Krooninen sairaus

tiivistelmä

ATP-aidatulla P2X7 on osoitettu olevan tärkeä rooli invasiivisuus ja etäpesäkkeiden joidenkin kasvainten. Kuitenkin mahdolliset yhteydet ja taustalla välisiä P2X7 ja eturauhassyövän ei ole selvitetty. Tässä me osoitimme, että P2X7 oli hyvin ilmaistu joitakin eturauhasen syöpäsoluja. Down-regulation P2X7 siRNA merkittävästi heikennetty ATP- tai BzATP perustuva maahanmuutto ja invaasion eturauhasen syöpäsolujen in vitro, ja se esti kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden paljaisiin hiiriin. Lisäksi, hiljentämisen P2X7 erittäin heikennettyä ATP- tai BzATP- ajettu ilmentyminen muuttuu EMT /invaasion liittyvien geenien Snail, E-kadheriinin, Claudin-1, IL-8 ja MMP-3, ja heikensi fosforylaation PI3K /AKT ja ERK1 /2 in vitro. Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin nude-hiirissä. Nämä tiedot osoittavat, että P2X7 stimuloi solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden eturauhassyöpäsoluissa kautta jotkut EMT /invaasio liittyviä geenejä sekä PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin. P2X7 voisi olla lupaava terapeuttinen kohde eturauhassyövässä.

Citation: Qiu Y, Li W-h, Zhang H-q, Liu Y, Tian X-X, Fang W-G (2014) P2X7 välittää ATP-Driven invasiivisuus eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (12): e114371. doi: 10,1371 /journal.pone.0114371

Editor: Jean Kanellopoulos, University Paris Sud, Ranska

vastaanotettu: 15 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 06 marraskuu 2014; Julkaistu: 08 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustukset WGF National Natural Science Foundation of China (81321003, 30971152), ja 973 Program (2010CB529402) päässä Ministry of Science and Technology of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, ja myös yksi johtavista syistä naisten syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Useimmat potilaat eivät kuole paikallisten primaarikasvaimen, mutta kaukaisten etäpesäkkeitä. Prosessi syövän etäpesäkkeiden koostuu peräkkäisten ja toisiinsa tapahtumat [2]. Yhtäältä syöpäsolut voivat hankkia vaeltavia ja invasiivisia ominaisuuksia epiteelivoltti mesenkymaalitransitioon (EMT), minkä ansiosta ne voivat hankkia valmiuksia tunkeutua ympäröiviin kudoksiin ja lopulta etäpesäkkeitä kaukaisiin kohtiin [3]. Toisaalta, vuorovaikutukset syöpäsoluja ja kasvaimen mikroympäris- ovat välttämättömiä metastaattisen levittämistä kasvainten soluihin [4]. Aikaisemmat tutkimukset ovat keskittyneet tärkeän kasvaimeen mikroympäristön molekyyli, adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP).

Sen lisäksi, että intrasellulaarisen rooli solujen aineenvaihduntaan energialähteenä, ATP on laajalti hyväksytty ekstrasellulaarisen signalointimolekyyli, ja voidaan vapauttaa solunulkoiseen ympäristöön sekä fysiologisia että patologisia tilanteita, kuten neurotransmissiota, kudosten vaurioita, et ai [5], [6], [7]. Nyt on selvää, että ATP on yksi runsas biokemiallisten komponenttien kasvain microenvironment ja sillä on keskeinen rooli isännän kasvain vuorovaikutus. Solunulkoinen ATP toimii signalointi molekyyli vuorovaikutuksessa P2-reseptorien ja välittää erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten solujen lisääntymisen, muuttoliike ja invaasio [8], [9], [10]. P2-reseptorit on jaettu kahteen eri perheeseen: G-proteiiniin kytketty P2Y-reseptorit (P2Y1-, 2, 4, 6, 11, 12, 13 ja 14) ja ligandin-porteilla kationi läpäisevän kanavan P2X-reseptorit (P2X1-7) [11]. Useat P2-reseptorien on raportoitu ekspressoituvan eturauhassyövän soluissa [10], [12]. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että solunulkoinen ATP oli tärkeä pro-invasiivisia aine ja P2Y2 oli yksi keskeisistä reseptorit, jotka välittämän ATP-edistänyt muuttoliike ja invaasion eturauhassyöpäsolujen [10]. Olemme kuitenkin myös havainneet, että ATP-välitteinen pro-invasiivisuus ei voida kokonaan lakkautetaan jälkeen maksimaalinen vaiennettu P2Y2-, mikä osoittaa, että jotkut muut reseptorin alatyyppi (t) saattaa olla mukana tässä prosessissa. Niistä P2X-reseptorin perhe, P2X7 on uusin kloonattua jäsen [13], ja alun perin pidetään sytolyyttisen reseptori, koska sen pitkäaikainen aktivaatio johtaa solukuolemaan [14]. Äskettäin todettiin, että P2X7 oli ilmentyy runsaana syöpäsoluja leukemia, neuroblastooma, melanooma, kuten myös eturauhasen, rinnan ja kilpirauhassyöpä [15], [16], [17], [18], [19], ja oli jopa ehdotetaan olevan biomarkkeri varhaisessa vaiheessa syöpä [17], [20], [21]. Lisäksi aktivointi P2X7 oli raportoitu olevan anti-apoptoottiset vaikutukset, edistää kasvainsolujen kasvua [22], [23], ja jopa edistää solujen invasiivisuus joissakin syöpäsoluissa [24], [25], joka on ristiriidassa alkuperäisen olettaen, että P2X7 oli ”kuoleman reseptori”. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään roolin P2X7 vuonna hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden eturauhassyövän, ja paljastaa taustalla olevien mekanismien.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja vasta

