Krooninen sairaus

tiivistelmä

Systemaattinen seulonta perustuu rakenteellinen samankaltaisuus lääkkeiden, kuten kolkisiini ja podofyllotoksiini johtanut tunnistamiseen noskapiini, mikrotubuluksiin kohdistetut aine, joka vaimentaa dynaaminen epävakaus mikrotubulusten vaikuttamatta polymeerin kokonaismäärästä massa mikrotubulusten. Raportoimme uuden sukupolven noskapiini johdannaisten mahdollisina tubuliinia sitovan syöpälääkkeet. Molekyylimallinnusta kokeita näiden johdannaisten 5a, 6a-j tuotti paremmin telakointi pisteet (-7,252–5,402 kcal /mol) kuin emoyhdisteen, noskapiini (-5,505 kcal /mol) ja sen nykyiset johdannaiset (-5,563–6,412 kcal /mol). Vapaa energia (Δ

G

bind

) laskelmat perustuvat lineaarisen vuorovaikutus energia (LIE) empiirinen yhtälö hyödyntämällä Surface Generalized Born (SGB) jatkumo liuotin malli ennusti tubuliinia Sitoutumisaffiniteetit johdannaisten 5a, 6a-j (vaihtelee -4,923 kohteeseen -6.189 kcal /mol). Yhdiste 6f osoitti korkein sitoutumisaffiniteetti tubuliinin (-6,189 kcal /mol). Kokeellinen arviointi näiden yhdisteiden Havaintoa teoreettisia tutkimuksia. N- (3-brormobenzyl) noskapiini (6 f) sitoutuu tubuliinin kanssa korkein sitoutumisaffiniteetti (K

D, 38 ± 4,0 uM), joka on ~ 4,0 kertaa suurempi kuin emoyhdisteen, noskapiini (K

D , 144 ± 1,0 uM), ja on myös voimakkaampi kuin ensimmäisen sukupolven kliinisen ehdokas EM011, 9-bromonoscapine (K

D, 54 ± 9,1 uM). Kaikki nämä yhdisteet osoittivat merkittävää sytotoksisuutta kohti syöpäsoluja, jossa IC

50-arvot vaihtelevat 6,7 uM 72,9 uM; yhdiste 6f osoitti näkyvästi syöpälääkkeen tehoa IC

50-arvot vaihtelevat 6,7 uM 26,9 uM syöpäsoluissa eri kudosten alkuperää. Nämä yhdisteet levoton DNA-synteesin, viivytti solusykliä G2 /M vaiheessa, ja indusoi apoptoottista solukuolemaa syöpäsoluissa. Yhdessä tutkimuksessa raportoitu tässä tunnistettu voimakas, kolmannen sukupolven noscapinoids uutena syöpälääkkeet.

Citation: Manchukonda NK, Naik PK, Santoshi S, Lopus M, Joseph S, Sridhar B, et al. (2013) Rational Design, Synthesis, ja biologinen arviointi Kolmannen sukupolven α-Noskapiini analogeja Voimakkaat Tubulin Sidonta syöpälääkkeet. PLoS ONE 8 (10): e77970. doi: 10,1371 /journal.pone.0077970

Editor: Chandra Verma, bioinformatiikan instituutti, Singapore

vastaanotettu: 23 helmikuu 2013; Hyväksytty: 06 syyskuu 2013; Julkaistu: 21 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Manchukonda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki läpi MLP 0002 CSIR 12. viisi vuotta hanketta (CSC0108-ORIGIN CSC0205 – DENOVA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Toisin kuin tässä tubuliinia sitovan kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten paklitakseli ja Vinka-alkaloidit, jotka sekoitti komplikaatioita ei-toivottuja sivuvaikutuksia, kuten systeeminen toksisuus, noskapiini [1-3], over-the-counter yskänärsytystä alkaloidi [4 , 5], on jolla on paremmat syöpälääkkeen profile [6-8] ja turvallisempaa toksisuusprofiili [9-11]. Mekanistisesti noskapiini sitoutuu tubuliinin kanssa stökiömetrialla yksi (0,95 ± 0,02) noskapiini molekyyli per tubuliinidimeereistä, muuttaa tubuliinia konformaatio sitoutumisen [12] vielä sallii polymeroitumisen tubuliinin mikrotubuluksiksi (MTS) [13,14]. Noskapiini kuitenkin aiheuttaa pieniä tukahduttaminen dynaamisen epävakaus mikrotubulushaarojen [13,14]. Tämän seurauksena, noskapiini estää mitoosin prometaphase, ja ehkä johtuen heikentynyt tarkistuspisteitä, syöpäsolut selektiivisesti saada sitoutunut apoptoottisen solukuoleman jättää normaalit solut vahingoittumattomina [6-14]. Farmakologisesta näkökulmasta, noskapiini on monia etuja, kuten mikrotubuluksiin sitovan aineen [1]. Se on tehokas monilääkeresistenteistä syöpäsolulinjoissa, vaikuttaa syöpäsolujen eri normaalista jakautuvien solujen [15,16], on parempi farmakokineettinen profiili [17,18], ja ei vahingoita normaaleissa kudoksissa (siis puuttuu toksisia sivuvaikutuksia) [ ,,,0],19,20]. Vaikka noskapiini on havaittu olevan sytotoksinen vastaan ​​monenlaisia ​​syöpäsolujen julkinen kirjasto National Cancer Institute, USA (NCI 60-solu-näyttö), IC

