Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aiemmat tutkimukset osoittivat alas-säätely GRIM-19 ensisijainen ihmisen kohdunkaulan syövistä, ja palauttaminen GRIM-19 aiheuttama kasvaimen taantumiseen. Induktio tuumorisuppressoriproteiinia p53 ubikitinaation ja hajoamista E6 oncoportein korkean riskin HPV kautta, joka muodostaa stabiilin kompleksin E6AP pidetään kriittinen mekanismi kohdunkaulan kasvainten kehittymiseen. Tavoitteet Tämän tutkimuksen selvittää mahdollista roolia GRIM-19 pelastamiseen p53-proteiinin ja houkutella kohdunkaulan syövän solujen apoptoosin.

Menetelmät /Principal Havainnot

proteiinin tasot GRIM-19 ja p53 havaittiin normaalissa kohdunkaulan kudoksissa 45 potilasta, joille tehtiin kohdunpoisto muista syistä kuin neoplasioihin joko kohdunkaulan tai kohdun limakalvon ja kohdunkaulan syöpä kudoksia 60 joilla on ei-metastasoitunut squamous epiteelin karsinoomia. Coimmunoprecipitation ja GST avattavasta määritys tehtiin tutkia vuorovaikutusta GRIM-19 kanssa 18E6 ja E6AP

in vivo ja in vitro

vastaavasti. Kilpailu on 18E6 kanssa E6AP sitoutumisessa GRIM-19 suorittamalla kilpailu avattavasta määritykset suunniteltiin tutkimaan häiriöitä E6 /E6AP kompleksin GRIM-19. Lisä-ja E6AP ubikitinaation by GRIM-19 havaittiin in vivo ja in vitro ubikitinaatio määrityksessä. Vaikutukset GRIM-19-riippuvainen p53 kertymistä soluproliferaatioon, solusyklin, apoptoosin tutkittiin MTT, virtaussytometrialla ja siirto elektronimikroskoopilla vastaavasti. Kasvain tukahduttaminen havaittiin ksenografti- hiirimallissa.

Päätelmä /merkitys

tasot GRIM-19 ja p53 olivat samanaikaisesti alaspäin säännelty kohdunkaulan syöpiä. Palauttaminen GRIM-19 voi aiheuttaa ubikinaation ja hajoamista E6AP, ja häiritä E6 /E6AP kompleksin vuorovaikutuksella N-pään GRIM-19 sekä E6- ja E6AP, joka suojeli p53 hajoamiselta ja edistää solujen apoptoosin. -tuumoriksenografti Tutkimukset paljastivat tukahduttaminen p53 hajoamista läsnäollessa GRIM-19. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GRIM-19 voi estää E6 /E6AP kompleksin; ja synergisesti tukahduttaa kohdunkaulan kasvaimen kasvua kanssa p53.

Citation: Zhou Y, Wei Y, Zhu J, Wang Q, Bao L, Ma Y et ai. (2011) GRIM-19 häiritsee E6 /E6AP Complex Rescue p53 ja apoptoosin indusoimiseksi kohdunkaulan syöpiä. PLoS ONE 6 (7): e22065. doi: 10,1371 /journal.pone.0022065

Editor: Scott A. Coonrod, Cornell University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 12 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (973 Program): 2007CB914503 https://www.973.gov.cn, National Natural Science Foundation of China (nro 81071683, 81001168 81072127 ja 91029710) http: //www.nsfc .gov.cn, ”Yhdestoista viisivuotiseen” teknologian tukiohjelma (2008BAI57B03) https://kjzc.jhgl.org, National Institutes of Health myöntää CA105005, CA78282 ja P30-CA134274 https://grants.nih.gov. Anhui Provincial Natural Science Foundation projekti (20090413117, 11040606M178) https://www.ahkjt.gov.cn, ja maakunnan Natural Science Research Project Anhuin maakunnan Higher University Education (KJ2010B375) https://www.ahedu.gov.cn/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

korkean riskin ihmisen papilloomavirusten (HR-HPV), kuten HPV18 ja HPV16, ei ole ainoastaan ​​tärkeä syy kohdunkaulan syövän [1], mutta myös taudinaiheuttajia osajoukon muita kasvaimia, kuten pään ja niskan levy- karsinoomista [2], keuhkosyöpä [3] ylempi aerodigestive suolikanavan syöpä [4] ja anogenital syöpä [5]. Ilmaisu viruksen onkoproteiineja E6 HPV-positiivisten kohdunkaulan karsinoomien [6] voivat olla vuorovaikutuksessa E6-liittyvä proteiini (E6AP) muodostamiseksi E6 /E6AP monimutkainen, että erityisesti indusoi ubikitinaation ja nopea hajoaminen p53, tumatranskriptiotekijä X-box sitova 91 (NFX1-91) ja PDZ domain sisältävät proteiinit kautta proteasomireitillä reitin [7], [8], [9], [10]. p53 hajoaminen on olennainen edellytys selviytymiselle HR-HPV-tartunnan kasvaimet; mikä estää E6 /E6AP monimutkainen välittävä p53 hajoaminen voi olla houkutteleva lähestymistapa hoitoon syöpiä HR-HPV-infektion [11], [12], [13], [14].

