Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä ( CRC) on kolmas merkittävä syy syöpään liittyvät kuolemat maailmassa. 5-fluorourasiili (5-FU), on laajalti käytetty kolorektaalisen syövän vaan yhden aineen tekee alhainen vaste. Koliinikinaasi-alfa (ChoKα), entsyymin, joka on tärkeä rooli soluproliferaation ja muutos, on raportoitu yli-ilmennetään monissa eri kasvaimissa, mukaan lukien peräsuolen kasvaimia. ChoKα inhibiittorit ovat viime aikoina kliinisissä kokeissa uutena antitumor strategiaa.

Menetelmät /Principal Havainnot

ChoKα erityisiä estäjät, MN58b ja TCD-717, ovat osoittaneet voimakas kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus sekä

vuonna vitro

ja

in vivo

vastaan ​​useita kasvain- solulinja ksenografteja, mukaan lukien CRC-solulinjat. Vaikutus ChoKα estäjiä yhdessä 5-FU uutena vaihtoehtona hoitoon paksusuolen kasvaimia on tutkittu sekä

in vitro

CRC-kasvain solulinjat, ja

in vivo

hiiren ksenografteissa malleissa. Vaikutukset tymidylaattisyntaasin (TS) ja tymidiinikinaasin (TK1) tasot, kaksi entsyymiä tiedetään olevan keskeinen rooli vaikutusmekanismi 5-FU, analysoitiin western-blottauksella ja kvantitatiivinen PCR-analyysillä. Yhdistelmä 5-FU ChoKα estäjien johti synergistinen vaikutus

in vitro

kolmessa eri ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, ja

in vivo

ihmisen paksusuolen nude-hiirissä. ChoKα estäjät moduloivat ekspressiotasot TS ja TK1 estämällä E2F tuotannon, joka tarjoaa järkevän sen vaikutusmekanismi.

Päätelmä /merkitys

Tuloksemme viittaavat siihen, että molemmat lääkkeet yhdessä näkyviin käyttötapaan synergistinen antitumoraalinen vaikutus johtuu ChoKα estäjät perustuva modulointi metaboloituminen 5-FU. Kliinistä merkitystä Näiden havaintojen tukevat vahvasti koska TCD-717 on viime aikoina tullut vaiheen I kliinisissä kokeissa kiinteitä kasvaimia.

Citation: de la Cueva A Ramírez de Molina A, Álvarez-Ayerza N, Ramos MA, Cebrián A, Pulgar TGD, et ai. (2013) Yhdistetty 5-FU ja ChoKα estäjät uutena Alternative Therapy paksusuolisyövän: Evidence in Human Tumor solulinjat ja hiiri ksenoqraftit. PLoS ONE 8 (6): e64961. doi: 10,1371 /journal.pone.0064961

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2013; Julkaistu: 10 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 de la Cueva et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on rahoittanut seuraavia apurahoja: Comunidad de Madrid (S-BIO /0280/2006 ja S2010 /BMD-2326), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, SAF2011-29699, RD06-0020-0016 ja RD12 /0036 /0019) ja EU: # 259737. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Juan Carlos Lacal on perustaja TCD Pharma ja jäsenenä sen Scientific Advisory Board mutta ei yhtiön palveluksessa. TCD Pharma kehittää yhdiste TCD717, joka on ChoKα estäjä, joka on tällä hetkellä faasin I kliinisissä kokeissa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on ensimmäinen yleisin syöpä ja se on toiseksi syy syöpä kuolema Euroopassa noin 212.000 kuolemaa vuosittain [1]. Eniten tutkittu lääke CRC on antimetaboliittina 5-fluorourasiilin (5-FU), kehitettiin yli 50 vuotta sitten [2]. 5-FU on analoginen urasiilin fluoriatomilla. Sen sytotoksisuusmekanismin koostuu väärinliittymistä on fluoronucleotides RNA: ksi ja DNA mutta tärkein myrkylliset vaikutukset välittyvät esto nukleotidin synteettinen Tymidylaattisyntaasientsyymin (TS). 5-FU on laajalti käytetty hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien CRC, rintasyövän ja pään ja kaulan alueen syövissä [3], [4]. Response hinnat 5-FU kemoterapian käyttöä ensisijaisena hoitona pitkälle CRC syöpä ovat vain 10-15% [5]. Yhdistelmä 5-FU uusilla sytotoksisten lääkkeiden, kuten oksaliplatiinia ja irinotekaania on parantanut hoitovaste 40-50% [6], [7]. Lisäksi uusia biologisia tekijöitä, kuten monoklonaalisia vasta-aineita setuksimabi ja bevasitsumabi ovat osoittaneet lisähyötyä potilaille etäpesäkkeitä [8], [9]. Näin ollen tämä lähestymistapa on saavuttaa merkittäviä parannuksia, ja edistää uusia terapeuttisia strategioita, jotka perustuvat kombinatorisista hoitoja.