50-arvot pysyy korkealla mikromolaarinen alueita ( ~ 21,1-100 uM) [12]. Tämän seurauksena eri noskapiini-pohjainen tubuliinia kohdistettuja aineita ovat kehittäneet muutoksilla lähinnä A, B ja C sivustoja (kuvio 1A) kun noskapiini telineen [21-28]. Näitä yhdisteitä kutsutaan noscapinoids (kuvio 2). Ensimmäisen sukupolven analogit syntetisoitiin kemiallisella manipuloinnin monimuotoisuus piste A on isokinoliini rengasjärjestelmä noskapiini (kuvio 1A) sisältyvät nitro [21], atsido [22], amino [23,24] ja halogenoidut [25-27] ( fluori, kloori, bromi ja jodi) α-noskapiini analogit, ja ne näkyvät ylivoimainen syövän vastainen vaikutus. Näiden havaintojen perusteella, laktonirenkaan bentsofura- (monimuotoisuus piste B, kuva 1A) pienennettiin sen syklinen eetteri analoginen [28] (esim 4a) ja tutkittiin sen teho kuin tubuliinia sitovien aineiden [29]. Lisämonimuotoisuutta pisteessä C (kuvio 1A) on bentsofura- rengasjärjestelmä noskapiini on raportoitu, jolloin saatiin toisen sukupolven O-alkyloidun [30] /asyloitu [31] noscapinoids, mukaan lukien hydroksi- johdannainen, joka on voimakkaampi kuin vanhemman noskapiini. Nämä raportit viittaavat siihen, että kemiallinen ohjailuun ruumiillistuneiden funktionaaliset ryhmät noskapiini on merkittävä vaikutus sen biologista aktiivisuutta. Jatkona ponnistelumme suunnitella uusia noskapiini johdannaisia, päätimme ottaa käyttöön muunnos moninaisuutta kohtaan D (kuvio 1 B) funktionalisoimalla ’N’ in isokinoliini yksikössä luonnon α-noskapiini (kutsumme heitä kolmannen sukupolven α-noskapiini analogit ), jotka ovat omiaan parantamaan biologista aktiivisuutta. Raporteissa kuvataan functionalization at ’N’ ovat läpi urea tyyppiä yhteyksiä [32] ja paljon ei ole tutkittu sen biologinen tehokkuus. Uskomme, että urea tyypin sidos ei voi olla oikea vaihtoehto, koska se häiritsee elektroni tiheys isokinoliini-N kautta siirtyy muualle. Siksi esillä olevassa tutkimuksessa olemme ottaneet käyttöön toiminnallisia ryhmiä pitämään sähköisen ympäristön N enimmäkseen ehjänä (eli pitämään vaikutusta metyyliryhmän ehjä). Näin ollen ”H” on N-CH

3 on tavoite muuttamista. Kaikki johdannaiset kuvattu ja syntetisoitu ovat linjassa tällä grafiikalla strategian (kuva 3).

(A) Eri monimuotoisuus pistettä johdannaisen α-noskapiini ja (B) suunnittelustrategia uusille α-noskapiini analogit (perus luuranko ja stereokemia on sama kuin luonnollisen α-noskapiini).

reaktio-olosuhteet: (i):

m

CPBA, DCM; b: 2 N HCI; c: FeSO

4.7H

2O; (Ii) R-Br, KI, K

2CO

3, Asetoni.

Kirjoittajat raportoivat kolmannen sukupolven noskapiini yhdisteiden 6a-j, jotka eroavat, joka on kytketty isokinoliini ” N ’luonnon α-noskapiini.

In silico

molekyylimallinnusta laskelmia näiden analogien kanssa tubuliinin monimutkaisia ​​käytettiin tutkimaan niiden sitoutumisaffiniteetti perustuvat kohtuullisiin ennustemallien. Uusi analogit, nornoscapine 5a ja 6a-j syntetisoitiin kemiallisesti ja tutkittiin niiden tubuliinin sitovia ominaisuuksia, ja niiden vaikutukset solusyklin etenemisen ja antiproliferatiivista aktiivisuutta nopeasti jakautuvia syöpäsoluja käyttäen edustavia ihmisen syövän solulinjoissa keuhko-, myelooma, rinta ja kohdunkaula.

Materiaalit ja menetelmät

V: Computational metodologia

ligandimallin valmistelua.

Molecular rakenteiden uusia johdannaisia ​​noskapiini 5a, 6a-j (kuva 3) yhdessä raportoitu noscapinoids 1, 2a-f (kuva 2) on rakennettu käyttäen molekyyli- rakentaja Maestro (versio 9.2, Schrödingerin). Kaikki nämä rakenteet olivat energiaa minimoida käyttämällä makrotaloudellisen (versio 9.9, Schrödingerin) ja OPLS 2005 voimakentän kanssa PRCG algoritmilla (1000 vaiheet minimointi ja energian gradientti 0,001). Asianmukaiset bond jotta kunkin rakenteen määrättiin käyttäen Ligprep (versio 2.5, Schrödingerin). Täydellinen geometrinen optimointi näiden rakenteiden suoritettiin käyttäen hybridi tiheysfunktionaaliteoriaan kanssa Becke kolmen parametrin vaihdon lisäämisen ja Lee-Yang-Parr korrelaatio funktionaalinen (B3LYP) [33,34] käyttäen perustana asetettu 3-21G * [35-37] . Jaguar (versio 7.7, Schrödinger, LLC) käytettiin geometrinen optimointi ligandien.