GRIM-19 tunnistettiin alun perin kuten kasvain esti proteiini, joka oli mukana solukuolemaan [15] kautta yhdistys ja tukahduttaminen STAT3 [16], [17]; Sen ilmentymistä säädeltiin munuaisten, eturauhasen ja kohdunkaulan syöpiä [16], [17], [18], [19], [20]. Lisäksi GRIM-19 vaimentaa onkogeenin indusoimaa remontin solun tukirangan ja soluliikkuvuus [21]; ja solusyklin etenemisen vuorovaikutuksessa tuumorisuppressoriproteiinia p16Ink4a [22]. Siten GRIM-19 saa aikaan erilliset mekanismit erilaisia ​​solutyyppejä. Kirjoittajat raportoivat, että GRIM-19 indusoi p53 kertyminen kautta häiriöitä E6 /E6AP monimutkainen ja induktio auto-ubikinaa- of E6AP kohdunkaulan syöpäsoluja. Tämä tutkimus osoittaa, uusi toiminto ja molekyylitason mekanismi, jonka GRIM-19 estää HR-HPV aiheuttama tuumorigeneesiä suojaamalla p53 hajoamiselta.

Tulokset

GRIM-19 ja p53 ovat samanaikaisesti vaimentua kohdunkaulan syövät

aiemmin tutkimus osoitti, että GRIM-19 indusoi kohdunkaulan kasvainten pienenemistä hiiren ksenograftimallia, mikä viittaa mahdolliseen rooliin GRIM-19 kasvaimen kasvun säätelyssä [20]. Koska p53-tuumorisuppressorin on myös alhainen ilmaistu kohdunkaulan kasvaimet, me tarkemmin, onko olemassa korrelaatiota välisiä GRIM-19 ja p53. Tasot GRIM-19 ja p53 olivat merkitsevästi (

p

0,01) pienempi tuumoreissa, ja korreloi suoraan toistensa kanssa 99% kohdunkaulan kasvaimet (Fig. 1). Sopusoinnussa alhainen p53 on kasvaimia, on hyvin tutkittu p53 kohdegeenin, PUMA, myös vaimentua kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin (Fig. 1). Nämä tulokset osoittivat, että GRIM-19 ja p53-tasot samanaikaisesti tukahdutettiin, mikä viittaa välistä mahdollista yhteyttä GRIM-19 ja p53 kohdunkaulan syövän.

(A) Solun totaali uutteita (50 ug) alkutuotannosta kohdunkaulan kasvaimet (T ) ja normaalin kohdunkaulan kudosten (N) tutkittiin ekspressiota GRIM-19, p53 ja PUMA Western-blottauksella. Edustaja tulokset Western blotting näkyvät. T1-T4 oli peräisin yksittäisten potilaiden kohdunkaulan syöpä. T1 ja T2 diagnosoitiin vaiheessa IIa; ja T3 ja T4 diagnosoitiin Ia squamous epiteelin karsinoomia. (B) kvantitatiivinen analyysi proteiinin ilmentyminen mitattuna optinen tiheys kunkin kaistan. Suhde tiheyden GRIM-19, p53, PUMA yli vastaavan GAPDH (45 tapausta normaalin kudoksen ja 60 tapausta kasvainkudoksen) laskettiin.

GRIM-19 täydentää p53-proteiinin tasot kohdunkaulan kasvainsolut

Jotta voitaisiin edelleen tutkia suhdetta GRIM-19 ja p53, HeLa-solut joko yli-ilmentymisen (pG19) tai taintumisen (siG19) on GRIM-19 käytettiin, ja tasot GRIM-19 ja p53 arvioitiin Western-blottauksella (kuvio 2A). Mielenkiintoista on, verrattuna vastaavaan kontrolliin (p /SICON-solut), p53 ja sen kohdegeenien PUMA ja p21 kasvoi HeLa /pG19-solut (Fig. 2A, vasen paneeli) ja vähenivät HeLa /siG19-solut (kuvio 2A, oikea paneeli ). Lisäksi kaksi muuta kohdunkaulan syövän solulinjat, SiHa ja CaSki, transfektoitiin joko GRIM-19-ekspressioplasmidin tai dsRNA kohdistaminen GRIM-19 ja verrattiin niiden valvontaa. Tulokset samankaltaisia ​​kuin HeLa saatiin näissä soluissa liian (Fig. 2B). Lisäksi testit muihin HPV-vapaa kasvainsolulinjoja (A549 ja HO8910) ei paljastanut samat tulokset kuin havaittu HeLa (Kuva S1). Näin ollen tasojen GRIM-19 suoraan korreloi näiden p53 kohdunkaulan syövän soluissa.

