Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka syöpiä ovat laajalti katsotaan ylläpitämään kantasoluja, olemassaolo kantasolujen munuaissolukarsinooma (RCC) on harvoin raportoitu, osittain puutteen vuoksi ainutlaatuinen pinnan markkereita. Me täällä tunnistettu syöpää kantasolun kaltaisia ​​soluja puoli väestöstä (SP) fenotyyppi viidessä ihmisen RCC solulinjoissa. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että 769P, ihmisen selkeän munuaissyöpää solulinja, sisälsi suurimman määrän SP-soluja verrattuna muihin neljä solulinjat. Nämä 769P SP solut hallussaan ominaisuudet leviämisen, itseuudistumisen, ja erilaistumista, sekä vahvaa vastustuskykyä kemoterapiaa ja sädehoitoa, jotka mahdollisesti liittyvät ABCB1 kuljettaja.

In vivo

kokeissa serial kasvaimen siirron hiirillä osoittivat myös, että 769P SP solut muodostivat kasvaimia NOD /SCID-hiiriin. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että 769P SP solut ovat ominaisuuksia syövän kantasoluja, mikä voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja terapia-vastus RCC.

Citation: Huang B, Huang YJ, Yao ZJ, Chen X, Guo SJ, Mao XP, et al. (2013) Cancer kantasolun Side Population solut Clear Cell munuaissolusyövässä Cell Line 769P. PLoS ONE 8 (7): e68293. doi: 10,1371 /journal.pone.0068293

Editor: Neil A. Bhowmick, Cedars Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 28 toukokuu 2013; Julkaistu: 11 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation (nro 81272809, No. 80202011, No. 81202013, nro 30872584); Guangdong Natural Science Foundation (nro 8251008901000018, No. S2012040007557); Sun Yat-sen innovatiivisia kykyjä Viljely ohjelma Erinomainen Tutors (nro 80000-3126205); Science and Technology Planning Project Guangdong, Kiina (No. 2011B050400021, No. 2012B090600021, No. 445323198311050317); ja Guangdong Key Laboratory of Urology, ensimmäinen Affiliated sairaala Guangzhou Medical University (nro 2010A060801016). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munuaisten syöpä on tärkeä terveysongelma, joka aiheuttaa yli 15000 kuolemantapausta Pohjois-Amerikassa vuosittain. Munuaisten syövän etäpesäkkeitä tai pitkälle aikuisilla on vastustuskykyinen tavanomaisille kemoterapeuttisten [1]. Selvittämiseen genesis tämän syövän auttaa varhainen diagnoosi ja hoito, mikä parantaa ennustetta.

Kiinteä kasvaimet koostuvat monentyyppisiä soluja eri kapasiteetti leviämisen. Vain pieni populaatio nämä solut voivat muodostaa kasvaimia immuunivajaissa hiirillä [2]. Tämä havainto on johtanut käsitteeseen syövän kantasoluja (CSCS), niin kutsuttuja tuumoriin aloittamista soluja tai varsi-, kuten syövän soluihin [3], [4], [5], [6], joka on ajateltu, joka pystyy Lisääntyvät itseuudistuvien, ja erilaistumaan useiksi suvusta, mikä on avainasemassa sekä kehitys- että kasvainten hoidossa [2], [3]. Vaikka CSCS on eristetty useita erilaisia ​​ihmisen kasvaimista, mukaan lukien hematologiset syövät [7], munasarjasyöpä [8], eturauhassyöpä [9], rintasyöpä [10], ja aivokasvainten [11], ei ole CSC-specific solun pinnan antigeeni markkereita on jota rajoittaa lisätutkimuksia aiheesta [12]. Side väestöstä (SP) on virtaussytometrialla (FCM) termi määritellä solun klustereiden vahva kyky pumpata DNA väriaine Hoechst 33342 kautta ABC kuljettajat. Side populaation solut häviävät käsittelemällä joko kalsiuminestäjien tai inhibiittorit ABC kuljettajat, kuten verapamiilin ja rapamysiini [13] .Tämä toiminta johtaa ”puolella” (pieni fluoresenssi) fenotyyppi väestöstä ja uskotaan olevan keskeinen itsestään -protective funktio ja siten yleinen tunnusmerkki kantasolujen [14], [15]. Koska se otettiin ensimmäisen kerran käyttöön Goodell et al. vuonna 1996 [16], SP-soluja on laajasti raportoitu rikastettu eri syöpä- kudoksissa, kuten rintasyövän [17], maha-suolikanavan kasvaimen [18], ja pienisoluinen keuhkosyöpä [19] ja solulinjat, kuten nenänielun kohdunkaulan [20], maksasyövän [21], ja virtsarakon syövän solulinjoissa [22]. SP-soluissa, joissa stemness potentiaalit, voivat muodostaa ksenograftikasvaimissa eläimillä ja ovat vastustuskykyisiä kemoterapiaa ja sädehoitoa, edistää kasvaimen uusiutumisen [23].

