Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistamiseksi aggressiivisuus liittyvien molekyylitason mekanismit ja biologisten merkkiaineiden ehdokkaita virtsarakon syövän, teimme SILAC (Stable Isotope Labelling aminohapot soluviljelmissä) proteomiikka analyysi verrataan invasiivisia T24 ja aggressiivinen metastaattisen johdettu T24T virtsarakon syövän solulinja. Kaikkiaan 289 proteiinien tunnistettiin ilmentyvät eri näiden solujen suuri luottamus. Täydentävät ja validointi analyysien kohteita vertaamalla proteiinin SILAC tietojen mRNA ilme suhdeluvut saatu oligonukleotidigeenisirumenetelmää, ja immunoblottauksella. Cul3, joka on ilmentynyt proteiini T24T, mukana ubikinaation ja myöhemmin proteasomaalisten hajoamista kohdeproteiinien, valittiin lisätutkimuksia varten. Toiminnalliset analyysit paljastivat, että Cul3 vaientaminen alentunut proliferatiivisia, muuttoliike ja invasiivisia hinnat T24T soluja, ja palautti ilmentymistä solun tukirangan proteiinien tunnistettiin olevan ali-ilmentynyt in T24T soluissa SILAC, kuten esriinin, moesiini, filamiini tai caveolin. Cul3 immunohistokemiallinen geelikuvioihin suoritetaan rakkokasvaimista täplittäin kudossiruina (n = 284), liittyi tuumorin luokitus, imusolmuke etäpesäke ja tautikohtaista selviytymistä. Siten SILAC lähestymistapa tunnistaa, että Cul3 moduloitu aggressiivinen fenotyyppi T24T solujen muuttamalla ilmaus solun tukirangan proteiinien mukana virtsarakon syöpä aggressiivisuus; ja soitti biomarkkereiden rooli virtsarakon syövän etenemisen, solmukohtien etäpesäkkeitä ja kliinisten tulosten arviointi.

Citation: Grau L, Luque-Garcia JL, González-Peramato P, Theodorescu D, Palou J, Fernandez-Gomez JM, et al. (2013) määrällinen proteomiikan analyysi paljastaa merkitys CUL3 vuonna virtsarakon syövän Aggressiivisuus. PLoS ONE 8 (1): e53328. doi: 10,1371 /journal.pone.0053328

Editor: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 19, 2012; Hyväksytty: 30 marraskuu 2012; Julkaistu: 8. tammikuuta 2013

Copyright: © 2013 Grau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustus (SAF2009-13035) Espanjan opetus- ja kulttuuriministeriö (MS-C.). J.L.L.-G. tukivat ”Ramón y Cajal” ohjelma, ja CTQ2010-18644 avustusta Espanjan ministeriön talous ja kilpailukyky. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä edustaa neljäs yleisin maligniteetti miesten ja 8. yleisin syy miesten syöpäkuolemista [1]. Kliinisesti, noin 75% siirtymäkauden solukarsinoomat (TCC) ovat ei-lihas- invasiivisia (TIS, Ta, ja T1), 20% lihasten soluttautua (T2-T4), ja 5% metastasoitunut aikaan diagnoosi [1]. Heikompilaatuinen kasvaimet ovat papillaarinen ja yleensä ei-invasiivisia, kun taas korkea-asteen kasvaimet voivat olla joko papillaarinen tai ei-papillaarinen, ja usein invasiivisia. Potilaat diagnosoitu paikallinen TCC on 5 vuoden elossaolo yli 90%. Kuitenkin potilailla, joilla on alueellinen ja etäinen metastaattinen sairaus on 5 vuoden elossaolo alle 50% ja 10%, vastaavasti [1]. Virtsarakon syövän etenemisessä seuraa monimutkainen peräkkäiset vaiheet, ei täysin ymmärretä [2] – [4]. Erot aggressiivisuus käyttäytyminen on kuvattu välillä invasiivisen T24 virtsarakon syövän solulinja, ja aggressiivinen T24T muunnos, joka kehittyy etäpesäkkeitä jälkeen häntälaskimoon injektion [5] – [9]. Tunnistaminen ilmentyvät eri proteiinien välillä nämä solut saattavat paljastaa molekyylitason mekanismeja, jotka liittyvät kasvaimen aggressiivisuus in vitro mikä saattaa johtaa etäpesäkkeitä. Proteiinit osallistuvat niin reitit voisivat olla biomarkkereita joko varhaisen tunnistamisen aggressiivista tuloksista ja /tai mahdollisesti olla terapeuttisesti kohdistettavan.