ATP, BzATP, KN62, LY294002, U0126 ja Digitonin saatiin Sigma (St Louis, MO, USA). Kanin anti-P2X7-vasta-ainetta (# Apr-008) saatiin Alomone Labs (Jerusalem, Israel), ja vasta-aineita β-aktiini (# TA-09), ERK1 /2 (# SC-94) ja E-kadheriinin (# SC-7870) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineita, Snail (# 3895S), Claudin-1 (# 4933P), p-AKT (# 4056S), AKT (# 4691S), ja p-ERK1 /2 (# 9101S) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri (# ZB-2305) ja vuohen anti-kani-IgG: tä (# ZB-2301) saatiin Origene (Maryland, USA). Fluo-4AM (# F14201) saatiin Molecular Probes (Eugene, OR, USA). HBSS (# 14025092) ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

1E8 ja 2B4-soluja, jotka ovat peräisin PC-3M ihmisen eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja. 1E8 oli erittäin metastaattinen, kun taas 2B4 oli ei-metastasoitunut [26]. 22RV1 eturauhassyöpä-solulinjaa ja BPH1 hankittiin American Type Culture Collection. Kaikki solut viljeltiin RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia, kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Käänteinen transkriptio ja real-time PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeita noudattaen. 2 ug kokonais-RNA: ta käänteisesti cDNA: ksi käyttäen MMLV-käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, Wisconsin, USA), ja reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Spesifisten alukkeiden ostettiin Invitrogen ja lueteltu S1 taulukossa. Lämpösykli-olosuhteet olivat seuraavat: 10 minuuttia 95 ° C: ssa, 30 sykliä 15 s 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa. Suhteellinen geenin ekspressiotasoja, normalisoidaan P-aktiinin ilmentymistä, laskettiin käyttäen 2

– △△ Ct menetelmä [27].

Solulyysis ja western blot-analyysi

Kokosolulysaatti uutettiin RIPA-puskurilla (Applygen Technologies Inc, Peking, Kiina), joka sisälsi proteaasinestäjiä ja fosfataasiestäjät (Roche, Mannheim, Saksa). Pitoisuus proteiinin määritettiin käyttäen BCA-reagenssia (Applygen Technologies Inc, Peking, Kiina). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), ja niitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli, joilla on primaarinen vasta-aineita P2X7 (1:200), E-kadheriinin (1:500), Claudin-1 (1:1000), Snail (1:1000), β-aktiini (1:1000), ERK1 /2 (1:1000), AKT (1:1000), p-ERK1 /2 (1:1000) tai p-AKT (1:1000), vastaavasti. Immunoreaktiivisia proteiinit visualisoitiin kemiluminesenssin (Applygen Technologies Inc) ja kvantitoitiin densitometrialla analyysillä käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

Soluja viljeltiin läsnä ollessa tai ilman ATP, ja supernatantti otettiin talteen sen jälkeen, kun eri tavalla. Supernatantti säilytettiin -80 ° C: ssa sen jälkeen, kun oli sentrifugoitu 12000 rpm: llä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. IL-8 ja MMP-3-proteiinin tasot mitattiin erikseen käyttäen IL-8-ELISA-pakkausta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja MMP-3: ELISA-kitillä (Boster, Wuhan, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita. Konsentraatio IL-8 ja MMP-3 määritettiin vertaamalla absorbanssi standardin proteiinia, ja sitten normalisoidaan proteiinin kokonaismäärän.