(A B) proteiini tasot GRIM-19 ja p53 ensisijainen kohdunkaulan syövistä. Western blotting, jossa on esitetty vasta-aineiden suoritettiin käyttäen lysaatteja, esitetyistä solulinjoista. (C) vaikutus GRIM-19 p53 mRNA: n ilmentymisen. MRNA GRIM-19 (vasen paneeli) huomattavan suuri HeLa /pG19 soluja (*

p

0,01), oikea paneeli esittää p53 mRNA: n ilmentymisen. Erot eivät ole tilastollisesti merkittäviä. (D) GRIM-19 ei vaikuttanut p53-promoottorin aktiivisuutta. P53-Luc toimittaja on käytetty. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta kolminkertaisia ​​näytteitä kussakin testissä. (E) GRIM-19 lisää puoliintumisaikaa p53. Soluja käsiteltiin CHX (100 ug /ml) osoitetun ajanjaksoina ja lysaatit alistettiin Western-blottauksella mainituilla vasta-aineilla. Edustavia tuloksia yhdestä kolmesta itsenäisestä kokeesta esitetään (vasen paneeli). Loput arvo p53 laskettiin suhde densitometristä arvojen p53 yli GAPDH kussakin näytteessä (oikea paneeli). Keskimääräinen jäljellä arvot kolmen erillisen kokeen piirrettiin. (F) GRIM-19 inhiboi p53 hajoamista

in vivo

. Ennen solujen keräämistä käsiteltiin MG132: ssa 4 tuntia, ja immunosaostuksella p53-vasta-aine tehtiin. Western blotting IP tuotteiden käytti ubikitiinipromoottori vasta-ainetta. GAPDH vasta-aineita käytettiin määrittämään vertailukelpoinen lastaus.

Sen tutkimiseksi, GRIM-19 lisäsi p53 kautta transkription säätelyyn, p53 mRNA tutkittiin kvantitatiivisen RT-PCR ja lusiferaasireportteri määritys suoritettiin HeLa /PCON ja HeLa /pG19 soluja. Taso p53 mRNA ei vaikuttanut yli-ilmentymisen GRIM-19 (Fig. 2C). Lisäksi p53-promoottori-driven lusiferaasireportteri- ei havaittu merkittäviä muutoksia p53-promoottorin aktiivisuus HeLa /PCON ja HeLa /pG19-solut (Fig. 2D), viittaa siihen, että GRIM-19 ei ole mukana transkription aktivoituminen p53.

kohdunkaulan kasvaimet, p53 on harvoin mutatoitu [23], ja se hajoaa nopeasti E6 /E6AP [6], [24], tutkimme seuraavaksi, onko lisäys p53 tasojen johtuu parannettu puoliintumisaika proteiinin . HeLa /pG19 ja HeLa /PCON soluja käsiteltiin sykloheksimidillä ja p53-proteiinin tasoja seurattiin ajan kuluessa. Todellakin, puoliintumisaika p53-proteiinin oli merkitsevästi (

p

0,01) pidennetään HeLa /pG19 soluja verrattuna HeLa /PCON-solut (Fig. 2E).

In vivo

ubikitinaation määritys osoitti myös, että ubikitinoituja p53 HeLa /pG19 solujen vähentynyt voimakkaasti verrattuna HeLa /PCON-soluja (kuvio 2F).

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että GRIM-19 palautettu p53 tasoilla proteiini vakauttaminen sijaan transkription ylössäätöä in kohdunkaulan kasvaimissa.

GRIM-19 stabiloi p53-proteiini vuorovaikutuksessa E6- ja E6AP proteiinit

E6 /E6AP välittämä p53 hajoamisen katsotaan tärkeänä mekanismi aloittamisen ja kehittämisen kohdunkaulan karsinoomien [23], [25]. Koska GRIM-19 sitoutuu 16E6 [26], me arveltu, että GRIM-19 häiritsee E6 /E6AP monimutkainen, minkä vuoksi se suojaa p53 hajoamiselta. Käyttämällä immunopresipitaatiomäärityksiä kanssa solulysaateista HeLa-soluista, löysimme vuorovaikutus GRIM-19 kanssa E6AP