Quantitative proteomiikka edistää löytö ehdokas tautikohtaisia ​​kohde ja biomarkkereita. Vaikka proteiini ja vasta-taulukot sallivat ero kvantifiointiin tunnettujen proteiinien [10], [11], massaspektrometriaa tekniikoita johtaa proteiinien tunnistamiseen [12]. Stabiili isotooppi merkinnät aminohappojen soluviljelmissä (SILAC) kuuluu sellaisen (12) C- ja (13) C-leimattua aminohappoa kasvualustojen erikseen viljellyistä soluista, jotka aiheuttavat solut, jotka sisältävät ”kevyt” tai ”raskas” proteiineja, vastaavasti [12] – [31]. Tietääksemme SILAC ei ole raportoitu virtsarakon syöpään. Täällä, kvantitatiivinen proteomiikka analyysin sovellettiin T24 ja T24T solujen proteiinien tunnistamiseen ja väyliä, jotka liittyvät niiden ero aggressiivisuus seuraavat meidän koe- järjestelyä (kuvio 1).

Funktionaaliset analyysit tehtiin arvioimiseksi ero aggressiivinen fenotyyppi T24 ja T24T virtsarakon syövän solut: A) leviämisen, B) invaasio, ja C) muuttoliike. Keskimääräinen päällekkäisiä kokeita kutakin toiminnallista määritystä näiden solujen useita ajankohtina on edustettuna kussakin paneelissa. D) kaavio, joka esittää työnkulun, jota käytetään multipleksoidun SILAC-pohjainen kokeissa. Sisäinen leimaus suoritettiin

in vitro

proteiini uutteet fraktioitiin SDS-PAGE, pilkottu trypsiinillä geeli, ja tryptisiin digestiot analysoitiin LC-MS /MS sekä tunnistaa ja määrällisesti proteiineja. E) Vertailu proteiinin muutokset tunnistetaan SILAC suoritettiin näiden havaita oligonukleotidisirujen. F) Validointi proteiinin muutokset tunnistetaan SILAC Western blot proteiiniuutteista saatu T24-T24T soluja. G) immunohistokemia kudosmatriisien sisältävien rakkokasvaimista palveli vahvistamaan yhdistysten Tunnistettujen proteiinien kliinis muuttujat virtsarakon syöpään. H) siRNA vaiennettu tunnistettu proteiinien ja myöhemmin toiminta-analyysejä ja immunoblottaus validointi toimi vaikutusten arvioimiseksi Kartoitettujen ehdokkaita aggressiivinen fenotyyppi T24T ja asetus muiden ilmentyvät eri proteiineja tunnistetaan SILAC.

Materiaalit ja menetelmät

1. Funktionaalinen analyysi T24 ja T24T virtsarakon syövän solujen

Soluviljely.

T24 saatiin American Type Culture Collection ja sitä viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [32], [33]. T24T oli peräisin T24 Dr Theodorescu laboratoriossa [5] – [9]. Soluja kasvatettiin 4-6 kohtien ja korjattu 75% -90% konfluenssiin. Solupelletit pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä ja jäädytettiin -20 ° C: ssa ennen RNA: n ja proteiinin uuttamalla.

Proliferaatiomääritys

1.2×10

4 solua kuoppaa kohti ympättiin 96- kuoppaiset levyt kolmena kappaleena DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. Kun on viljelty 24, 48, 72 ja 96 tuntia, proliferaatio mitattiin MTT-määrityksellä (Roche, Mannheim, Saksa).

Haavan paranemista määrityksessä.

3.5×10

5-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, ja haava tehtiin yksikerroksista käyttämällä steriiliä pipetin kärkeä sen jälkeen, kun solut saavuttivat konfluenssin. Valokuvia solujen valtaavat haava otettiin ilmoitettuina aikoina.

invaasiomääritys.

Soluviljely 24-kuoppalevyille insertit (huokoskoko 8 pm, BD Biosciences, San Jose, CA) olivat ympättiin 2.5×10

4 T24 ja T24T soluja, ja myös T24T soluja jälkeen 24 ja 48 tuntia transfektion kanssa Cul3 siRNA (50 nM) 500 ui DMEM 0,1% FBS ylemmässä kammiossa. Medium 10% FBS (500 ui) lisättiin alempaan kammioon kemotaktinen aine. Matrigel invaasio kammiot (BD) ylläpidettiin 24 tuntia kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ilmakehässä. Solut molemmin puolin Matrigel kammion kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan, pestiin PBS: llä, värjättiin 1 ug /ml: lla 4′-6-diamino-2-fenyyli (DAPI: Sigma, St Louis, MO) 10 minuuttia , ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla (Leica TCS-SP5, Wetzlar, Saksa). Lukumäärä tunkeutumaan solujen avulla on arvioitu Imaris ohjelmisto (Bit Plane, Zurich, Sveitsi), arvioimalla prosenttiosuus Invasion: lukumäärä hyökkäävän solua /montako solujen x 100.

Cul3 hiljentäminen.

