Krooninen sairaus

tiivistelmä

edistysaskelista huolimatta havaitseminen ja hoito, kastraatio kestävä eturauhassyöpä on edelleen merkittävä kliininen ongelma. Poikkeavaan aktiivisuus kantasolujen polkuja, ja niiden sääntelyä androgeenireseptorin (AR), on mahdollista antaa yksityiskohtaista tietoa uusia mekanismeja ja reittejä ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi kehittyneitä, castrate kestävä eturauhasen syöpiä. Tätä varten olemme tutkineet rooli alkion kantasoluilla säädin Sox2 [SRY (sukupuoli määrittävä alue Y) -box 2] normaaleissa ja pahanlaatuiset eturauhasen epiteelisolujen. Normaalissa eturauhasessa, Sox2 ilmaistaan ​​osan pohjapinta epiteelisolujen. Eturauhasen kasvaimet olivat joko Sox2-positiivisia tai Sox2-negatiivinen, joissa prosenttiosuus Sox2-positiivisten kasvainten kasvaa Gleason pisteet ja etäpesäkkeitä. Vuonna kastraatio vastustuskykyisten eturauhassyöpäsolulinja CWR-R1, endogeeninen ilmentyminen Sox2 tukahdutettiin AR signalointi, ja AR kromatiiniin IP osoittaa, että AR sitoo hostajaelementti sisällä Sox2 promoottori. Samoin normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa ja ihmisen alkion kantasoluja, lisääntynyt AR signalointi vähentää myös Sox2 ilme. Kestävyys antiandrogeeninen MDV3100 johtaa huomattavaan kasvuun Sox2 ilmaisun kolmen eturauhassyövän solulinjoissa, ja kastraatio herkkä LAPC-4 eturauhassyöpäsolulinja ektooppinen ilmentyminen Sox2 riitti edistää kastraatio kestäviä kasvaimen muodostumisen. Menetys Sox2 ilmentymisen kastraatio kestävä CWR-R1 eturauhassyöpä-solulinjaa inhiboi solujen kasvua. Up-regulation Sox2 ei liittynyt lisääntynyt CD133 ilmentyminen, mutta oli yhteydessä lisääntyneeseen FGF5 (fibroblastikasvutekijää 5) ilmaisua. Nämä tiedot esittää mallin kohonnut Sox2 ilmaisun menettämisen vuoksi AR-välitteistä tukahduttaminen aikana kastraatio, ja seurauksena kastraatio-vastus kautta mekanismeja ei liity induktio kanoninen alkion kantasoluilla polkuja.

Citation: Kregel S, Kiriluk KJ , Rosen AM, Cai Y, Reyes EE, Otto KB, et al. (2013) Sox2 Onko androgeenireseptorin-Tukahdutettu Gene joka edistää kastraatio hylkivät Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (1): e53701. doi: 10,1371 /journal.pone.0053701

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2012; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 11 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Kregel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta tämä työ oli jalomielinen lahjoitus: The University of Chicago osasto Kirurgian § urologian; Chicagon yliopistossa Kattava Cancer Center (UCCCC); Pilot palkinnon National Cancer Institute (NCI) P50 CA090386 SPORE in Eturauhassyöpä on Robert H. Lurie Kattava Cancer Center Northwestern University ja Cancer Research Center of University of Chicago; amerikkalainen Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004); Syöpä Centerin Support Grant (P30 CA14599); Brinson Foundation; Alvin Baum Family Fund; ja The University of Chicago Cancer Research Foundation Naisten Board. S. Kregel tukena on HHMI: Med-into-Grad Fellowship (56006772) ja syöpäbiologian Training Grant (T32-CA09594); E. Reyes tukena on Immunology Training Grant (AI07090-31). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Relapse pahanlaatuisen eturauhassyövän jälkeen hormonihoito on merkittävä kliininen ongelma, ja uusia strategioita tarvitaan ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi kastraatio kestävä eturauhasen syöpiä. Androgeenien puute hoitoa (ADT) on ollut tukipilari eturauhassyövän hoitoon, koska löytö Charles Huggins ja Clarence Hodges 1941, että kastraatio merkitsevästi tuetun joilla on pitkälle edennyt eturauhassyöpä [1]. On kuitenkin väistämätöntä, taudin etenemisen vuoksi kasvun kastraatiotasolle-resistenttien syöpäsolujen. On olemassa useita mekanismeja kehittämiseen kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC), joista suurin osa keskitytään androgeenireseptorin (AR) [2]. Näin ollen estämällä intrasellulaarisen AR signalointi eturauhasen syöpäsolujen on ollut merkittävä painopiste eturauhassyövän tutkimuksen tuloksena on erilaisia ​​kemiallisia estäjien kohdistaminen AR signalointia, joita käytetään klinikalla [3]. Valitettavasti, vaikka kaikki nämä inhibiittorit tuottaa alustavan hoitovasteen, tämä on yleisesti seuraa uusiutumisen ja taudin etenemistä.