Cell transfektio

ohimenevä geenien, kaksi erillistä siRNA oligonukleotideja kohdistaminen P2X7 käytettiin sekvenssien kanssa seuraavasti: P2X7 siRNA1, 5′-CTAGGATAATGTCCAACTAAA-3 ’ja P2X7 siRNA2, 5′-CACAGTGTCTTTGACACCGCA-3’. Sekoituskoodin siRNA: ta käytettiin negatiivisena kontrollina. 1E8 ja 2B4 eturauhassyövän solut transfektoitiin edellä siRNA käyttäen Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

vakaa geenien, kaksi plasmidia, joissa shRNA (lyhyt hiusneula-RNA ) kohdistaminen P2X7 muodostettiin käyttäen pGPU6 /GFP /Neo kloonausjärjestelmää (Genepharma Co, Ltd, Shanghai, Kiina). Sekvenssit kohdistaminen P2X7 olivat seuraavat: shRNA1, 5′-GCATGAATTATGGCACCATTA-3 ’, ja shRNA2, 5′-GCAATTCAGGGCGGAATAATG-3’. PGPU6 /GFP /Neo-vektoria, jossa hajotus- sekvenssin shRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Cell transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solukloonien vakaa pudotus P2X7 perustettiin 1E8 soluissa genetisiiniä (G418) valinta.

geenin yli-ilmentyminen, joka on ilmentävällä vektorilla, joka koodaa täyspitkää ihmisen P2X7 (hP2X7) rakennettiin (Genepharma Co, Ltd , Shanghai, Kiina), ja transfektoitiin 22RV1 syöpäsolujen.

In vitro migraatiokokeessa ja invaasiomääritys

migraatio ja invasiivisuus kyvyt eturauhassyöpäsolujen arvioitiin käyttämällä Boyden jaosto mukainen määritys kuvaamaa menetelmää Albini et al [28], jossa on joitakin muutoksia. Solumigraation analysoitiin käyttämällä 24-kuoppaista Transwell kammiot, joka sisälsi 8 ​​uM huokoskoko polyeteenitereftalaatti kalvon soluviljelmässä insertit (Costar, San Diego, CA, USA). Ylempi lokero ympättiin 0,5 x 10

5 elinkelpoisia soluja ja alempi osasto oli täynnä 600 ui NIH3T3 väliaine kuin kemoattraktantti. Inkuboinnin jälkeen tai ilman ATP: 12 tuntia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2, kammiot poistettiin. Solut yläpuolella kammion poistettiin pumpulipuikolla vanupuikkoja, ja solujen alapuolella kalvot värjättiin kristallivioletilla kuluessa tallentamisesta 4% formaldehydiä. Cell invasiivinen kyky arvioitiin käyttäen samoja teriä, kuten edellä mainittiin, mutta kalvo peitetään kalvolla Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Tässä tapauksessa, 1 x 10

5 elävät solut ympättiin ylempään osastoon. Kalvot leikattiin ja kiinnitettiin objektilaseille ja soluja havaittiin mikroskoopilla x 200 suurennuksella. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa, ja tulokset muuttoliikkeen ja invaasio normalisoituivat valvontaa.

Ethics selvitys

Kaikki hiiret esille tietyssä taudinaiheuttajista vapaa (SPF) ympäristö. Kaikki eläimet käsiteltiin mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals. Kaikki koemenettelyt ja pöytäkirjat hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitean Pekingin yliopisto (nro LA2011-72).

In vivo -määritys

BALB /c-nude-hiiriin (4 viikon ikäisiä) hankittiin Animal laitos Peking University Health Science Center ja satunnaistettiin kolmeen ryhmään (n = 8 ryhmää kohti). Kaksi 1E8 klooneja vakaa knockdovvn P2X7 sekä yksi negatiivinen kontrolli kloonia käytettiin seuraavissa kokeissa. Solut logaritminen kasvuvaiheessa kerättiin ja säädettiin PBS pitoisuuteen 5 x 10

6 solua /ml, ja 200 ui solususpensiota ihonalaisesti kunkin etummainen kylki alueella nude-hiirten. Kahdeksan viikkoa ymppäyksen jälkeen kaikki hiiret lopetettiin läpi kaula sijoiltaan, ja primäärikasvaimissa yhdessä eräiden elinten, kuten maksa, keuhkot, munuaiset ja imusolmukkeet leikattiin. Kasvaimet, maksa, keuhkot ja munuaiset hiiristä kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, upotettiin parafiiniin ja sitten otettiin leikattiin 4~5 um viipaleiksi. Jos haluat tarkkailla etäinen mikrometastaasin primaarituumorin, hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) tahra suoritettiin kudoksiin dioja. Samaan aikaan jotkut tuumorikudokset lyysattiin RIPA-lyysipuskuria havaita proteiinin ilmentymiä EMT /invaasion liittyvien geenien Western blot -analyysiä käyttämällä. Lisäksi jotkut Tuumorinäytteet upotettiin OTC-väliaineessa, ja pakastetut osat 5 um paksuus valmistettiin immunofluoresenssimäärityksellä.

