Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yli 90% syövän kuolleisuutta johtuu syöpä on metastasoitunut. Siksi on tärkeää tehostaa tutkimusta etäpesäkkeitä muodostumiseen ja hoito. Tässä me kuvaamme ensimmäistä kertaa metastasizing kyky ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja C33A kateenkorvattomissa nude-hiirissä ihon alle implantaation syöpäsoluja. Tässä mallissa osoitimme tasaista etenemistä lannerangan ja munuaisten imusolmukemetastaaseja aikana kasvainten kehittymiseen. Lisäksi pääasiassa esiintyvät imusuonten etäpesäkkeitä, me visualisoida muodostumista hematogenous etäpesäkkeiden hyödyntäen punainen fluoresoiva proteiini (RFP) ilmentävät C33A-RFP soluissa. RFP positiiviset syöpäsolut havaittiin vaeltavat verisuonten ja muodostavat mikrometastaasien keuhkoissa kasvaimen kantavien hiirten. Seuraavaksi ryhdyimme analysoimaan vaikutuksen onkolyyttisten virotherapy että C33A-RFP malli ja osoittivat tehokkaan virusvälitteiseltä hidastanut kasvaimen koon ja metastaattisen taakka. Nämä tulokset viittaavat siihen, C33A-RFP kohdunkaulan syövän mallia uuden alustan analysoida syövän etäpesäkkeitä sekä testata uusia hoitovaihtoehtoja torjumiseksi etäpesäkkeitä.

Citation: Donat U, Rother J, Schäfer S, Hess M, Härtl B, Kober C, et ai. (2014) karakterisointi Etäpesäke Formation ja Virotherapy Human C33A Kohdunkaulan syöpä Model. PLoS ONE 9 (6): e98533. doi: 10,1371 /journal.pone.0098533

Editor: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 syyskuu 2013; Hyväksytty: 05 toukokuu 2014; Julkaistu: 02 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Donat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimuksen ja kehittämisen osasto Genelux Corporation, San Diego, USA, ja palvelu Grant yliopiston Würzburg, Saksa rahoittama Genelux Corp. UD ja SW sai tutkijatohtorin. JR, CK, SS, ja MH sai jatko Fellowship Genelux Corporation myönnetty yliopiston Würzburg. AAS, JS, NGC, ja RJA ovat toimihenkilöitä Genelux Corporationin ja taloudellisia etuja Genelux Corporation. BH on toimihenkilö on Genelux GmbH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tätä työtä tuetaan tutkimuksen ja kehityksen osasto Genelux Corporation, San Diego, USA, ja palvelu Grant yliopiston Würzburg, Saksa rahoittama Genelux Corp. UD ja SW sai tutkijatohtorin. JR, CK, SS ja MH sai jatko Fellowship Genelux Corporation myönnetty yliopiston Würzburg. AAS, JS, NGC ja RJA ovat toimihenkilöitä Genelux Corporationin ja taloudellisia etuja Genelux Corporation. BH on toimihenkilö on Genelux GmbH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Lisäksi kaikkia kilpailevia intressejä totesi ennen kirjoittajat lisätä, että ne eivät muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Metastasoitunut leviäminen kasvaimia on monivaiheinen prosessi jonka aikana pahanlaatuisten solujen levittää primaarikasvaimen kaukaisiin elimiin [1]. Kasvain solut vaeltavat kahdella pääväylien: Imunestejärjestelmän ja verenkiertoa. Aikana imusuonten etäpesäke, yhteinen piirre useimmissa karsinoomien, kasvainsolut jättää alkuperäisen kasvaimen sivuston ja siirtyä sen jälkeen ratkaisun alueellisiin imusolmukkeisiin ja kaukaisiin niitä [2]. Diagnoosi imusolmukemetastaaseja on suuri merkitys. Vaikka imusolmukemetastaaseja itse harvoin hengenvaarallisia ne osoittavat valtion syövän etenemisen [3]. Useimmat syöpäkuolemista johtuu kehittämiseen etäpesäkkeitä. Näin ollen laajan tulkinnan biologian etäpesäkkeiden on tarpeen. Kolme suurta alustoja käytetään tällä hetkellä kehitetään

in vivo

etäpesäkkeitä malleja. Näitä ovat kemialliset induktio, jolloin syöpää aiheuttavia aineita annetaan indusoimaan kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden, syngeeniset ja ksenografti- elinsiirtoa malleja, joihin liittyy elinsiirtoon tuumorisolujen /kudosta hiiren isännät ja geneettisesti hiiren malleissa [4] – [5]. Täällä teemme kanssa ksenogeenista spontaani siirremallissa etäpesäkkeiden. Useita ksenogeenisten etäpesäkkeiden malleja on luotu viime vuosina, esimerkiksi eturauhasen [6] – [8], peräsuolen [9] – [10], rintojen [11] – [12], mahan [13] – [14] tai munuaissyövän [15] karsinoomat. Lisäksi on olemassa myös joitakin malleja ihmisen papilloomaviruksen (HPV) positiivinen kohdunkaulansyövän kuvattu [16] – [18].