Cul3 tippuu alas suoritettiin T24T lyhytaikaisella transfektiolla kanssa Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) käyttäen kontrolli (ei-kohdistaminen) pienet häiritsevät kaksijuosteinen RNA (siRNA) ja älykkään altaan siRNA kohdistettu Cul3 (molemmat alkaen Dharmacon, Waltham, MA). Cul3 hiljentäminen transfektantteja alttiiksi 50 nM ja 100Nm kohdennetun siRNA kerättiin 24 ja 48h varten jakaantumiseen, kulkeutumiseen tai invaasio määrityksiä, kuten edellä on kuvattu. Cul3 hiljentäminen vahvistettiin immunoblottauksella.

2. SILAC proteiini profilointi

Soluviljely ja metabolinen leimaus.

T24 ja T24T soluja pidettiin lysiini ja arginiini-köyhdytettyä DMEM (Millipore, Billerica, MA) täydennettynä 10% dialysoitua FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen) ja joko luonnossa esiintyvän isotoopin runsaus ( ”kevyt”) (T24) tai stabiili isotooppi-leimattu ( ”heavy”)

13C

6 lysiiniä ja

13C

6 arginiini aminohapon (Cambridge Isotope Labs, Andover, MA) (T24T). Viljelyalustassa päivittyy välein 2 päivää poistamalla puolet tilavuudesta läsnä kullekin levylle ja korvaamalla se tuoreella alustalla. Soluja kasvatettiin vähintään 6 kahdentumisen sallimaan leimalla varustetun aminohappoja. Kaksi suurta SILAC näytteitä (2 x 10

7 solua kunnossa) tehtiin. Täydellinen sisällyttäminen

13C-Arg ja

13C-Lys osaksi T24 ja T24T solut kuuden solun jakautumisen isotooppisesti raskasväliaine (suora ja käänteinen merkinnät) varmistettiin MS proteiinin sulattaa.

proteiini fraktiointi.

vähentää monimutkaisuutta näytteen ydin- /sytosoliin fraktiointi suoritettiin. Solut lyysattiin lyysipuskurissa (20 mM HEPES, pH 7,0, 10 mM KCI, 2 mM MgCI, 0,5% Nonidet P40, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM PMSF, 0,15 U ml

-1 aprotiniini) ja homogenoitiin 30 iskulla Dounce-homogenisaattorissa. Homogenaatti sentrifugoitiin 1500 g: ssä 5 min sedimenttiin ytimet. Sitten supernatantti resedimented 15000 g: llä 5 minuutin ajan, ja saatu supernatantti muodosti ei-ydin- tai sytosoliin osa. Ydin- Pelletti pestiin kolme kertaa ja suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin, joka sisälsi 0,5 M NaCl: a. Uutettu materiaali sedimentoitiin 15000 g 10 minuutin ajan ja saatu supernatantti nimettiin tumafraktios-.

SDS-PAGE ja geeli ruoansulatusta.

proteiinit soluliman ja ydin- fraktiot erotettiin SDS-PAGE: lla 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Yhteensä 80 ug proteiinia ladattiin kaistaa kohti. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit visualisoitiin Coomassie blue -värjäyksellä ja geeli kaista leikattiin vaakasuunnassa 20 osiin. Leikattiin geelin nauhat leikattiin pieniksi paloiksi ja väri poistettiin 50:50 25 mM ammoniumbikarbonaattia /asetonitriili, kuivattu asetonitriilillä ja kuivataan. Geelipalat rehydratoitiin 30 ui 12,5 ng /ml trypsiini-liuosta 25 mM ammoniumbikarbonaattia ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Peptidit uutettiin käyttäen asetonitriiliä ja 5% muurahaishappoa, kuivattiin vakuumissa sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 15 ul: aan 2% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa. Kaikki näytteet sonikoitiin 10 minuutin ajan, ennen kuin MS-analyysillä.

Nanoflow LC-MS /MS: llä.

peptidin seos geelissä tryptinen digestions (käyttäen 30 ui trypsiiniä 12,5 ng /ml ) analysoitiin käyttäen nanoflow LC-MS /MS: llä. Peptidit ladattiin ansa pylvääseen (Reprosil C

18, 3 um hiukkaskoko, 0,3 x 10 mm, 120 Ä: n huokoskoko, SGE) ja eluoitiin sitten analyyttiseen kolonniin (Acclaim PepMap 100, C