immunofluoresenssimäärityksellä

Immunofluoresenssivärjäystä, kasvain näytteet upotettiin OTC-väliaineessa , ja jäädytetty osat 5 pm paksu valmisteltiin. Leikkeet kiinnitettiin asetonilla 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa, ja sitten ei-spesifinen sitoutuminen estettiin vuohen seerumissa 1 tunti huoneenlämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden Snail (Cell Signaling Technology), E-kadheriinin (Santa Cruz), tai Claudin-1 (Invitrogen), vastaavasti, ja inkuboitiin sitten FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Sigma) 1 h huoneen lämpötilassa. DAPI värjäys käytettiin visualisoimaan ytimiä. Kuvat otettiin konfokaalimikroskopialla.

Fluo-4AM ja etidiumbromidilla otto määrityksissä

Muutokset vapaa sisäinen kalsiumpitoisuus mitattiin fluoresoivan indikaattorin Fluo-4AM. Solut maljattiin 1 mm lasipohja astia ladattiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa 1 uM Fluo-4AM HBSS-puskuriin. Ylimääräinen väri poistettiin huuhtelemalla solut kahdesti HBSS. Sitten soluja inkuboitiin vielä 10 minuuttia HBSS: ssä ja käsiteltiin kanssa tai ilman ATP: n ja BzATP kuten kuviossa legendoja. Kuvat otettiin 5 sekunnin välein; lukuisia soluja näkökenttä mitattiin 350 s saada keskimääräinen Fluo-4 fluoresoiva signaali. Mitata etidiumbro- ottoa, etidiumbromidia (25 uM) lisättiin superfuusioelatusainetta ratkaisuihin. Kuvat otettiin 5 s välein 900 s. Yhteenlaskettu otto etidiumbromidia arvioitiin lisäämällä digitoniinia (100 uM) kyvetissä. Läpäisevyyttä vaikutus ATP tai BzATP arvioitiin verrattuna läpäiseväksi mitattiin, kun läsnä digitoniinipuskuriliuosta.

Solun eloonjääminen määritys

arvioimiseksi solujen eloonjäämistä, 2 x 10

5 solua ympättiin kuoppaa kohti kuuden kuoppaisissa levyissä elatusainekontrolli tai läsnä ollessa, 1 mM ATP: tä (tai 100 uM BzATP: llä), ja kasvatettiin 24 tuntia. Solujen eloonjäänti arvioitiin MTT-määritys ja data ilmaistiin% solujen eloonjäämistä verrattuna kontrolliin. Tulokset todensi manuaalinen solulaskennan. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin.

Data-analyysi ja tilastot

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. Aineisto analysoitiin SPSS 19.0. Opiskelijan

t

-testi suoritettiin arvioimaan erot kahden ryhmien ja nonparametric ANOVA käytettiin, kun useita keinoja verrattiin. Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä p 0,05.

Tulokset

Eturauhassyöpä solut ilmensivät funktionaalista P2X7

Ensinnäkin, olemme analysoineet mRNA: n ilmentymisen P2X7 eturauhassyöpäsoluissa 1E8, 2B4 ja 22RV1 sekä hyvänlaatuisen kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen BPH1 käyttäen reaaliaikaista PCR, ja totesi, että P2X7 oli merkittävästi ilmaistu 1E8 ja 2B4 eturauhassyövän solut, kun taas sen ilme oli hyvin heikko vuonna 22RV1 ja BPH1 soluja (kuvio. 1A). Lisäksi, P2X7-proteiini ilmentyy suuresti 1E8 ja 2B4 (Fig. 1 B) syöpäsolujen. Seuraavaksi tutkimme solunsisäisen vapaan kalsiumin pitoisuus ([Ca

2+] i) onko P2X7 eturauhassyöpäsoluissa oli toimiva. Solunulkoisen ATP: tä (1 mM) tai BzATP (100 uM) käsittely aiheutti merkittävää lisäystä [Ca

2+] i: n eturauhassyövän soluissa, seurattiin Fluo-4 fluoresenssi. Kuitenkin KN62 (1 uM), P2X7 antagonisti, estivät merkittävästi ATP tai BzATP aiheuttama [Ca

2+] i kasvaa (Fig. 1 C). Etidium otto kirjattiin myös eturauhassyöpäsoluissa, kun on stimuloitu ATP tai BzATP: llä, joka inhiboitui merkittävästi, kun KN62 lisättiin ulkoiseen liuokseen (Fig. 1 D-E). Kaikki nämä tulokset viittasivat siihen, että P2X7 ilmaistu eturauhassyövän soluissa oli toiminnallinen.