RCC, kolmanneksi yleisin syöpä on virtsateiden, osuus on noin 3% kaikista ihmisen syöpäsairauksia. RCC luokitellaan selkeä solu, papillaarinen, kromofobista leikettä, kerätä kanava, ja luokkiin RCC selkeät cell RCC (CCRCC) kuin yleisin tyyppi. Tämä osuus on 82% RCC. Metastaattisen CCRCC edelleen olemaan suuri haaste kliinikoille ja aiheuttaa noin 35% RCC liittyvää kuolleisuutta [24]. RCC tapaukset ovat lisääntyneet tasaisesti vuosikymmeniä [25]. Lisäksi useimmilla potilailla on jo joko etäpesäkkeitä klo alustavan diagnoosin tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä jälkeen primaarikasvaimen resektio [26]. Ennuste RCC on huono osittain vastuksen metastaattisen RCC useimmat nykyiset hoidot, kuten kemoterapia ja sädehoito. Kohdennettu hoito vastaan ​​CSCS voi tuoda uutta toivoa parantaa ennustetta potilaita, joilla on RCC.

Vaikka merkittävää edistystä on tapahtunut SP tutkimuksen roolia SP solujen RCC jää täysin selvitetty [27], [28 ], [29], [30]. Addla et ai. [29] ovat raportoineet, että sekä normaalissa että pahanlaatuisten munuaisten epiteelisolujen sisälsi osan SP-soluja, jotka olivat rikastuttaa joidenkin kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Viime aikoina, Nishizawa et ai. [30] ovat havainneet, että SP-solut ovat peräisin RCC soluista osoitti korkeamman kasvaimeen aloittamista kyky kuin NSP soluja. Siksi me arveltu, että SP-solut ovat rikastettu osa syövän kantasoluja.

Tässä tutkimuksessa tehtiin tunnistamiseksi SP solut perustettu ihmisen RCC solulinjojen ja määrittää niiden ominaisuuksien ja roolit kasvainten synnyssä ja hoidossa RCC. Täällä eristetty SP soluja 769P soluista, ihmisen CCRCC solulinja, Hoechst värjäys ja virtaussytometria. Meidän in vitro ja in vivo kokeet osoittivat, että SP solut hallussaan tunnettu CSC ominaisuudet leviämisen, itseuudistumisen, ja erilaistumista, sekä vahvaa vastustuskykyä kemoterapiaa ja sädehoitoa, jotka mahdollisesti liittyvät ABCB1 kuljettaja. Nämä havainnot voivat tarjota uusia näkökulmia tulevaisuuden CSC tutkimuksen ja kliinisen syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Viisi ihmisen RCC solulinjoissa 769P, 786-O OS-RC-2, SN12C, ja SKRC39 käytettiin tässä tutkimuksessa. Solulinjoja 769P ja 786-O saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA); OS-RC-2, SN12C, ja SKRC39 ystävällisesti lahjakas tohtori Zhuowei Liu (Department of Urology, Sun Yat-sen University Cancer Center), jotka ovat saaneet näissä solulinjoissa päässä Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina) [31], [32], [33]. 769P, 786-O, OS-RC-2 ja SKRC39 soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, Kalifornia, USA), kun taas SN12C soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco) 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Molemmat väliaine sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Gibco), 1% (v /v) penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

Side Population Analysis and Cell Sorting

Side väestön analyysi ja solujen lajittelu suoritettiin, kuten on kuvattu aikaisemmin Goodell et al. [16] kanssa muutos. Lyhyesti, solut trypsinoitiin, suspendoitiin 1 x 10