Vuoden kohdunkaulan syövän seulonnan tutkimus (HPV positiivisia ja HPV negatiivinen solulinjoja) varten onkolyyttinen virotherapy vaikutukset onkolyyttisten vacciniaviruksen GLV-1h68 seuraavilla solulinjoissa analysoitiin. Tulokset osoittavat, että läsnäoloa ja kopioluvun HPV-DNA kohdunkaulan syövän solut eivät ole vaikutusta terapeuttista tehoa GLV-1h68 (taulukko S1). Lisäksi olemme havainneet, muodostumista imusolmukemetastaaseja jälkeen implantoitu ihon alle C33A HPV-negatiivinen ihmisen kohdunkaulan syövän solujen immuunipuutteisilla hiirillä. Näin ollen tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet luonnehdinta metastaasien kyky tässä solulinjassa, jota ei ole kuvattu kirjallisuudessa tähän mennessä. Analysoimme imusuonten ja hematogenous leviäminen C33A-RFP soluja nude-hiirissä ihon alle istutuksen syöpäsolujen, jolloin lymfakiertoa edusti pääreitti metastasizing syöpäsoluja. Lisäksi tasainen eteneminen imusolmukemetastaaseja in korrelaatio kasvaimen kasvua osoitettiin.

Lisäksi olemme analysoineet onkolyyttinen virotherapy of C33A kasvaimia ja etäpesäkkeitä uutena hoitovaihtoehto. Onkolyyttiset virukset voivat replikoitua selektiivisesti syöpäsoluissa, jolloin tuhoutuminen kasvainkudoksen, mutta jättäen terveiden kudosten vahingoittumattomina [19]. Tässä olemme keskittyneet tutkimalla vaikutusta aiemmin kuvattu heikennetty rekombinantti vaccinia-virus GLV-1h68 [20] – [21]. Terapeuttinen vaikutus tämän viruksen primaaristen kasvainten on osoitettu monissa karsinoomien, kuten rinta-, haima- tai eturauhassyöpä [21] – [23]. Lisäksi olemme hiljattain osoitti terapeuttista potentiaalia GLV-1h68 hoidettaessa imusuonten ja hematogenous etäpesäkkeitä peräisin ihmisen eturauhasen karsinoomasolulinja PC-3 [22], mikä osoittaa, että GLV-1h68 voisi poistaa etäpesäkkeitä C33A-mallin hyvin. Todellakin, tässä osoitimme jyrkkä virusvälitteiseltä väheneminen C33A-RFP kasvaimia ja metastasoituneeseen taakka.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

HPV-negatiivinen ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja C33A viljeltiin DMEM korkea glukoosi (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS: ää (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa) ja 1%: gentamisiini liuosta (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa). C33A noomasolulinjasta toimittanut Frank Stubenrauch, FT (UKT, Tübingenin yliopistossa; [24]). Aitouden C33A solujen varmistettiin DSMZ GmbH (Leibniz Institute DSMZ-saksalainen kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures, Braunschweig, Saksa). C33A-RFP soluja viljeltiin samoissa olosuhteissa, paitsi lisäämällä 5 ug /ml blastisidiinia. Ihmisen epiteelisolujen munuaissolut (293FT) saatiin Invitrogen GmbH (Karlsruhe, Saksa) ja niitä viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 2 mM L-glutamiinia (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa).

Generation C33A-RFP solujen

cDNA-sekvenssi punainen fluoresoiva proteiini (

mRFP1

) insertoitiin C33A genomiin käyttäen Vira Virta Lentivirusvektorikonstruktit Expression System Kit (Invitrogen GmbH, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeita.

mRFP1

koodittavan plasmidin pCR-TK-SEL-MRFP saatiin Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) ja käytettiin tuottamaan

mRFP1-

sisältävät lentivirusvektoreita kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Replikaatiokyvyttömäksi

mRFP1

-koodauksella lentivirukset tuotettiin 293FT soluissa kotransfektoimalla plasmidit pLP1, pLP2, PLP /VSVG, jotka toimittavat lentiviruksen rakenne- ja replikaation proteiinien ja pLENTI6 /V5-DEST-MRFP ekspressioplasmidin käyttäen Lipofectamine ™ 2000. Transduktion jälkeen C33A solujen MRFP-koodaus lentivirukset ja blastisidiinia (5 ug /ml) valinta, yhtä stabiili RFP ilmentävien C33A klooni valittiin.