Koliinikinaasialfan (ChoKα), ensimmäisen entsyymin Kennedy reitti on vastuussa synteesi suurten fosfolipidi solukalvojen, fosfatidyylikoliini (PC). Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ChoKα on tärkeä rooli solun transformaatiossa ja indusoi

in vivo

tuumorigeneesissä [10], [11]. Lisäksi ChoKα yliekspressoituu paksusuoli-, rinta-, keuhko-, eturauhas-, munasarja- ja hematologiset kasvaimet [11] – [16]. Näiden havaintojen perusteella, ChoKα on käytetty uutena molekyyli tavoite kehittää uusi kasvaimia torjuvaa strategiaa. ChoKα estäjät (ChoKIs) ovat johdannaisia ​​on Hemicolinium-3 (HC3) rakenne, joka on tunnettu koliinikinaasi-inhibiittori, jolla on korkea neurotoksisuutta

in vivo

[17] – [19]. MN58b [20], [21] tunnistettiin ensimmäisen sukupolven HC3 johdannaista, jolla on voimakas antiproliferatiivinen vaikutus

in vitro

ja tehokas kasvaimen kasvua estävä aktiivisuus

in vivo

nude-hiirissä, mukaan lukien paksusuoli- ksenografteissa [10] , [21]. MN58b on käytetty mallina uuden sukupolven yhdisteitä ja johtaa molekyylin tutkia vaikutusmekanismi tämän uuden luokan syöpälääkkeiden.

toinen sukupolvi ChoKα estäjien on syntetisoitu parantamaan siedettävyyttä ChoKα estäjien hiirillä. TCD-717 on valittu useiden molekyylien koska se tarjosi parhaat tulokset

in vitro

ja

in vivo

(julkaisemattomat tulokset). ChoKα inhibiittorit ovat erittäin spesifisiä lääkkeitä tuumorisoluja, koska ensisijainen solut palautuvasti pidätettiin G1 ja pystyvät saamaan takaisin kasvukinetiikat kun lääkeaine on poistettu. Kuitenkin kasvainsolut laukaista solukuolema samanaikaisesti kasvuun solunsisäisen seramiditasot [22], [23]. Molemmat lääkkeet, MN58b ja TCD-717, ovat peräisin Hemicolinium-3, ja sellaisina ne ovat molemmat pitää kilpailukykyisenä inhibiittorit koliini on koliinisitojadomeeni taskun [24] – [26].

on kuvattu, että yhdistetty käyttö koliinikinaasi-spesifinen siRNA ja 5-FU, johtaa synergistinen vaikutus vähentää solujen lisääntymistä rintasyövän solujen [27]. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli selvittää antituumorivaikutuksen tehosta yhdistetyn hallinnon kemiallisten ChoKα estäjiä ja 5-FU, etsivät vaihtoehtoista hoitoa, joka mahdollistaisi parantaa 5-FU rate vasteen CRC hoidossa ja vähentää siihen liittyvän myrkyllisyyden. Kliinistä merkitystä tätä uutta hoitoa tukevat vahvasti koska TCD-717 on hiljattain hyväksytty tulla kliinisissä tutkimuksissa kiinteitä kasvaimia (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01215864).

Tulokset

ChoKα tasoja ihmisen johdettu paksusuolen syövän solulinjat

ChoKα tasot analysoitiin kolmen koolonsyöpäsolulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt, DLD-1, HT29 ja SW620 verrattuna ei kasvaimen peräsuolen solulinjan CCD -841. Kuvio 1 osoittaa, että ChoKα tasot ovat noin 20-30 kertaa suurempi kuin ensisijainen solulinja. Tämä tulos on sopusoinnussa aikaisempien analyysi ChoKα ilmaisun Tuumorinäytteissä verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin samasta potilaasta [11], ja tarjoaa järkevää mahdollista käyttöä ChoKα estäjien klinikalla yhdessä tavanomaisen kemoterapian.

ChoKα proteiinin tasoja on kolme peräsuolen kasvaimen solulinjojen, DLD-1, HT29 ja SW620 on verrattu suhteen ei kasvainten peräsuolen solulinjan CCD-841. Alla Länsi se edustaa kvantifiointiin tasoilla (ChoKα /tubuliinin).

