Krooninen sairaus

tiivistelmä

Prohibitin 1 (PHB1) on erittäin konservoitunut proteiini, joka yhdessä sen homologin prohibitin 2 (PHB2) pääasiassa paikantuu sisempi mitokondrion kalvon. Vaikka se alun perin tunnistettiin sen kyky estää G1 /S etenemiseen ihmisen fibroblasteissa, sen rooli kasvaimia estävä keskustellaan. Määrittää toiminnon prohibitins ylläpitämiseksi solun homeostaasin, me syntyy syöpäsolun jotka ekspressoivat prohibitin-suunnattu shRNAs. Osoitamme, että prohibitin proteiinit ovat välttämättömiä syöpäsolujen lisääntymistä. Down-regulation prohibitin ilmentymisen merkittävästi vähensi solunjakautumisen. Lisäksi mitokondrioiden morfologia ei ollut vaikutusta, mutta menetys prohibitins johtivat hajoamista fuusioproteiinin OPA1 ja joissakin syöpäsolujen linjat, alennettua kyky näytteille kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Nämä syöpäsolut oli myös vähentää adheesiota solunulkoisen matriisin. Yhdessä nämä havainnot viittaavat prohibitins on ratkaiseva merkitys adheesioprosesseja solussa ja siten yllä syöpäsolun leviämistä ja selviytymistä.

Citation: Sievers C, Billig G, Gottschalk K, Rudel T (2010) Prohibitins Are vaaditaan Cancer Cell Proliferation ja Adhesion. PLoS ONE 5 (9): e12735. doi: 10,1371 /journal.pone.0012735

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 06 elokuu 2010; Julkaistu: 14 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Sievers et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoittamalla kuudennessa puiteohjelmassa Euroopan unionin, Project OIKEA (LSHB-CT-2004-005276) TR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Prohibitins (PHB1 ja PHB2) ovat erittäin homologisia proteiineja, jotka ovat konservoituneita läpi evoluution, ja ekspressoituvat [1] – [3]. Prohibitins pääasiassa paikallistaa mitokondriot, mutta esiintyy myös ytimen ja lipidilautoilla sytoplasmisen membraanin [1], [4] – [7]. Lokalisointi lipidilauttoja on myös ominaisuus muiden jäsenten stomatin /prohibitin /flotilin /HflK /C-domeeni (SPFH) perheen proteiineja, [8].

Tähän mennessä tehdyt tutkimukset ovat liittyy PHB1 monipuolista roolit ylläpito solun homeostaasin. Alustava työ ehdotti se toimii estäjä DNA-synteesin, rooli, joka on myöhemmin osoitettu sen 3’UTR [9], [10]. A V-alleelinen ilmentymisen muoto PHB1 liittyi lisääntynyt riski sairastua rintasyöpään [11]; mutta tämä yhdistys ei vahvistettu kliinisessä ympäristössä [12], [13]. PHB1 lokalisoituu transkriptiotekijät E2F perheen tumassa rintasyöpäsoluissa [14], ja on vuorovaikutuksessa Rb tuumorisuppressoriproteiinia pRB tumaan ja estää siten solusyklin [15]. Vastaavasti, siRNA-välitteinen hiljentäminen PHB1 ilmentymisen todettiin lisäävän rintasyöpäsolujen lisääntymistä [16]. Huolimatta näistä merkkejä kasvaimen suppressoriaktiivisuutta, viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet alentunut soluproliferaatiota hävitessä PHB1 ilmaisun hiiren alkion fibroblasteissa ja muut alkusolut; ja pelastus soluproliferaation kun yli-ilmentymisen mitokondrioiden kohdistettujen PHB2 [17].

Viimeaikaisten toimien PHB1 myös tärkeä rooli solujen siirto: Ohimenevä vaiennettu PHB1 siRNA-välitteisen knockdown johti paakkuuntuu fenotyyppiin HeLa-soluissa, joka on verrattavissa Her2 /ErbB2 tai Rac vika eli kokkareista solut osoittivat selvästi kalvon värjäytymistä yleiseurooppalaisen kadheriinin ja β-kateniinin. Kirjoittajat ehdottivat kosketus Solut hajotettiin kasvainsoluissa johtuen menetys PHB1 [6]. Tutkimukset hiiva ovat johdonmukaisesti osoittaneet, että PHB1 ja PHB2 toimivat mitokondrioiden chaperones sisemmässä mitokondrion kalvon [3], [18] – [20]. PHB1 ja PHB2 ovat riippuvaisia ​​toisistaan ​​proteiinitasolla ja menetettyään yhden samanaikaisesti johtaa menetys muiden [21]. Ne ovat vuorovaikutuksessa mitokondrioiden proteaasien, erityisesti mAAA, jota tarvitaan kokoonpanoon Hengitysketjun komplekseja [22], [23]. Tyhjennyssäiliö pois prohibitins hiivassa vähenivät näin replikatiivista elinikä ja vika mitokondrion kalvon potentiaalia [18], [24]. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoitettu mitokondrioiden toimintaa prohibitins ihmisen solulinjoissa: n yli-ilmentyminen PHB1 havaittiin suojata oksidatiivista stressiä vastaan ​​[25]; Lisäksi siRNA-välitteisen knockdovvn PHB2 johti hajoamisen mitokondrion fuusioproteiinin OPA1 [17] ja sirpaloituminen mitokondrioiden verkon [21]. On kuitenkin vielä epäselvää prohibitin ilmaus stabiloi mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) [17], [26], [27].