Viruskanta

heikennettyä vaccinia-viruskanta GLV- 1h68 aiemmin kuvattu Zhang

et al

. [21]. Kolme ekspressiokasetteja, jotka koodaavat

Renilla

lusiferaasi-GFP-fuusioproteiini, β-galaktosidaasi, tai β-glukuronidaasi rekombinoitiin

F14.5L

,

J2R

ja

A56R

loci, vastaavasti, vanhempien LIVP viruksen genomin.

Ethics selvitys

Kaikkia eläimiä hoidetaan ja käsitellään tiukasti mukaisesti eläinten hyvä käytäntöjä määritetty kansallisissa ja paikallinen eläinten hyvinvoinnin elimet (Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals julkaissut National Institutes of Health ja Saksan animal Welfare Act ”TierSchG”). Kokeelliset protokollat ​​hyväksyi hallituksen Unterfranken, Saksa (protokolla numerot 55.2-2531.01-17 /08 ja 55.2-2531.01-25 /12) ja /tai Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja Explora BioLabs, joka sijaitsee San Diego Science Center (San Diego, USA) (protokolla numero: EB08-003; EB11-025).

kasvaimen istutuksen ja virus hallinto

Kasvaimet syntyvät istuttamalla 5 x 10

6 C33A-RFP solua 100 ui PBS: ää ihonalaisesti oikeaan vatsan kylki 6-8 viikkoa vanha nainen kateenkorvattomien nude

Foxn1

nu

hiiriä (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Saksa). Kasvain ja imusolmuke tilavuus seurattiin kaksiulotteisena käyttämällä digitaalista paksuus ja lasketaan [(pituus) x (leveys)

2 x 0,52]. Kasvaimen tilavuus mitattiin elävien hiirten, kun taas imusolmuke tilavuus mitattiin

post mortem

, avaamisen jälkeen vatsa. Imusolmuke määriteltiin laajenee, kun maksimaalinen halkaisija ylitti 3 mm. Tutkittaessa vaikutusta onkolyyttisten virotherapy kerta-annos on 5 x 10

6 plakkia muodostavaa yksikköä (pfu) GLV-1h68 100 ui PBS: ää injektoitiin laskimonsisäisesti (iv) otetaan C33A-RFP kasvainta kantavissa hiirissä, sen jälkeen, kun kasvain määrä oli 200-250 mm

3. Hiiret tapettiin mukaan suuntaviivojen eutanasia on Jyrsijät hiilidioksidin avulla.

fluoresenssikuvantamisella

Kuvia C33A-RFP tuumoreita kantavaa hiirtä otettiin Maestro EX Imaging System (Caliper, Hopkinton , MA, USA). Fluoresenssikuvantamiseen kasvaimia, munuaiset, keuhkot ja imusolmukkeista C33A-RFP kasvainta kantavissa hiirissä suoritettiin MZ16 FA Stereo-fluoresenssimikroskooppia (Leica, Wetzlar, Saksa). Kuvantaminen hiirien Maestro EX Imaging System, eläimet nukutettiin käyttäen 2-3% isofluraania. Digitaaliset kuvat prosessoitiin Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, USA).

mittaus fluoresenssin intensiteetin

mittaaminen fluoresenssin voimakkuus RFP signaalia imusolmukkeissa ja munuaisissa C33A- RFP tuumoreita kantavaa hiirtä suoritettiin käyttäen ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij). RGB-kuvia RFP signaalin munuaiset ja imusolmukkeiden muunnettiin 8-bittinen harmaasävy intensiteetti alueella 0-255. Fluoresenssin intensiteetti edustaa keskimääräistä kirkkautta kaikkien RFP liittyvien pikseliä.

immunohistokemia

histologia, kasvaimia, imusolmukkeiden ja munuaiset leikattiin irti ja kiinnitettiin 16 h 4% paraformaldehydi /PBS, pH 7.4. Valmistaminen 100 um: n leikkeitä ja merkintämenettelyjä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26] käyttämällä Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Sveitsi). Sen jälkeen merkintöjä, kudosleikkeet asennettu Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa). Valmistamiseksi 10 um: n leikkeitä kudosnäytteet leikattiin kanssa kryostaatilla 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Saksa). Sen jälkeen nestehukka 10% ja 30% sakkaroosia (Carl Roth, Karlsruhe, Saksa) näytteet upotettiin Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek Europe BV, Alphen aan den Rijn, Alankomaat). Cryo-leikkeitä säilytettiin -80 ° C: ssa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 1 tunti. PBS-pesun jälkeen, leikkeet värjättiin 1 tunnin ajan johdetun vasta-aineiden ja lopuksi asennetaan Mowiol 4-88.

Vasta-aineet ja reagenssit

endoteelisolujen verisuonten värjättiin hamsterin monoklonaalista CD31 vasta-aineella (Chemicon International, Temecula, USA; MAB1398Z) ja endoteelin imusuonten kanin polyklonaalisella anti-Lyve-1 vasta-aineella (Abcam, Cambridge, UK; ab14917). Tumat Hoechst 33342-leimattua (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksa). DyLight488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (aasi) saatiin Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). Ensisijainen ja toissijainen vasta-aineet laimennettiin 1:100 PBS /0,3% Triton-X-100.