(A) Suhteellinen mRNA-ekspressiota P2X7 normalisoitiin β-aktiini transkriptin 1E8, 2B4, 22RV1 ja BPH1 soluja. (B) Proteiinin tasot P2X7 eturauhassyöpäsoluissa havaittiin Western blot -analyysillä ja data normalisoitiin P-aktiini. Proteiinin ilmentyminen P2X7 vuonna BPH1 soluissa määriteltiin 1. Arvot esitetään keskiarvona ± S.D. (Pystypalkit). (C) edustaja solunsisäisen kalsiumin muutokset vasteena ATP: tä (1 mM) tai BzATP (100 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa KN62 (1 uM). (D) edustaja eti- oton eturauhasen syöpäsolujen perustilan tai stimuloitaessa ATP: tä (1 mM) tai BzATP (100 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa KN62. ATP /BzATP lisättiin, kuten on osoitettu nuolella, on HBSS, joka sisältää 25 uM etidiumbromidia. (E) Etidium fluoresenssi-intensiteetti on perustilan tai stimuloitaessa ATP: tä (1 mM) tai BzATP (100 uM) läsnä ollessa tai puuttuessa KN62, esitettiin prosentteina suhteessa arvoon digitoniinipuskuriliuosta aiheuttama permeabilisation. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. * P 0,05.

P2X7 oli mukana ATP /BzATP perustuva maahanmuutto ja invaasion eturauhasen syöpäsolujen in vitro

P2X7 on osoitettu olevan yli-ilmentynyt useissa kasvaimissa [15], [16], [17], [18], [19], mutta sen rooli syövän etenemisessä on edelleen epäselvä. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että solunulkoinen ATP voisi lisätä maahanmuuttoa ja invaasion eturauhassyöpäsolujen [29], [30]. Mietimme onko P2X7 ollut merkitystä ATP välittämää biologista käyttäytymistä eturauhassyöpäsolujen. Ensinnäkin, olemme analysoineet vaikutusta P2X7 eloonjäämiseen eturauhassyöpäsolujen, ja totesi, että aktivointi P2X7 ATP tai BzATP: llä ei ollut vaikutusta solujen elinkykyä (Fig. 2A). Sen sijaan havaitsimme, että aktivoituminen P2X7 ATP aiheutti merkittävän parannuksen solumigraation ja hyökkäyksen syöpäsolujen (Fig. 2C-D). Sitten kaksi erillistä siRNA: t (siRNA1 ja siRNA2) käytettiin hiljentää P2X7 ilmaisun, ja kukin siRNA saavuttaneet merkittävän vaikutuksen pudotus P2X7 eturauhassyöpäsoluissa (Fig. 2B). Down-regulation P2X7 siRNA estää huomattavasti ATP-ajettu muuttoliikettä ja hyökkäyksen 1E8 ja 2B4 syöpäsolujen (Fig. 2C-D). Samoin knockdovvn P2X7 myös merkittävästi estänyt BzATP välittämää muuttoliike ja invaasion eturauhassyövän solut 1E8 ja 2B4 syöpäsolujen (S1 kuva). Lisäksi yli-ilmentyminen P2X7 näkyvästi parannettu ATP aiheuttaman muuttoliikkeen ja hyökkäyksen 22RV1 eturauhassyövän solut (S2A-B kuva). Nämä tulokset viittaavat siihen, että P2X7 oli mukana ATP-välitteisen muuttoliike ja invaasion eturauhasen syöpäsoluja.

(A) 1E8 ja 2B4 eturauhassyövän soluja käsiteltiin 1 mM ATP: ssa 12 h ja 24 h. Solujen eloonjäänti arvioitiin MTT: llä ja tiedot normalisoitiin niihin hallinnassa kunnossa. (B) 1E8 ja 2B4-soluja transfektoitiin kaksi eri P2X7 siRNA: t (siRNA1 ja siRNA2) tai kontrolli-siRNA: (NC). Western blot suoritettiin kokeita sen havaitsemiseksi pudotus tehokkuutta. (C-D) In ​​vitro muuttoliikettä ja invaasiota määritykset suoritettiin menetelmissä kuvatulla tavalla jaksossa puuttuessa (Control) tai läsnä oli 1 mM ATP (ATP 12 h). Tiedot solumigraation tai invaasion laskettiin prosentteina kontrollista soluja. Tulokset osoittavat histogrammit ja arvot esitetään keskiarvona ± S.D. (Pystypalkit). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. * P 0,05.