Tässä näytämme prohibitins olla rooli ylläpitää solujen homoeostasis ja proliferaation syöpäsolut ja ensiöparit. Ehtyminen prohibitins ollut merkittävää vaikutusta mitokondrioiden toimintaan mutta ei vaikuta solujen tarttuminen soluväliaineen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

HEK293 ja HeLa-solut saatiin Saksan kerääminen mikro-organismien ja Cell Cultures (DSMZ). HT1080wt, Jurkat ja Capani-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC). IF6 solut lahjana U. Rapp, Würzburg. HeLa-solut testattiin ja todistaa oikeaksi DSMZ kautta STR-sormenjälkien. HEK293-solut ja HT1080wt soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FCS: ää, 1% penisilliini /streptomysiini, 10 mM HEPES, pH 7,4, ja 4 mM L-glutamiini. HeLa-soluja, IF6 solut ja Jurkat-soluja viljeltiin RPMI 10% FCS, 1% penisilliini /streptomysiiniä. HT29-soluja viljeltiin McCoyn elatusainetta, johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä. Capan I-soluja viljeltiin RPMI 20% FCS: ää ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä. Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO2.

Generation of shRNA pudotus solulinjojen

shRNA-ilmentävät vektorit rakennettiin kloonaamalla eri shRNAs osaksi pLL3.7 tai pLVTHM vektori. Tuottaa indusoitavissa vektorin järjestelmä, shRNAs päässä konstitutiivista ilmentämistä järjestelmän pLVTHM subkloonattiin indusoituva vektori järjestelmän pLVPT, siirtämällä kasetti, joka sisälsi shRNA ja H1-promoottorin kautta Xhol /Xbal-restriktiokohtien. Kaikki rakenteet varmistettiin sekvensoimalla. Nukleotidisekvenssit shRNA tavoitteet käyttää, ovat seuraavat: shLuci, 5′-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ’; PHB1-0, 5’GCGGAGAGAGCCAGATTTG-3 ’; PHB1-3, 5’-GACACATCTGACCTTCGGGAA-3 ’; ja PHB2-0, 5’-GACAGAGAGGGCCAAGGAC-3 ’. Pysyvästi transdusoitu, konstitutiivisia tai indusoituvia Knockdown solulinjoja muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]; katso myös https://tronolab.epfl.ch/). Lyhyesti, HeLa-solut transdusoitiin vastaavien lentivirusvektori läsnä ollessa Polybrene (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Sillä transduktion pLVPT lentivirusvektorien, shRNA ilmentyminen indusoitiin käsittelemällä 1 ug /ml doksisykliiniä (Sigma) 3 päivää ja solut lajitellaan eGFP ilmentymisen kanssa MoFlo® -virtaussytometrillä (Dako Denmark A /S, Glostrup, Tanska) . Validointiin pudotus tasoilla, RNA eristettiin käyttäen RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin QuantiTect SYBR Green real-time PCR Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Kaikki vektorit saatiin D. Trono, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Ranska.

Soft agar määritys

Solut (2 x 10

3) ympättiin 0,3% matalassa lämpötilassa sulavassa agaroosia (Sigma) DMEM: ssa, jota oli täydennetty 10% FCS: ää, ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun 2-4 viikkoa inkuboinnin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

solun proliferaation ja solusyklin analyysi

CFSE värjäystä, solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: ssä, värjättiin sitten 5 uM CFSE 5 minuuttia huoneenlämmössä (RT). Jäljelle jäänyt CFSE poistettiin pesemällä kahdesti PBS: llä ja solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja kasvatettiin solujen elatusaineeseen. CFSE fluoresenssi-intensiteetti mitattiin FACS-analyysillä 24 tunnin välein 5 päivän ajan. BrdU analyysit suoritettiin käyttäen

Cell Proliferation ELISA, BrdU (kemiluminesenssi) B kit (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut siirrostettiin 3,5 x 10

3 valkoinen reunat 96-kuoppaiselle levylle. BrdU lisättiin loppukonsentraatioon 10 uM 1 tunnin ajan. Peroksidaasiin konjugoitu anti-BrdU-vasta-ainetta lisättiin soluihin 30-60 min RT: ssä ja luminesenssi mitattiin sen jälkeen, kun inkubointi 3-10 min käyttäen Monolight 3096 mikrolevyn luminometrillä (BD Bioscience).