Fluoresenssimikroskopia

Kuvia kasvain, imusolmuke ja munuaisleikkeissä otettiin kiinni seuraavin mikroskoopit: stereo-fluoresenssi mikroskooppi MZ16 FA (Leica) varustettu digitaalisella CCD-kamera ja Leica IM1000 4.0 ohjelmisto (1300 x 1030 pikselin RGB-värikuvia), joka on TCS SP2 AOBS konfokaali laser mikroskooppi (Leica) varustettu LCS 2,16 ohjelmisto ( 1024 1024 pikselin RGB-värikuvia) ja Axiovert 200 M (Zeiss) kanssa Axiovision 4.5 ohjelmisto (1388 x 1040 pikselin harmaasävy kuvia), tässä järjestyksessä. Digitaaliset kuvat prosessoitiin Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) ja yhdistettiin, jolloin saatiin pseudo-värikuvia. Kuvia soluja siirrostettiin 24-kuoppalevyille otettiin kiinni joko stereo-fluoresenssi mikroskooppi MZ16 FA (Leica) kanssa tai Axiovert 200 M (Zeiss).

valmistaminen yksisolususpensioi- ja FACS-analyysiä

valmistamiseksi yhden solun suspensioita kasvainten, lanne ja munuaisten imusolmukkeet, keuhkot ja munuaiset C33A-RFP tuumoreita kantavaa hiirtä kudokset punnittiin, jauhettu ja inkuboitiin yksittäin DMEM korkea glukoosi johon oli lisätty 2% FCS: ää, 10,000 U /ml kollagenaasi I (Sigma, Steinheim, Saksa) ja 5 MU /ml DNaasi I (Calbiochem, Darmstadt, Saksa) 37 ° C: ssa. Kasvainkudoksista inkuboitiin 35 min, LN ja RN kudoksia 30 minuuttia, munuaiset 20 min ja keuhkot 15 min. Sen jälkeen, kudokset läpi 70 pm nylon mesh-suodattimet (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) ja siirrettiin DMEM korkea glukoosi johon oli lisätty 2% FCS: ää. Sentrifugoinnin jälkeen (1000 g, 10 min) suspendoitiin uudestaan ​​2x tilavuuteen PBS /2% FCS, joka koskee kudoksen painoa. Myöhemmät, 100 ui yhden solun suspensiot analysoitiin käyttäen Accuri C6 Cytometer ja FACS-analyysiä ohjelmiston CFlow Versio 1.0.227.4 (Accuri Solumittauslaitteet, Inc. Ann Arbor, MI, USA). Solut aidatulla koon mukaan (FSC) ja rakeisuus (SSC). Lisäksi 100 ui yhden solun suspensiot ympättiin 24-kuoppalevyille 1 x 10

-1-1 x 10

-4 laimennoksia. Laimennokset valmistettiin DMEM korkea glukoosi johon oli lisätty 10% FCS: ää. Kolmen vuorokauden kuluttua solususpensio kylvämisen media oli täydennetty 5 ug /ml blastisidiinia, valitse C33A-RFP soluissa. Solujen pesua ja median uusiminen tehtiin kahdesti viikossa. Viikon kuluttua blastisidiinia valinta C33A-RFP soluja 24 kuopan levyt värjättiin kristallivioletilla 3 h, pestään ja kuivataan. Jälkeenpäin solujen pesäkkeet laskettiin.

Tilastollinen

kaksitahoiset Opiskelijan

t

testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin.

P

arvot ≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tähdet osoittavat merkittävää eroa kokeellista ryhmien (* tarkoittaa p≤0.05; ** osoittaa p≤0.01; *** osoittaa p≤0.001).

Tulokset

kasvukinetiikka ihonalainen C33A- RFP kasvaimia ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa muodostumista

havaittu laajentumisen lannerangan ja munuaisten imusolmukkeisiin C33A kasvaimen kantavien hiirten osoitti, että läsnä metastasized syöpäsoluja. Jotta visualisointi metastaattisen C33A solun leviämiseen, cDNA-sekvenssi, punainen fluoresoiva proteiini (

mRFP1

) insertoitiin C33A genomiin. Expression of RFP vuonna C33A soluissa varmistettiin fluoresenssimikroskopialla (Fig. 1a). Myöhemmin 5 x 10