Protein valmistelua.

co kiteytetty kolkisiinin-tubuliinin monimutkainen rakenne (PDB ID: 1SA0, resoluutio 3.58Å) [38] käytettiin molekyyli- telakointi ja rescoring. Monivaiheinen Schrödingerin proteiinin valmistamiseksi ohjatun (PPrep) käytettiin lopullinen valmiste proteiinia. Puuttuu vetyatomit lisättiin rakenteen avulla Maestro käyttöliittymä (versio 9.2, Schrödinger). Kaikki vesimolekyylit poistettiin monimutkainen ja optimoi vetysidos verkkoon PPrep ohjatun. Puuttuva aminohapot 37-47 (A-ketju) ja 275-284 (B-ketju) on yhteistyössä kiteytyi rakenne täytettiin homologia-pohjainen mallinnustekniikkaa perustuu eri templates kuten ATE ID: 3DU7 (C-ketju ) ja ATE ID: 3RYC (D-ketju), vastaavasti, käyttäen Prime (versio 3.0, Schrödingerin). Rakenne saatiin energiaa minimoida käyttämällä OPLS 2005 voimakentän kanssa Polak-RIBIERE konjugaattigradienttimenetelmä (PRCG) algoritmia. Minimointi lopetettiin joko sen jälkeen 5000 vaiheiden tai sen jälkeen energia kaltevuus lähentyneet alle 0,001 kcal /mol. Kaikki atomi molekyylidynamiikan (MD) simulointi proteiinin rakenteen nimenomaisen vedessä suoritettiin käyttäen Gromacs 4.5.4 ohjelmisto [39] ja GROMOS96 voimakenttä jonkin aikaa asteikolla 10 ns. Kolmiulotteinen määräajoin reunaehdot määrättiin, liitti molekyylin dodekaedri solvatoituneissa kanssa SPC216 veden mallia käyttäen Gromacs paketin ja energiaa minimoida käyttämällä 1000 vaiheita jyrkimmän laskeutumisen. Järjestelmä neutraloitiin 32 Na

+ vastaioni ja sen paikallisesti minimoida käyttämällä 100 vaiheet jyrkimmän laskeutumisen. Sähköstaattinen Termi kuvattiin käyttäen Particle Mesh Ewald algoritmi [40]. LINCS [41] algoritmia käytettiin pakottavat kaikki side pituudet ja katkaisun etäisyydet laskettaessa varaushäviöihin ja van der Waals vuorovaikutuksia 1,0 nm. Järjestelmä tasapainotettiin 100 ps MD juoksee kanta rajoituksiin proteiinin jotta rentoutumista liuottimen molekyylien 300K ja normaalipaineessa. Järjestelmä kytkettiin ulkoiseen kylpy jonka Berendsen termostaatti kytkentä ajan 0,1 ps kanssa oletusarvo. Lopulliset MD laskelmat tehtiin 10,0 ns samoissa olosuhteissa ajalla vaiheen 2 fs. Yleistä laatua mallin saatu, stereokemiallinen arvot ja sitoutumattomien vuorovaikutuksia testattiin käyttämällä PROCHECK [42], ERRAT [43] ja VERIFY3D [44]. PROCHECK Tulokset osoittivat 94,8% selkärangan kulmat ovat sallittuja alueilla, joilla G-tekijät – 0,12. Ramachandran juoni [45] analyysi paljasti vain 1,6% tähteiden kieltänyt alueella ja 2,3% jäämiä jalomielisyydessään alueilla. ERRAT on ”yleinen laatutekijä” laskin ohjelma sitoutumattomien atomi vuorovaikutusta. Hyväksytty alue ERRAT on 50 ja korkeammat pisteet osoittavat tarkkuus mallin. Siinä tapauksessa, tubuliinin, The ERRAT pistemäärä oli 88,402, joka on alueella korkealaatuisia mallin. Samoin VERIFY 3D pisteet 95.25% kertoo hyvälaatuista malli.

Molecular telakointi ligandien ja laskeminen sitovien vapaa energioita.

Reseptori-grid tiedosto oli syntyy painopisteessä noscapinoid sitoutumiskohdan [46] käyttämällä Glide (versio 5.7, Schrödingerin). Muokkausalueen on kooltaan 12A x 12 x 12 määriteltiin tubuliinia ja keskitetty painopisteensä sitoutumiskohdan, jotta rajoittaa massan keskellä telakoituna ligandin. Suurempi sulkevan laatikko koko 12A x 12A x 12A, joka miehitetty kaikki atomit telakoituna aiheuttaa myös määritelty. Skaalauskertoimen on 0,4 van der Waalsin säteiden levitettiin atomia proteiinin absoluuttisen veloittaa osittain pienempi kuin tai yhtä suuri kuin 0,25. Kaikki ligandit sitten telakoituna sitoutumiskohtaan joissa liukukulma XP (extra precision) ja arvioitiin käyttäen Glide XP

Score toiminto [47,48]. Lisäksi typistetty komplekseja näiden ligandien minimienergiatilassa perustuvat hybridi Monte Carlo simulointi ja niiden sitova vapaa energia (Δ

G

bind

) päälle tubuliinia ennustettiin käyttämällä lineaarista vuorovaikutus energia menetelmä (LIE), jonka pinta yleistynyt Born (SGB) jatkumo hydrataatiotila malli. Valhe-SGB malli arvioi sitoutumisaffiniteetteja joukon uusia yhdisteitä käyttäen kokeellista sitoutumisaffiniteetti dataa joukon koulutus asetettu. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet alkuperäinen muotoilu SGB-LIE (yhtälö 1) ehdottama Jorgensen [49] ja toteutettu Liaison paketti (versio 5.6, Schrödingerin, LLC) käyttäen OPLS 2005 voimaan field.