TMRE värjäys

analysoimiseksi mitokondrion kalvon potentiaalia, 100 nM TMRE lisättiin elatusaineeseen ja soluja inkuboitiin edelleen 30 minuutin ajan normaaleissa viljelyolosuhteissa. Inkorporaatio mitattiin FACS. Kontrolloida täydellinen menetys kalvon potentiaalia, 1 uM CCCP lisättiin 5 minuuttia.

ATP-tasot

Cellular ATP synteesi mitattiin käyttämällä ATP

bioluminisenssimääritys Kit HSII

(ROCHE) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 10

5-10

7 solua /25 ui per kuoppa 96-kuoppaisen levyn lyysattiin sama tilavuus solun hajotusreagenssi inkuboimalla 5 minuuttia huoneenlämpötilassa. Viisikymmentä mikrolitraa saatetun lusiferaasin reagenssia lisättiin hyvin automaattisilla injektiona (BD Bioscience, Monolight luminometria). Mittaukset (kesto 2 sekuntia) jälkeen otettiin 1 sekunnin viiveen jälkeen.

Western blotting

Solut hajotettiin 2 x näytepuskuria, joka sisälsi 200 mM DTT: tä ja proteiinit erotettiin käyttämällä 10% SDS- SIVU. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin sähköllä päälle polyvinylideenifluoridi mikrohuokoisen kalvon ja immunologisesti käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​OPA1 (BD Biosciences), PHB1 ja PHB2 (Neomarkers) ja Actin (Sigma). OPA1 pirstoutuminen kvantitoitiin käyttäen AIDA-ohjelmisto.

immunofluoresenssi

Soluja kasvatettiin peitinlasit kiinnitettiin 4% paraformadehyde 30 min RT: ssa, ja sitten läpäiseviksi 0,5% Triton X-100. Seuraavaksi solut immunovärjättiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: hiiren anti-Tom20 (BD Biosciences) (1:100 laimennus, 2 h RT), hiiren anti-paksilliini-1 (BD Transduction) (1:100), phalloidin-Alexa 488 ( Mobitec) (1:200) ja aasin anti-hiiri, Cy ™ 3 (1:100). Kvantifiointi mitokondrioiden verkon tehtiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Transmissioelektronimikroskopia

Solut tyhjentynyt prohibitins indusoimalla shRNA ilmaisun 10 päivän fiksoitiin 2,5% glutaraldehydi, jälkikiinnitettiin 0,5% osmiumtetroksidilla ja vertasi käyttäen parkkihappo ja uranyyliasetaatilla. Näytteet dehydratoidaan arvostellaan etanolisarjassa ja upotettu Polybed. Ultraohuet leikkeet analysoitiin leo 906E transmissioelektronimikroskoopin (Leo GmbH).

adheesiomäärityksellä

Mittaa solujen adheesiota, mikrotiitterilevyt päällystettiin 1 mg /ml fibronektiiniä, 2 mg /ml kollageenin tai 3 mg /ml BSA: ta, vastaavasti. GFP: n ilmentyminen oli alle herkkyys fluoresenssimittari (488 nm), siksi värjätyistä soluista CFSE: llä ennen kylvö. Soluja inkuboitiin päällystettyihin kuoppiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa.

analysoimiseksi solujen migraation ja adheesion, solut indusoidaan doksisykliini 8 päivää ympättiin alla subkonfluenteista olosuhteissa, soluviljelmässä levyjen tai peitelaseja, 20 tuntia jälkeen 4 h seerumistarvaatio. Soluja käsiteltiin 50 uM forskoliinia 20 min indusoimaan cAMP /PKA aktivointi ja siten lamellipodioihin ja fokaalisen adheesion muodostumista. Aktiinisäikeiden ja paikallisia tarttumista visualisoitiin kautta immunosytokemian ja paikallisia tarttumista laskettiin käsin.