ChoKα estäjiä synergistisesti 5-FU edistävät solukuolemaa koolonkarsinoomasoluissa

Vaikutus leviämisen ChoKα estäjien yhdessä 5-FU määritettiin kolmessa kolorektaalisyöpä solulinjoissa: DLD-1, HT29 ja SW620. Arvioida sopivina pitoisuuksina kullekin yhdisteen, soluja käsiteltiin laajalla konsentraatioalueella, joka perustuu niiden IC

50, yksin tai yhdistelmänä. Pitoisuudet käytettiin 1-6 uM (MN58b ja TCD717) sekä 2-8,5 uM 5FU sekä samanaikainen ja peräkkäinen hoitoja (Kuva S1). Paras yhdistelmä saavuttaa tehokas synergia solujen lisääntymistä huumeiden oli peräkkäinen hoito aloittaa vain ChoKα estäjä ja sen jälkeen 5-FU. Inhiboivaa vaikutusta kvantitoitiin MTT-määritystä, ja inhibiitionopeudet analysoitiin menetelmällä Chou ja Talalay, ja yhdistelmä indeksit (CI) mukaan arvioitujen CalcuSyn-ohjelman [28]. Tontit saatiin kun ChoKα estäjiä TCD-717 ja MN58b yhdistettiin 5-FU DLD-1, HT29 ja SW620 solulinjoissa (kuvio S1). CI ja edustava kustakin erilaisesta CRC solulinjasta peräkkäinen yhdistelmä ChoKα estäjien ja 5-FU on esitetty (kuva 2).

6 x 10

3 kasvainsoluja viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä . 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, solut altistettiin TCD-717 (vasemmanpuoleiset paneelit) ja 24 h tai MN58b (oikea paneeli) 9 tuntia. Tämän jälkeen väliaine vaihdettiin väliaineeseen, joka sisälsi 5-FU 60 h levyillä aiemmin hoidettu MN58b ja 24 h levyillä käsitelty TCD-717. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT: llä ja edustettuina prosentteina kontrollista, käsittelemättömien solujen. CI-arvo kulloinkin on keskiarvo kolmen erillisen kokeen, kukin suoritettiin neljänä rinnakkaisena. CI 1 osoittaa synergististä vaikutusta. Esitetään edustava koe kolmesta itsenäisestä kokeesta.

vaikutus tämän yhdistelmän tutkittiin, ja solusyklin jakautuminen indusoi TCD-717 ja 5-FU yksin tai yhdistelmänä analysoitiin (kuvio 3). Virtaussytometria-analyysi osoitti merkittävän solukuoleman induktioon käsittelyn jälkeen ChoKIs vain lisääntyy yhdessä 5-FU: n, joka osoittaa, että yhdistetty hoito vaikutus oli voimakkaampi kuin yksittäisiä hoitoja. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kasvainsolut ovat herkkiä ChoKα estäjiä jos altistuvat G1 vaiheessa, mutta tulee tunteeton S-vaiheessa [23]. 5-FU altistuksen aiheuttama S vaihe kertymistä, mutta yhdistelmähoito rajusti S-vaiheeseen keskittymisen ja lisääntynyt solujen kuolleisuutta. Nämä tulokset tukevat vaatimusta juokseva hoito aloitetaan ChoKα estäjien selittää puute synergia havaittiin vaihtoehtoista helpottavat käsittelyä.

2,5 × 10

5 DLD-1 ja SW620 solulinjoja istutettiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 h TCD-717, jota seuraa 5-FU: ssa 24 tuntia yksinään tai yhdistelmänä. Näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden lisääntynyt solukuolema verrattuna kahta lääkettä yksinään. Taulukot alla grafiikka osoittaa prosenttiosuuden eri vaiheiden solusyklin kun käsittele TCD-717 ja 5-FU yksin tai yhdistelmänä. * P 0,05 verrattuna eri solusyklivaiheista vs. kontrolli.

In vivo

synergia ChoKα estäjiä ja 5-FU nude-hiirissä

Vaikutukset kombinatorisista hoitoja ChoKα estäjiä ja 5-FU on

in vivo

kasvaimen kasvua DLD-1 ja SW620 nude-hiirissä olivat seuraavaksi tutkittiin. DLD-1 -ksenografteja inokuloitiin kateenkorvattomissa hiirissä ja kun kasvaimet saavuttivat standardin määrä noin 0,2 cm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (10 kasvaimia /ryhmä) ja käsiteltiin sen jälkeen seuraavan aikataulun mukaisesti: ChoKα inhibiittorit annetaan 2 mg /kg /päivä kolme kertaa viikossa 3 viikkoa, ja 5-FU annettiin 40 mg /kg /vrk kahdesti viikossa 3 viikkoa. Kasvaimen kasvu oli kuluttua hoidon aloittamisesta. Kasvaimen tilavuutta vähennettiin kaikissa hoidetuissa ryhmissä riippumatta hoidon, verrataan ohjaus, käsittelemättömät hiiret (kuvio 4). Kasvaimen kasvu yhdistelmän ryhmistä kussakin kokeessa oli huomattavasti pienempi kuin niillä, joita hoidettiin ChoKα estäjiä tai 5-FU yksinään (p-arvot 0,05), mikä osoittaa vahvan hidastanut kasvaimen tilavuuden yhdistelmä aikataulujen.