Δ

G

b

i

n

d

=

α

(

〈

U

v

d

w

b

〉

−

〈

U

v

d

w

f

〉

)

+

β

(

〈

U

e

l

e

c

b

〉

−

〈

U

e

l

e

c

f

〉

)

+

γ

(

〈

U

c

a

v

b

〉

−

〈

U

c

a

v

f

〉

)

(1)

Here ⟨⟩ Edustavat ensemble keskimäärin

b

edustaa sitoutuneessa muodossa ligandin,

f

edustaa vapaa muoto ligandin, ja α, β, ja γ ovat kertoimia.

U

vdw

,

U

sähkö

, ja

U

cav

ovat van der Waalsin, sähköstaattinen, ja ontelo energia termejä SGB jatkumo liuotin malli. Onkalo energia aikavälillä

U

cav

, on verrannollinen paljaan pinnan ala ligandin. Erilaisia ​​energiaa kuuluvat parametrit yhtälössä 1 laskettiin telakoituna monimutkainen vastaa kutakin analogista käyttäen Liaison pakettia kuten aiemmin on kuvattu [24]. Keskimääräinen LIE energian kannalta käytetty rakentamiseen sitoutumisaffiniteetin mallia sekä sitoutumisen vapaan energioiden noskapiini johdannaisia. Α

,

β, ja γ VALEHTELET sovitusparametreja määritettiin käyttäen Minitab tilastopaketista (versio 16.0, Minitab Inc.) sovittamalla kokeellinen sitomisaffiniteettien opetusjoukolla molekyylejä. Aineisto koostuu 7 noskapiini johdannaisia ​​(yhdisteet: 1, 2a-f; kuva 2), joiden tiedetään olevan kokeellisen sidosaffmiteetti käytettiin opetusjoukolla.

B: Kokeellinen menetelmät

kemiallinen synteesi noskapiini johdannaisia.

Reagenssit ja kaikki liuottimet olivat analyyttisesti puhdasta ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Kaikki reaktiot suoritettiin uunissa kuivattuun pulloihin magneettisekoittajalla. Kaikki kokeet seurattiin analyyttisellä ohutlevykromatografialla (TLC) suoritettiin silikageelillä GF254 pre-päällystetyillä levyillä. Eluoinnin jälkeen maljat visualisoitiin valaisemalla UV-valolla 254 nm: ssä UV-aktiivisia aineita. Värjäämällä PMA ja hiiltymisen kuumalla levyllä saavutetaan edelleen visualisointi. Liuottimet poistettiin

tyhjiössä

ja lämmitetään vesihauteessa 35 ° C: ssa. Silikageeli hienompia kuin 200 mesh käytettiin pylväskromatografialla. Pylvästä pakattiin lietteenä silikageeliä heksaanissa ja tasapainotettiin sopivan /liuotinseoksen ennen käyttöä. Yhdisteet ladattiin sellaisenaan tai sen konsentroitua liuosta käyttäen sopivaa liuotinjärjestelmää. Paineen kanssa ilmapumpun avustaa eluointiin. Saannot viittaavat kro- matografisesti ja spektroskooppisesti homogeenisia materiaaleja, ellei toisin mainita. Asianmukaiset nimet kaikille uusille yhdisteitä annettiin avulla ChemBioOffice 2010. Sulamispisteet mitattiin Fischer-Johns sulamispistelaitteella ja ne ovat korjaamattomia. Puhtaus kaikkien yhdisteiden ( 96%), jota käytetään biologista seulontaa varten määritettiin analyyttisellä HPLC: llä (SPD-M20A, jotta: Shimadzu) käyttämällä ODS-pylvästä eluoitiin gradientilla seokseen, jossa oli asetonitriili-vesi. Infrapunaspektroskopia (IR) -spektrit rekisteröitiin raakoina nesteitä tai KBr-tableteilla ja absorptiot ilmoitetaan cm

-1. Ydinmagneettinen resonanssi (NMR) -spektrit tallennettiin 300 (Bruker) ja 500 MHz (Varian) spektrometrit sopivissa liuottimissa käyttäen tetrametyylisilaanista (TMS) sisäisenä standardina tai liuotin signaaleja toissijaisiksi standardit ja kemialliset siirtymät on esitetty δ mittakaavoissa. Multiplisiteetit NMR-signaalien on nimetty s (singletti), d (dubletti), t (tripletti), q (kvartetti), br (leveä), m (multipletti, ja ratkaisematta riviä), jne.