6 C33A-RFP solut olivat ihon alle (s.c.) istutetaan oikeaan kylkeen nude-hiirten. Joka viikko jopa 49 vuorokauden kuluttua implantaation kuudesta seitsemään C33A-RFP tuumoreita kantavaa hiirtä tutkittiin. Osana näiden analyysien määriä kasvaimia, lannerangan (LN1, LN2) ja munuaisten (RN1, RN2) imusolmukkeet mitattiin (Fig. 1 b + c) ja fluoresenssin kuvantamisen kasvaimia ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa suoritettiin (Fig. 1 d) . Osoitimme vakaata kasvua kasvaimen tilavuuden viikosta jälkeen kiinnittymisestä C33A-RFP soluissa. Samalla, volyymit lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet kasvaa sekä, viittaa mahdolliseen kasvainsolun kolonisaatio prosessi, jonka tuloksena imusolmuke tilavuuden laajeneminen. Fluoresenssikuvantamiseen vahvisti RFP signaalia laajentuneessa imusolmukkeet, mikä osoittaa C33A-RFP etäpesäkkeitä. Erityisesti tilavuus LN1, lannerangan imusolmuke sijaitsee lähimpänä ensisijainen C33A-RFP kasvain, oli yhä ensimmäinen ja suurin, kuten voisi odottaa alueelliseen imusolmukemetastaaseja.

Kasvaimet ja imusolmukkeiden kuudesta seitsemän hiirtä aikapistettä kohti analysoitiin (7 ja 21 dpti: n = 7, 14, 28, 35 ja 49 dpti: n = 6). Bright kenttä (BF), RFP ja päällystä kuvia C33A-RFP soluja, Mittakaavapalkki edustaa 100 um. b aika käyrä C33A-RFP kasvaimen kasvua. c tilavuus lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet ajan. d Edustavia kuvia kasvainten (ylärivi) ja vastaavat imusolmukkeiden (alarivi) ja C33A-RFP kasvainta kantavissa hiirissä on osoitettu päivän kuluttua kasvainsolun istutuksen. Kuviin kasvaimista (T) otettiin elävien hiirten avulla Maestro EX Imaging System. Kuvantaminen lannerangan (LN1, LN2) ja munuaisten (RN1, RN2) imusolmukemetastaaseja vatsan tuumoreita kantavien hiirten tehtiin

post mortem

, avaamisen jälkeen vatsa ja elimien. Mittaviivat edustaa 2 mm. e Osuus kaikista imusolmukkeiden positiivinen RFP ajan. f Prosenttiosuus LN1, LN2, RN1 ja RN2 vastaavasti positiivinen RFP aikapistettä kohti.

Lisäksi fluoresenssikuvantamisella aikana kurssin 49 päivää paljasti tasainen kasvu määrän imusolmukkeiden positiivinen RFP kasvainsolujen istutuksen, alkaen 21%: RFP positiivisia imusolmukkeita 7. päivänä määrä nousi 88%: imusolmukkeiden positiivinen RFP ilmaisun lopussa kokeen (Fig. 1 e). Lisäksi prosenttiosuus RFP positiivinen LN1, LN2, RN1 ja RN2 analysoitiin aikapistettä kohti. Päivänä 7 post istutusta 86% kaikkien havaittujen LN1s olivat positiivisia RFP, kun taas mitään RFP signaali oli havaittavissa LN2, RN1 tai RN2 johtaa oletukseen, että metastaattinen bakteerikannasta C33A-RFP soluissa tapahtuu ensin alueelliseen imusolmuke LN1. Neljätoista vuorokautta kasvainsolujen istutuksen (dpti) kaikki havaitut LN1s (100%) ja 50% RN1s oli positiivinen RFP, mikä osoittaa, että sen jälkeen kun metastasizing sen LN1 C33A-RFP solujen levinnyt seuraavaan paikallisen imusolmukkeen (munuaisten imusolmuke RN1) . Metastasized C33A-RFP solujen LN2 ja RN2 ensin havaittiin päivänä 28 post istutusta (Kuva. 1f). Yhdessä osoitimme jatkuvaa etenemistä etäpesäke lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet, joina sekä C33A-RFP kasvaimen kasvua viikosta toiseen kuluttua s.c. kasvainsolun istutuksen.

C33A-RFP kasvainsoluja etäispesäkkeitä kautta sekä imusuonten ja hematogenous reitit

Aikana mikroskooppisia tutkimuksia havaitsimme läsnäolo C33A-RFP solujen imusuonten yhdistää lannerangan ja munuaisten imusolmukemetastaaseja in C33A-RFP on kasvain, mikä osoittaa lymphatics koska reitti toissijainen etäpesäkkeiden tässä mallissa (Fig. 2a, b) .Lisäksi verenkierrossa C33A-RFP soluja havaittiin myös punasolujen sisältävä verisuonten vieressä että LN-RN-yhdistävät imusuonten, mikä hematogenous reitin metastaattisen kasvainsolujen vaeltamista (Fig. 2c). Erityisesti fluoresenssikuvantamiseen paljasti RFP signaalia keuhkot C33A-RFP on kasvain, joka yleensä on ensimmäinen elin saada metastasized tapauksessa metastaaseja kautta hematogenous reittiä. Jopa päivä 28 kasvainten soluistutusryhmä ei keuhkojen todettiin positiiviseksi RFP, kun taas vuorokautena 35 kolme kuudesta ja päivänä 49 viisi kuudesta keuhkot positiivisiksi RFP paikkoja (Kuva. 2d).