Viime löydöt somaattisten solujen uudelleenohjelmointi määritellyillä geeneihin indusoi pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) syvästi osoittaa että ilmaisu muutaman kantasolujen geenit kykenevät herättävä suuren mittakaavan muutokset geeni-ilmentymisen ja solujen käyttäytymistä, joista monet ovat ominaisuuksia pahanlaatuisten solujen [4]. Tällainen kantasolujen uudelleenohjelmointi tekijöitä vahvistetaan onkogeenien (c-Myc ja Klf4) tai ovat nousemassa onkogeenien (Sox2, Oct4, ja Nanog) erilaisissa syövissä [5], [6], [7]. Sox2, Oct4, ja Nanog transkriptiotekijät käsittää ytimen alkion kantasoluilla transkriptiotekijän koneet ja ovat välttämättömiä kohti ylläpitämiseksi pluripotenttisuus ja estämään erilaistumista [8]. Tutkimuksissa käytetään solulinjoja, näitä geenejä paitsi edistävät solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä, mutta myös heikentää normaalin erilaistumisen prosesseihin; jotka molemmat ovat tunnusmerkkejä kasvaimen kehittymisen ja taudin etenemisen [5], [7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Joissakin tapauksissa, sellaisten geenien ekspression uskotaan merkitä harvinaisia ​​syövän kantasoluja /aloittamista soluihin [12], [16]. Siten tehtävä näiden transkriptiotekijöiden aikuisilla syöpäsolujen ajatellaan estävän erilaistumista ja edistää kantasolujen pluripotenttisuus ja selviytymisen mekanismeja samanlainen päätehtävä alkion kantasoluja.

Sox2 [SRY (sukupuoli määrittävä alue Y) -box 2] on transkriptiotekijä, joka on tärkeää säilyttää säilymisen ja pluripotenttisuuden eriytymättömiä alkion kantasoluja, ja on syntymässä roolia epigenetic uudelleenohjelmointi tekijä ja onkogeeni [5], [17], [18], [19] , [20]. Ihmisen alkion kantasoluja Sox2 säätelee ilmentymistä 1259 geenien, joista monet ovat yhteistyössä säädellään Oct4 ja /tai Nanog [21]. Eturauhasen, Sox2 ilmentyminen on havaittu solujen pohjapinta-epiteelisolujen kerroksen normaalia rauhasen epiteeli [22], ja eturauhasen kasvaimissa [22], [23]. Ilmaisu on Sox2 eturauhastuumoreissa on ajateltu edistää aggressiivisempia kasvaimen fenotyypin edistämällä ”kantasoluja, kuten” kasvain fenotyyppi. Todellakin, geenijärjestelyillä ilmentymisen analyysit osoittivat, että iPS kennomainen allekirjoitus on läsnä osa hyvänlaatuisia ja aggressiivinen eturauhasen kasvaimia, ja tämä allekirjoitus koituu pahempi tauti ennusteen [24]. Ryhmämme on aiemmin tunnistettu Sox2 olevan erittäin ilmaistaan ​​normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen verrattuna epiteelisolut rakkularauhaset: elin samanlaisia ​​toiminta ja kehittävän alkuperää, toisin kuin eturauhasen, on harvoin sivusto tumorigeneesin [25]. Yhdessä nämä tiedot lainaavat hypoteesia, että Sox2 toimii aikuisten normaalien ja pahanlaatuisten epiteelisolujen säätelemään monien saman geenin tavoitteet säätelee Sox2 ihmis- ES-soluja, mikä edistää vähemmän eriytetty alkion kantasoluilla kasvain fenotyyppi; Lisäksi Sox2 ilmaisu voitaisiin rajoittaa harvinainen syöpä kantasolujen /aloittamista soluja, jotka antavat huonompi sairaus ennuste. Vaihtoehtoisesti Sox2 voi olla hyvin erilaisia ​​toiminto aikuisten epiteelisolujen. Nämä tiedot viittaavat myös siihen, että Sox2 voivat edistää kastraation-vastus vähentämällä riippuvuutta eturauhasen syövän solujen AR signalointi niiden kasvua ja selviytymistä.