P2X7 osallistui säätelyssä EMT /invaasion liittyvien geenien ilmentyminen eturauhassyövässä soluissa

Käyttäen cDNA mikrosiruanalyysi, edellisessä tutkimuksessa kävi ilmi, että solunulkoinen ATP voisi säädellä mRNA ilmentymistä Snail, E-kadheriinin, Claudin-1 ja IL-8, joka tärkeitä rooleja EMT ja syövän etenemistä [10]. Lisäksi aiemmat tutkimuksessa eturauhassyövän osoitti, että ATP hoito voisi lisätä MMP-3, joka on laajasti mukana invaasiota ja etäpesäkkeiden syöpä [30]. Niinpä me pohti P2X7 osallistuneet näihin ATP välittämän geeni ilmaisuja. Kuten on esitetty kuviossa. 3, kun läsnä on ATP, ilmauksia Snail, IL-8 ja MMP-3 lisättiin merkittävästi eturauhasen syöpäsolujen 1E8 ja 2B4, kun taas ilmaisuja E-kadheriinin ja Claudin-1 olivat näkyvästi vähentää. BzATP osoitti samanlaista vaikutusta ilmentymiä EMT /invaasion liittyvien geenien eturauhassyövän soluissa (S3 kuva). Kuitenkin, kun pudotus P2X7 siRNA, muutokset ilmauksia Snail, IL-8, MMP-3, E-kadheriinin ja Claudin-1, jota välittää ATP tai BzATP, olivat heikennettyjä (Fig. 3 ja S3 kuvassa). Lisäksi nimenomaan estää aktivointi P2X7 sen antagonisti KN62, ATP ja BzATP voinut vaikuttaa ilmentymiä Snail, E-kadheriinin ja Claudin-1 enää (S4 ja S5 kuviot). Vastaavasti, ATP lisäsi ekspressiota Snail ja vähentyneen ilmentämisen E-kadheriinin in 22RV1 soluissa, jotka eksogeenisesti ilmaistaan ​​P2X7 (S2C kuva). Kaikki nämä tiedot osoittivat, että P2X7 oli tarpeen ATP-välitteisen ilmentymisen muutoksia EMT /invaasion liittyvien geenien eturauhasen syöpäsoluja.

P2X7 vaiennetaan soluja (siRNA1 ja siRNA2) ja valvoa siRNA-soluja (NC) käsiteltiin kanssa tai ilman sitä 1 mM ATP: tä 12 tuntia. Proteiini tasot Snail (A), E-kadheriinin (B) ja Claudin-1 (C) tutkittiin Western blot -analyysillä. Proteiini tasoja IL-8 (D) ja MMP-3 (E), arvioitiin ELISA-määrityksellä. Ilmaisuja näistä proteiineista normalisoitiin niiden ekspression kontrollisoluissa (ilman ATP). Tulokset esitettiin keskiarvona ± S.D. (Pystypalkit). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. * P 0,05.

aktivoituminen PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin olivat kriittisiä ATP- /BzATP perustuva maahanmuutto, invaasion ja ilmentyminen muuttuu EMT /invaasion liittyviä geenejä

meidän edellisessä tutkimuksessa on osoitettu, että ATP PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin on ajasta ja annoksesta riippuvaa tavalla 1E8 ja 2B4 syöpäsolujen [29], [30]. Tässä olemme huomanneet, että BzATP hoito aiheutti myös merkittävän aktivoitumisen PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireittien eturauhassyöpäsoluissa (S6A-B kuviossa). Ymmärtää toiminnalliset vaikutukset PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireittien eturauhassyöpäsoluissa, kaksi farmakologiset inhibiittorit, LY294002 ja U0126 käytettiin estämään PI3K /AKT ja ERK1 /2-signalointireitin vastaavasti (Fig. 4A-B ja S6A- B Kuva). Tulokset osoittivat, että ATP- ja BzATP perustuva maahanmuutto ja invaasion eturauhassyövän solut merkittävästi tukahdutettiin kun PI3K /AKT tai ERK1 /2 signalointireitille estyi (Fig. 4C-D ja S6c-D kuva). Lisäksi inhibitio joko PI3K /AKT tai ERK1 /2 signalointireitin vaimensi merkittävästi ilmentyminen muuttuu EMT /invaasion liittyvien geenien aiheuttama ATP tai BzATP eturauhassyöpäsoluissa (Fig. 5 ja S7 kuviossa).