6 solua /ml esilämmitetyssä RPMI-1640, joka sisälsi 2% FBS: ää ja 10 mmol /L HEPES (Gibco), sitten inkuboitiin 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma , St. Louis, MO, USA) joko yksinään tai yhdessä 50 mikromol /l verapamiili (Sigma), ABC transporter estäjä, pimeässä 90 min 37 ° C vesihauteessa ajoittain sekoittaen. Lopussa värjäys, solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen kylmään HBSS (Gibco), joka sisälsi 2% FBS: ää ja 10 mmol /l HEPES. FCM analyysi ja solujen lajittelu suoritettiin sitten suoraan EPICS ALTRA Flow Cytosorter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Hoechst 33342 oli innoissaan 100 mW UV laser ja havaittiin 450 BP suodatin sininen fluoresenssi ja 675 BP suodatin punaisen fluoresenssin. 610-

nm puoliläpäisevä peili lyhyt

–

pass

(DMSP) suodatinta käytetään erottamaan emissioaallonpituudet. Monikulmainen live portti FS-HO sininen juoni luotiin jättää roskat ja kuolleet solut. SP-soluissa ja ei-SP (NSP) solut lajitellaan seuraavilla kokeilla.

Clone Formation Pitkäaikaisia ​​ja erilaistuminen Analyysit

Tarkat autoclone lajittelutavan, joka 500 769P solujen SP tai NSP fenotyyppi lajiteltiin suoraan 6 cm viljelymaljalle, ja viljeltiin RPMI-1640 valmiissa elatusaineessa 10 päivän ajan. Kun suurin osa solun klooneja oli laajentunut yli 50 solua, ne pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 75% metanolia 15 minuutin ajan, ja värjättiin kristallivioletilla 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Inkubaation jälkeen, maljat huuhdeltiin ja useita klooneja, jotka sisälsivät yli 50 solua laskettiin alle faasikontrastimikroskoopilla. Klooni muodostuminen tehokkuus oli suhde määrää kloonien lukumäärän ympättyä solua. Klooni muodostuminen määritykset toistettiin kolmena kappaleena.

Pitkän aikavälin erilaistumista koe suoritettiin 10 päivän kuluttua solujen lajittelun, protokollan mukaisesti puolella väestöstä analyysin, määrittää erilaistumista kyky SP ja NSP soluja.

havaitseminen mRNA Expression of ABC Family jäsenten Lajittele 769P SP Cells RT-PCR

Yhteensä RNA uutettiin SP ja NSP solut erikseen käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA). Ilmentymisen ABCB1, ABCC1, ja ABCG2 havaittiin käyttämällä PrimeScript

TMRT-PCR Kit (Takara, Otsu, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet (taulukko 1) suunniteltiin ja syntetisoitiin Invitrogen. GAPDH käytettiin sisäisenä referenssinä. PCR-olosuhteet olivat denaturointi 94 ° C: ssa 4 min, jota seurasi 40 sykliä, hehkutus 94 ° C: ssa 45 s, 58 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 45 s, ja pidennys 72 ° C ° C: ssa 8 min . PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 1,5% agaroosia mRNA ilmaisun ABC perheenjäseniä.

havaitseminen Protein Expression of ABC Family jäsenten Lajittele 769P SP solujen Western blotting -tekniikalla

Yhteensä proteiinit uutettiin SP ja NSP-solut erikseen ja denaturoitu natriumdodekyylisulfaattia (SDS) näytepuskuriin, niin yhtä ladattiin 8% polyakryyliamidigeelillä. Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo. Blotteja inkuboitiin ilmoitetuilla primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa, sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella, ja lopulta havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia Western blotting tunnistus reagenssit (GE Healthcare, UK). Hiiren ABCG2 (at 1:1,000 laimennus), ABCB1 (1:1,000), ja ABCC1 (1:5,000) Monoklonaalisten vasta-aineiden Abcam Inc. (Cambridge, UK) sekä anti-GAPDH (1:2,000) Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) käytettiin määrittämään suhteellinen proteiinin tasot.

säteily ja Drug herkkyys Analyysit

määrittämiseksi solujen herkkyys säteilylle, juuri lajitellaan SP ja NSP soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille (500 solua /kuoppa), ja altistettiin 5 Gy röntgen (500 cGy /min, käyttäen 12 cm x 6 cm säteilykentän) kanssa tai ilman sitä 30 minuutin esihaudonta verapamiilin kanssa (50 umol /l) päivästä lajittelun jälkeen. Kun useimmat solun klooneja oli yli 50 solua, ne värjättiin kristallivioletilla lukumäärän määrittämiseksi selviytymisen soluja.