18, 3 um hiukkaskoko, 75 um x 15 cm, 100 Ä: n huokoskoko, Dionex, LC Packings) lineaarisella gradientilla 5-80% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa. Näyte toimittanut yli 120 min nano-LC ultra 1D plus-järjestelmä (Eksigent) noin 200 nl /min virtausnopeutta ruostumatonta terästä nano-reiän päästötason (OD 150 nm, ID 30 pm, Proxeon, Odense, Tanska) . Peptidit skannattu ja hajanaista kanssa LTQ XL lineaarinen ioni ansa massaspektrometriä (Thermo, San Jose, CA) toimi datariippuvainen ZoomScan ja MS /MS vuorottelutila käyttäen kolmea voimakkain esiasteita havaita tutkimuksessa skannaus 400-1600 u (kolme μscans). ZoomScan massa ikkuna asetettiin 12 Da jonka avulla voidaan seurata koko

12C /

13C-isotoopin kirjekuori useimpien kaksinkertaisesti ja kolmasti ladattu peptidejä. Yksin varautuneet ionit suljettiin MS /MS-analyysiä. Normalisoitu törmäys energiaa asetettiin 35% ja dynaaminen syrjäytymisen aikana suorasta 3 min jälkeen, jotta vältetään toistuvia pirstoutuminen ioneja.

Protein tunnistaminen ja kvantitointi.

Generated .raw tiedostot muunnettiin .mgf tiedostoja for MASCOT-tietokannan haku. Tietokanta, joka sisältää NCBInr Homo Sapiens sisältävät sekvenssit 34180 proteiinia merkinnät (Alkaen 03.04.2008) tehtiin haku käyttäen MASCOT ohjelmiston (versio 2.3 Matrix Science) proteiinin tunnistamiseen. Hakuehtoja mukana trypsiini spesifisyys yhdellä jäi pilkkominen sallittua, ja metioniinin hapetus,

13C-Arg ja

13C-Lys kuin muuttuja muutoksia. Vähintään esiaste fragmentti-ionin massa tarkkuus 1,2 ja 0,3 Da, vastaavasti, ja vaatimus vähintään kahden rohkea punainen (ainutlaatuinen peptidejä) proteiinia kohden tarvittiin proteiinin kvantitoimiseksi. Cut-off-arvot MASCOT tulokset peptidien ja proteiinien asetettiin 39 (

p

0,05) ja 46 (

p

0,01), vastaavasti, pitää niitä tarkasti tunnisteiden . Väärien positiivisten määrä laskettiin etsimässä sama spektri vastaan ​​NCBInr Homo Sapiens decoy satunnaistettu tietokantaan. Suhteellinen kvantifiointi suhteet tunnistettu proteiinien laskettiin QuiXoT (versio 1.3.26). SILAC T24T /T24 suhteet määriteltiin voimakkuudet raskaan peptidien (C

13) jaettuna intensiteetin valon peptidien (C

12). Proteiini suhteet saadaan QuiXoT manuaalisesti todennettava kaikkien peptidien. Osa

13C

6-Arg muutettiin

13C

5-Pro ​​johtaa vähenemiseen intensiteetti isotooppileimattua peptidi huippu; Tämä korjattiin kaikki peptidit, jotka sisältävät yhden tai useamman proliinitähteet lisäämällä intensiteetti löytynyt sisältävä peptidi

13C

6-Arg

13C

5-Pro ​​tai

13C

6 Lys

13C

5-Pro ​​intensiteettiä huipun sisältävät ainoastaan ​​

13C

6-Arg tai

13C

6-Lys. Yhdistetty luettelo proteiinien tunnistettiin kaikissa kokeissa kondensoitiin 80% homologia käyttäen ProteinCenter ohjelmistopakettia (Proxeon bioinformatiikan AS, Odense, Tanska) poistamiseksi tarpeeton tunnukset kuten ihmisen ortologiset sekvenssit, tarpeeton tietokannan merkinnät, ja erottaa isoformeja seuratuilla peptidi kattavuus. Solunosasijaintia ja toiminnallisia prosesseja proteiinien tunnistetaan SILAC jaettiin perustuvat biologiseen tietoon saatavana Gene ontologia (GO) merkinnät. Nerokkuus Pathway (IPA) ohjelmistoa käytettiin myös antaa yksityiskohtaista tietoa biologisista verkkoihin [33], [34].

3. Geeniekspressioprofilointi kanssa oligonukleotidisirujen

RNA.

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA), jota seurasi RNeasy puhdistusta. RNA laatu arvioitiin perustuen 260:280 suhteet absorbanssin ja eheys tarkistettiin geelielektroforeesilla käyttämällä 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA) [32], [34].

Gene taulukot.

Täydentävät DNA syntetisoitiin

in vitro

transkription 1,5 ug kokonais-RNA puhdistettiin käyttämällä T7-oligo (dT) Promoottori Primer Assay (Affymetrix, Santa Clara, CA), jotka on merkitty biotinyloitua nukleotidit (Enzo Biochem, Farmingdale, NY), ja hybridisoidaan testata GeneChips (Affymetrix), arvioida näytteen laadun ennen hybridisoitumaan päälle U133A ihmisen GeneChips sisältävät 22283-koettimien, jotka edustavat tunnettuja geenejä ja ilmaisun sekvenssin leimoilla (Affymetrix) [34].