in vivo

(Fig. 3A). Sitten tarkasteltiin GRIM-19-E6AP vuorovaikutus

in vitro

GST avattavan määrityksissä. E6AP koodaa kolmea eri proteiini-isoformit (I, II ja III), jotka eroavat toisistaan ​​niiden N-pään hännät, joilla kaikilla on kyky stimuloida E6-välitteinen ubikitiinipromoottori riippuvainen hajoamista p53-proteiinin [27]. Koska useat funktionaalisia domeeneja E6AP oli aiemmin tunnistettu [28], me syntyy kolme rekombinanttiplasmidien ilmentävät His-E6AP-III isoformi-pohjainen poistot: pE6AP-Δ1 (1-286 aa), pE6AP-Δ2 (287-521 aa) ja pE6AP-Δ3 (522-872 aa). E6 sitoutumiskohtia sijaitsivat välillä aa 287-521 of E6AP-III, kun taas hect verkkotunnuksen ubikitiinipromoottori sitoutumiskohdista sijaitsi segmentin 522-872 aa (Fig. 3C) [29]. Huomasimme, että vain E6AP-Δ3 sitoutunut GST-merkityn GRIM-19 GST pull-down-määritys (Fig. 3B-C), mutta ei katalyyttisesti inaktiivinen E6AP sisältää mutaatio Cys asemassa 840 (kuvio S2), Nämä tulokset tukivat päätelmää, että GRIM-19 voi sitoa hect verkkotunnus E6AP. Kartoittaa tarkka vuorovaikutuksessa alueen GRIM-19 kanssa E6AP, käytimme GST-merkitty GRIM-19 deleetiot pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Δ2 ja pGST-G19-Δ3; Ja totesi, että aminohapot 1-35 GRIM-19 oli riittävä sitoutumisen E6AP proteiineja (Fig. 3d).

(A) Co-immunosaostus analyysit suoritettiin sen määrittämiseksi, vuorovaikutusta GRIM-19 kanssa E6AP

in vivo

. Solulysaatit HeLa-solut immunosaostettiin normaali IgG ja anti-GRIM-19-vasta-aineita ja Western blotattiin anti-E6AP. Input (preIP) kaista edustaa 10% uutteen käytetyn immunopresipitaatioreaktion. HC = IgG raskaan ketjun. (B) GST pull-down kokeet suoritettiin tutkimaan vuorovaikutusta His-E6AP poistot GST-fuusioitu GRIM-19-proteiini

in vitro

. (C) Kaaviokuva E6AP osoittaa eri toiminnalliset domeenit kuten sitoutumiskohdat GRIM-19. (D) vuorovaikutusta GST-GRIM-19 poistot kanssa E6AP. * Osoittaa aseman yhtyeen oikeat molekyylikoon. (E) Co-immunosaostus analyysit suoritettiin sen määrittämiseksi, vuorovaikutusta GRIM-19 kanssa 18E6. Solulysaatit HeLa-soluista, jotka on transfektoitu p18E6-Flag alistettiin IP mainituilla vasta-aineilla. Input (preIP) kaista edustaa 10% uutteen käytetyn immunopresipitaatioreaktion. LC = IgG-kevytketjun. (F) vuorovaikutusta GST-GRIM-19 poistot kanssa 18E6. * Osoittaa aseman yhtyeen oikeat molekyylikoon. (G) poistaminen kartoitus E6- tai E6AP sitoutumiskohdista GRIM-19.

Olemme raportoineet vuorovaikutuksen GRIM-19 kanssa 16E6 ennen [26], me sitten tutkitaan yhdistyksen GRIM -19 ja 18E6. Alhaisen ilmentymisen E6 ja huono reaktiivisuus saatavilla E6-vasta-aineita, jotka on raportoitu useissa julkaisuissa [30], [31], [32], [33], emme onnistuneet saamaan tyydyttävää 18E6 Western blot päässä solulysaateista. Näin ollen plasmidi p18E6-Flag, joka ekspressoi Flag-merkitty 18E6 proteiini rakennettiin. Kautta immunosaostus määritykset HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu p18E6-Flag, löydettiin 18E6 kerasaostuvat GRIM-19

in vivo

(Fig. 3E). Kartoittaa tarkka vuorovaikutuksessa alueen GRIM-19 kanssa 18E6, käytimme sitoutumiskohdan GRIM-19 kanssa 18E6 käyttämällä GST-merkityn GRIM-19 deleetiot (pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Δ2 ja pGST-G19- Δ3); Ja totesi, että aminohapot 1-35 GRIM-19 riittivät sitomiseksi 18E6 proteiineihin

in vitro

(Fig. 3F).

Siksi pääteltiin, että GRIM-19 voidaan sitoa sekä 18E6 ja E6AP

in vivo ja in vitro

, joka saattaa olla merkitystä kertymistä p53-proteiini.