muuttoliike C33A-RFP solujen lymph aluksen yhdistää LN1 ja RN1 42 dpti. Mittaviivat edustaa 2 mm. b Lyve-1-värjäys 100 um poikkileikkauksia välisen osan LN1 ja RN1. Mittaviivat edustaa 200 um. c Migration of C33A-RFP solujen imusolmukkeiden (täytetty nuolenkärki) ja käytettäessä punasolujen sisältävän verisuoni (avoin nuolenkärki) 32 dpti. Scale pylväät edustavat 2 mm (vasen) ja 500 um (oikealla). d RFP signaaleja keuhkot C33A-RFP on kasvain. Yllä: edustaja kuva keuhko 42 dpti. Mittakaava on 2 mm. Alla: prosenttiosuus keuhkot positiivisiksi RFP paikkoja ajan. Keuhkot kuudesta seitsemään hiirtä aikapistettä kohti tutkittiin (7 ja 21 dpti: n = 7, 14, 28, 35 ja 49 dpti: n = 6).

Yhteenvetona selvästi osoittaneet että C33A-RFP solut käyttävät imusuonten sekä hematogenous reitit metastaattisen leviäminen sc implantoitu kasvain nude-hiirissä.

Lisäksi havaitsimme kertyminen RFP signaalin näiden hiirten munuaisiin fluoresenssin kuvantamisen aikana kuluessa 49 päivä (Fig. 3). Histologinen analyysi kasvaimia, LNS ja RNS kasvaimen kantavien hiirten 31 dpti paljasti järjestäytynyt rakenne RFP ilmentävien C33A solujen kasvaimia ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa, joka ei ole totta RFP munuaisiin (Fig. 4a). Lisäksi osoitimme, että munuaisten RFP signaalia sijaitsivat pääasiassa aivokuoren ja CD31 merkitty verisuonten ydin ja lantion munuaiset (Fig. 4b). Kuvia munuaiskuoressa kanssa suurennettuna paljasti RFP kertymistä nephrons, jolloin RFP näytti sijaita solun itsenäisesti spot-kuvioita (Fig. 4c). Ei micrometastases havaittu munuaisissa. Siksi oletetaan, että voimakas RFP signaalia munuaisissa C33A-RFP on kasvain saattaa johtua laskeuma RFP munuaisten cortex, kun veren suodatuksen nephrons. Toisin kuin mitä havaittiin munuaisissa, mikrometastaasien havaittiin keuhkoissa C33A-RFP kasvainta kantavissa hiirissä 42 dpti (Fig. 4d vasemmalla). Lisäksi yhden C33A-RFP soluja havaittiin verisuonten keuhkojen sekä RFP fragmentteja samanlaisia ​​kuin havaittiin munuaisen kuoresta munuaiset (Fig. 4d oikealla).

Kuudesta seitsemään hiiret analysoitiin kohti ajankohtana (7 ja 21 dpti: n = 7; 14, 28 ja 35 dpti: n = 6). Edustavan kuvia RFP signaalin munuaisissa. Ylärivi: overlay kirkkaita kentän ja RFP kuvia. Alarivi: kuvia RFP signaalia. Mittaviivat edustaa 2 mm. b Mean fluoresenssin voimakkuus RFP signaalin munuaisissa C33A-RFP kasvainta kantavien hiirten ajan.

ytimien a, b ja c värjättiin Hoechst väriainetta. Peittokuvat kirkkaan kentän, RFP ja Hoechst kuvia 10 um osien kasvain, LN, RN ja munuaisissa 31 dpti. Mittaviivat edustaa 50 um. b Kuvia 100 pm osien munuaisen 31 dpti, värjättiin anti-CD31-vasta-aineen ja Hoechst väriainetta. Mittakaava on 2 mm. c 10 pm munuaisleikettä Hoechstilla väriainetta. Oikea: konfokaali kuva. Mittaviivat edustavat 100 um (vasemmalla) ja 10 um (oikealla). d CD31 ja Hoechst värjäys 100 pm keuhkoleikkeissä 42 dpti. Täytetty nuolenkärki: in verisuoneen muuttavia C33A-RFP solu; tyhjä nuolenkärki: RFP positiivinen palasia. Mittaviivat edustavat 250 um (vasemmalla) ja 50 um (oikealla). Kaikki kuvat ovat edustavia esimerkkejä.

Yhdessä histologiset analyysit osoittivat, että, järjestäytynyt rakenne RFP ilmentävien C33A oleviin soluihin ja imusolmukemetastaaseja, kun taas RFP signaalia munuaisissa näytti olevan pääasiassa seurausta proteiinin kertymistä eikä vain etäpesäkkeitä RFP positiivisia kasvainsoluja. RFP signaalia keuhkoissa näytti johtuvan molemmat, etäpesäkkeitä ja asettui C33A-RFP solujen ja RFP laskeuman.