Tietojen analysointi.

skannatut kuvatiedostot oli silmämääräisesti esineitä ja analysoitiin käyttämällä Affymetrix Microarray Suite 5.0 (MAS 5,0). Differentiaalikaavojen arvioitiin käyttämällä signaalia pääasiallisena vastauksena toimenpide uutetaan kunkin geenin jokaista näytteessä määritettynä oletusasetukset MAS 5.0. Korrelaatioita geeni ja proteiinin suhde analysoitiin Kendallin tau testi. Vertailla SILAC ja oligonukleotidisirujen tuloksia, kumulatiivinen todennäköisyys odotettavissa ja havaitut tulokset olivat edustettuina annosalueella differentiaalikaavojen suhteissa.

4. Validation immunoblottauksella

Yhteensä proteiini uutettiin virtsarakon syövän soluista käyttäen RIPA lyysipuskuria ja kvantifioitiin Bradfordin menetelmällä käyttäen BSA: ta standardina (Protein Assay, Bio-Rad, Hercules, CA). Kokonaisproteiinin uutteet (50 ug) sekoitettiin 5 x SDS-näytepuskuria (62,5 mM Tris-HCI [pH 6,8], 2% SDS: ää, 10% glyserolia, 5% β-merkaptoetanolia, 0,005% bromofenolisinistä), ja SDS-PAGE: lla 10 % akryyliamidigeeleillä. Proteiinit siirrettiin sähköllä PVDF kalvoja (Millipore, Bedford, MC) ja aktivointi metanolilla. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä ja 0,1% Tween-20: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden: Annexin2 (39 kDa, hiiri, 1:2000, # 610068 , BD Transduction Laboratories, San Jose, CA USA), Bcas2 (26 kDa, hiiri, 1:6000, # H00010286-M01, Abnova, Heidelberg, Saksa), L-Caldesmon (80 kDa, hiiri, 1:100, # C56520, BD Transduction Laboratories), kalretikuliinin (48 kDa, kani, 1:5000, # C4606, Sigma, St. Louis, MO, USA), Caveolin1 (20-22 kDa, hiiri, 1:100, # C37120, BD Transduction Laboratories) cdc2 (34 kDa, kani, 1:1000, # sc-954, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), CD44 (80 kDa, hiiri, 1:50, # NCL-CD44v3, Novocastra, Wetzlar, Saksa) , Copine3 (38 kDa, kani, 1:100, ystävällisesti toimitti tohtori Piris, joka sijaitsee CNIO, Madrid, Espanja), Cul3 (89 kDa, kani, 1:100, # RB1575PCS, Neomarkers, Fremont, CA, USA) , Cytokeratin18 (48 kDa, hiiri, 1:100, # IF14, Oncogene-Merck, Darmstad, Saksa), DDX21 (87 kDa, kani, 1:3500, # 10528-1-AP, Proteintech, USA), DNMT1 (183 kDa, hiiri, 1:100, # IMG-261, IMGENEX, San Diego, CA, USA), Dynactin p50 (44 kDa: n, hiiren, 1:100, # D74620, BD Transduction Laboratories), Dynamin (hiiri, 97 kDa: n, 1:5000, # D25520, BD Transduction Laboratories,), EGFR (175 kDa, hiiri, 1:100, # GRO1, Oncogene-MERCK), Erzin (80 kDa, hiiri, 1:7000, # E8897, Sigma), filamiini A (250 kDa, hiiri, 1:50, # NCL-FIL, Novocastra, UK), gelsoliini (47 kDa, hiiri, 1:100, # G4896, Sigma), HSP70: n (70 kDa, hiiri, 1:200, # SC-66048, Santa Cruz), Importiini 9 (116 kDa, vuohi, 1:100, sc-103567, Santa Cruz), MCM6 (92 kDa, kani, 1:200, ystävällisesti toimitti tohtori Mendez, joka sijaitsee osoitteessa CNIO, Madrid, Espanja), MAPK-4 (65 kDa, kani, 1:1000, sc-68169, Santa Cruz), moesiini (68-77 kDa, hiiri, 01:50, # MS-727-P0, Neomarkers), MSH6 (152 kDa, hiiri, 1:200, # 610918, BD transduktio Laboratories), Nucleophosmin /B23 (32 kDa, hiiri, 1:5000, # 18-7288, Zymed, SF, CA, USA), NUP133 (133 kDa, hiiri , 1:500, # SC-101290, Santa Cruz), Rab14 (23 kDa, kani, 1:100, # PRO-873, Avivasybio, San Diego, CA), RCC1 (44 kDa, vuohi, 1:300, # SC-1161, Santa Cruz), VDAC (30 kDa, kani, 1:100, # 4866, Cell Signaling, Beverly, MA). Blotit pestiin PBS: ssä ja 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 1 tunti huoneenlämpötilassa: anti-hiiri (1:1000), anti-kani (1:2000) ja anti-vuohi ( 1:2000, kaikki Dako, Glostrup, Tanska). Vasta-aineen sitoutuminen visualisoitiin käyttäen vahvistettua kemiluminesenssireagenssia immunoblottauksella tunnistusjärjestelmä (ECL, GE Healthcare). a-tubuliinin (50 kDa, hiiri, 1:4000, # T5168, Sigma) käytettiin kuormaus- ja normalisoi valvontaa. Immunoblotit skannattiin ja analysoitiin käyttämällä ImageJ1.43u ohjelmistoa (Wayne Rasband, National Institute of Health).