GRIM-19 häiritsee E6 /E6AP monimutkainen ja lisätä E6AP ubikitinaatio ja hajoaminen

Koska että molemmat 18E6 ja E6AP-Δ3 voivat olla vuorovaikutuksessa aminohappojen 1-35 N päätepisteestä GRIM-19 (Fig. 3G), päätimme siitä 18E6 kilpaili E6AP sitoutumisessa GRIM-19 suorittamalla kilpailu avattavan määrityksissä. Kun läsnä on puhdistettu GST-G19-proteiinin ja kasvava määrä E6AP-Δ3, sitoutumisen 18E6 ja GRIM-19 asteittain pieneni E6AP-Δ3 kasvoi (Fig. 4A). Vaikka E6AP-Δ2 ole vuorovaikutuksessa GST-G19, on hyvin tunnettua, että tämä alue ei ole aivan E6-sitoutumiskohtia [28]. Siksi testasimme GST-G19 ja E6AP-Δ2 kilpailla sitova 18E6. Kun läsnä on E6AP-Δ2, GST-G19-sidottu 18E6 laski verrattuna 18E6 esitetty yksinään (Fig. 4B). Lisäksi emme tarkkailla yhdistys E6AP-Δ2 GST-G19 läsnäollessa 18E6, mikä viittaa siihen, että proteiinit eivät voi muodostaa heterotrimeerinen kompleksi 18E6 /E6AP-Δ2 /GST-G19.

(A ) kilpailukykyinen analyysit suoritettiin analysoida sitoutuminen 18E6 GST-GRIM-19-fuusioproteiinin läsnä ollessa kasvavia määriä E6AP-Δ3 vaihtelee 0-6 ug. (B) Vedä alas kokeita sitoutumisen määrittämiseksi 18E6 GST-GRIM-19-proteiineja. Milloin on osoitettu E6AP-Δ2 proteiineja (10 ug) lisättiin osaksi GST Alasvetoköysi reaktion. (C) GRIM-19 lisätyn E6AP hajoamista

in vivo

. Ennen solujen keräämistä käsiteltiin MG132: ssa 4 tuntia, ja immunosaostuksella E6AP-vasta-aine tehtiin. Western blotting IP tuotteiden käytti ubikitiinipromoottori vasta-ainetta. GAPDH vasta-aineita käytettiin määrittämään vertailukelpoinen lastaus. (D)

In vitro

E6AP ubikitinaation määrityksessä. Ihmisen yhdistelmä-ubikitiinipromoottori, E1, E2 (UbcH5c), batereria-ilmentää ja puhdistaa GST ja GTS-GRIM-19, E6AP (villityypin tai katalyyttisesti aktiivinen mutantti CA) peräisin vehnänalkiouute sekoitettiin

in vitro

E6AP ubikinaation määritys ja immunoblotattu ubikitiinipromoottori vasta-aineella. (E) kaikkiaan solulysaateista HeLa-soluista ilmensivät mainittuja ekspressioplasmidit olivat Western blotattiin mainituilla vasta-aineilla.

On hyvin tunnettua, että E6AP voi kohdistaa itsensä ubikitinaation, mikä mekanismi hallita oma puoliintumisaika [7], [34]. Sitten tutkia, jos ilmaus GRIM-19 voi vaikuttaa hajoamista E6AP, kun läsnä on yli-ilmentynyt GRIM-19, ubikitinoituja E6AP merkittävästi lisääntynyt verrattuna HeLa /PCON-solut (Fig. 4C). In vitro ubikitinaation määrityksessä osoitti, että GRIM-19 lisäsi autoubiquitination villityypin E6AP, mutta ei määräävän-negatiivinen CA mutantin käyttäen distettiin E1 ja E2 (UbcH5c), bakteereja ilmaistuna GRIM-19, ja villityypin E6AP ja CA mutantti E6AP käännetty vehnänalkiouute järjestelmä (Fig. 4D). Itse asiassa huomasimme, E6AP-proteiinin väheni soluissa yliekspressioon GRIM-19 (Fig. 4E, S1).

Yhteenvetona voimme päätellä, että GRIM-19 estää p53 hajoamista estämällä E6 /E6AP kompleksin muodostumisen ja edistää ubikinaation ja hajoamista E6AP.

