Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta kaikista veripohjaisten biomarkkerit käytetään valvomaan eturauhassyövän potilailla, eturauhasen syöpä on edelleen toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus miehillä Yhdysvalloissa. Tämä johtuu suurelta osin ei ymmärretä molekyyli polkuja, jotka ovat vastuussa aggressiivinen muotoja eturauhasen syöpiä, kastraattialueelle kestävä eturauhassyöpä ja metastaattinen eturauhassyöpä. Cell signalointipolkujen aktivoidaan

erbB2

onkogeeni tai

RAS

onkogeeni usein todettu muuttaa metastasoivaa eturauhasen syöpiä. Arvioida ja määrittää rooli ErbB2 /RAS-reitin eturauhassyövän etäpesäkkeiden, olemme arvioineet vaikutusta

erbB2

– tai

RAS

-overexpression on metastaattisen mahdollisuudet neljän eturauhasen syöpäsolun linjat johdettu kasvaimia eri androgen suuntauksiin. Voit tehdä niin, me transfektoitu ihmisen DU145, LNCaP ja PC3 syöpäsolujen ja hiiren Myc-Cap syöpäsolujen kanssa aktivoitua muotoa

erbB2

tai

H-RAS

ja arvioidaan metastasoituneeseen potentiaalit kolmea täydentävää määrityksissä, haavan paranemista määrityksessä siirtokuoppaan liikkuvuuden määritys ja siirtokuoppaan invaasiomääritys. Osoitimme, että vaikka yli-ilmentyminen

ErbB2

lisäsi metastaattista potentiaalia androgeenisäädellyn tunteeton syöpäsolujen (ts PC3 ja DU145), se ei vaikuttanut metastaattinen potentiaalit androgeenin herkkien syöpäsolujen (ts LNCaP ja myc-cap). Sen sijaan yli-ilmentyminen

H-RAS

kasvoi vain solun motiliteettia Myc-CAP soluja, jotka yli-ilmentävät ihmisen

c-MYC

onkogeeni. Tuloksemme viittaavat siihen, että ErbB2: ta tekee yhteistyötä androgeenin signalointi edistää eturauhassyövän etäpesäkkeiden, ja että vaikka RAS on yksi kriittinen alavirran efektoreja ErbB2, se ei phenocopy ErbB2: sen vaikutus metastaattisen potentiaalin eturauhassyövän solulinjoissa.

Citation: Tome-Garcia J, Li D, Ghazaryan S, Shu L, Wu L (2014) ErbB2 Lisäykset Metastaattinen potentiaalit Erityisesti in androgeenin Insensitive syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (6): e99525. doi: 10,1371 /journal.pone.0099525

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 17 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Tome-Garcia et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot ovat saatavilla paperilla.

Rahoitus: Start-up varoja Rutgers New Jersey Medical School. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin ei-ihon syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus miehillä Yhdysvalloissa [1]. Kasvusta huolimatta seulonta varhaisen havaitsemisen ja seurannan, eturauhassyövän aiheuttamaa kuolleisuutta on pysynyt samalla tasolla [2]. Tämä johtuu todennäköisesti sekä kyvyttömyys diagnostisesti erottaa ei-invasiivisia, veltto paikallinen eturauhasen syöpiä ja erittäin aggressiivinen paikallisia syöpiä korkea metastaattinen potentiaali, ja huono ymmärtämistä solu- ja molekyylitason perustan metastasoituneen eturauhassyövissä [3].

Yksi parhaista tutkittu geenien ihmisen maligniteettien, mukaan lukien eturauhassyöpä, on

erbB2

tai

HER2

tai

NEU

onkogeeni. ErbB2: on jäsen, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) perheeseen, joka koostuu neljästä jäsentä (EGFR, ErbB2:, ErbB3 ja erbB4), jotka toimivat tyrosiinikinaasi-reseptorit [4] – [7]. Niitä pidetään tehokkaina välittäjinä solujen kasvun ja syövän kehitykseen [8] – [10]. Rintasyövässä vahvistus tai yliekspressio