Hiiret olivat altistettiin 2 mg /kg /päivä ChoKα estäjien kolmena päivänä viikossa ja 40 mg /kg /päivä 5-FU: n kaksi päivää viikossa yhdistelmänä tai yksin aikana 3 viikkoa. Kasvaimen kasvun esto on esitetty alla kutakin koetta. (A) DLD-1 käsitellyt kasvaimet MN58b kuten ChoKα estäjän ja 5-FU. (B) DLD-1 käsitellyt kasvaimet TCD-717. (C) SW620 kasvaimet altistettiin TCD-717 ja 5-FU.

Koska validointi, SW620 ksenograftit tutkittiin myös seuraavia identtinen aikataulun yhdistelmä TCD-717 ja 5-FU. Tilastollisesti merkittävä vaikutus havaittiin myös yhdistelmähoitoa (kuvio 4).

ChoKα estäjät moduloivat ekspressiotasot keskeisten osallistuvien entsyymien aineenvaihduntaan 5-FU

Valaistaan ​​mekanismi tämän synergistisen vaikutuksen ChoKα estäjiä ja 5-FU, tutkimme vaikutus ChoKα estäjien ekspressiotasot keskeisten entsyymien metaboliareitti 5-FU, kuten tymidylaattisyntaasia (TS) ja tymidiinikinaasi (TK1). SW620-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla ChoKα estäjien 2-10 uM (kuvio 5A) osoittavat annos-riippuvainen lasku määriä näitä proteiineja. Seuraava, SW620, HT29 ja DLD-1 käsiteltiin ChoKα estäjien (TCD-717 6 ja 10 uM, MN58b 10 ja 15 uM) ja 5-FU (5,5 uM), yksin tai peräkkäinen yhdistelmä vaikutusten määrittämiseksi ilmaisun tasoilla näiden entsyymien (kuvio 5B). Free (aktiivinen muoto) ja kolmen komponentin kompleksin (inaktiivinen muoto) TS ja TK1 analysoitiin western-blottauksella. Kuten odotettua, soluja käsiteltiin 5-FU osoittivat sekä TS kolmen komponentin kompleksin (ylempi kaista) ja vapaan TS (alempi kaista). ChoKα estäjät indusoi merkittävän alas-säätely sekä ilmaisia ​​TS (aktiivinen muoto) ja kolmen komponentin kompleksin (aktiivinen muoto), sekä TK1 (kuvio 5B). Siten peräkkäinen yhdistelmä ChoKα estäjien ja 5-FU aiheuttama molemmat mekanismit inaktivaation, vähentynyt muodostuminen kolmoiskompleksin ja merkittävä alas-säätely TS aktiivinen (vapaa muoto). Lisäksi, ChoKIs vähentynyt TK1 tasoilla, jotka vaikuttavat myös mekanismi liittyy 5-FU vastus. Tämä vaikutus voisi selittää mekanismin synergian molempia lääkkeitä.

2,5 x 10

5 DLD-1, HT29 ja SW620-solulinjoja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 tuntia. (A) SW620-solulinja oli altistunut kohonneisiin ChoKα estäjien 24 tuntia. (B) SW620, HT29 ja DLD-1 solulinjoja altistettiin kahdelle pitoisuuksien ChoKα estäjien [TCD-717: 6 uM (vasen rivi) tai 10pM (oikea rivi); MN58b: 10 uM (vasen rivi) tai 15 uM (oikea linja)]. Milloin on osoitettu, väliaine poistettiin käsittelyn jälkeen ChoKα estäjien kuten edellä ja muuttunut tuoretta kasvualustaa 5,5 uM 5-FU: ssa vielä 24 tuntia. Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot käyttäen monoklonaalisia anti-tymidylaattisyntaasin TS106 klooni TS ja monoklonaalinen anti-tymidiinikinaasin klooni F12 varten TK1. Kuvassa näkyy päällä edustavan blot, alareunassa proteiini tasoilla (yhteensä TS, aktiivinen TS, ja TK1 /tubuliinin) lasketaan keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) 2,5 x 10