13C-NMR-spektrit olivat kirjataan 75 MHz spektrometrillä. Korkean resoluution massaspektrit (HRMS) saatiin käyttämällä ESI-QTOF massaspektrometrialla. Optiset rotaatiot mitattiin Roudolph Digipol 781 polarimetrillä 25 ° C: ssa. Kaupallisesti saatavilla olevia liuottimia heksaani, CH

2CI

2, ja EtOAc: tä käytettiin sellaisenaan ilman lisäpuhdistusta. Natural α-noskapiini ostettiin Sigma-Aldrich, ja sitä käytetään sellaisenaan. Synteettinen lähestymistapa valmistamiseksi noskapiini johdannaisia, 6a-j on esitetty kuviossa 3. Kaikki nämä johdannaiset syntetisoitiin nornoscapine 5a lähtöaineena, joka puolestaan ​​syntetisoitiin noscapine.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a): Liuokseen, jossa oli luonnollinen α- noskapiini (2,0 g, 4,84 mmol) dikloorimetaanissa (15 ml), lisättiin mCPBA: ta (1,66 g, 9,7 mmol) annoksittain 0 ° C: ssa. Reaktioseosta sekoitettiin 1 tunti huoneen lämpötilassa, laimennettiin dikloorimetaanilla (20 ml), ylimäärä peroksidia sammutettiin 1 M vesipit. liuos NaHSO

3 (15 ml), orgaaninen kerros erotettiin sitten, kuivattiin vedettömällä Na

2SO

4, ja konsentroitiin. Raaka jäännös liuotettiin metanoliin (20 ml), tehtiin happamaksi pH-arvoon 1,0 käyttäen 2 N HCI: a, sekoitettiin 5 minuuttia ja suodatettiin. Suodos konsentroitiin alennetussa paineessa, liuotettiin uudelleen dikloorimetaaniin (20 ml), kuivattiin vedettömällä Na

2SO

4, suodatettiin ja väkevöitiin. Vaaleankeltainen kiinteä aine α- noskapiini N-oxide.HCl Näin saatu suola liuotettiin metanoliin (20 ml), FeSO

4.7H

2O (2,69 g, 9,68 mmol) lisättiin. Kun seosta oli sekoitettu huoneenlämpötilassa 12 tuntia, reaktioseos konsentroitiin ja käsiteltiin 25% ammoniakin vesiliuosta saada pH-arvoon 10, uutettiin dikloorimetaanilla (3 x 10 ml), kuivattiin vedettömällä Na

2SO

4 , ja haihdutettiin alennetussa paineessa. Raaka jäännös altistettiin trietyyliamiinihydrokloridin käsiteltiin silikageelipylväskromatografialla ja eluoitiin 3: 7 etyyliasetaatti: heksaanilla (2: 3) gave(S)-6,7-dimethoxy-3-((

R

)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a) (0,92 g, 48%) valkoisena kiinteänä aineena. sp 170 ° C; [Α]

D

25 = -105,6 (c = 1, metanoli), saanto: 48% IR ν

max (cm

-1): 3360, 2942, 1759, 1624, 1501 , 1280, 1119, 1074, 1042, 1023, 932, 796, 679

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3): δ 6,94 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 6,33 (s, 1H), 5,99-5,89 (m, 4H), 4,85 (d, J = 4,53 Hz, 1 H), 4,09 (s, 3H), 4,07 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 2,69-2,58 (m , 1H), 2,54-2,42 (m, 1H), 2,36-2,23 (m, 1H), 2,22-2,09 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 168,5, 152,1 , 148.3,147.8, 141,0, 140,4, 134,1, 131,9, 119,6, 118,3, 117,5, 116,9, 103,1, 100,7, 20,6, 62,2, 59,4, 56,6, 52,7, 39,5, 29,7 MS (ESI)

m Twitter /

z

400 [M + H]

+; HRMS (ESI) laskettu kaavalle C

21H

22NO

7: 400,1396, havaittu: 400,1401.

Yleinen menettely valmistelussa 6a-j.

Siirry liuosta, jossa oli (

S

)-6,7-dimethoxy-3-((

R

)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one 5a (200 mg, 0,50 mmol) asetonissa (5 ml), lisättiin kaliumkarbonaattia (1,10 mmol), kaliumjodidia (0,5 mmol) ja alkyylibromidin (0,55 mmol) ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa (RT) 1 h. Raaka reaktioseos suodatettiin, suodos haihdutettiin vakuumissa, vettä (5 ml) ja dikloorimetaanilla (2 x 10 ml), lisättiin, orgaaninen kerros erotettiin, pestiin H

2O, kuivattiin vedettömällä Na

2SO

4 ja suodatetaan. Näin saatu jäännös kromatografoitiin trietyyliamiinia käsiteltiin silikageelikolonnissa eluoiden heksaanilla /etyyliasetaatilla (70:30), jolloin saatiin 6a-j kuin kiinteiden tuotteiden.

(S) -3 – ((

R

) -6-bentsyyli-4-metoksi-5,6,7,8-tetrahydro [1,3] dioksolo [4,5

g

] isokinolin-5-yyli) – 6,7-dimethoxyisobenzofuran-1 (3H) -oni (6): Saanto: 93%; sp 64 ° C; [Α]

D

25 = 1,3 ° (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3503, 2490, 2837, 1759, 1621, 1595, 1569, 1498, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) 7,33-7,15 (m, 5H), 6,98 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 6,33 (s, 1 H), 6,17 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 5,94 ( s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1 H), 4,62 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,15-4,06 (m, 4H), 4,02 (s, 3H), 3,86 (s, 3H ), 3,66 (d, J = 13,21 Hz, 1H), 2,51-2,36 (m, 2H), 2,35-2,15 (m, 1H), 2,06-1,91 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 168,1, 152,2, 148,4, 147,8, 141,3, 140,5, 139,0, 133,9, 131,9, 128,7, 126,9, 119,8, 118,2, 117,7, 116,9, 102,4, 100,7, 81,7, 61,5, 59,6, 56,7, 59,6 , 62,3, 45,1, 26,5. MS (ESI)

m Twitter /

z

490 [M+H]