Tässä osoitamme, että Sox2 ilmentyy useimmissa normaalin eturauhasen pohjapinta epiteelisolujen ja on tasaisesti ilmaistaan ​​osajoukko eturauhasen kasvaimia. Lisäksi Sox2 ilmaistaan ​​valtaosa kastraation vastustuskykyisten metastaattinen eturauhassyöpä vaurioita. Normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa, ihmisen alkion kantasoluja, ja kastraatio kestävä eturauhasen syöpäsolujen, ligandin aktivointi AR edistää väheneminen Sox2 ilmaisua, joka on seurausta suoran sitoutumisen AR on Sox2 cis-tehostaja-alue. Expression of Sox2 on myös lisääntynyt eturauhassyövän solut, jotka ovat resistenttejä antiandrogeeninen MDV3100. In kastraatio-herkkien syöpäsolujen, Sox2 ilmaisu riittää edistää kastraatio kestäviä kasvaimen muodostumisen. Ilmaisu on Sox2 eturauhassyöpäsoluissa, ei kuitenkaan aiheuttanut muutoksia differentiaatiospesifisiä PSA ilmaisu, lisääntyminen CD133-positiivisia otaksuttu syövän kantasoluja /aloittamista soluja, tai ilmaus tunnetaan ihmisalkion kantasoluja (hESC) -associated Sox2 kohdegeenien. Siten Sox2 näyttää edistää kastraatio vastuksen kautta mekanismeja, joihin ei liity uudelleen ilmaus kantasolujen Sox2-kohdegeenien tai lisäyksiä harvinainen kasvain kantasolujen /aloittamista solupopulaatioiden.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines and Materials

R1881 ja aktinomysiini D ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ja MDV3100 ostettiin Selleck Chemicals (Houston, TX), ja säilytettiin -20 ° C Etanoli . Kaikki ihmisen eturauhassyövän solulinjaa kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu [26], [27]. Kaikkia viljelmiä rutiininomaisesti seulottiin puuttuminen mykoplasmakontaminaation käyttäen ATCC Universal Mycoplasma Detection Kit (Manassas, VA). PC-3, VCAP, ja NCCIT solulinjat ostettiin ATCC, ja DU145, LNCaP, LAPC-4, C4-2, CWR22Rv1, CWR-R1, MDA-PCa2b, ja E006AA solulinjoja avokätisesti Dr. John Isaacs The Johns Hopkins University ja on aiemmin tunnettu [28]. Ihmisen kantasolujen linja WA01 (H1) hankittiin WiCell (Madison, WI) ja viljeltiin käyttäen syöttölaite riippumaton protokollan mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, B. C.). ES-soluja käytettiin kymmenen kohtia sulattamisesta. Erittyy ja kokonais-PSA ja testosteroni mitattiin käyttäen Roche Elecsys Yhteensä prostataspesifinen antigeeni (PSA) ja testosteroni (T) määritykset. Solukasvu mitattiin käyttämällä Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen /Molecular Probes, Eugene, OR).

Lentivirusvektorikonstruktit Sox2, AR, ja valvonta-vektorit (Preceiver-Lv105) ostettiin GeneCopoeia (Rockville, MD ). Lentivirusvektorikonstruktit tetrasykliiniä transaktivaattori (LV-rtTA) ja indusoituva lentiviraalinen Sox2 vektori päässä Hochedlinger lab hankittiin kautta Addgene [29]. Tarvittaessa, Sox2 ilmentyminen indusoitiin käyttäen 1 ug /ml Doksisykliini (Sigma). Knockdovvn Sox2 ilmaisun käyttäen shRNA ekspressio saavutettiin käyttäen anti-ihmisen Sox2 shRNA geenin joukko, joka koostuu 4 eri lentiviruksen kohdesekvenssien vastaan ​​Sox2 ja ei-äänenvaimennusjärjestelmiä ohjaus [HSH017628-HIVH1 (Sox2) ja CSHCTR001-HIVH1 (kontrolli) vektoreita joka sisältää GFP: n ja puromysiinin vastustuskyvyn komponentit; Genecopoeia]. Korkea tiitteri lentivirus tehtiin transfektoimalla kanssa ViraPower Lentivrial pakkaus sekoitus (Invitrogen, Grand Island, NY) ja Lenti-X Keskitin (Clontech, Mountain View, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Ei-pahanlaatuinen epiteelin perustettiin viljelmät tuoreesta ihmisen eturauhasen kudosten hankittu kirurgisista näytteistä, kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Nämä kudokset hankittiin nopeutetussa protokolla hyväksymä Chicagon yliopistossa Institutional Review Board (IRB). Kudosnäytteet hallinnoi Chicagon yliopistossa Human Tissue Resource Center ydin laitokseen; tarve potilaan suostumus on luopua, koska hankitut näytteet de-tunnistaa. 4 mm biopsia lyöntejä kuin kasvainkudoksen otettiin eturauhasen ja rakkula kudoksissa olevia potilaita eturauhasen; puolet tästä kudos kiinnitettiin ja analysoitiin patologi puuttumisen varmistamiseksi kasvain. Dissosiaatio eturauhasessa ja kasvua epiteelisolujen on aiemmin kuvattu [30], [31], ja samoja menetelmiä käytettiin luomaan täsmäsi eturauhasen (PrEC) ja rakkularauhasen (SVEC) epiteelisolujen viljelmissä. Kasvatettiin käyttäen Keratinoctye Seerumittomat alusta täydennettynä kasvutekijät (GFS) (vakio K-SFM, Invitrogen Life Technologies) ja voidaan viljellä jopa 8 kohtia ennen merkittäviä solujen vanhenemista [32]. Meidän kokeissa, kaikki viljelmät analysoitiin tai ennen neljäs siirrostus.

