvoivat hitaammin kuin MIF-ohjaus soluja, kuten on osoitettu sekä merkittävästi pienempi määrä Trypan Blue-ilman elinkelpoisten solujen solukasvumäärityksessä (kuvio S1

D

) ja alennetun pesäkkeiden muodostumista (kuva S1

E

). Olemme myös tutkineet vaikutusta estämällä endogeenisen miR-34 solujen kasvuun mi

RIDIAN

miR-34-inhibiittoreita. Ne ovat yksijuosteisia kemiallisesti parannettu oligonukleotideja, jotka voivat tehokkaasti estää endogeenisen kypsä miR-34. miR-34-estäjät aiheuttama lähes 20%: n nousu klonogeeniset kasvu verrattuna ohjaus (120,3 ± 2,9 pesäkettä /hyvin vs. 95,3 ± 1,8 pesäkettä /kuoppa) (Kuva 3

A-B

). Teimme myös solun invaasiomääritys in MiaPaCa2 solujen miR-34 palauttaminen sekä miR-34a matkivat ja miR-34a-MIF. miR-34 inhiboi merkittävästi hyökkäyksen mahdollisuudet MiaPaCa2-soluissa (kuvio S2). Tuloksemme osoittavat, että miR-34 on mukana MiaPaCa2 solujen kasvua; miR-34 palauttaminen estää klonogeeniset kasvua, ja estämällä endogeenisen miR-34 miR-34-estäjät edistää kasvua. Tuloksemme ovat sopusoinnussa raportoitiin tuumorisuppressori funktiona miR-34 [6], [8], [9], [11], [22].

MiaPaCa2-solut transfektoitiin miR-34 jäljittelee tai inhibiittorit, 24 tuntia myöhemmin solut siemennettiin 6-kuoppalevyille (200 solua /kuoppa, kolmena rinnakkaisena). Sen jälkeen, kun 12-14 päivä Inkuboinnin jälkeen levyt pestiin varovasti PBS: llä ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla.

edustava kuvia pesäkkeiden.

B

, Colonies yli 50 solut laskettiin.

C

, Palauttaminen miR-34 johtaa kaspaasi-3 aktivaation. Kaspaasi-3-aktivaation määritys suoritettiin, kuten on kuvattu kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. Kertainen fluoresenssisignaalin laskettiin jakamalla normalisoidun signaalin kunkin käsitellyn näytteen kanssa, että käsittelemätön kontrolli. **

P

0,01, ***

P

0,001, Opiskelijan

t

-testi, n = 3.

D

, solusyklin jakautuminen MiaPaCa2-soluissa, jotka on transfektoitu miR-34 jäljittelee. Solusyklin analyysi suoritettiin 1 päivä transfektion jälkeen. Solut värjättiin propidiumjodidilla jälkeen etanoli kiinnitys ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Koska p53: n kasvaimia estävä toiminta on välittämää osittain indusoimalla apoptoosin [23], [24], tutkimme vaikutus miR-34 palautettiin apoptoosin induktio MiaPaCa2 transfektoiduissa soluissa miR-34 jäljittelee. Kuten kuviossa 3

C

, ohimenevä transfektio miR-34 jäljittelee, johti huomattavasti kaspaasi-3, on keskeinen osoitus solujen apoptoosin [25]. Olemme myös arvioineet vaikutusta miR-34 jäljittelee solusyklin. miR-34 jäljittelee aiheutti merkittäviä G1 ja G2 /M pidätystä ja vähentää solujen S-vaiheessa (kuva 3

D

), johdonmukainen muiden raportteja miR-34 palauttaminen eri syövän malleissa [6], [7], [8], [10], [11], [21], [22], [26]. Tämä vaikutus on solusyklin on samanlainen kuin p53 palauttaminen kuten aiemmin raportoitu [23], [24], [27], [28], mikä osoittaa, että miR-34 palauttaminen voi käyttää vaikutuksia sukua palauttaminen p53-tuumorisuppressorin funktio, ainakin osittain, soluissa p53 lakkaa toimimasta.

miR-34 palauttaminen herkistää MiaPaCa2 solujen kemo- ja sädehoidon

Seuraavaksi tutkittiin, miR-34 palauttaminen voisi herkistää haimasyöpäsoluissa korkeatasoinen endogeenisen Bcl-2 ilmaisun kemo- ja sädehoidon. WST-1-pohjainen sytotoksisuusmääritys käytettiin äskettäin kuvattu [6], [18], jossa arvioidaan solujen vaste kolmen kemoterapeuttiset aineet, dosetakseli, sisplatiinin ja gemsitabiinin, jotka kaikki ovat tällä hetkellä käytetään haiman syövän kemoterapiaan. Kuten kuviossa 4

, miR-34 ennallistamisen MiaPaCa2-soluissa suoritetuista solut 2-3 kertaa herkempi kemoterapeuttiset aineet, verrattuna vektorisäätö soluja, joka perustuu IC50 tietoihin. Apoptoosin määrityksissä miR-34a palauttaminen huomattavasti gemsitabiini tai säteilyn aiheuttama kaspaasi-3-aktivaation (kuvio 4

B

) ja osa-G1 soluihin (kuva 4

C

). Olemme myös suorittaa klonogeenisten määrityksessä miR-34a matkivat herkistyneet MiaPaCa2 solujen röntgensäteilyn, jossa on säteilyn lisälaite suhde (ER) = 1,3 (kuvio 4

D

). Tuloksemme osoittavat, että miR-34 palauttaminen voi voittaa kemo- /radioresistance haiman syöpäsoluja, jotka ovat korkeita Bcl-2 ja alhainen pohjapinta tasoja miR-34s, ja ovat riippuvaisia ​​Bcl-2 selviytymisen ja kestävyys hoito.