Tulokset

valikoiva menetys PHB1 köyhdytetyn solujen

Toistaiseksi ole yksimielisyyttä toiminta PHB1 on saavutettu; rintasyöpäsoluissa, PHB1 on raportoitu toimivan tuumorisuppressorina [15], [16], kun taas ensisijainen endoteelisoluissa ehtyminen PHB1 johti alentuneeseen solujen lisääntymisen [26]. Määritellä rooli PHB1 HeLa-soluissa, adenokarsinoomasolulinja, me syntyy stabiileja solulinjoja ilmentävät PHB1-suunnattu shRNAs käyttämällä konstitutiivista pLL3.7 lentiviruksen shRNA ilmaisun järjestelmä [29]. Expression kolmesta eri shRNAs, shPHB1-2, shPHB1-3 ja shPHB1-0, kohdistaminen koodaava alue PHB1 indusoi ehtyminen PHB1 RNA interferenssi (RNAi) mRNA (Fig. 1A) ja proteiini (Fig. 1 B) taso. Ehtyminen PHB1 korreloi samanaikaisesti ekspression markkeriproteiinia eGFP (Fig. 1 C), mikä osoittaa onnistuneen lentiviruksen transduktion näissä soluissa. Sitten kasvoi eri solulinjojen ja seurataan koostumus solupopulaation käyttäen mikroskopia ja FACS-analyysiä. Selektiivinen väheneminen shPHB ilmentävien solujen solusta allas havaittiin, nähtävissä vähentäminen eGFP-positiivisen solupopulaation (Fig. 1 D). Tämä menetys ei johtunut lisääntyneestä apoptoosin shRNA ilmentävien solujen (tuloksia ei ole esitetty), mutta nopeammin kuin transdusoitujen, PHB1 proteiinia ekspressoivia soluja, ja siten eGFP-negatiivisia soluja, jotka osoittivat normaalia proliferaatiota.

(A, B) PHB1 mRNA: ta ja proteiinia tasot tehokkaasti vähennetään soluissa, jotka ilmentävät shPHB1-0, shPHB1-2 ja shPHB1-3 käyttämällä konstitutiivista lentiviruksen ilmaisun järjestelmä pLL3.7 kuten on esitetty qRT-PCR: llä ja Western blotit, vastaavasti. (C) Kun lentiviraalinen transduktio vakaa integraatio osoitetaan GFP: n ilmentymisen. (D) kanssa ilmentymisen positiivisesti validoitu shRNAs kohdistaminen PHB1 mRNA osa GFP ekspressoivien solujen väheni kymmenen päivän kuluessa transduktion poolista transdusoitujen solujen, kuten FACS-analyysillä. (E) Transdusoidut ilmentävien HeLa-solujen kontrollivektorilla tai PHB1 kohdistaminen shRNAs ympättiin pehmeässä agarissa. Vain ohjaus solut kasvoivat alle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa ja muodostaa pesäkkeitä.

Sen testaamiseksi, onko tämä havainto oli spesifinen HeLa-solut, useita eri syöpäsolulinjojen, mukaan lukien Capan1 solut, HT1080wt, Jurkat-T-solut , IF6 ja HT29, transdusoitiin samalla lentiviruksen shRNA konstrukti ja niiden kasvua tarkkailtiin ennen. Western blot analyysi paljasti ilmentymisen shPHB1-0 johti ehtymiseen PHB1 kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio. S1A). Lisäksi samanlainen HeLa-solut, pitkäaikainen viljely heikentäneet eGFP-positiivisten solujen (Kuva. S1B), sulkee pois solulinja-vaikutuksensa. On kiinnostavaa, että samanlainen ilmiö havaittiin lisääntyvissä ensisijainen ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) jälkeen transdusoimaan shPHB1-0 (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että menetys PHB1 häiritsee leviämisen.

Koska ankkurista riippumaton kasvu on tunnusmerkki syöpäsoluja [30], me myös arvioinut tämän fenotyypin meidän solulinjoissa ilmentävät konstitutiivisesti shRNAs kohdistaminen PHB1. Solut ympättiin pehmeällä agarilla ja niiden kasvua tarkkailtiin ennen. Ohjaus ja ei-transdusoidut solut osoittivat normaalia kasvua ominaisuudet, pesäkkeitä muodostavaa ja lisääntyvissä, kun taas PHB1-knockdown-soluja pysyi yksittäisinä soluina (Fig. 1 E), joka osoittaa PHB1 on rooli kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun.

PHB1 /PHB2 tarvitaan syöpäsolujen lisääntymistä

Koska ehdollinen vaiennettu PHB1 ilmaisun johti menetykseen leviämisen ja tarjoavat samalla liikakasvua trandusoidun solujen pitkän aikavälin tutkimuksia vaikutuksista alennettu PHB1 ilmaisun molekyylitasolla eivät olleet mahdollista. Siksi me ilmaisi saman validoitu shRNAs toiminnalliseen knockdovvn PHB1 on lentivirusvektori valvonnassa on doksisykliini-indusoituvan promoottorin [28]. Analysoida rooli PHB2 ja sen vuorovaikutusta PHB1, suunnittelimme lisäksi shRNA erityisesti suunnattu PHB2 mRNA (yksityiskohdat katso materiaalit ja menetelmät).