5 SW620, HT29 ja DLD-1-solulinjoja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 tuntia. (A) SW620, (B) HT29 ja (C) DLD-1 solulinjoja altistettiin kahdelle pitoisuuksien ChoKα estäjien [TCD-717: 6 uM (vasen rivi) tai 10pM (oikea rivi); MN58b: 10 uM (vasen rivi) tai 15 uM (oikea linja)]. Milloin on osoitettu, väliaine poistettiin käsittelyn jälkeen ChoKα estäjien kuten edellä ja muuttunut tuoretta kasvualustaa 5,5 uM 5-FU: ssa vielä 24 tuntia. Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blotilla käyttämällä anti-E2F1. Kuvassa näkyy päällä edustavan blot, alareunassa proteiinin tasot (E2F1 /GAPDH) laskettu keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Sekä TK1 ja TS on osoitettu olevan alle transkriptionaalisen säätelyn E2F1 [29], [30]. Siten tutkimme, onko huomattava vähentäminen tasojen TK1 RUOTS jälkeen ChoK esto oli välittämä vaikutusta tasoa tämän transkriptiotekijän. Kuten kuviossa 5C, kaikissa kolmessa solulinjoissa tutkittu, merkittävästä vähentämisestä tasojen E2F1 havaittiin sopusoinnussa sen sääntelytehtävässä TS ja TK1 synteesi.

Seuraavaksi tutkia mahdollisuuksia induktion apoptoosin jälkeen ChoK inibition, sillä tunnusmerkki apoptoosin tasot PARP analysoitiin samanlaisissa olosuhteissa, ja merkittävästä vähentämisestä havaittiin PARP tasoilla SW620 (kuvio 6A), HT29 (kuvio 6B) ja DLD-1 (kuvio 6C) solu linjat käsittelyn jälkeen yhdistelmä aikataulun. PARP on proteiini osallisena DNA: n korjauksessa ja lasku on samanlainen fysiologinen merkitys, että sen katkaisun, koska alhaisempia PARP vältetään DNA: n korjaukseen ja solut laukaistaan ​​apoptoosin sitoutumiseen.

(A-C) SW620, HT29 ja DLD-1-solut ympättiin kuten kuvattu kohdassa materiaalit ja menetelmät ja käsiteltiin kaksi pitoisuuksien ChoKα estäjien [TCD-717: 6 uM (vasen rivi) tai 10pM (oikea rivi); MN58b: 10 uM (vasen rivi) tai 15 uM (oikea linja)] 24 tuntia ja, missä merkitty, 5,5 uM 5-FU tai ajoneuvo vielä 24 tuntia. Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot käyttäen polyklonaalista vasta-ainetta anti-PARP. Taakse kaavio, tiedot osoittavat proteiinin tasot (PARP /GAPDH) lasketaan keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (A) SW620. (B) HT29. (C) DLD-1. (D) PARP ja ChoKα ekspressiotasot HT29 ja SW620-solulinjat, jotka on transfektoitu tietyllä ChoKα siRNA määritettiin Western blot-analyysi tai ohjaus sekoituskoodin siRNA (scr). Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot käyttäen ChoKα monoklonaalista vasta-ainetta ja polyklonaalista vasta-ainetta anti-PARP. Alla jokainen Länsi suhde PARP /Tubulin on edustettuna. (E) kaspaasi 3: n aktiivisuuden (ylempi paneeli) ja sen katkaisun (alempi paneeli) määritettiin HT29-hoidon jälkeen MN58b: ssa 24 tuntia. (F) kaspaasi 3 entsymaattinen aktiivisuus mitattiin myös transfektion jälkeen HT29 kanssa ChoKα tietyn siRNA tai ohjaus siRNA (SCR) 48 tuntia. Western blot edustaa tasojen ChoKα transfektion jälkeen, ja sen suhteellinen lasku normalisoitu GAPDH tasolle.

HT29 ja SW620-solut transfektoitiin myös erityisen siRNA-ChoKα. Kuten on esitetty kuviossa 6D, samanlaisia ​​tuloksia saatiin kuin ChoKα farmakologinen esto, jolla on voimakas väheneminen PARP tasoilla, osoitus spesifisyyden vuoksi ChoKα inhibition.

Koska lisänäyttöä apoptoosin induktion jälkeen ChoK estäjien koolonkarsinoomasoluissa, kaksi vaihtoehtoista tapaa aloittamisen apoptoottisen signaloinnin koneita käytettiin. Kaspaasi 3 aktiivisuus ja lohkaisu oli helposti havaitaan sen jälkeen MN58b hoidossa HT29 (kuvio 6E). Downregulation ChoKα ilmaisun erityisillä siRNA myös lisääntynyt kaspaasiaktiivisuus, edelleen tukea spesifisyyttä tämä vaikutus perustuu vähentämiseen ChoKα aktiivisuuden (kuvio 6F). Näin ollen, ChoK-inhibiittorit kykenevät indusoimaan apoptoosin kaspaasi 3

Lopuksi TS tasot analysoitiin kasvaimet syntyvät

in vivo

ksenograftimallissa DLD-1-hoidon jälkeen MN58b ja 5-FU: n ja kontrolliin verrattuna, käsittelemättömät hiiret (kuvio 7). Tilastollisesti merkittävä väheneminen TS tasolla (sekä kokonais- ja aktiivista proteiinia) havaittiin käsitellyt kasvaimet MN58b yksin tai yhdessä 5-FU, kun taas mitään merkittävää eroa havaittiin kasvaimia hiirille on 5-FU yksin.