, miR-34 palauttaminen herkistää solut kemoterapeuttisten aineiden. MTT-pohjainen sytotoksisuusmääritys suoritettiin käyttämällä Zeocin-resistenttejä vakaa MiaPaCa2-miR-34a-MIF ja MiaPaCa2-MIF-solut.

B

, miR-34 palauttaminen lisää kaspaasi-3 aktivaation aiheuttama gemsitabiini tai röntgensäteilyä in MiaPaCa2 soluissa. Suhteellinen kaspaasi-3 aktivaatio laskettiin normalisoimalla fluoresenssisignaali kaikista testi- näytteessä että NC matkivat tai MIF ohjaus 100. *

P

0,05, ***

P

0,001, Opiskelijan

t

-testi, n = 3.

C

, miR-34 palauttaminen kasvattaa säteilyn aiheuttamista apoptoosin MiaPaca-2-soluissa. Solut transfektoitiin miR-34a matkivat tai NC matkivat. 24 tuntia myöhemmin solut altistettiin röntgensäteilyn. Solut kerättiin sen jälkeen, kun vielä 48 tunnin ajan, värjättiin propidiumjodidilla jälkeen etanoli kiinnitys, ja analysoitiin virtaussytometrialla varten% soluista osa-G1 vaiheeseen. *

P

0,05, Studentin t-testi, n = 2.

D

, miR-34 palauttaminen radiosensitized MiaPaca-2-soluissa. Klonogeenisten määritys suoritettiin, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

Data näytetään keskimääräisenä +/- SD (n = 3).

CD44 + /CD133 + solut ovat tumorsphere muodostavia ja kasvaimen aloittamista solujen korkea Bcl-2 ja menetys miR-34 ilmentyminen

tutkia mahdollisuuksia vaikutuksen miR-34 palauttaminen kasvainten aloittamista solujen MiaPaCa2 solulinjassa, ensin tarkasteltiin kasvain- aloittamista solu tai syövän kantasolujen väestön MiaPaCa2 solujen eri solunpintamarkkereiden. Sekä CD44 [29] ja CD133 [19], [30] on käytetty merkkiaineina tunnistaa haimasyövän kantasoluja kasvainkudoksista. Kuitenkin, ei ole kertomus syövän kantasoluja MiaPaCa2 soluissa. Arvioimme CD44 ja CD133 tilaansa MiaPaCa2 soluissa immunofluoresenssivärjäyksellä ja FACS lajittelu. Noin 60% soluista ovat CD44 + ja 3-5% soluista ovat CD133 + kuitenkin vain 1-2% soluista ovat CD44 + /CD133 + double-positiivinen (Q2 kuviossa 5

). Tutkia itseuudistumisen potentiaalin solujen erilaisilla pintamerkkiaine profiilit, me sitoutui tumorsphere kulttuurin lajitellut solut erityinen ultra-low kiinnitys kulttuuri levy ehdollista väline tumorsphere kulttuuri [29]. Seitsemästä kymmeneen päivää myöhemmin, CD44 + /CD133 + double-positiivisten MiaPaCa2 solut kasvoivat tyypillinen tumorspheres mutta ei CD44- /CD133- double-negatiivisia soluja, kun taas CD44 + /CD133- tai CD44- /CD133 + single-positiivisten solujen oli vähemmän ja pienempiä aloilla (Kuva 5

B-C

). Edustaja tumorsphere alkaen CD44 + /CD133 + solujen on esitetty kuviossa 5

B

(insertin). Teimme myös rajoittava laimennus kasvain-aloittaminen määritys nude-hiirissä käyttäen lajitellut solut, ja tiedot on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. CD44- /CD133- solut eivät muodosta kasvain, kun taas 1 x 10

4 CD44 + /CD133 + solujen muodostunut kasvain 4 ulos 4 hiirtä, 1 x 10

3 CD44 + /CD133 + solut muodostivat kasvain 2 ulos 4 hiirtä, eikä kasvain muodostaa 1 x 10

2-soluissa. Siten meidän tiedot osoittavat, että CD44 + /CD133 + kaksinkertainen positiivisia MiaPaCa2 soluja on rikastunut kasvaimeen aloittamista soluja tai syövän kantasoluja /esisolujen kykenevät itseuudistumisen, mutta CD44- /CD133- double-negatiivinen populaatio ei sisällä tällaisia ​​soluja. Tuloksemme viittaavat myös siihen, että CD44 /CD133 soveltuvat markkereita kasvaimen aloittamista solujen MiaPaCa2 solulinjassa.

, CD44 ja CD133 värjäytymistä MiaPaCa2 soluja. MiaPaCa2 solut värjättiin anti-CD44-APC ja anti-CD133-PE ja lajitellaan FACS. Noin 1-2% soluista ovat CD44 + /CD133 + double-positiivinen (Q2).

B-C

, Tumorsphere kulttuurin lajitellut solut. Lajitellut solut maljattiin tumorsphere kulttuurin kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

. 7-10 päivää myöhemmin, tumorspheres laskettiin (

B

). Insertti esittää edustavan tumorsphere alkaen CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 soluja.

C

.