Western-blottaus, immunohistokemia ja Immunofluorescence

Koko-solulysaateista kerättiin 100000 soluja käytettiin kaistaa kohti. Vasta-aineita käytettiin: anti-AR (N-20, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); anti-Beta Actin (Sigma-Aldrich); anti-ΔNp63 (4A4, Santa Cruz); anti-Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Nanog (D73G4 XP, Cell Signaling Technology); anti-Oct4 (C30A3, Cell Signaling Technology); ja anti-glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH, Cell Signaling Technology). Toissijainen piparjuuriperoksidaasikonjugoiduilla vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technologies, ja HRP havaittiin käyttäen SuperSignal West Femto kemiluminesenssisubstraatilla (Peircen /Thermo Scientific, Rockford, IL). Vaihtoehtoisesti toissijainen vasta-Rockland (Gilbertsville, PA) käytettiin ja keräämän tiedon avulla Licor Odyssey järjestelmä (Lincoln, NE).

immuunivärjäytyminen Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, kani monoklonaalinen) suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kohdat ylläpitää joko Chicagon yliopistossa Human Tissue Resource Core laitokseen tai Northwestern University /University of Chicago Eturauhasen SPORE ohjelmaa ja niiden malli Procurement Program. Jälkeen deparaffinization ja nesteytys, kudoksia käsiteltiin antigeenin haku puskurilla (S1699 kohteesta DAKO, Glostrup, Tanska) on höyrystimen 20 minuuttia. Anti-Sox2-vasta-aine (1:25 laimennos) levitettiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa kosteuskammiossa. Seuraavat TBS pesun, antigeeni-vasta-aineen sitoutumista havaittiin Envision + -järjestelmä (DAKO, K4001 hiiren primaarinen vasta-aineet) ja DAB + (DAKO, K3468). Kudosleikkeet upotetaan hetkeksi hematoksyliinillä varten counterstaining ja oli kansi-liukastui. Kudokset analysoitiin koulutettu Urogenitaalinen patologi ja teki siitä prosentuaalinen solujen positiivisella tumavärjäystä (0 = ei värjäytymistä; 1 = 1-10% positiivisia soluja; 2 = 11-50% positiivisia soluja, ja 3 = 50% positiivista solut); sekä värjäytymisen intensiteetti (0 = ei värjäytymistä, 1 = heikko värjäytyminen; 2 = kohtalainen värjäytyminen, 3 = voimakas värjäytyminen). Kuvia, dioja digitoitiin käyttäen Pannoramic Scan Koko Dia Scanner (Cambridge Research ja instrumentointi, Hopkinton, MA) ja otettujen kuvien Pannoramic Viewer ohjelmistoversio 1.14.50 (3DHistech, Budapest, Unkari).

immunofluoresenssilla, kudokset poistettiin parafiini, vedettömät ja käsiteltiin antigeenin haku puskurilla. Vasta-aine sitoutuminen Sox2 (D6D9, Cell Signaling Technology, Alexa-Fluor 555-konjugoitu, 1:50 laimennos TBST) ja p63 (4A4, Santa Cruz Biotechnology, Alexa-Fluor 647 konjugoitu, 1:50 laimennos TBST) varten tehtiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kudokset olivat vasta-värjättiin DAPI ja asennetaan käyttäen Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL). Fluoresoivia kuvia otettiin kiinni käyttämällä Leica TCS SP2 AOBS Laser Scanning konfokaalimikroskoopilla.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (Q-RT-PCR), ja PCR-Array analyysit

RNA puhdistettiin käyttämällä Qiagen RNeasy Mini Kit lisävarusteena DNAasia ruoansulatus (Qiagen, Valencia, CA) ja laatu testattiin käyttämällä Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Vakio Q-RT-PCR, uutettu RNA muunnettiin cDNA käänteistranskriptiolla käyttämällä SuperScript® III käänteistranskriptaasi (Invitrogen). Tasot Sox2, PSA, FGF5 ja GAPDH transkripti kvantitoitiin käyttämällä