Hiiret inokuloitiin DLD-1-soluja, kuten edellä kohdassa Materiaalit ja menetelmät ja joko jätettiin käsittelemättä tai käsiteltiin MN58b tai 5-FU yksin tai yhdistelmänä. A) TS ekspressiotasot Jokaisen kokeen ryhmä: ohjaus, MN58b, 5-FU: n ja yhdistelmä ryhmä. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. B) Kaavio edustaa tarkoittaa proteiinin tasot TS /tubuliinin suhteet kullekin ryhmälle. Mustat palkit edustavat yhteensä TS /tubuliinia arvoja; Harmaat pylväät edustavat TS aktiivinen arvoja. (*) Tilastollisesti merkitsevä (p 0,05), verrattuna kontrolliryhmään.

Down-regulation mRNA tasojen TS ja TK1 geeni hoidon jälkeen ChoKα estäjien ja 5FU DLD-1, SW620 ja HT29

Prekliiniset ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että TS ilmaisu on tekijä 5-FU herkkyys ja kliinisten tulosten [31], [32]. Sen mukaisesti nämä tulokset, geenien monistuminen TS sitä kautta lisää TS-mRNA: n ja proteiinin, on havaittu solulinjoja, jotka ovat resistenttejä 5-FU: [31], [33], [34].

edellä esitetyn perusteella tuloksia, SW620, HT29 ja DLD-1-soluja käsiteltiin MN58b ja TCD-717: ssa 24 tuntia. Hoito ChoKα estäjien aiheutti huomattavan alas-säätely Sekä TS ja TK1 mRNA-tasot määritettynä reaaliaikainen Q-PCR-määrityksen käyttäen spesifisiä koettimia Hs00426591_m1 TS ja Hs01062125_m1 varten TK1 (kuva 8). Nämä tulokset osoittavat, että alas modulaatio proteiinissa tasot TS ja TK1 aiheuttama ChoKα inhibiittorit tulokset huomattava vähentäminen transkriptionaalisella tasolla, joilla on merkittävä vaikutus sekä TS, ja sen pelastaa reitin välittämä TK1. Koska tasot E2F1 olivat myös merkittävästi vähentää, on kohtuullista ehdottaa, että tämä transkriptiofaktori on vastuussa havaitut vaikutukset TS ja TK1 inhibitio kuten aikaisemmin on kuvattu [29], [30].

2,5 × 10

5 DLD-1, HT29 ja SW620 solulinjoja istutettiin 6-kuoppalevyille ja inkuboitiin optimaalisissa olosuhteissa 24 tuntia. Seuraavaksi solut altistettiin eri pitoisuuksia ChoKα estäjien 24 tuntia. Tasot TS ja TK1 analysoitiin RT-qPCR kuten kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. 18S käytettiin endogeenisen ohjaus normalisointi.

Edelliset tulokset olisivat yhdenmukaisia ​​yleinen vaikutus geenin transkriptio aiheuttama ChoKα estäjiä. Voit testata tätä mahdollisuutta, mRNA-tasoja muiden proteiinien mukana myös 5-FU vaikutusmekanismia tutkittiin. Toisin kuin mitä oli havaittu TS tai TK1, uridiinifosforylaasi (

UPP1

) lisättiin sen jälkeen, kun hoidon ChoKα estäjien (kuvio 9). Tämä korkeus voi olla fysiologisesti relevantti, koska

UPP1

vastaa muutosta 5-FU välittävälle metaboliitti, joka muunnetaan aktiivisia metaboliitteja fluoriuridii- trifosfaatiksi (FUTP) ja fluorideoksiuridiini trifosfaatiksi (FdUTP). Siten vaikutukset havaittiin E2F1, TS ja TK1 eivät vastaa yleistä, epäspesifinen vaikutus geenin transkriptioon.

2,5 × 10

5 DLD-1, HT29 ja SW620 solulinjoja ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 h vakio-olosuhteissa. Sen jälkeen soluja käsiteltiin ChoKα inhibiittorit, TCD-717 (6 ja 10 uM) ja MN58b (10 ja 15 uM) aikana 24 tuntia. 18S käytettiin endogeenista kontrolli.