Vähennykset PHB1 ja PHB2 proteiinin ilmentyminen havaittiin 3-4 päivää sen jälkeen, lisäämällä doksisykliini, tulossa pieneni huomattavasti 5-6 päivää ja sitten loput vakaasti pienentyä jopa 10 päivää (Fig. 2A, B). Ehtyminen yksi prohibitin proteiinin johtaneet siihen, että muiden (Fig. 2C). Tämä vaikutus johtui todennäköisesti proteiinin epävakautta, kuten mRNA-tasoja ei-äänieristys geenin pysyi vakiona (tuloksia ei ole esitetty). Kuten aiemmin havaittiin, kun perustava vaiennettu PHB1 (Fig. 1 D), indusoituva vaimentaminen prohibitins vähentänyt solujen lisääntymistä. BrdU analyysit paljastivat pienentää DNA-synteesi 5 vrk induktio PHB1 ja PHB2 ehtymisen (Fig. 2D). Arvioida leviämisen nopeuden yhden solun tasolla, solut värjättiin Karboksi loisteputki succinidylester (CFSE); Tämän tahra on jakautunut tasaisesti sytoplasmassa ja stoikiometrisesti jaetaan tytärsoluihin solunjakautumisen aikana. Solujen lisääntyminen oli selvästi vähentynyt PHB1- tai PHB2-köyhdytetty soluja verrattuna ohjata soluja (Kuva. 2E). Lisäksi nämä solut oli vähentynyt ankkurointiriippumattomuudeksi ja jättänyt kasvaa pehmeän agarin (Fig. 2F). Siten meidän tiedot osoittavat, että prohibitins rooli solujen lisääntymisen.

(A, B) transduktio kanssa pLVPT lentiviruksen mahdollistaa doksisykliini indusoituvan shRNA ilme. Osoitetulla induktion PHB1 ja PHB2 proteiinin ilmentymistä tehokkaasti vähentää. (C) indusoituva ilmentyminen joko PHB1 kohdennettu tai PHB2 suunnattu mRNA johti vähentää ilmentymistä molemmat proteiinit, kuten on esitetty Western blot. (D) BrdU-analyysi osoittaa, HeLa-soluja, jotka ilmentävät shPHB1-0, shPHB1-3 tai shPHB2-0 varten 10 päivää osoittavat alennettua lisääntymisnopeus verrattuna soluihin, jotka ilmentävät ohjaus shRNA (shLuci). (E) CFSE intensiteetti mitattuna FACS 0 h (1), 24 h (2), 48 h (3), 72 h (4), ja 96 tunnin (5) on korkeampi prohibitin pudotus soluissa osoittaa kevennettyä laimennus CFSE paastota jäljittelevän tytär soluja. (F) CFSE intensiteetti mitataan FACS 24 tunnin välein 5 päivän ajan ja mediaani jokaisen piikin piirrettiin toisiaan vastaan. (G) Indusoituvaa ilmentymistä shRNAs johti samaan feno- vähentää /tappio kiinnittymisestä riippumattoman kasvun PHB1 (shPHB1-0, shPHB1-3) ja PHB2 (shPHB2-0) pudotus soluissa havaittu konstitutiivista ilmentämistä järjestelmään.

menetys prohibitins johtaa pirstaloitumiseen mitokondrioita

Koska prohibitins pääasiassa lokalisoitu mitokondriot [1], päätimme testata ehtyminen prohibitins vaikuttaa eheyden mitokondrioita. Käyttämällä immunofluoresenssimikroskoopilla havaitsimme selkeän pirstoutuminen mitokondrioiden verkon soluissa, jotka ilmentävät shPHB1-3, joka kasvoi ajan mittaan (kuvio. 3A, B); Expression of shPHB2-0 ei onnistunut indusoimaan merkittävää kasvua pirstoutuminen mitokondrion verkon (Fig. 3A, B). Lisäksi, ekspressio shPHB1-3 johti tehokkaammin pudotus sekä prohibitins.

(A, B) mitokondrioita prohibitin pudotus solut värjättiin anti-Tom 20, ja mitokondrioiden pirstoutuminen kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Laajennettu induktio doksysykliinillä lisäsi pirstoutuminen shPHB1-3 ilmentävissä soluissa. (C) Western-blotit osoittavat, että pitkäaikainen doksisykliini aiheuttama shPHB1-3 ilmaus johti vahvempi prohibitin knockdown kuin shPHB2-0 ilme, korreloi yhä pirstoutumisen fuusion toimivaltaisen fragmentteja a ja b OPA1. (D) kvantifiointi osoitti, että fuusio toimivaltainen lomakkeet hajonnut pienempiin palasia c ja e. (E) kvantifiointi OPA1 kuviointi kontrollisoluissa (shLuci), PHB1-köyhdytettyä soluja (shPHB1-3) ja soluja käsiteltiin 60 uM CCCP 80 min (CCCP) aiheuttamaan menetykseen ΔΨm. OPA1 kuvio CCCP-käsitellyissä soluissa poikkesivat shPHB1-3 ilmentävien solujen, kuten fragmentit a ja b olivat täysin menetetty, kun taas pienemmät fragmentit d ja e lisättiin. (F) TEM kuvia solujen kanssa prohibitin pudotus indusoitiin 10 päivää osoitti tiheämpää ulkonäkö mitokondrioiden kuin shLuci-ilmentävät kontrollisolut, mutta morfologia kristat rakenne ei muuttunut.