Virta

SYBR® Green Master Mix (Invitrogen) käyttämällä mukautettuja alukkeita Sox2 [5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ’(eteenpäin), 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC- 3 (reverse)]; PSA [5’-TCATCCTGTCTCGGATTGTG-3 ’(eteenpäin), 5′-ATATCGTAGAGCGGGTGTGG-3′ (taaksepäin)]; FGF5 [5’-AGTCAATGGATCCCACGAAGC-3 ’(eteenpäin), 5′-TGAACTTGGCAG TTGCATGGA-3′ (taaksepäin)]; ja GAPDH [5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ’(eteenpäin), 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’ (taaksepäin)]. Standardikäyrät arviointiin käytettiin aluketta tehokkuutta ja keskimääräinen muutos kynnyssyklissä (ACt) arvot määritettiin kullekin näytteiden suhteen endogeenisen GAPDH tasoilla ja verrattuna vehikkelikontrolliin (ΔΔCT). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena määrittää keskiarvon keskivirhe, ja opiskelijan t-testit suoritettiin normalisoinnin hallita saada p-arvot.

ihmisalkion kantasolujen PCR Arrays, RT

2 First Strand Kit (SA biotieteiden, Valencia, CA) käytettiin kääntää puhtaaksi RNA cDNA. RT

2 qPCR Master Mix (SA Biosciences) ja ihmisalkioiden kantasolujen RT

2 Profiler ™ PCR Array (Cat # PAHS-081, SA Biosciences) käytettiin tutkimaan selostukset 84 keskeisten geenien ylläpitämiseksi pluripotenttisuuden ja itseuudistumisen tilan alkion kantasoluja. Taulukot tehtiin biologisia rinnakkaisnäytettä kolmena kappaleena kullekin tilalle. RT

2 Profiler ™ PCR Array Data Analysis ohjelmaa käytettiin arvioimaan keskimääräinen muutos kynnyssyklissä (ACt) arvot kullekin näytteistä suhteessa ajoneuvon ohjaus (ΔΔCT), määrittää keskivirhe ja saada p-arvojen kautta opiskelijan t -testiä.

AR Kromatiini Immunoprecipication

Kromatiini-IP-protokollia mukautettiin aiemmin raportoitu menetelmiä [33]. Soluja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin ja käsiteltiin 24 tunnin ajan, 1 nM R1881. Solut kiinnitettiin 1% formaldehydiä huoneen lämpötilassa 15 minuuttia; ristisidoksia sammutettiin 0,125 M glysiini PBS: ssä 15 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin jääkylmällä PBS: llä. Sen jälkeen kun solut kaavittiin PBS: ssä plus 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Saksa), solujen pelletit kerättiin sentrifugoimalla ja soluytimet uutettiin sentrifugoimalla 14000 rpm 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Solutumat suspendoitiin uudelleen ja pestiin micrococcal nukleaasia (Tris [pH 7,4] 10 mM, NaCl 15 mM, KCI 60 mM, Spermiini 0,15 mM, spermidiiniä 0,5 mM, CaCl2 1 mM) ja sitten inkuboitiin 10000 U micrococcal nukleaasia varten 20 minuuttia 37 ° C: ssa kevyesti thermomixing. Tämän jälkeen tumat talteen ja suspendoitiin uudelleen RIPA-PIC-puskuriin [150 mM natriumkloridia, 1,0% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0 /1 x proteaasi- estäjä cocktail (Roche)] ja sonikoitiin (Fisher Scientific, Hampton, NH, malli FB-120 Sonic Dismembrator). Sonikoitiin kromatiinin uutteet ennalta selvitetty yön yli 4 ° C: ssa inkuboimalla proteiini G-agaroosilla helmiä käsiteltiin Normaali kanin IgG: tä (Cell Signaling Technology), ja kromatiinin fragmentit immunosaostettiin spesifisillä vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Jotta 1 ml laimennettua kromatiinin liuosta, 50 ug seuraavia vasta-aineita käytettiin: Normaali kanin IgG: tä (Cell Signaling Technology) negatiivisena kontrollina; Histoni H3 (Abcam, Cambridge, MA) positiivisena kontrollina; ja AR (N-20, Santa Cruz,) että koeolosuhteissa. Sen jälkeen helmet kerättiin ja pestiin TSE I-puskuria [0,1% Triton X-100, 2 nM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI (pH 8,1)], TSE II-puskuria [0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI (pH 8,1)], Brown Buffer III [0,25 LiCI 1,0% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), 1% deoksikolaatti, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI: ää (pH 8,1)], ja kaksi kertaa TE-puskuria [1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI: ää (pH 8,1)]. Immunosaostetun kromatiinin fragmentit eluoitiin pois agaroosihelmiä käyttäen Brown eluutiopuskuria [1% SDS, 0,1 M NaHCO 3, 1 mM DTT: tä, 1 x proteaasiestäjäseostabletit (Roche)] ja inkuboitiin 10 minuuttia 95 ° C: ssa voimakkaasti thermomixing. Eluoitu chromatin ja panoksia inkuboitiin sitten yön yli 65 ° C: ssa varovasti thermomixing kääntää siltoja. Näytteet käsiteltiin sitten 2 ug RNaasiA (Novagen, Darmstadt, Saksa) 37 ° C: ssa 15 minuuttia, sitten 2 ug proteinaasi K 55 ° C: ssa 30 minuutin ajan (Cell Signaling Technology). Lopuksi immunoprecipiated DNA-fragmentit uutetaan fenoli-kloroformi (Sigma-Aldrich) louhinta ja alistettiin Q-RT-PCR käyttämällä kaupallisesti saatavilla SimpleChIP ™ Human Sox2 cis-tehostajana promoottori alukkeita (Cell Signaling Technology).