+

5(S)-3-((R)-6-(4-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6b): Saanto: 95%; sp 76 ° C; [Α]

D

25 = -146,0 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3493, 2939, 2837, 1759, 1622, 1596, 1497, 1479, 1271, 1213, 1115, 1079, 971, 789, 711, 644, 479, 811 , 746

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) δ 7,37 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 7,12 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1 H), 6,04 (bs, 1 H), 5,94 (s, 2H), 5,59 (bs, 1 H), 4,57 (d, J = 3,77 Hz, 1H,), 4,14-3,89 ( m, 7H), 3,85 (s, 3H), 3,57 (d, 1 H), 2,46-2,09 (m, 3H), 2,00-1,84 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) ö 168,1, 152,2, 148,5, 147,8, 141,0, 140,4, 138,0, 133,9, 131,8, 131,2, 130,4, 120,6, 119,8, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7, 81,5, 62,3, 61,0, 59,4, 59,3, 56,7 , 45,3, 26.6.MS (ESI)

m Twitter /

z

568 [m + H]

+. HRMS (ESI) laskettu kaavalle C

28H

27NO

7: 568,0970, löydetty: 568.0946.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-nitrobenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6c): Saanto: 94%; sp 154 ​​° C; [Α]

D

25 = +68,0 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3490, 3078, 2931, 2901, 2837, 1751, 1620, 1520, 1499, 1389, 1343, 1274, 1213, 1080, 972, 852, 733, 610

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) ö 8,13 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,30 (s, 1 H), 6,01-5,92 (m, 3H), 5,62 (d, J = 3,77 Hz, 1 H), 4,61 (d, J = 3.77Hz, 1 H), 4,27 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,09 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 2,44-2,28 (m, 2H), 2,23-2,13 (m, 1H), 2,00-1,85 (m, 1 H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 168,1, 152,3, 148,6, 147,8, 147,1, 147,0, 140,6, 140,3, 134,0, 131,7 , 129,0, 123,4, 119,9, 118,1, 117,7, 116,3, 102,4, 100,8, 81,4, 62,3, 61,4, 59,5, 59,4, 56,6, 46,0, 27,0. MS (ESI)

m Twitter /

z

557 [M + H]

+; HRMS (ESI) laskettu kaavalle C

28H

26N

2O

9NA: 557,1536, löydetty: 557.1557.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6d): Saanto: 92%; sp 66 ° C; [Α]

D

25 = 6,66 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3492, 2936, 2836, 1759, 1613, 1511, 1269, 1115, 1013, 970, 821, 713, 517 cm

-1 1.HNMR ( 300 MHz, CDCI

3) 7,15 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,12 Hz, 1 H), 6,76 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,28 (s, 1 H ), 6,12 (d, J = 8.12Hz, 1 H), 5,93 (s, 2H), 5,58 (d, J = 3,58 Hz, 1 H), 4,55 (d, J = 3,55 Hz, 1 H), 4,10 (s, 3H ), 4,03 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,55 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,50-2,13 (m, 3H), 2,04-1,83 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 168,1, 158,5, 152,1, 148,4, 147,7, 141,2, 140,5, 133,9, 131,7, 130,0, 119,7, 118,1, 117,8, 113,4, 116,6, 102,4 , 100,6, 81,5, 62,3, 60,7, 59,3, 59,2, 56,7, 55,1, 44,8, 26.2.MS (ESI)

m Twitter /

z

520 [m + H]

+ ; HRMS (ESI) laskettu kaavalle C

29H

29 NO

8Na: 542,1790, löydetty: 542.1817.

(S)-3-((R)-6-(3-chlorobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6e): Saanto: 92%; sp 62 ° C; [Α]

D

25 = +36,0 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3395, 3022, 2925, 2849, 1728, 1603, 1486, 1302, 1261, 1186, 1058, 811, 747

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) ö 7,29-7,12 (m, 4H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 6,34 (s, 1 H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 5,95 (s , 2H), 5,67 (d, J = 3,77 Hz, 1 H), 4,61 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,17-4,08 (m, 4H), 4,05 (s, 3H), 3,87 (s, 3H) , 3,63 (d, J = 13,59 Hz, 1H), 2,49-2,37 (m, 2H), 2,31-2,16 (m, 1H), 2,06-1,93 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 168,1, 152,2, 148,5, 141,2, 140,9, 140,4, 133,9, 131,8, 129,4, 128,4, 127,0, 126,7, 119,7, 118,1, 117,7, 116,6, 102,3, 100,7, 81,7, 64,3, 62,4, 61,2, 59,5, 59,3, 56,6, 45,5, 26,8. MS (ESI)

m Twitter /

z

524 [M+H]

+.

(S)-3-((

R

)-6-(3-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6 f): Saanto: 97%; sp 65 ° C; [Α]

D

25 = +52,0 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3503, 2940, 2837, 1759, 1621, 1498, 1387, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695

1.HNMR: (300 MHz , CDCI

3) ö 7,40-7,30 (m, 2H), 7,24-7,09 (m, 2H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 6,34 (s, 1 H), 6,15 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 5,95 (s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1 H), 4,60 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,17-4,06 (m, 4H), 4,04 (s , 3H) 3,87, (s, 3H), 3,63 (d, J = 13,78 Hz, 1H), 2,50-2,37 (m, 2H), 2,32-2,19 (m, 1H), 2,07-1,92 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) 168,1, 152,2, 148,5, 147,9, 141,5, 140,4, 134,0, 131,8, 131,4, 130,0, 129,7, 127,3, 122,2, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7 , 81,6, 81,1, 62,5, 61,1, 59,5, 59,3, 56,7, 45,4, 26,8. MS (ESI) m /z 568 [M+H]