Effects of ChoKα estäjien MAPK, AKT signalointi ja seramideja tasoilla

Kuten aiemmin kuvanneet meille ja Chesney ryhmä [40] – [42] esto ChoKα on vaikutusta MAPK-kinaasin ja AKT signalointireitteihin kanssa jyrkkä aleneminen fosforyloidun muodoissa useissa solutyypeissä. Sopusoinnussa näiden tulosten, kun SW620-soluja käsiteltiin ChoKα estäjiä jyrkkä vähentäminen sekä p42 /p44 havaittiin (kuvio 10A). Toisin aiempien raporttien muita solulinjoja, ei ole merkittävää vaikutusta ei havaittu fosforylaation Pakt-Ser

473 (kuvio 10B). Lisäksi mitään vaikutusta joko signalointireittiä havaittiin käsittelemällä SW620-solujen kanssa 5-FU yksin, eikä merkittäviä muutoksia havaittujen vaikutusten kun solut käsiteltiin ChoKα estäjien havaittiin alle yhdistelmä olosuhteissa.

(A ) 2,5 × 10

5 SW620-soluja siirrostettiin 6-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tuntia ja altistettiin kahdelle pitoisuuksien ChoKα estäjien [TCD-717: 6 uM (vasen rivi) tai 10pM (oikea rivi); MN58b: 10 uM (vasen rivi) tai 15 uM (oikea linja)]. Milloin on osoitettu, väliaine poistettiin käsittelyn jälkeen ChoKα estäjien ja muuttunut tuoretta kasvualustaa 5,5 uM 5-FU: ssa vielä 24 tuntia. Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blot käyttäen monoklonaalisia anti-fosfo p44 /p42 MAPK ja anti-p44 /P42 MAPK. Kuviossa on esitetty tyypillinen blot kahden itsenäisen kokeen. (B) SW620-soluja kasvatettiin ja käsiteltiin kuten on esitetty (A), 15 uM MN58b ja 5,5 uM 5-FU yksinään tai yhdessä 24 tuntia. Proteiinin ilmentyminen analysoitiin Western blotilla käyttämällä anti-pAKT- Pa

473, anti-AKT tai anti-GAPDH. Kuvassa näkyy päällä edustavan blot, alareunassa proteiinin tasot (Pakt-Ser

473 /yhteensä AKT /GAPDH) edustavasta kokeesta. (C) 2 x 10

6 SW620-soluja siirrostettiin p100 levyille ja inkuboitiin 24 tuntia normaaliolosuhteissa. Sitten soluja käsiteltiin 15 uM MN58b ja 5,5 uM 5-FU yksinään tai yhdessä 24 tuntia. Yhteensä Seramiditasojen analysoitiin UPLC-TOF. Keskiarvo ± SD kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty.

Lopuksi sukupolven seramidien on havaittu erityisesti Jurkat-soluissa hoidon jälkeen MN58b kun taas mitään merkittävää kasvua ei havaittu ihmisen primaarilymfosyyteissä [22 ]. Tämä voi olla vastuussa apoptoosin induktion tämän solukkojärjestelmässä, ja se voisi myös selittää havaitun synergia tässä tutkimuksessa. Ei kuitenkaan vaikuta ceramides tasot havaittiin jälkeen 5-FU hoito yksinään eikä sen jälkeen kombinatorisista aikatauluja MN58b ja 5-FU (kuvio 10B), lukuun ottamatta tätä mekanismia vastuussa synergiaa havaittiin, kun 5-FU yhdistettiin ChoK estäjiä.

keskustelu

Colon syöpä on yksi yleisimmistä kuolinsyistä syöpään maailmanlaajuisesti. Vakiohoito CRC perustuu 5-FU ensilinjan yleensä yhdessä muiden sytostaattien kuten oksaliplatiinia tai topoisomeraasi I -estäjä CPT-11 (Irinotecan) [33] – [35].

parempi tuntemus molekyylibiologian CRC kasvaimia on muuttunut hallintaa CRC potilaita, joilla asema K-Ras mutaatiot kriittisenä päätöksenteon ongelma. Lukuisat kliiniset kokeet ovat käynnissä parantaa aikataulut CRC potilaille, kuten monien muiden syöpien riskiä. Kuitenkin alhainen parantavia hoitoja tekee edelleen välttämätöntä tutkia uusia hoitomenetelmiä paremmin hinnat selviytymistä. Tässä mielessä erittäin etsitään aktiivisesti uusia hoitoja perustuu kombinatorisista kemoterapiaa ja täsmähoitoihin on synnyttänyt uusia lupaavia vaihtoehtoja. Tämä strategia perustuu aikatauluja, jotka ovat lisänneet hoitovaste 10-15% 5-FU yksin 40-50% yhdistettynä kemoterapia [6], [7].