In vivo kasvainmuodostusta

Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Chicagon yliopistossa Institutional Animal Care ja Käytä lausunnon (IACUC, protokolla numerot 72066 ja 72231). Kaikki Leikkaus suoritettiin ketamiinia /ksylatsiinia anestesia, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

In vivo

kasvainten muodostumista LAPC-4 ja CWR-R1-solut tehtiin kautta ihonalaista ymppäyksen miljoona solua 4-6 viikkoa vanhojen urospuolisten kateenkorvattomia nude-hiiriä (Harlan, Indianapolis, IN) käyttäen 75% Matrigel ja 25% HBSS-liuosta (BD Biosciences). Mittaamaan kasvain take in kuohittua isäntä, isäntä hiiret kirurgisesti kastroitu viikkoa ennen soluinokulaation. Mitata etenemistä kastraatio vastus, eläin isännät olivat kastroitu kun kasvaimet saavuttivat 0,5 cm

3. Analysoida kiertävä yhteensä PSA kasvain implantin ja vahvista testosteroni ehtyminen kastroitu isännät, otettiin verta sydänpunktuurilla kokeiluasteella päätepisteen.

virtaussytometria

Kaikki vasta-Inkubaatioiden pesee, ja virtaussytometria-analyysit suoritettiin käyttäen jääkylmää solujen lajittelu-puskuria (1 x PBS, 0,5% naudan seerumin albumiinia (BSA), 2 mmol /l EDTA: a) minimaalinen valossa käyttäen aiemmin raportoitu protokollia [26], [31]. Solut värjättiin Live /Dead korjattavissa Green Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) kohti valmistajan ohjeiden. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec, Köln, Saksa, 1:20 laimennos 10 minuutin ajan), ja sen jälkeen merkitty CD133 /2 (293C3) -APC-konjugoitua ihmisen monoklonaalinen vasta-aine (Miltenyi Biotec), tai isotyyppi ohjaus hiiren IgG2b-APC (Miltenyi Biotec) klo 1:10 laimennus 30-min. Sitten solut pestiin ja kiinnitettiin 15 minuutin ajan 3,2%: Ultra Pure EM Grade Formaldehydi (Polysciences, Inc .; Warrington, PA). Kiinnityksen jälkeen solut pestiin ja värjättiin FXCycle Violet (Invitrogen, 1:1000 laimennus). Analyysi tehtiin Becton Dickinson LSR II, ja vähintään 250.000 laskee hankittiin jokaiselle koetilalle. FACSDiVa ohjelmisto käytettiin tiedonhankinta- ja FlowJo ohjelmistot käytettiin analyysiin.

Floating Sferoidiviljelmiä Culture Pitoisuus

In vitro

kelluva pallosia kasvatettiin 1 x 10

5 LAPC-4 ja LNCaP transdusoitiin joko lentiviraalinen Sox ja GFP ConFtrol vektorit [Preceiver-Lv105; GeneCopoeia (Rockville, MD)]. Soluja viljeltiin Ultra-Low kiinnitys 25 cm

2 soluviljelypullot (Corning, Corning, NY) ja kasvatettiin suspensiossa 5 päivää. Sferoidit on muodostettu sen jälkeen, kun 5 päivää siirrettiin 10 cm

2 astiat (Corning, Corning, NY) 24 tunnin ajan, jotta kiinnitys. Sferoidit värjättiin sitten kristallivioletilla liuosta (Sigma-Aldrich), huuhdeltiin ja laskettiin. Sphere muodostus suoritettiin kolmena kappaleena.

TILASTOANALYYSI

Kaikissa tapauksissa tiedot on toistettu käyttämällä useita biologisten ja teknisten rinnakkaista. Aineisto analysoitiin SigmaPlot 11,0 ohjelmistoa käyttäen yksisuuntainen ANOVA pareittain Multiple vertailumenettelyjä (Holm-Sidak menetelmä).