GRIM-19 viiveitä G0 /G1 siirtymistä, estää solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia, ja edistetään p53 kertyminen vivo

Koska inductions solukierron pysähtymisen ja solujen kasvua tukahduttaminen ovat tärkeimmät toiminnot p53, me seuraavaksi arvioitiin vaikutuksen GRIM-19-riippuvainen p53 vakauttaminen solusyklin. Solusyklin jakautuminen analyysit osoittivat merkittävästi viivästynyt G0 /G1 siirtymä HeLa /pG19 soluja verrattuna HeLa /PCON-solut (taulukko 1). Lisäksi, kuten on esitetty MTT: llä, solujen leviämisen HeLa /pG19-soluissa oli merkittävästi (p 0,05) tukahdutetaan päivänä 3 ja päivänä 4 (Fig. 5A) verrattuna HeLa /PCON soluja.

(A ) MTT-määritys suoritettiin osoitettu soluissa. MTT-analyysi suoritettiin kuten materiaalit ja menetelmät. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SE 8 näytettä. (B) Morfologiset ominaisuudet HeLa /PCON ja HeLa /pG19 solut tutkittiin läpäisyelektronimikroskoopilla. Kromatiinin tiivistyminen, laajentamiseen ja levennetty tumakalvoa aukkoja, epämääräinen tumakalvoa rakenne, murtumat tumakalvoa ja Endoplasmakalvosto laajeneminen oli nuolilla. ER, Endoplasmakalvosto; NM, tumakalvoa. (C) Täyspitkä ja pilkotaan muodossa kaspaasi-3 ja PARP HeLa /PCON ja HeLa /pG19 solut määritettiin Western blot -analyysit. (D) HeLa /Con ja HeLa /G19-soluja istutetaan 6-viikkoisen naaras-kateenkorvattomia nude-hiiriä (10 hiirtä kussakin solulinja) ja kasvatettiin 6 viikkoa. Kasvaimet kerättiin, ja painot mitattiin. Data esittää keskiarvo 10 kasvainten kussakin ryhmässä. (E): n ilmentyminen GRIM-19, p53, p21, PUMA, P27 ja E6AP kasvaimissa peräisin hiiristä määritettynä Western blot-analyysit, ja edustavia tuloksia on esitetty. (F) malli yhteistyötä GRIM-19 ja p53. Kun GRIM-19 on läsnä korkea, se vaikuttaa E6 /E6AP monimutkainen, edistää heidän ubikitinaa- siten estää p53 hajoamista. Menetys GRIM-19 mahdollistaa iskun E6 /E6AP kompleksi p53 ja sen hajoamistuotteet kautta proteasomin.

Koska edistää apoptoosia on toinen keskeinen p53, suoritimme solujen apoptoosin määritykset siirto- (TEM) ja Western blotting kaspaasi 3 ja PARP-vasta-aineita. Valikoima varhaisen apoptoosin ominaispiirteet ovat esitetty HeLa /pG19 solujen, myös ydinvoima chromatin tiivistyminen, levennetty tumakalvoa kuilu, epämääräinen tumakalvoa rakenne, murtumat tumakalvoa ja Endoplasmakalvosto laajentamiseen; kuitenkin, nämä ilmiöt ei havaittu HeLa /PCON soluissa (kuvio. 5B nuolet). Lisäksi lohkaisu kaspaasi 3 ja PARP lisättiin HeLa /pG19 soluja verrattuna HeLa /PCON-solut (Fig. 5C).

Havaitsimme myös kasvaimen painot hiirissä, HeLa /pG19 solujen väheni merkittävästi verrattuna kuin kontrolliryhmät (

p

0,05) (Fig. 5D). GRIM-19 ja p53 yhdessä p21, PUMA ja p27-proteiinit huomattavasti, mutta E6AP väheni kasvaimissa johdettu HeLa /pG19 soluja verrattuna kasvainten HeLa /PCON soluissa (kuvio. 5E).

Lopuksi perustuvat havaintoihin, malli GRIM-19 indusoi apoptoosia estämällä E6 /E6AP monimutkainen ja vakauttava p53 arveltu (Fig. 5F). Tämä malli viittaa siihen, että läsnäolo GRIM-19 edistää auto-ubikinaation ja hajoaminen E6AP vuorovaikutuksessa näiden proteiinien ja edistää p53 vakauttamiseen, kasvun pysähtymiseen ja apoptoosiin.

Keskustelu

High-riski ihmisen papilloomavirukset (HR-HPV), kuten HPV18 ja HPV16, jotka liittyvät 99,7% kohdunkaulan syövistä [35], jotka ovat yleisimpiä gynekologisia kasvaimia kehitysmaissa [36]. Viruksen onkoproteiineja E6- ja E7 ilmaistaan ​​HPV-positiivisten kohdunkaulan karsinoomien [6], kun taas virus E2-proteiini tukahduttaa transkriptio E6 /E7 onkogeenien ja aktivoi viruksen DNA: n replikaatiota yhdessä viruksen E1 helikaasin [37], [38], [39]. E6 /E6AP välittämän hajoamista p53 pidetään tärkeimpänä mekanismi aloittamisen ja kehittämisen kohdunkaulan syövistä [6], [11], [12], [25], [40], [41]. Viimeaikaiset tutkimukset ehdotti, että häiriö E6 /E6AP kompleksi voi tappaa kohdunkaulan kasvaimia lisäämällä p53-proteiinin tasoa [11], [12], [40]. Tutkimuksessamme esittelemme uuden lähestymistavan estää p53 hajoamista palauttaminen GRIM-19, joka häiritsee E6 /E6AP monimutkainen.