+.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(3-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isokinolin-5-yyli) isobentsofuraani-1 (3H) -onia (6 g): Saanto: 94%; sp 60 ° C; [Α]

D

25 = -144,01 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3501, 2941, 2836, 1760, 1620, 1598, 1497, 1387, 1268, 1212, 1012, 933, 786, 693

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) ö 7,21-7,11 (t, 1H), 7,00-6,89 (m, 2H), 6,84-6,72 (m, 2H), 6,33 (s, 1 H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,67 (d, 4,53, 1 H), 4,62 (d, J = 4,53 Hz, 1 H), 4,10 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 3,88-3,80 (m, 7H), 3,63 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,51-2,33 (m, 2H), 2,33-2,16 (m, 1H), 2,03-1,87 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 168,1, 159,6, 152,2, 148,4, 147,8, 141,2, 140,7, 140,5, 133,9, 131,9, 128,8, 120,9, 119,9, 118,2, 117,7, 116,8, 113,6, 113,0, 102,4, 100,7 , 81,5, 62,3, 61,6, 59,4, 59,3, 56,7, 55,2, 45,2, 26,4. MS (ESI) m /z 520 [M+H]

+.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(2-oxopropyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isokinolin-5-yyli) isobentsofuraani-1 (3H) -oni (6h): Saanto: 98%; sp 179 ° C; [Α]

D

25 = -34,0 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3393, 2957, 2904, 2840, 1764, 1706, 1624, 1500, 1482, 1387, 1364, 1275, 1223, 1041, 1010, 941, 897, 828 , 710, 693, 538.cm

-1 1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) 6,90 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 6,28 (s, 1 H), 6,00-5,88 (m , 3H), 5,51 (d, J = 3,58 Hz, 1 H), 4,61 (d, J = 3,58 Hz, 1 H), 4,08 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,64 (d, J = 4,15 Hz, 2H), 2,50-2,39 (m, 2H), 2,37-2,29 (m, 1 H), 2,09 (s, 3H), 1,91-1,76 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 167,7, 153,2, 148,5, 140,3, 140,2, 131,8, 120,2, 118,0, 117,7, 116,8, 102,4, 100,7, 96,0, 81,8, 67,6, 62,1, 59,4, 59,0, 56,6, 47,3 , 29,6, 28,2, 27,2. MS (ESI)

m Twitter /

z

456 [M + H]

+; HRMS (ESI) laskettu kaavalle C

24H

25NO

8Na: 478,1477, havaittu: 478,1470.

Metyyli 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6 i): Saanto: 97%; sp 155 ° C; [Α]

D

25 = -66,6 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3488, 3006, 2947, 2919, 2851, 1755, 1627, 1590, 1484, 1387, 1265, 1214, 1085, 1017, 894, 789, 735, 696 , 546

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) δ 6,96 (d, J = 8,30 Hz, 1 H), 6,31 (s, 1 H), 6,03 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 3,21 Hz, 2H), 5,52 (d, J = 3,96 Hz, 1 H), 4,86 ​​(d, J = 3,96 Hz, 1 H), 4,10 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,80 (d, J = 15,86 Hz, 1 H), 3,65 (s, 3H), 3,54 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 2,81-2,53 (m, 2H), 2,40-2,23 (m, 1H), 1,94-1,74 (m, 1 H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) δ 171,7, 167,8, 152,1, 148,3, 147,5, 140,2, 140,1, 134,2, 131,8, 120,1 , 117,9, 117,7, 117,3, 102,3, 100,7, 82,2, 62,1, 59,4, 58,2, 58,1, 56,6, 51,1, 47,3, 28.9.MS (ESI) m /z 494 [m + H]

+.

Etyyli 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6 j): Saanto: 98%; sp 92 ° C; [Α]

D

25 = -174,68 (c = 1, dikloorimetaani); IR ν

max (cm

-1): 3511, 2945, 2921, 2839, 1763, 1727, 1625, 1481, 1389, 1270, 1203, 1111, 1032, 931, 817, 790, 703, 614

1.HNMR (300 MHz, CDCI

3) δ 6,90 (d, J = 8,12 Hz, 1 H), 6,27 (s, 1 H), 6,01-5,82 (m, 3H), 5,44 (d, J = 3,96 Hz, 1 H), 4,84 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,19-4,00 (m, 8H), 3,85 (s, 3H), 3,83 (d, 1 H), 3,49 (d, J = 17,56 Hz , 1H), 2,75-2,54 (m, 2H), 2,38-2,20 (m, 1H), 1,91-1,71 (m, 1 H), 1,24 (t, 3H)

13.CNMR (75 MHz, CDCI

3) ö 171,2, 167,7, 152,1, 148,3, 147,5, 140,3, 140,1, 134,2, 131,9, 120,2, 117,8, 117,7, 117,4, 102,3, 100,7, 96,0, 82,2, 62,2, 60,1, 59,4, 58,1, 56,6, 47,3, 29,0, 14,1. MS (ESI) m /z 486 [M + H]

+; HRMS (ESI) laskettu kaavalle C

25H

27 NO

9NA: 508,1583, havaittu: 508,1578.

röntgenkristallografisilla analyysi.