määrittämiseksi solujen herkkyys huumeita, SP ja NSP-solut ympättiin 96-kuoppalevyille (500 solua /kuoppa) ja viljeltiin mitoksantroni (MTX, topoisomeraasi II: n inhibiittori antineoplastinen aine, Sigma), 5-fluorourasiili (5-FU, Sigma), tai sunitinibipitoisuutta (tyrosiinikinaasi-inhibiittori, Sutentin Pfizer, New York, USA ) seuraavana päivänä pitoisuutena kaltevuus, tai ilman 30 minuutin esi-inkubaation 50 umol /ml verapamiilia kuin chemosensitizer että mitoksantronia. Käsittelemättömiä soluja käytettiin kontrollina. Neljä rinnakkaista kuopat asettaa kullekin ryhmälle. Kun 3 päivää, kunkin kuopan absorbanssi aallonpituudella 570 nm (

570) mitattiin. Solujen eloonjääminen laskettiin käyttäen kaavaa: eloonjäämisaste = (keskiarvo

570 koestussyvennyksiin /keskiarvo

570 kontrollikuoppia) x 100% . Inhibitio laskettiin käyttämällä kaavaa: esto = 100% – eloonjääneitä.

Vieraslajisiirteen Kasvaimen muodostumisen määritys

Eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Eläimet Sun Yat-sen University. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden ensimmäisen Affiliated sairaala Sun Yat-sen University. Kaikkiaan 54 5 7 viikon ikäisten ei liikalihava diabeettinen (NOD) /sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) naarashiiriä saatiin Experimental Animal Center of Sun Yat-sen University. Hiiret jaettiin 6 ryhmään, jossa on 9 hiirtä kussakin ryhmässä. Ilmoitetun määrän juuri järjestetty SP ja NSP solut suspendoitiin 200 ui PBS: ää, erikseen, ja siirrostettiin ihonalaisesti kainalon fossa NOD /SCID-hiirten heti lajittelun. Hiiriä tarkkailtiin kahdesti viikossa muodostumista kouraantuntuva kasvaimia. Tällä 6 viikkoa ymppäyksen jälkeen, hiiret lopetettiin arvioida kasvaimen muodostumisen. Kasvaimet mitattiin käyttäen mikrometrillä, punnittiin, ja valokuvattiin. Osa jokaisen ihonalainen kasvain kerättiin, kiinnitettiin 10% formaldehydiä, ja upotettu parafiiniin patologisen arvioinnin jälkeen H 0,5 mm fragmentit ja kaikki näkyvä möhkäleitä poistettiin, pilkottiin sitten 1 mg /ml kollagenaasia tyyppiä II (Sigma) ja 1,2 mg /ml dispaasi (Sigma) 45-90 minuutin ajan 37 ° C. Satunnaisesti, 0,2 ug /ml trypsiiniä (Invitrogen) käytettiin 10 min varmistaa dissosiaation yksittäisiksi soluiksi. Solut suodatettiin peräkkäisen 70-um solun- poistamaan jäljellä möhkäleitä. Kerätyt solut suspendoitiin PBS: ään lisättynä 1% FCS. Vähintään 100000 Kerätyt solut värjättiin SP-analyysi. Kaksikymmentä 5- 6-viikon ikäisiä sdic naaras hiiret jaettiin tasan 4 ryhmiin sarjasiirteillä määrityksessä. Jokainen 5000 solut erottaa ksenografti kasvain, joka oli muodostettu 2000 SP-soluja, 20000 SP-soluja, 20000 NSP-solut, tai 200000 NSP-soluja, inokuloitiin uudelleen osaksi NOD /SCID-hiiri. Kasvaimen muodostumisen arviointi ja patologinen tutkimus tehtiin 6 viikkoa myöhemmin.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD) vähintään kolmen erillisen kokeen. Microsoft Office Excel 2007 ja SPSS13.0 ohjelmistoja käytettiin tietojenkäsittelyä. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin

t

testiä.

P

arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

olemassaolo SP Solut RCC Cell Lines

Viisi RCC solulinjoja analysoitiin heidän SP fenotyypit. R2 portti osoittaa, että prosenttiosuus SP soluja, dim Hoechst 33342 fluoresenssi, laski 4,82% joukosta 769P soluja ilman verapamiili hoitoa 0,02% joukossa 769P soluista verapamiilin preinkubointi (Fig. 1A). Uusi koe on lajitellut solut osoittivat puhtaus on 96,61% SP-soluissa ja 99.89% osalta NSP soluja (Fig. 1 B). Muille neljälle RCC solulinjat, suhteet SP solujen 786-O ja OS-RC-2 solut olivat 0,1% ja 0,2%, mikä oli liian alhainen seuraavissa kokeissa; ei ole SP-soluja joukossa havaitaan SN12C ja SKRC39 solut (Fig. S1). Siksi SP ja NSP solut lajiteltiin 769P solujen myöhemmissä kokeissa.