Tulokset

Sox2 on ilmentyy normaaleissa eturauhasen Basal epiteelisolujen ja alajoukko eturauhaskasvaimia

arvioimiseksi esiintyvyys ja kuvio Sox2-proteiinin ilmentymisen eturauhasen, teimme immunohistokemiallisessa arviointi sarjasta ihmisen eturauhasen kudosten ja kasvaimia. Nämä analyysit osoittavat, että normaaleissa ja hyvänlaatuisia hyperplastic (BPH) eturauhaskudoksiin Sox2 ilmentyminen rajoittuu pohjapinta epiteelisoluihin (kuvio 1A). Analyysit eturauhasen kasvaimia osoittaa, että Sox2 on joko tasaisesti ilmaistu tai tasaisesti poissa (kuvio 1A). Suurin osa (12 14) kastraation kestävä etäpesäkkeitä analysoitiin myös ilmaista Sox2 (kuvio 1 B ja C). Prosenttiosuus Sox2-positiivisten kasvainten kasvaa Gleason Score, jossa pieni joukko suotuisia-ennusteen Gleason Pisteet 6 kasvaimia ja suurin osa on huono ennuste Gleason Pisteet 10 ja kastraatio kestävä etäpesäkkeitä positiivisia (kuvio 1 C). Mielenkiintoista, analyysit premaligneja eturauhasen intraepiteelisiin neoplasia (PIN) vaurioita dokumentoitu seka pohjapinta ja luminaalisen epiteelin solujen värjäytymisen (kuvio 1 C). Nämä kasvain tiedot ovat yhdenmukaisia ​​havainto Jia et al. käyttämällä eri Sox2 vasta-osoittaa, että ilmaisu korreloi Gleason luokan [23]. Tuloksemme on ristiriidassa tämän raportin, mutta koska havaitsemme vahva pohjapinta-epiteelin värjäytymisen ole pahanlaatuisia kudokset sekä yhtenäinen vahva Sox2 ilmentymisen pieni osa kasvaimista sijasta porrastettu kasvu värjäytymisen intensiteettiä [23]. Nämä tiedot osoittamiseksi, että Sox2 tasaisesti ilmaistaan ​​osajoukko eturauhasen kasvaimia, ja osoittaa, että Sox2 ilmaisu antaa ainutlaatuisen kasvain alatyypin joka ei näytä rajoittuvan harvinainen syöpä aloittamista /varsi kaltaisia ​​soluja eturauhasen kasvaimia.

A) immunohistokemiallinen värjäys Sox2 osoittaa edustavan ydin- pohjapinta epiteelin värjäytymisen (tummanpunainen) normaalissa rauhaset (alue # 3), ja kaksi erillistä kasvaimen alueita, jotka ovat joko tasaisesti Sox2-positve (alue # 2) tai Sox2-negatiivinen ( alue # 1). B) ilmentäminen Sox2 edustavissa kastraatio kestävä etäpesäkeleesioita. Laatikko on 8-kertainen suurennus vastaa aluetta näkyy 40 × kuvan. C) osuus ja jakelu Sox2 ilmaisun kesken eturauhasen tautitiloja. Normaalissa, BPH, ja HGPIN kudokset, Sox2 ilmaistaan ​​pohjapinta-epiteelisolujen (Grey Bars). Positiivinen ekspressio on määritelty yli 50%: n syöpäsolujen positiivinen, joiden suhteellinen intensiteetti on 1 tai suurempi asteikolla 0-3. Syövän kudoksissa ja etäpesäkkeitä, Sox2 on joko tasaisesti ilmaistu tai poissa, ja prosenttiosuus Sox2-positiivisten kasvainten kasvaa Gleason Score (mustat palkit). BPH: Eturauhasen liikakasvu; HGPIN: korkea-asteinen eturauhasen intraepiteelinen neoplasia; GS: Gleason Score (N = yksittäisen potilaan näytteitä analysoidaan).

Sox2 koekspressoituu sisällä Osuus p63-Positive Basal epiteelisolujen

ilmentyminen Sox2 vuonna AR-negatiivinen pohjapinta-epiteelisolujen merkitsee, että Sox2 voi toimia edistää selviytymistä eturauhasen varren ja pohjapinta ohimeneviä vahvistavan soluja tai säilyttää ne eriyttämätön tilassa. Normaalissa eturauhasessa, The paracrine vuorovaikutus strooman ja epiteelisoluissa on androgeeniriippuvaisessa, joissa AR-positiivisia stroomasolujen tuottaa sarjan kasvutekijöiden, kutsutaan kollektiivisesti ”andromedins”, joka signaali lähellä epiteelisolujen edistää leviämisen AR-negatiivinen, p63-positiivisia pohjapinta epiteelisolujen ja selviytymisen AR-positiivinen /prostataspesifisen antigeenin (PSA) -positiivinen luminaalisen epiteelisolut [34]. Voit selvittää, mikä osuus pohjapinta-epiteelisolujen olivat Sox2-positiivisia, teimme yhteistyötä immunofluoresenssivärjäyksellä of Sox2 ja p63. Nämä tiedot osoittavat, että 75% eturauhasen pohjapinta epiteelisolujen sijaitsee eturauhasen reuna-alue ilmaista sekä Sox2 ja p63, kun taas loput 25% solut ilmentävät p63 mutta ei Sox2 (kuvio 2A). Tämä havainto viittaa siihen, että Sox2 ilmaisu rajataan kaksi potentiaalista populaatioiden tyvi- epiteelisolujen; nämä solut voivat myös olla ainutlaatuisia ilmiasun ja voi johtua erillisiä kasvaimia [35].