ErbB2

on yhteinen tapahtuma, joka näkyy 15-30% kaikista näytteistä [11], ja

erbB2

geenin monistuminen ja /tai yli-ilmentyminen on liittynyt joilla on huono kliininen tulos [12], [13]. Yhdenmukainen tärkeä rooli ErbB2 rintasyövän etäpesäke, yliekspressio konstitutiivisesti aktivoitua muotoa

erbB2

(eli

Neut

) [14] hiirillä riittää laukaisemaan metastaattisen maitorauhaskasvaimet [15 ]. Kuitenkin mahdollista roolia ErbB2 kehittämisessä metastaattisen eturauhassyövän on epäselvä osittain siksi erilaisia ​​yrityksiä arvioimaan taajuuksilla

erbB2

vahvistus /yli-ilmentymisen ihmisen eturauhassyöpänäytteissä tuotti ristiriitaisia ​​tuloksia [16] – [25]. Mielenkiintoista,

erbB2

yli-ilmentyminen on liitetty androgeeni kestävä metastaattinen eturauhassyövissä [26], mikä viittaa mahdollisen tehtävän ErbB2 hankintaan metastaattisen potentiaalin eturauhassyöpäsolujen.

yli-ilmentyminen

erbB2-

tuloksia induktion useita signalointireittien, kuten fosfoinositidi-3-kinaasi /proteiinikinaasi B (PI3K /AKT) reitti ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) reitti [27]. Sekä PI3K /AKT-reitin ja MAPK-reitin säätelevät solujen lisääntymistä ja solujen eloonjäämistä, ja ovat sekaantuneet syövän etäpesäkkeiden [28] – [30]. Pääasiallinen alavirtavaikuttajainhibiittorit ErbB2, joka säätelee näiden kahden kinaasin reitit on onkogeeninen

RAS

, vaikka erbB2: on myös mahdollisuus aktivoida PI3K /AKT riippumaton

RAS

aktivointi [31]. Tärkeää on, PI3K /AKT ja MAPK ovat vain RAS-efektori reittejä yleisesti mutatoitunut ihmisen syövissä [32].

RAS

onkogeenien koodaavat kolme monomeeristä GTPaasit, H-RAS, N-RAS, ja K-RAS, jotka aktivoituvat, kun sidottu GTP. Vaikka esto

RAS

androgeeni-riippumaton PC3 syöpäsolujen ja androgeeniriippuvaisissa LNCaP syöpäsolujen johtanut kasvun pysähtymisen ja apoptoosin [33], konstitutiivinen aktivoituminen RAS /MAPK-reitin LNCaP eturauhassyövän solut edistetään androgeenireseptorin yliherkkyys [34]. Lisäksi immunohistokemiallinen analyysi hormoni-herkkä ja hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä yksilöitä osoitti, että lisääntynyt ilmentyminen

N-RAS

liittyi hormoni tulenkestävät eturauhasen syöpiä, ja korreloi lyhyempi aika kasvaimen uusiutumisen ja vähensi tautikohtaiset selviytyminen [35]. Eräässä xenograph hiirimallissa, aktivointi kaksi RAS efektori väyliä,

Raf /ERK

ja

RalGEF

, että kohtalaisen metastaattisen DU145 eturauhassyöpä-solulinjaa edistää etäpesäkkeiden aivoihin ja luun, vastaavasti [ ,,,0],36]. Nämä tiedot viittaavat mahdolliseen rooliin RAS edistämisessä etäpesäkkeitä ihmisen eturauhasen syöpiä.

määritellä tarkemmin mahdollisia rooleja ErbB2 /RAS-reitin edistämisessä eturauhassyövän etäpesäkkeiden olemme tutkineet vaikutuksia yliekspressio

erbB2

tai

RAS

metastaattista ominaisuuksista kolmen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja yksi hiiren eturauhassyöpäsolulinja eri androgeenivaikutuksen herkkyyksiä ja eri metastaattisen potentiaaleja. Tätä varten meidän on ensin transfektoitu kolme yleisesti käytetty ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (DU145, LNCaP ja PC3) ja yksi hiiren eturauhassyöpäsolulinja (Myc-cap) kanssa aktivoitua muotoa

erbB2

tai

H-RAS

. Sitten arvioitiin metastaattisen potentiaalin muuntogeenisen soluja kolmen eri täydentäviä määrityksiä, haavan paranemista määrityksessä siirtokuoppaan liikkuvuuden määritys, ja invaasiomääritys. Olemme havainneet, että vaikka yliekspressio