5. Kliininen arviointi ilmaus etäpesäkkeiden liittyvät biomarkkerit

kudosnäytteitä ja mikrosirut.

Seitsemän mittatilaustyönä virtsarakon syöpä kudossiruina rakennettiin vuoden kasvainmerkkiaineet ryhmä kuten kolmena tai quadriplicate ytimet (1,0 mm) ensisijaisen virtsarakon kasvain (n = 284) seuraava satunnaistettuja malleja. Parafinoidut kasvaimia kudoksen array rakentamiseen kerättiin ja käsitellään anonyymisti eettisten ja oikeusturvaa ohjeita koehenkilöillä jälkeen kirjallinen suostumus hyväksynnän ja Institutional Review Board (IRB) hyväksyttyjen käytäntöjen vastaavat tutkimushankkeen SAF2009-13035 osoitteessa yhteistyötahoja: Fundació Puigvert ja Hospital Central de Asturias. Väestötietoja osoitti, että läsnä 251 urosta ja 33 naarasta, joiden keski-ikä 66,0 vuotta (vaihteluväli: 25-81). Kasvain vaihe jakelu oli: pT1 (n = 87), pT2 (n = 121), pT3 (n = 48) ja pT4 (n = 28), ja kasvaimen jakelu oli: huonolaatuisen (n = 58) ja korkea- asteen (n = 226), määritellään mukaan konsensuksen kriteerien [35]. Kaksi näistä kudossiruina lukien joukko 71 lihas-invasiivisia (pT2 +) korkealaatuista TCC rakkokasvaimista tunnettujen imusolmuke metastasoituneen tila (N0 = 37, N + = 34). Ennusteeseen viittaavia ja selityksin seurannan sallittuja tietoja yhteenliittymien Cul3 kanssa histopatologia ja lopputulokseen.

immunohistokemia.

Proteiinin ilmentymistä Cul3 arvioitiin immunohistokemia kudossiruina käyttämällä avidiini-biotiini immunoperoksidaasilla menettelyjä. Antigeeni haku (0,01% sitruunahappoa 15 minuuttia mikroaalloilla) käytettiin ennen inkubointia yön yli 4 ° C: n Cul3 kanin vasta-ainetta, joita käytetään immunoblottauksessa (1:300 laimennus). Vasta-aineen sitoutuminen detektoitiin biotinyloidulla vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1:1000, Vector Laboratories). Koska ensisijainen vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. Kives käytettiin positiivisena kontrollina. Diaminobentsidiiniä oli käytössä lopullisen kromogeeni ja hematoksyliinillä kuin ydin- vastavärinä [32] – [34].

Tilastollinen analyysi.

Keinot havainnot kaksi riippumatonta tarkkailijaa kaikista ydintä kustakin kasvainnäyte puettu käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Associations of Cul3 ilmaisun immuunihistokemiallisesti histopatologinen vaiheessa ja kasvaimen arvioitiin käyttämällä ei-parametrinen Wilcoxonin-Mann-Whitneyn ja Kruskall-Wallis testit [36]. Cul3 ilmentyminen arvioitiin jatkuvana muuttujana, joka perustuu solujen määrä proteiinia ekspressoivien tumassa. Intensiteetti värjäyksen luokiteltiin negatiivinen (-) ja matala (+), keskitason (++) ja korkea (+++). Sen lisäksi, että solunsisäinen sijainti, se arvioitiin myös, onko proteiini oli läsnä tai ei soluväliaineen ympäröivän neoplastisia soluja. Cul3 cut-off tasoa ennustetekijöiden arviointi valittiin perusteella mediaani ilmaisun arvojen joukossa ryhmien alle analyysejä. Association of Cul3 tiettyyn tautiin eloonjäämistä arvioitiin käyttämällä log-rank testi tapauksissa käytettävissä seurantaan. Tautikohtaiset elinaika määriteltiin kuukauden kuluttua siitä höyläysleikkaus tai cystectomy ja kuoleman seurauksena tauti (tai viimeinen seurannan päivämäärä). Potilaat elossa viimeisessä seurannassa tai kadonnut seurata sensuroitiin. Survival käyrät piirrettiin käyttämällä Kaplan-Meier metodologia [36]. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS tilastollista pakettia (versio 17.0).