Kohdennettu hoito on hoito, jossa on keskittynyt mekanismi, joka nimenomaan toimii häiritsevän hyvin määritelty tavoite tai biologisia polku [36]. Tällä hetkellä nämä uudet lähestymistavat olisivat todellinen lupaus parantaa hallintaa ja lopputulos syöpäpotilaiden, koska se nimenomaan vaikuttavan syöpäsolukoihin ja siksi pitäisi olla vähemmän sivuvaikutuksia kuin muita terapeuttisia hoitoja.

ChoKα on yli-ilmennetään monenlaisia ​​ihmisen kasvaimissa mukaan lukien peräsuolen syöpä [11] – [16]. Lisääntynyt veren kokonaiskolesterolia koliini aineenvaihduntatuotteiden, kuten fosfokoliini, tuote ChoK toiminnan, on myös yhteinen piirre monissa kasvaimia [37]. Näin ollen, ChoKα on uusi mielenkiintoinen kohde kehittämiseksi syövän hoitomuotoja. Tämän seurauksena, ChoKα estäjät on tiivistetty erityisesti häiritse sen toimintaa [10], [18], [20], [21].

yhdistelmä siRNA-ChoK 5-FU rintasyövän solut on osoittanut vähentämistä solujen elinkelpoisuuden ja lisääntymistä [27]. Kuitenkin tämä hoito perustuu käytön siRNA, joka ei kuljetetaan kohdesoluihin

in vivo

tehokkaasti. Täällä käytämme kaksi kemiallisia estäjiä suunniteltu vastaan ​​ChoKα (MN58b ja TCD-717), jossa suuri teho kasvainsoluja vastaan ​​

in vitro

ja

in vivo

, tutkia vaikutusta yhdistelmän 5-FU ja tätä uutta kohdennettua terapeuttinen lähestymistapa parantaa nykyisiä CRC hoitoja. Vahva synergistinen kasvaimen kasvua estävä vaikutus, kun 5-FU: n ja ChoKα inhibiittoreita käytettiin yhdistelmänä vastaan ​​useita CRC solulinjoja on raportoitu.

Aiemmat raportit ryhmämme osoittavat, että apoptoosin induktio inhiboimalla ChoKα liittyy tiettyyn sukupolven keramidien kasvainsoluissa [22], [23]. Dramaattinen ero vastauksena erityisiin ChoKα estäjien on havaittu normaalin ja kasvaimen soluihin. Kun taas tukkeutumisen

de novo

fosfokoliinin (PCho) synteesin MN58b primaarisissa soluissa indusoi retinoblastoomasolulinjassa (Rb) defosforyloinnilla ja tulokset palautuvia solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheessa kasvainsolut kärsivät jyrkkä huojuntaa metaboliaan tärkeimmät kalvolipidien fosfatidyylikoliini ja sfingomyeliini, tuloksena merkittävä kasvu solunsisäisen seramiditasot, joka edistää apoptoosia [22], [23]. Nämä ensimmäiset kokeet on toistettu muita solutyyppejä, mukaan lukien paksusuolen syöpä solulinjat (tietoja ei esitetty). Lisätodisteita on raportoitu, että osoittaa selvästi esto PI3K /AKT ja ERK signalointi väylät ChoK inhibiittorit [38], [39], [40]. Kuitenkin kellarissa järjestelmissä käytetään tässä tutkimuksessa ei MAPK eikä AKT signalointi tai ceramides sukupolvi on muuttunut merkittävästi 5-FU hoito yksinään. Mitään merkittävää vaikutusta ei havaita joko silloin, kun soluja käsiteltiin kombinatorisista järjestelmiä, jotka oli voimakas synergia sekä in vitro tai in vivo olosuhteissa. Nämä tulokset yhteensä osoittavat, että edellisen vaikutukset raportoi toimintamekanismit ChoKα estäjien joko MAPK, AKT ja keramidit signalointi eivät ole vastuussa synergiavaikutuksesta havaittu koolonkarsinoomasoluissa kun yhdistetään ChoKα estäjiä ja 5-FU.

Tässä on tutkittu tarkemmin mekanismia synergiaa ChoK estäjiä ja 5-FU parempaa ymmärtämistä ja parantaa sen mahdollinen käyttö klinikalla. TS-proteiini on keskeinen rooli biosynteesissä tymidylaattisyn-, olennainen esiaste DNA-synteesiin [41]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että TS-proteiinin tasot ovat korkeampia useissa kasvaimissa kudoksissa verrattuna niiden normaaliin kollegansa [42]. Lisäksi korkea TS arvot liittyvät huonon ennusteen näistä syövistä [43] – [45]. Toinen kriittinen entsyymiä tymidiinin aineenvaihdunta on TK1 joka kasvoi aktiivisuus merkitsee mahdollisuutta resistenssimekanismi 5-FU: [46].

Tässä osoitamme, että ChoKα inhibiittorit indusoivat voimakkaan alaspäin modulaation tasojen sekä TS ja