ErbB2-

lisääntynyt metastaattisen potentiaalin erityisesti androgeenista epäherkkiä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, yliekspressio

RAS

ei ollut samankaltaisia ​​vaikutuksia metastaattinen potentiaali, mutta erityisesti lisääntynyt solun liikkuvuus on

c-MYC

-overexpressing hiiren Myc-cap soluja.

Methods

Solulinjat ja Cell Culture

Myc-Cap on ei-metastaattinen, androgeenireseptorin -sensitive hiiren eturauhassyöpäsolulinja joka perustettiin alkutuotannosta eturauhaskasvaimissa eristää

Pb-Hi-Myc

hiirissä [37]. LNCaP [38], DU145 [39], ja PC3 [40] ovat kolmen ihmisen metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa erilaisilla, androgeenin herkkyydet ja eri metastaattinen ominaisuudet (taulukko 1). LNCaP ja PC3 solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa, ja Myc-CaP-soluja kasvatettiin DMEM: ssä. Molemmat media täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS). DU145-soluja ylläpidettiin DMEM: Hamin F12-alustassa (01:01), johon oli lisätty 10% vastasyntyneen vasikan seerumia. Amfotrooppisille Phoenix soluja käytettiin retroviruksen transfektioon ja pidettiin DMEM täydennetty 12,5% FBS. Senescent BJ ihmisen ihon fibroblastisoluja syntyy monistus vanhenemista [41], ja käytettiin positiivisena kontrollina β-galaktosidaasin aktiivisuus määritys. Ne pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki solut viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Retroviral transfektio

Retrovirusperäiset yliekspressio vektorit

pBabe-puromysiini-H- Ras

ja

pBabe-puromysiini-ErbB2

, joka yli-ilmentävät mutatoitunut muoto ihmisen

H-RAS

geeni (

H-RAS

G12V

) ja konstitutiivinen aktivoitu muoto ihmisen

erbB2

geeni (

Neut

), vastaavasti, olivat lahja Dr. Gustavo Leone. Suuritiitteristen viruksia valmistettiin kalsiumfosfaatin lyhytaikaisella transfektiolla retrovirus-konstruktien kohdalla amfotrooppinen Phoenix pakkaus solut kuten aiemmin on kuvattu [42]. Olemme tartunnan eturauhasen syöpäsolujen tuoreella retrovirusten käyttäen tavanomaisia ​​menetelmiä polybreenin (4 ug /ml). Infektoidut solut altistettiin valinta puromysiinin (2,5 ug /ml) viiden päivän ajan. Puromysiiniresistenttiä soluja viljeltiin tuoreessa DMEM ilman puromysiinissä yhden päivän ennen kuin joko korjataan valmistautua solulysaateista Western blotting-analyysi, tai uudelleen päällystetty kokeita varten. Kaikki tiedot esitetään kerättiin käyttämällä soluja vähintään kahdesta itsenäisestä retrovirus- transfektiot että tuotti samanlaiset tasot

ErbB2

ja

RAS

yli-ilmentymisen.

Western Blot

solulysaatteja kanssa yhtä suuret määrät proteiineja (30 ug) erotettiin 8% SDS-PAGE, paitsi ERK ja Perk, jonka solulysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE. Erotetut proteiinit olivat sitten siirrettiin elektroforeettisesti 0,45 uM nitroselluloosakalvolle (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), joka oli tämän jälkeen tukittiin 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20: tä (w /v)). Blotteja inkuboitiin sitten sopivia laimennoksia primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa TBST, joka sisälsi 3% rasvatonta maitojauhetta. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään Western blot-analyysi sisältää polyklonaalisia vasta-aineita H-RAS (sc-520), E2F1 (sc-193), E2F2 (sc-633), ERK1 /2 (sc-135