Muun monet muut proteiinit, OPA1 on merkittävä rooli valvonnassa mitokondrion fuusio [31] ja kristat eheys [32]. Koska aiemmat julkaisut ovat osoittaneet, että prohibitins ovat tarvitaan vakaata ekspressiota OPA1 [17], [21], analysoitiin vaikutus PHB1 ja PHB2 heikentymisen tasot mitokondrion fuusioproteiinin OPA1. OPA1 Proteiinit ilmennetään seitsemän silmukoitumisvarianttia, näkyvä viisi bändejä (a-e) Immunoblotilla, johtuu osittain fuusio toimintaa OPA1 [33]. Havaitsimme hajoaminen OPA1 soluissa tyhjentynyt prohibitins, joka korreloi tehokkuutta prohibitins ehtyminen. Erityisesti fuusio toimivaltainen fragmentteja a ja b menetettiin ja pieniä palasia c-e kasvoi upon PHB1 ehtyminen pitempiä ajanjaksoja (Fig. 3C, D). Mielenkiintoista on, että solut, jotka ilmentävät shPHB2-0 bändejä a ja b säilyi ennallaan, ja vain lisää kaistalla e havaittiin (kuva Fig. 3C). Vaikutus oli spesifinen OPA1, koska hajoamista muiden mitokondrion proteiinin, mukaan lukien Hsp60, ATP-syntaasi ja Tims Toms ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset tukevat selektiivinen aktiivisuus shPHB1-3 mitokondrioiden pirstoutuminen ja OPA1 hajoamista.

aikaisemmista tutkimuksista tiedettiin, että hajoamista MMP indusoi OPA1 hajoamista ja mitokondrioiden pirstoutuminen [33]. Sen vuoksi testasimme, onko rakenteessa OPA1 pirstoutumisen aiheuttama PHB1 ehtyminen ja MMP oli samanlainen. Soluja käsiteltiin irrottamista reagenssin karbonyyli syanidia

m

kloorifenyyli hydratsoni (CCCP) ja OPA1 vyöhykkeet havaittiin immunoblottauksella. OPA1 geelikuvioihin olivat selvästi eri soluissa ilman MMP verrattuna niihin tyhjentynyt PHB1 (Fig. 3E). Fuusio toimivaltaisten fragmentit OPA1 hajosivat ja ilmaus fragmenttien c, d ja e nostettiin puuttuessa MMP. In prohibitin vaje solujen ilmentäminen bändi d ilmentyminen oli voimakkaasti vähentynyt, kun taas bändi b oli vain hieman vähentynyt, mikä viittaa siihen, että erilaiset mekanismit selittämään havaittuja vaikutuksia. Kun aika-kurssi kokeessa havaitsimme, että CCCP aiheuttaa mitokondrioissa pirstoutumista ennen OPA1 hajoamista (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että OPA1 hajoaminen voi olla seurausta mitokondriaalisen pirstoutuminen tässä tapauksessa.

Voit testata, onko hiljentäminen of PHB1 indusoi menetys MMP, me värjätään shPHB1-3 ilmentäviä soluja tetra- etyyliesteri perkloraattia (TMRE), solun läpäisevä väriaine, jota sekvestroida aktiivisia mitokondrioita. TMRE värjäytymisen intensiteetti oli samanlainen kontrolli- ja PHB1-köyhdytettyä solut (Fig. S2A), mikä viittaa siihen, että mitokondrion kalvon säilyy ehjänä siitä huolimatta pirstoutuminen mitokondrioiden näissä soluissa. Mukaisesti, ATP-tasot pysyivät muuttumattomina soluissa köyhdytetty prohibitins (Fig. S2B). Koska OPA1 hajoaminen on myös osoitettu johtavan muutoksiin kristat morfologiassa [32], tutkimme kristat rakennetta mitokondrioiden soluissa köyhdytetty prohibitins käyttäen Transmission (TEM). In PHB1-vaiennetaan ja ohjaus soluja, kristat rakenne säilyi ennallaan (kuvio. 3F), joka ilmaisee normaalin mitokondrion fysiologia.