Detection elinkelpoisten C33A-RFP oleviin soluihin, LNS, RNS, keuhkot ja munuaiset kasvainta kantavien hiirten

tutkia tarkemmin, ovatko RFP signaalia kasvaimissa, LNS, RNS, keuhkoista ja munuaisista C33A-RFP kasvain hiirille johtui elinkelpoisia C33A soluista, yksisolususpensioita näiden kudosten 5 hiiren 49 dpti valmistettiin ja FACS: lla analysoituna. Olemme havainneet, että 83% soluista kasvainsolun suspensiot olivat positiivisia RFP, 42% LN, 32% RN, 11% keuhkoissa ja 18% munuaisten suspensioita (Fig. 5a). Näin ollen, RFP positiivisia kasvainsoluja oli havaittavissa kaikissa analysoitiin kudoksissa C33A-RFP kasvainta kantavien hiirten.

Kudokset kaikki 5 hiirtä tutkittiin (n = 5). määrä RFP positiivisen (RFP +) ja negatiivinen (RFP-) solujen yksisolususpensioita kasvain, LN, RN, keuhkojen ja munuaisten. 10000 tapahtumaa analysoitiin FACS. b kasvu eri laimennoksia (10

-1-10

-4) ja C33A-RFP yksisolususpensioita kuopissa 24 kuopan levyille viikon kuluttua blastisidiinia valinnan. Vasen kuva: mediakulutuksesta kuopissa, jotka sisälsivät 2 päivää vanha media. Oikealla: kaivot värjäyksen jälkeen kristallivioletilla. c Numbers pesäkkeitä muodostavien C33A-RFP solua grammaa kohti kasvain, LN, RN, keuhkojen ja munuaisten, vastaavasti. Cell pesäkkeet laskettiin kunkin elimen jälkeen blastisidiini-valinnan ja kristallivioletti värjäystä.

määrittää, kuinka moni näistä RFP positiiviset solut olivat todellakin elinkelpoisia tuumorisoluja, teimme blastisidiinia valinnan määritys. Viikon kuluttua blastisidiinia valinnan mediakulutuksesta (osoitettu muuttamalla väri fenolipunaista punaisesta keltaiseksi) korreloi elinkykyisten solujen määrä (Fig. 5b, vasemmalla). Kristallivioletti värjäys osoitti lisäksi, että kasvain, LN ja RN suspensiot sisälsivät enemmän elinkelpoisia C33A-RFP soluja kuin keuhkojen ja munuaisten suspensioita (Fig. 5b, oikea). Vain muutama positiivinen C33A-RFP solujen pesäkkeitä havaittiin kuopissa keuhkojen ja munuaisten keskeytykset 10

-1 laimennoksia, kun taas RFP positiivisia soluja havaittiin kaikissa laimennoksia kasvain, LN ja RN keskeytykset.

Tämän jälkeen värjättiin C33A-RFP solun pesäkkeet laskettiin, että sopivia laimennoksia ja pesäkkeitä muodostavien C33A-RFP solua per gramma kudosta määritettiin kasvainten, etäpesäkkeiden ja elimiä. Kävi ilmi, että 8,6 × 10

6 (± 2,9 x 10

6) pesäkkeitä muodostavien C33A-RFP soluja havaittiin grammaa kohti kasvainkudoksen, 1,7 x 10

7 (± 5,9 x 10

6 ) in LN ja 1,5 × 10

7 (± 1,7 x 10

7) in RN. Vastakohtana tälle vain 4,8 × 10

3 (± 9,7 x 10

3) pesäkkeitä muodostavien C33A-RFP soluja havaittiin keuhkoissa ja 8,1 × 10

3 (± 1,7 x 10

4) munuaisiin (Fig. 5c).

Niinpä osoitti huomattavasti alempi määrä elinkelpoisia C33A-RFP solujen keuhkoihin ja munuaisiin kuin kasvaimia ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa kasvaimen kantavien hiirten, paljastaa, että C33A-RFP metastaasit muodostuminen tapahtuu pääasiassa kautta imusuonten reittiä.

torjunta etäpesäkkeitä C33A-RFP malli

Kerran metastaattinen leviäminen C33A-RFP soluja nude-hiirissä jälkeen sc istuttaminen kasvainsolujen leimasi ryhdyimme analysoimaan mahdollisuutta onkolyyttisten virotherapy uutena hoitovaihtoehto C33A-RFP kasvaimia ja etäpesäkkeitä. Viime aikoina on osoitettu, että onkolyyttisten vaccinia-virus GLV-1h68 on tehokas aine taistelussa hematogenous sekä imusuonten etäpesäkkeitä ihmisen eturauhassyövän malli PC-3 [22], [27]. Tämän perusteella GLV-1h68 näyttää olevan lupaava ehdokas hävittämiseksi C33A-RFP etäpesäkkeitä. Aluksi, 12 C33A-RFP kasvain hiiriin injektoitiin 11 dpti 5 x 10