IE8 ja 2B4-soluja käsiteltiin LY294002 (kaistat merkitty LY294002) tai U0126 (kaistat merkitty U0126) tai ilman hoitoa (toimi negatiivisena kontrollina, kaistat merkitään NC). (A-B) LY294002 ja U0126 esti ATP-välitteisen PI3K /AKT ja ERK1 /2 aktivointi vastaavasti. (C-D) vaikutukset LY294002 ja U0126 maahanmuutosta ja hyökkäyksen 1E8 ja 2B4 syöpäsolujen. Tiedot solumigraation tai invaasion laskettiin prosentteina kontrollista soluja. Tulokset osoittavat histogrammit, ja arvot esitetään keskiarvona ± S.D. (Pystypalkit). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. * P 0,05.

IE8 ja 2B4-soluja käsiteltiin LY294002 (kaistat merkitty LY294002) tai U0126 (kaistat merkitty U0126) tai ilman hoitoa (toimi negatiivisena kontrollina, kaistat merkitään NC ). Expressions of Snail (A), E-kadheriinin (B) ja Claudin-1 (C) havaittiin Western blot. Ilmaukset IL-8 (D) ja MMP-3 (E) havaittiin ELISA. Ilmaisuja näistä proteiineista normalisoitiin niiden ekspression kontrollisoluissa (ilman ATP). Tulokset esitettiin keskiarvona ± S.D. (Pystypalkit). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. * P 0,05.

P2X7 vaadittiin ATP /BzATP aiheuttama aktivoituminen PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin

Koska havaitsimme, että P2X7 sekä PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin näytteillä merkittäviä vaikutuksia ATP- ja BzATP perustuva maahanmuutto, invaasion ja ilmentyminen muuttuu EMT /invaasion liittyvien geenien eturauhassyövän soluissa, mietimme onko P2X7 oli mukana ATP- ja BzATP aiheuttama aktivointi PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin. Kuten on esitetty kuviossa. 6 ja S8 kuviossa, knockdovvn P2X7 johti näkyvästi eston ATP- ja BzATP aiheuttama fosforylaation PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, on tärkeä rooli P2X7 ATP-aktivaatio PI3K /AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin.

P2X7 vaiennetaan soluja (siRNA1 ja siRNA2) ja valvoa siRNA-soluja (NC) käsiteltiin kanssa tai ilman sitä 1 mM ATP: tä 15 minuuttia. Western blot suoritettiin kokeita sen analysoimiseksi fosforylaation tasoon AKT (A) ja ERK1 /2 (B). Ilmauksia p-AKT ja p-ERK1 /2 normalisoituivat niiden ilmentymisen kontrolli soluissa (ilman ATP). Tulokset esitettiin keskiarvona ± S.D. (Pystypalkit). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. * P 0,05.

P2X7 vaadittiin in vivo invasiivisuus ja etäpesäkkeiden sekä sääntely ilmentymisen EMT /invaasion liittyvien geenien

Lopuksi analysoitiin in vivo vaikutusta P2X7 on hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden paljaisiin hiiriin. Hiirissä, kehitetty ihon alle ruiskutetaan ohjaus soluja, näkyy merkittävä invasiivisuus läheisiin kudoksiin kuten rasvan ja lihasten. Lisäksi hiiret injektoitiin kontrolli-solujen, 37,5% niistä esitetään etäispesäkkeitä munuaisten ja 87,5% esitetty imusolmukemetastaaseja. Kuitenkin kaksi ryhmää injektoitiin P2X7-vaiennetaan soluja, vain yksi hiiri oli etäpesäke imusolmuke (Fig. 7).

(A) 1E8-soluja transfektoitiin stabiilisti P2X7 shRNA tai sekoituskoodin shRNA (NC ). Kaksi stabiilia P2X7 shRNA kloonia (shRNA1 ja shRNA2) on esitetty ilmaisemaan alhainen P2X7 Western blot -analyysiä käyttämällä. (B) edustaja valokuva tuumorisektioiden ja viereisten kudosten (värjätään hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05.

analysoitiin myös ilmaisuja Snail, E-kadheriinin, Claudin-1 ja IL-8 sekä fosforylaation tasoja AKT ja ERK1 /2 primaarikasvaimen kudoksissa hiiret muodostettu 1E8 ohjaus shRNA solujen ja P2X7 shRNA soluja. Sen jälkeen pudotus P2X7, ilmauksia Snail ja IL-8 ovat luonnollisesti estyy, kun taas ilmaisuja E-kadheriinin ja Claudin-1 lisättiin merkittävästi (Fig. 8A-C). Sitä paitsi, P2X7 pudotus esti merkittävästi aktivoinnin AKT ja ERK1 /2 kasvainkudoksissa (Fig. 8D). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​havaittuja tuloksia in vitro.