On raportoitu, että GRIM-19 voi estää transkription aktiivisuutta STAT3 kautta proteiini- proteiini-vuorovaikutuksen ja estää syövän kasvua [16], [17]. STAT3 on osoitettu estävän p53 ilmaisun kautta transkription sorron src onkogeenin indusoimaa signalointireittien tietyissä jyrsijän solulinjojen [42]. Joissakin tutkimuksissa syöpäsolulinjoissa osoittivat korrelaation korkea konstitutiivinen STST3 aktiivisuutta ja p53-geenin mutaatioita, vaikka syy ja seuraussuhteita ei perustettu [43]. Tietyissä pään ja kaulan levyepiteelikarsinoomia, p53: n on osoitettu alas säädellä NF-KB ja STAT3 aiheuttama geenien ilmentyminen [44]. Olemme osoittaneet edellisessä julkaisussa GRIM-19 menetys korreloi korkea STST3 aktiivisuus ensisijainen kohdunkaulan syövistä [20]. Vaikka tällainen havainnot viittaavat mahdollisuuteen, että menetys GRIM-19 edistää korkea STST3 toiminta, joka voisi lopulta kopiointia alas säädellä p53 ilmentymistä, meidän ei ilmennyt (kuva 2C Lisäksi viruksen proteiineja, kuten U95 ja vIRF1 voivat myös sitoutua GRIM-19 [21], [26], [47]. Olemme aiemmin osoittaneet yhteyden 16E6 ja GRIM-19 [26]; täällä, huomasimme vuorovaikutusta GRIM-19 kanssa 18E6 ja E6AP

in vivo

ja

in vitro

, ja induktio autoubiquitination hajoamisen E6AP by GRIM-19. HR-HPV-infektio kohdunkaulan syövän soluja, GRIM-19 kykeni indusoimaan kertymistä p53-proteiinin ja lisätä p53 kohdegeenien, kuten p21 ja puma. Lisäksi merkittäviä muutoksia solusyklin profiilin, solujen lisääntymistä, ja ominaisuus morfologiset merkkejä apoptoosin havaittiin HeLa-soluissa yli-ilmentymiseen GRIM-19. Siten GRIM-19 ja p53 voi synergisesti estää kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua.

E6AP on kriittinen säätelijä p53 hajoamista ihmisen kohdunkaulasyövän käytettäessä E6 riippuvaisella tavalla. Lukuun ottamatta fromp53, E6 /E6AP kompleksin on raportoitu häiritsevän useiden solun toimintojen [48], mukaan lukien transkription aktivaattorit, kuten IRF3, co-aktivaattorit kuten ASP300, apoptoosi-induktorit, kuten Bak, GADD34, prokaspaasi-8 ja sen sovittimen FADD, proteiinikinaasit kuten Tyk2, soluadheesion liittyvät molekyylit, kuten paksilliini, ja NFX1-91, eli molekyylejä, jotka vaimentaa telomeraasiaktiivisuutta. Useimmissa näistä tapauksista E6 /E6AP monimutkaisia ​​tavoitteita näiden proteiinien hajoaminen, jotta syövän syntyyn [48]. E6 vuorovaikutus E6AP on raportoitu olevan tärkeä ihon karsinogeneesin siirtogeenisen hiiren mallia [49], [50]. E6AP kohdentaa myös proteiineja käytettäessä E6-riippumattomalla tavalla. Itse asiassa, useita substraatteja, kuten jäsenet Src-proteiini-kinaasien [51], Polycomb-proteiinin Ring1B [52] ja promyelosyyttinen leukemia (PML) proteiini [53], on raportoitu. Luonnossa esiintyviä satunnaista E6AP mutaatiot liittyvät Angelmanin oireyhtymä, vakava muoto kehitysvammaisuus, jolloin kertyminen vahingoittumattomia proteiinin aggregaattien on raportoitu [52], [54], [55], [56]. Niinpä E6AP proteiinia yhdessä E6- ja joissakin tilanteissa omasta on keskeinen rooli proteiinien hajoaminen ohjaa useita ihmisillä esiintyvät sairaudet.