solu- to solukontaktissa estyy prohibitin köyhdytetyn soluissa

aikana alkuperäistä tutkimukset prohibitin pudotus solulinjat, havaitsimme, että menetys prohibitin-köyhdytettyä soluissa oli riippuvainen tiheys, jossa solut ympättiin soluviljelylevyille. Suurilla solutiheyksiin, menetys pudotus solujen väheni, mutta ei estää (Fig. 4A). Lisäksi menetys prohibitins ilmaisun aiheutti muutoksen solun morfologiassa tietyissä syöpäsolulinjoissa: HeLa-solut, varsinkin kun oli ympätty alhainen tiheys taipumus säilyä yhtenä solujen pitkänomainen morfologia, joka muistuttaa fibroblasteja (Fig. 4B). Samanlainen fenotyyppi havaittiin, kun HeLa soluja pidettiin väliaikaisesti olosuhteissa kylvämällä ne agaroosi peittämälle soluviljelymaljoille: hallita vain solut muodostivat pesäkkeitä, kun taas prohibitin-vaimennettu solut eivät muodosta solu- solu-kontaktien ja pesäkkeet (Fig. 4C ).

(A, B) mykistys prohibitin lauseke 10 vuorokauden ajan aiheutti levitetyssä solujen morfologia kanssa tumaan hieman koholla. (A) Kun ympättiin alhaisen tiheyden prohibitin pudotus solut pysyivät yksittäisinä soluina mahdollisimman vähän solu-solu-kontakti. (B) Suuremmilla siemenet tiheys, prohibitin-pudotus soluissa ilmeni edelleen pitkänomainen morfologia mutta joko muodostunut klusterit (shPHB1-3) tai pysyivät pääosin yksittäisinä soluina, joilla on alentunut solu-solu yhteyttä. Leviämisen nopeus prohibitin pudotus soluja lisättiin myös verrattuna soluihin ympätty alhaisella normaaliksi tiheys. (C) estäminen ankkurointi istuttamalla soluja agar kuorrutettu kudosviljelylevyille voimakkaasti alentunut proliferaationopeus ja pesäkkeenmuodostusta prohibitin pudotus soluissa, kun taas kontrolli-solut (shLuci ilmentävät solut) muodostuu suuri solu möhkäleitä. (D) Prohibitin vähennetty ja ohjaus soluja käsiteltiin CFSE lisäämiseksi fluoresenssi-intensiteetin ja ympättiin soluväliaineen proteiinien kollageenin tai fibronektiiniin, tai BSA 30 min. Irtonaiset solut pestiin pois, ja mitattiin fluoresenssi-intensiteetti. Prohibitin Knockdown merkittävästi alentunut pito. (E) Doksisykliini aiheuttama solut ympättiin peitinlaseil- 20 h, mitä seurasi seerumistarvaatio 4 tuntia. Hoidon jälkeen 50 uM forskoliinia 20 min, brightfield kuvat osoittivat lamellipodioihin muodostumisen hallinnassa soluissa, mutta ei prohibitin- köyhdytettyä soluissa. Lisäksi prohibitin-köyhdytettyä solut osoittivat vähentynyt muodostuminen paikallisessa tarttumisessa esitetyllä immunosolukemiallisella värjäyksen avulla phalloidin ja anti-paksilliini vasta-aineita. (F) kvantifiointiin paikallisessa tarttumisessa valvonta- ja prohibitin pudotus solujen α-paksilliini 1 värjättyä Pilkut laskettiin 30 solua kunnossa.

tutkimiseksi soluväliainekonstruktissa kontakti muodostumista, solut ympättiin levyille päällystetty soluväliaineen proteiinien fibronektiiniä tai kollageenin. Tarttuvuus PHB1- ja PHB2-köyhdytettyä solujen nämä matriksiproteiinien inhiboitui merkittävästi (kuvio. 4D). Edelleen määrällisesti soluväliainekonstruktissa liitetiedoston, fokaalisen adheesion muodostuminen aiheutettiin Forskolin jälkeen seerumistarvaatio. Immunofluoresenssimikroskoopilla paljasti vähentää leviäminen ja muodostuminen aktiinifilamenttien (Fig. 4E), sekä lukumäärän väheneminen fokaalisten adheesioiden (Fig. 4E, F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että prohibitins myös rooli solun matriisi vuorovaikutus.