(A) immunofluoresenssi ja Snail, E-kadheriinin, Claudin-1 (vihreä) ja DAPI (sininen) suoritettiin kasvainkudoksissa hiirillä. Kuvat otettiin konfokaalimikroskopiaa. Scale pylväät edustavat 75 pm tai 25 pm, kuten on esitetty kuviossa. (B) Western-blottaus suoritettiin havaita proteiinin tasot Snail, E-kadheriinin ja Claudin-1 kasvainkudoksissa. (C) ELISA käytettiin tutkimaan IL-8. (D) Western blottaus suoritettiin analysoida fosforylaation taso AKT ja ERK1 /2 kasvainkudoksissa. Kunkin ryhmän, ainakin kolme eri kasvaimia kolmesta eri hiiriä käytettiin kokeissa. * P 0,05.

Keskustelu

Useat tutkimukset osoittivat, että solunulkoinen microenvironment kasvaimia sisälsi paljon korkeampia pitoisuuksia ATP kuin terveiden kudosten ja ATP voisi edustaa stressaavaa ärsyke syövän etenemisen [7]. ATP voitaisiin erittävät eläviä kasvainsoluja niiden mikroympäristön suhteellisen korkeina pitoisuuksina sekä vapautua nekroottisen soluista vaurionympäröiviä alueilla syövistä [6], [7], [24]. Kuten kaikkialla solunulkoisen messenger, ATP toimintoja kautta sen vuorovaikutusta P2X ja P2Y reseptoreihin.

Niistä P2-reseptorien tartutaan solunulkoinen ATP, P2X7 on yksi kaikkein toistuvasti ilmaissut tai jopa yli-ilmaiseman syöpäsoluja. P2X7 on ATP ionikanava ja on jo pitkään ollut tunnettu sytotoksisen aktiivisuuden kuitenkin yhä enemmän näyttöä ehdotti rooli P2X7 soluproliferaatioon. P2X7 on osoitettu stimuloivan proliferaatiota lymfoidisoluissa ja edistää seerumin riippumatonta kasvua [22], [23]. Laajat tutkimukset immuunijärjestelmän solut osoittivat merkittävää roolia P2X7 immunomodulatorisena reseptori osallistuu interleukiini (IL) -1β kypsymisen ja vapauttaa, antigeenin esittelyä ja siirre-versus-host reaktio [31], [32], [33]. Viime vuosikymmenen aikana, korkea-ilmentyminen P2X7 on todettu erityyppistä kasvaimia ja on saatu lisää näyttöä, joka esittää pro syövän vaikutukset P2X7 [15], [16], [17]. Melanoomasoluja erittäin ilmaistaan ​​P2X7, näytetään antiapoptooppinen vaikutus [16]. Sen jälkeen transfektion P2X7, HEK293 fibroblastit ja CT26 koolonkarsinoomasoluille osoitettu parannuksia kasvainten synnyssä, in vivo kasvun ja angiogeneesin, ja väheneminen apoptoosin [34]. Lisäksi aktivointi P2X7 edistettävä muuttoliikkeen ja invasiivisuus rintasyövän solujen [24] ja lymfoidineoplasman soluihin [35]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että P2X7 oli hyvin ilmaistu joitakin eturauhasen syöpäsoluja. Knockdown P2X7 siRNA merkittävästi kumottu ATP-lisätä maastamuuttoa ja invaasion in vitro. Sitä paitsi, alas-säätely P2X7 johti merkittävää tuumorin invasiivisuus ja etäpesäkkeiden paljaisiin hiiriin. Lisäksi yli-ilmentyminen P2X7 tehosti merkittävästi ATP-välitteisen muuttoliikettä ja hyökkäyksen 22RV1 eturauhassyövän solut, jotka tarjoavat lisätodiste siitä, että P2X7 oli yksi keskeisistä sääntelyviranomaiset eturauhassyövän hyökkäyksen ja etäpesäkkeitä.

Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä askel aikana syövän etenemiseen ja liittyy läheisesti korkeaan liikkuvien ja invasiivisen ominaisuus syöpäsoluja.