Tulokset

Toiminnalliset analyysit

in vitro

Useat aggressiivisuus näkökohtia T24-T24T soluissa alun perin analysoitiin. T24T oli merkittäviä korkeampi lisääntymistä hinnat kuin T24 neljässä ajankohtina tutkittu (p 0,05, kuvio 1A). Invasion analyysit osoittivat, että T24 olivat keskimäärin 50% vähemmän invasiivisia kuin T24T solut 48h (kuvio 1 B). Haavan paranemista analyysit paljastivat huomattavasti nopeamman siirtymisen hinnan T24T (kuvio 1 C). I

n vitro

määrityksiä ehdotti, että T24T soluja oli enemmän aggressiivista fenotyyppejä.

Muutokset proteiinia runsaasti välillä T24 ja T24T soluihin käyttäen SILAC

Yhteensä 1830 proteiinien tunnistettiin kaksi SILAC kokeita, joista 831 oli samanaikaisesti tunnistettiin molemmissa rinnakkaisissa ja syötti perusteiden proteiinin kvantitoimiseksi. Yleinen väärä löytö oli 2,1% on arvioitu useissa osumia vastaan ​​päinvastaisessa järjestyksessä /yhteensä osumia (p 0,01). Keskimääräinen suhteellinen keskihajonta (SD), joka saadaan laskemalla saatu toistojen oli 0,24, mikä osoittaa hyvää välisen kokeissa.

Mitä SILAC suhteet jakelu, useimmat proteiinit tunnistettu olivat sisällä SILAC suhde välillä 1,5 ja 0,67, odotetusti, kun analysoidaan läheisesti solulinjoja on 01:01 proteiinin seos (kuvio 2A). Käyttäen 1,5 kynnyksen suhteen, 289-proteiinit ilmentyvät differentiaalisesti kahden solulinjojen, joista 88 oli runsaampaa T24T. Niistä 289 ilmentyvät eri proteiineja (taulukko S1), taulukko 1 sisältää proteiinit aiemmin liittyvät virtsarakon syövän etäpesäkkeitä, ja näistä vahvistetuista immunoblottauksella. Täydellinen luettelo proteiinien tunnistettiin molemmissa näytteitä (n = 831) käyttäen SILAC on taulukossa S2.

Proteiinit lajiteltiin ja piirrettiin mukaan SILAC suhde. Odotetusti 01:01 seosta, useimmat proteiinit osoitti SILAC suhde sisällä 1,5 ja 0,67 cutoffs. Luokittelu proteiinien tunnistaa perustuen niiden toiminnallinen merkinnät käyttämällä Gene ontologia: B) Molecular toiminto, C) Biologiset prosessit ja D) Cellular komponentteja. Nämä analyysit suoritettiin 289-proteiinien havaittiin ilmentyä erilailla. Kun useampi kuin yksi tehtävä oli käytettävissä tietyn proteiinin, kaikki toiminnalliset merkinnät otettiin huomioon analyyseissä. Nämä luokitukset olivat tarpeettomia (yli 100%) proteiineista voitaisiin selityksin useammassa kuin yhdessä tehtävä.

toiminnallinen luokittelu proteiinien tunnistettu

toiminnallinen merkinnästä 289 ilmennetty eri proteiinien T24 ja T24T solut määritettiin alunperin käyttäen Protein Centerin ohjelmisto. Kolme päätyyppiä merkintöjä saatiin GO konsortio verkkosivuilla: solukomponenttien, molekyyli- toimintoja, ja biologisia prosesseja (kuvio 2B, C, D). GOslim lähestymistapa erityisesti määritelty ProteinCenter vähensi useita GO merkintöjä hallittavissa joukko noin 20 korkean tason termejä, joita käytettiin suodattaa tiedot prosenttiosuus arvioita. Merkittävän molekulaarisen toiminnot sisältyvät proteiineihin (78%) tai katalyyttinen aktiivisuus (67%). Aineenvaihduntaan (84%) ja solujen organisaatio ja biogeneesin (54%) oli tiivistä biologisiin prosesseihin. Proteiini merkintä jakelu tukenut

in vitro

funktionaalisia määrityksiä edellä kuvatun yhdistää solujen uudelleenjärjestely muuttoliikkeeseen ja invaasiota fenotyypit (kuvio 1). Suuri määrä proteiineja paikantuvat sytoplasmaan (87%) havaittiin verrattuna ytimeen (48%). Tämä havainto sai meidät keskittymään proteiineja, jotka voisi olla merkittävä tehtävä solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä ja aggressiivinen fenotyypin T24T.