Koska E6AP toimii myös kaksitoiminen koaktivaattorikompleksien varten steroidihormonireseptoreihin (SHRs) sisältäen progesteronireseptorin, estrogeenireseptori, androgeenireseptorin, glukokortikoidireseptorin, retiinihapporeseptorin-α ja tyroidihormonireseptorin [29], [57], ja aminohapot 170-680 ovat aktivaatiodomeenia E6AP [29], vuorovaikutus GRIM-19 kanssa E6AP (522-872 aa) voisi ennustaa, että GRIM-19 todennäköisesti säätelee SHR-riippuvaista geenin transkription.

Yhteenvetona, tutkimuksemme ensimmäistä kertaa osoittaa uuden mekanismin, jolla GRIM-19 lohkojen E6 /E6AP kompleksi; ja yhteistyö kahden erillisen tuumorisuppressoriproteiinia proteiinien säätelyssä solujen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki kohdunkaulan kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin kohdunpoisto välillä tammikuu 2008 ja marraskuussa 2009 Anhui Provincial Hospital sidoksissa Anhui Medical University, Hefei, Kiina. Tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt eettinen tarkastelu hallituksen Anhui Provincial Hospital. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Kaikki eläin koetoimenpiteet suorittaa tässä tutkimuksessa on hyväksynyt laboratoriossa eläinten eettisen komitean Anhuin maakunnan sairaalan Affiliated Anhui Medical University alle luvan numero 201000179, ja olivat noudattaen ohjeita eläinten hoito esitetään tämän lausunnon.

Kasvaimet

osa tuoreita leikattu kudokset upotettiin parafiiniin, leikattiin 5 7 um paksuisia leikkeitä patologista diagnoosi, ja loput kudos jäädytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten poimia proteiineja ja RNA: ta. Kliiniset vaiheet määritettiin sertifioitu gynekologiset patologi mukaan modifioidun International Federation of Naistenklinikka Obstetrics (FIGO) lavastus järjestelmä kohdunkaulasyövän 2000. 60 ei-metastasoitunut levyepiteelikarsinooma epiteelin karsinoomien tutkittu näissä tutkimuksissa olivat HPV16 tai HPV18 positiivisia ja kuului tyyppi Ia (13 potilasta), Ib (9 potilasta) ja II (38 potilasta). Lisäksi 45 normaali kohdunkaulan kudoksissa potilailta, joille tehtiin kohdunpoisto muista syistä kuin neoplasia joko kohdunkaulan tai kohdun limakalvon kerättiin ja käytettiin tavanomaista valvontaa tässä tutkimuksessa.

Soluviljely ja transfektio

Human kohdunkaulan syövän solulinjat HeLa, SiHa ja CaSki ja ihmisen keuhkojen adenokarsinooman A549 American Type Culture Collection (ATCC) kasvatettiin DMEM, jossa 10% naudan sikiön seerumia. Ihmisen munasarjasyövän solulinja HO8910 ostettiin solusta pankin Kiinan tiedeakatemia [58], [59] ja kasvatettiin täydellisessä RPMI-1640. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) käytettiin transfektioon. Pysyvästitransfektoitu solulinjoja HeLa /PCON ja HeLa /pG19 ilmentävien kontrollivektorille ja ihmisen GRIM-19, vastaavasti, on kuvattu aiemmin [20].

tuumoriksenografteja

Eläimet kasvatettiin normaaleissa laboratorio olosuhteissa. Kaksi ryhmää (10 kussakin ryhmässä) 6-viikkoisen naaras-kateenkorvattomia nude-hiirten (Beijing koe-eläin keskus) istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen hiirten joko HeLa /pG19 tai HeLa /PCON soluja (1 x 10

7) 0,1 ml: ssa PBS: ää, joka sisälsi 50% matrigeeliä. Kaikki hiiret pidettiin patogeeni-vapaassa ympäristössä. Lopussa kokeen (6 viikkoa implantaation jälkeen), hiiret lopetettiin, kasvaimet kerättiin ja punnittiin. Osa kunkin kasvaimen prosessoitiin immunohistokemiallista ja biokemiallisia analyysejä, ja loput jäädytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Plasmidit

plasmidit LZRSpBMN-linkkeri-IRES-EGFP-STAT3C (STAT3C) ilmentävät konstitutiivisesti aktiivisen mutantin STST3 ja LZRS pBMN-linkkeri-IRES-EGFP-STAT3DN (STAT3DN) ekspressoivat vallitsevaa negatiivista mutantti STST3 olivat lahja tri Hodge DR kuten aiemmin on kuvattu [60]. Tyhjän vektorin pIRES-Puro2-Myc (PCON) ja pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc (pG19) ilmentävät Myc-merkityn GRIM-19 on kuvattu aiemmin [20].