A) Immunofluoresoivat co-värjäys Sox2 (vihreä) kanssa pohjapinta-markkeri p63 (punainen), joka osoittaa, että 75% normaali pohjapinta-epiteelisolujen ovat positiivisia sekä Sox2 ja p63 (keltainen), kun taas loput 25% ovat Sox2-negatiivinen (punainen). DAPI värjäys kohokohtia ytimet (edustavat kuvat normaalin eturauhasen epiteelin hankitaan kolmesta eri potilaan näytteitä). B) Western blotting sarjasta potilaasta peräisin eturauhasen (PrEC) ja rakkularauhanen (SVEC) epiteelin myydä (PrEC) kulttuureissa osoittaa, että osa näistä kulttuureista ilmaista havaittavissa Sox2, kun taas muut PrEC ja kaikki SVEC kulttuureissa eivät. C) immunosytokemiallinen värjäys Sox2, joka esittää yhtenäisen ydin- Sox2 ilmentymisen Sox2-positiivisia PrECs ja puute Sox2-positiivisten solujen Sox2-negatiivinen PrECs (edustavat kuvat kolmen erillisen kokeen).

Tämän perusteella, loimme useita ei-pahanlaatuisten eturauhasen epiteelisolujen (PrEC) viljelmät vastaeroteltujen eturauhasessa ja analysoitiin niitä Sox2 ilme. Tällaiset PrEC viljelmät eivät ilmennä havaittavissa oleva määrä AR proteiinin, koska ne koostuvat pääosin p63-positiivisia ohimenevä vahvistavan soluja sekä pieniä populaatioita CD133-positiivisia kantasoluja, PSCA-positiivisten välisolujen, ja Kromograniini A-positiivisten neuroendokriinisoluissa [ ,,,0],26], [31]. Ylimääräisenä ohjaus, me eristää potilaan täsmäsi rakkularauhanen epiteelisolujen (SVEC) viljelmät käyttäen samoja menetelmiä. Western blotting-analyysit dokumentoitu, että PrEC viljelmät olivat joko Sox2-positiivisia tai Sox2-negatiivisia, ja vastaavat SVEC viljelmät olivat johdonmukaisesti negatiivisia (kuvio 2B) [25]. Heterogeeninen solujen populaatiot kuten PrEC kulttuureissa ehdotti, että Sox2 voidaan ilmentää tehokkaasti pienessä määrässä soluja. Immunosytokemi- analyysit Sox2 ilmaisun kuitenkin asiakirjoja, että suurin osa soluista Sox2-positiivisten PrEC kulttuureissa ilmaista Sox2; vaikka on vähän, jos lainkaan havaittavia Sox2-ilmentävien solujen Sox2-negatiivinen PrEC viljelmissä (kuvio 2C). Näin ollen, ei-pahanlaatuinen PrEC kulttuureissa, Sox2 ilmentyminen ei rajoitu ainutlaatuisen solupopulaation, kuten CD133-positiiviset eturauhasen kantasoluja.

Lisääntynyt androgeenireseptorin (AR) Signaling Vähentää Sox2 Expression normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen ( PrECs) ja ihmisalkion kantasoluja (hESCs) B

aiemmin on osoitettu, kokeellisesti, että aktivoituminen AR opastinjärjestelmillä androgen sitova eturauhasen epiteelisolujen indusoi niiden kasvun pysähtymisen ja lopulta terminaali erilaistumista erittävien-onteloerityssolut [36] , [37], [38]. Ilmaisu on Sox2 basaali epiteelisoluissa ja puute Sox2 ilmentymisen hyvänlaatuisen AR-positiivisten luminal epiteelisolujen ehdotettu, että AR voi tukahduttaa Sox2 ilme. Käyttämällä Sox2-positiivisia PrEC kulttuureissa, vaste Sox2 ilmaisun ulkoisille ilmaisun ja ligandin induktion villityypin AR arvioitiin. p-Actin käytettiin latauskontrollina. p-Actin käytettiin latauskontrollina. p-Actin käytettiin latauskontrollina.