Keskustelu

löytämisen jälkeen niiden anti-proliferatiivista aktiivisuutta, prohibitins on liitetty useita solutoimintoihin [10] , [18], [34]. Kuitenkin useita rivejä epäsuoria todisteita, kuten niiden yli-ilmentyminen lukuisissa syöpäsoluissa [35] osoitti, että prohibitins eivät toimineet niin klassisen kasvain vaimennin. Täällä näytämme prohibitins ovat tärkeä edellytys syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymistä. Käytimme lentivirus-välitteisen shRNA ilmentymistä spesifisesti vähentämään PHB1 ja PHB2 mRNA: ta ja proteiinia tasolla, vastaavasti. Käyttämällä konstitutiivista ilmentämistä järjestelmän pLL3.7, olemme osoittaneet, että kaikilla testatuilla syöpäsolulinjoissa, määrä soluja, jotka ilmentävät PHB1 mRNA kohdistaminen shRNA pieneni sisällä altaan transdusoitujen ja ei transdusoidut solut. Lisäksi PHB1-köyhdytettyä solut eivät kyenneet kasvamaan kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa. Tuloksemme ovat sopusoinnussa kahden viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että RNAi-välitteinen vaiennettu PHB1 tai PHB2 vastaavasti johtaa alentunut leviämisen ensisijainen endoteelisoluissa ja hiiren alkion fibroblasteissa [17], [26]. Nämä tiedot ovat jyrkässä ristiriidassa aiemman tutkimuksen, jossa kasvoi leviämisen estämistä rintasyövän melanoomaan MCF-7 upon siRNA-välitteinen vaiennettu PHB1 [16]. On mahdollista prohibitins on erilainen merkitys rintasyöpäsoluissa verrattuna muihin syöpäsolutyyppien.

suostumuksella alkuperäisen havainnon, että RNA 3’UTR PHB1 kiinnostavuus sytotoksisia vaikutuksia syöpäsoluihin [9] [10]: n ilmentyminen T-alleelista PHB1 3’UTR on yhdistetty lisääntyneeseen alttiuteen rintasyövän [11]: kuitenkin useita kliinisiä tutkimuksia ovat ristiriidassa näiden havaintojen [12], [13]. Lisäksi sekvensointi PHB1 3’UTR eri syöpäsolulinjojen, mukaan lukien MCF-7, osoitti korkeampaa taajuutta yleinen sekvenssin vaihtelua verrattuna ensisijaisen ei-syöpäsolujen sijaan hallitseva ilmaisema erityinen T-alleelin (CS ja TR, julkaisematon). Nämä havainnot viittaavat siihen, että prohibitins tehdä osansa Karsinogeneesin mutta taso, jolla vaikutus kohdistuu, eli 3’UTR RNA tai proteiini, jää epäselväksi: hiljentäminen joko PHB1 tai PHB2 mRNA RNAi johti vähentämiseen kunkin 3 ’ UTR mutta myös knockdown molempien prohibitin proteiineja. Koska ilmentymisen kaikkien testattujen shRNAs johti hidastunut lisääntymisnopeus, tämä fenotyyppi on todennäköisesti seurausta menetys prohibitin proteiineja.

arvioimiseksi pitkän aikavälin vaikutusta prohibitin ehtyminen, me syntyy HeLa-solulinjoissa indusoituvan shRNA ilme. Näissä soluissa PHB1 ja PHB2 mRNA: t olivat tehokkaasti ja selektiivisesti alas-säädellään induktion geenispesifisillä shRNA ja prohibitin proteiinit palautuvasti tukahdutetaan. Samanlainen konstitutiivisen hiljentämisen PHB1 tai PHB2, induktio shRNA ilmentymisen vähensi solujen lisääntymisen ja esti pesäkemuodostusta pehmeällä agar-maljoille, joka ilmaisee vian kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Nämä solut linjat meille mahdollisuuden hienosäätää PHB1 ja PHB2 hiljentäminen standardoiduissa olosuhteissa ja tutkia taustalla oleva mekanismi vahva liittyvä fenotyyppi prohibitin ehtyminen. Ensin analysoidaan vaikutus prohibitin ehtymisen tasoista mitokondrioiden fuusioproteiinin OPA1 kuten edelliset julkaisut ovat osoittaneet, että prohibitins ovat välttämättömiä stabiilin ilmentymisen OPA1 [17], [21]. Voisimme osoittaa, että OPA1 ekspressio on riippuvainen siitä, millä tasolla prohibitins. Alentaen hiukan prohibitins katsottuna varhain induktion shRNA tuotannon, johti osittaiseen pirstoutuminen fuusio toimivaltaisen OPA1 fragmentit a ja b. Myöhäisemmässä vaiheessa induktion ja siten vahvempi ehtyminen prohibitins, OPA1 pirstoutuminen lisääntynyt ja mitokondrioita ilmestyi hajanainen. Epätäydellinen vähentäminen prohibitin proteiineja, joita nähdään ilmaus shRNAs shPHB1-0 ja shPHB2-0, johtanut ainoastaan ​​lieviä OPA1 pirstoutumista eikä sirpaloituminen mitokondrioiden verkon. Tarkempi analyysi paljasti, että jopa vahvat ja pitkäkestoinen ehtyminen PHB1 esim tuottavissa soluissa shPHB1-3, ei aiheuttanut hukkaamisen MMP.

Toistaiseksi vaikutukset prohibitin menetyksen nisäkässoluissa ovat vielä epäselviä: Schleicher et al. [26], ja Ross et al.