vertailu geenin ja proteiinin ilmentyminen suhdeluvut

SILAC proteiinin ilmentymisen suhteita verrattiin mRNA: n ilmentymisen tarjoamat oligonukleotidigeenisirumenetelmää ehdokkaiden tunnistaa molemmat menetelmät (n = 438) (taulukko 1, taulukko S3). Positiivinen korrelaatiokerroin (Kendalls tau) on 0,206 (p 0,0005) saatiin (kuvio S1A). Tärkeää on, että mediaani SILAC proteiinin ilmentymisen suhde oli 0,98 nämä ehdokkaat (vaihteluväli: +0,16-9,44), joka oli samanlainen kuin mediaani 1,02 havaittu oligonukleotidisirujen (vaihteluväli: +0,01-+100,80). Ilman kaksi harha havaita Molemmissa menetelmissä lisäsi korrelaatiokerroin on 0,210 (p 0,0005, N = 438: Kuva S1B). Tulkita erot odotetun ja havaitun väliset korrelaatiot RNA: n ja proteiinin ilmentyminen, kumulatiivinen todennäköisyys havaittu suhteen erilainen ekspressio edusti vastaan ​​odotettu suhde sekä tekniikoita (kuvio S1C, D). Luvut korosti laajemman valikoimia differentiaalikaavojen havaittu oligonukleotidisirujen verrattuna samaan ehdokkaita SILAC analyysejä.

validointi SILAC tunnistettu ehdokkaita käyttämällä immunoblottauksella

Validoida SILAC ilmentymisen suhde proteiinien tunnistettu sekä rinnakkaisnäytteiden immunoblottaus suoritettiin (kuvio 3). Lisääntynyt ilmentyminen T24T havaittiin gelsoliini, Cul3, importins, nucleoporins ja EGFR, ja vähentynyttä ilmentymistä todettiin esriinin, moesiini, filamiini, caveolin tai CD44, mm. Immunoblotit kvantifioitiin korreloivan ilmentymisen suhdeluvut saadaan SILAC ja geenien rakenteet. Perustuu hyvä sopimus Näiden havaintojen Cul3, proteiinin tiedetään osallistuvan ubikinaation ja myöhemmän hajoamisen kohdeproteiinien, se valittiin jatkotutkimuksiin: a) arvioida sen kliinistä merkitystä biomarkkerina ehdokas arvioida aggressiivinen kliininen käytös ja b) arvioida Cul3 vaikutusta aggressiiviseen fenotyypin T24T ja moduloi muita differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien tunnistetaan SILAC. Kuva S2 osoitti ylimääräisen immunopilkkujen ehdokkaiden differentiaalisesti ilmaistut T24T solujen oligonukleotidisirujen jotka eivät kvantitoitiin SILAC, ja

päinvastoin

, jolle vasta-aineita oli saatavilla. Emme havainneet suuria eroja kokeellinen molekyylipaino verrattuna ennustetun kokoisia.

(A) validointi SILAC tulokset valittujen proteiinien immunoblot-proteiinin otteet virtsarakon syövän solujen analysoitiin. Tulokset vahvisti ekspressiotasot proteiinien tunnistetaan proteomic lähestymistapaa, kuten differentiaalisesti ja ei-ilmentyvät differentiaalisesti ehdokkaita. Vasta-aineet näytetään yksi hallitseva vyöhyke odotetun molekyylipainot hyväksyttiin, ja α-tubuliinin, käytettiin lastaus ohjaus. GSN, Gelsoliini; Cul3, Cullin 3; IPO9. Importiini 9; EGFR, epidermaalisen kasvutekijän reseptori; NUP133, Nucleoporin 133; HSP70, Heat Shock Protein 70 kDa; MCM6, minikromosomi huolto Complex Component 6; RCC1, Regulator kromosomista Kondensaatio 1; BCAS2 rintasyöpäpotilailla Amplified Sequence 2; DNM, Dynamin; NPM, Nucleophosmin; DCTN, Dynactin; CALR, kalretikuliini; MAPK, mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi; DDX21, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptidi 21; Cdc2: solunjakautumisen Cycle 2; DNMT1, DNA (sytosiini-5) -Methyltransferase 1; MSH6, MutS Homologi 6; RAB14, GTPaasia Rab14; VDAC, Voltage-Dependent Anion Channel; CK18, sytokeratiinivasta 18; Cald, Caldesmon; CD44, CD44-antigeenin isoformia 1 esiaste 2; EZR, Erzin; MSN, moesiini; ANXA2, anneksiini A2; CPNE3, Copine 3; FLNA, filamiini A;