6 plakkia muodostavaa yksikköä (pfu) GLV-1h68 tai PBS: ää kontrollina, vastaavasti. Jo 14 päivän kuluttua virus /PBS injektio (dpi) kasvaimen tilavuus GLV-1h68 hoidetussa ryhmässä alkoi laskea. 18 dpi tilastolliseen merkittävä väheneminen C33A-RFP kasvainten saavutettiin koska virus hoitoon verrattuna PBS: llä käsiteltyihin ohjaus kasvaimia (Fig. 6a). Kasvaintilavuudet pienennetään alkuperäisestä koosta. Histologinen analyysit viruksen käsiteltyjen ja kontrollien tuumoreiden 21 dpi paljasti massiivinen leviäminen GLV-1h68 kasvaimissa viruksen ryhmä, joka liittyy alemman fluoresenssin intensiteetti RFP ja Hoechst, mikä osoittaa viruksen välittämän, voimakas nekroosi kasvainkudoksen (Fig. 6b ). Lisäksi määriä lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet PBS-ryhmässä olivat huomattavasti korkeammat verrattuna kuin viruksen hoidetussa ryhmässä 21 dpi, mikä osoittaa etäpesäkkeitä estävä vaikutus GLV-1h68 (Fig. 6c). Jatkotutkimuksissa imusolmukkeiden positiivinen C33A-RFP määritettiin fluoresenssimikroskopialla. Kävi ilmi, että 16 ulos 22 imusolmukesuurentumia (72,3%) olivat positiivisia RFP PBS-ryhmässä, kun taas vain 1 ulos 15 imusolmukesuurentumia (6,7%) oli positiivisen RFP että GLV-1h68 käsitelty ryhmä ( kuva 6d), mikä osoittaa viruksen välittämä terapeuttinen vaikutus imusolmuke etäpesäke muodostumista. Lisäksi mikroskooppisen analyysit lannerangan imusolmuke etäpesäke kohdat osoittivat, ettei RFP eikä virus koodattu GFP on havaittavissa 21 päivän kuluttua virus injektion. Vastakohtana tälle, vahva RFP signaalia ei havaittu imusolmukkeissa ja PBS: llä käsiteltyihin C33A-RFP kasvain hiirille. Lopulta RFP munuaisissa ja keuhkoissa C33A-RFP syöpäkasvaimia sisältävistä hiiristä analysoitiin mikroskooppisesti ja verrattiin PBS ja viruksen käsiteltyjen ryhmien. Molemmissa tapauksissa huomattavan osan RFP havaittiin koska virus hoitoon (Fig. 6f, g).

Time käyrä C33A-RFP kasvaimen kasvua 12 hiirillä annon jälkeen onkolyyttisten vacciniaviruksen GLV-1h68 ja vastaavasti PBS: llä (n = 6). Analyysit C33A-RFP kasvaimia ja etäpesäkkeitä b-g tehtiin 32 dpti ja 21 päivän ajan hoidon jälkeen GLV-1h68 tai PBS (dpi). Kuusi hiirtä tutkittiin ryhmää kohden (n = 6). b Left: C33A-RFP kasvainta kantavien hiirten 21 dpi. Oikealla: 100 pm osat PBS ja GLV-1h68 kasvaimen. Tumat värjättiin Hoechst väriaine, GFP ilmaistaan ​​GLV-1h68 ja RFP mukaan C33A soluja. c tilavuus lannerangan ja munuaisten imusolmukkeiden ja d prosenttiosuus RFP positiivinen imusolmukkeiden PBS: ssä ja GLV-1h68 käsiteltiin C33A-RFP kasvainta kantavien hiirten (vasen). Oikealla: Kuvia lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet PBS ja GLV-1h68 hoidetuissa hiirissä. e 100 um: n leikkeet PBS (vasemmalla) ja GLV-1h68 (oikealla) käsiteltiin lannerangan imusolmuke etäpesäke. f vasen: Prosenttiosuus munuaiset positiivisia RFP PBS ja GLV-1h68 hoidetuissa hiirissä. Oikealla: Kuvia munuaiset PBS ja virusten ryhmä. g Prosenttiosuus keuhkojen positiivisia RFP PBS ja GLV-1h68 ryhmä. Kaikki kuvat ovat edustavia esimerkkejä. Kaikki mittakaavan pylväät edustavat 2 mm.

Kaiken kaikkiaan olemme osoittaneet tehokasta virus-välitteinen väheneminen kasvaimen koon ja metastaattisen taakan C33A-RFP kasvainta kantavien hiirten 21 dpi.

Keskustelu