X-ray tiedot yhdisteet 6h ja 6i kerättiin huoneenlämpötilassa käyttämällä Bruker Smart Apex CCD diffraktometrissä grafiitti monokromatoidulla MoKα säteilyn (λ = 0.71073Å) käyttäen ω-skannausmetodia [50]. Alustava hilaparametrien ja suunta matriiseja saatiin neljä kehystä. Integrointi ja skaalaus intensiteetti tietojen suoritettiin käyttäen SAINT ohjelmaa. Rakenteet 6h ja 6i ratkaistiin suorilla menetelmillä käyttämällä SHELXS97 ja hienosäätö suoritettiin koko matriisin pienimmän neliösumman tekniikkaa käyttäen SHELXL97 [50]. Anisotrooppinen siirtymä parametrit olivat mukana kaikki muuta kuin vetyatomia. Kaikki H-atomien kiinnittynyt C ja N sijaitsi ero Fourierin ja olivat geometrisesti optimoitu ja annettiin niin ratsastus atomeja, CH = ,93-,97 Å, NH = 0,86 Å, jossa U

iso (H) = 1,5 U

eq (C) metyyli H tai 1.2U

eq (C, N). Metyyliryhmät annettiin pyöriä mutta ei kärki.

Crystal tiedot 6h: C

24H

25NO

8

M

= 455,45, väritön levy, 0,17 x 0,15 x 0,07 mm

3, ortorombinen, tila ryhmä

P

2

12

12

1 (nro 19),

= 8,7173 (12),

b

= 12,8144 (17),

c

= 19,436 (3) Å,

V

= 2171,2 (5)

3

Z

= 4,

D

c = 1,393 g /cm

3, F

000 = 960, CCD Area Detector, MoKα säteily, λ = 0,71073 Å,

T

= 294 (2) K, 2

θ

max = 50,0 °, 21015 heijastukset kerättiin, 2200 ainutlaatuinen (R

int = 0,0227). Lopullinen munaus = 1,045,

R1

= 0,0279,

WR 2

= 0,0774,

R

indeksit perustuvat 2086 heijastuksia I 2σ (I) (jaottelu F

2), 302 parametrit, 0 rajoituksia, μ

= 0,105 mm

-1. CCDC 914991 sisältää täydentäviä Kristallografinen tietoja rakenteesta. Yksityiskohtainen selvittäminen kiderakenteen ja analyysi julkaistaan ​​muualla.

Crystal tiedot 6i: C

24H

25NO

9,

M

= 471,45, väritön neula , 0,18 0,12 0,08 mm

3, tetragoninen, tila ryhmä

P

4

32

12 (nro 96),

=

b

= 11,6748 (4),

c

= 32,753 (2) Ä,

V

= 4464,3 (4) Å

3

Z

= 8,

D

c = 1,403 g /cm

3, F

000 = 1984 CCD Area Detector, MoKα säteily, λ = 0,71073 Å,

T

= 294 ( 2) K, 2

θ

max = 50,0 °, 43048 heijastukset kerättiin, 2346 ainutlaatuinen (R

int = 0,0252). Lopullinen munaus = 1,051,

R1

= 0,0396,

WR 2

= 0,1095,

R

indeksit perustuvat 2198 heijastuksia I 2σ (I) (jaottelu F

2), 311 parametrit, 0 rajoituksia,

μ

= 0,108 mm

-1. CCDC 914990 sisältää täydentäviä Kristallografinen tietoja rakenteesta. Yksityiskohtainen selvittäminen kiderakenteen ja analyysi julkaistaan ​​muualla.

Tubulin puhdistusta.

Tubulin vailla mikrotubulusten liittyvien proteiinien (MAP) puhdistettiin naudan aivoista sykliä lämpötilasta riippuvainen polymerointi 0.072⟨

U

vdw

⟩−0.006⟨

U

elec

⟩−0.951⟨

U

cav

⟩. 0.7-5.6916a-5.997-62.8167.520.820-5.707–6b-6.918-60.2557.270.988-5.622–6c-6.087-63.6841.560.846-5.63991 8.0-5.5186d-6.882-64.8535.950.865-5.708–6e-6.907-61.8579.0910.972-5.852–6f-7.252-62.6276.071.287-6.18938 4.0-6.0366g-5.767-61.3464.560.445-5.227–6h-7.196-65.0855.791.033-6.003–6i-5.712-62.1241.140.723-5.40779 0.072⟨

U

vdw

⟩−0.006⟨

U

elec

⟩−0.951⟨

U

cav

⟩. hours

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Noscapine0.2958.8510.2424.297.2419.484.1962.3830.6219.058.5337.365a0.2763.3712.9319.458.4613.474.0866.3741.5710.747.0839.256a1.4467.069.5320.178.1216.284.9463.1844.829.067.3937.726b0.7455.3912.1728.797.3719.424.1664.4243.1811.387.5335.846c0.8260.6611.4924.298.0820.724.8563.4936.7315.388.2738.416d0.5256.8212.2828.397.2722.734.6259.4145.388.297.8336.186e0.8762.5711.9323.158.1712.844.5768.4245.427.026.8338.526f1.0464.269.5122.479.4711.826.2967.4850.446.384.7237.296g0.6263.3212.9221.3710.8620.944.0862.2840.2912.768.0737.936h0.3561.1612.2925.0911.3712.255.9268.5848.737.196.2836.186i0.4657.4111.0827.1412.2519.574.6263.3840.1814.376.4337.156j0.3959.159.4724.358.2925.713.0966.1727.2422.168.6339.48Table

tukeminen Information

Kuva S1.