A, SP lajittelu käyttämällä Hoechst 33342. polygonaalinen live portti luotiin jättää roskat ja kuolleet solut. Ainakin 50000 solua hankittiin analysoida SP fenotyyppi jokaisen näytteen. Prosenttiosuus SP-solujen laski, kun 769P soluja esi-inkuboida verapamiili estää ATP transporter. B, puhtaus juuri lajitellaan 769P SP ja ei-SP (NSP) solut oli 96,61% ja 99,89% (1-0,11%).

Clone muodostaminen ja erilaistuminen Lajittele 769P SP ja NSP Cells

jälkeen 7 päivää viljelyn, useimmat kloonit sisälsivät enemmän kuin 50 solua. Laskimme kloonien määrää, ja totesi, että keskimääräinen klooni muodostumisen tehokkuutta SP-solujen oli merkittävästi korkeampi kuin NSP-soluja [(56,4 ± 1,3)% vs. (22,7 ± 1,5)%,

P

0,001; Kuva. 2A).

A, klooni muodostumisen määritykset osoittavat, että klooni muodostumisen tehokkuutta juuri järjestetty SP-soluissa oli korkeampi kuin NSP soluja. **,

P

0,01. B, 10 päivän kuluttua lajittelun osuus SP soluja (merkitty R2 portti) joukossa lajiteltu SP-soluissa ja lajitellaan NSP soluja mitattiin. Osuus SP solujen joukossa lajitellut SP-soluissa on vain 19,51%, mikä viittaa siihen, että useimmat lajitellut SP solut erilaistuvat NSP soluihin. Osuus SP solujen joukossa lajitellut NSP soluja on vain 2,39%, mikä viittaa siihen, että lajitellut NSP soluja ei voi erilaistua SP soluihin.

Kun 10 päivän viljelyn useimmat lajiteltu 769P SP solut erilaistuneet NSP soluihin, kun taas vain pieni osa SP soluja havaittiin keskuudessa lajiteltu 769P NSP soluja (Fig. 2B), mikä viittaa kykyä SP solujen itse uudistaa ja erilaistuvat NSP soluihin.

Expression of ABC Family jäsenten Lajittele 769P SP ja NSP Solut

ilmentymisen ABCB1, ABCG2, ja ABCC1 havaittiin RT-PCR: llä ja Western blottauksella. Molemmat kokeet osoittivat, että ABCB1 ilmaistiin korkealla tasolla lajitellun SP-soluissa, mutta varsin alhaisella tasolla lajitellun NSP soluissa, kun taas ABCC1 ja ABCG2 voinut havaita joko lajitellun SP tai NSP soluja (Fig. 3).

A, käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio. B, Western blotting. Kaista 1, lajiteltu NSP solut; kaista 2, lajiteltu SP soluja. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Molemmat kokeet osoittavat, että ABCB1 ilmaisu on vahvempi SP kuin NSP soluissa ja että ABCG2 ja ABCC1 ei ilmaistu SP ja NSP soluja.

herkkyys Lajittele 769P SP ja NSP solut säteilylle ja huumeet

mitattiin herkkyys lajitellaan 769P SP ja NSP soluja säteilylle kloonin muodostumista määrityksessä. Klooni muodostuminen tehokkuus SP-solujen oli merkittävästi korkeampi kuin NSP soluja joko ennen säteilyä tai sen jälkeen (

P

0,05; Fig. 4A). Yksityiskohtaisesti klooni muodostumista tehokkuutta SP solut eivät muutu merkittävästi, kun säteily (

P

0,05), kun taas että NSP solujen väheni dramaattisesti (

P

0,05), mikä viittaa siihen, että SP solut olivat vastustuskykyisempiä röntgen vaurioita kuin NSP soluja.

A kloonin muodostumista tehokkuutta lajiteltu 769P SP-soluissa on merkittävästi suurempi kuin NSP soluja joko ennen tai jälkeen 5 Gy röntgen säteilytys. Klooni muodostuminen tehokkuus SP solujen on huomattavasti korkeampi kuin NSP solujen säteilytyksen jälkeen (

P

0,01); klooni muodostumista tehokkuutta säteilyttämätön NSP solujen on merkittävästi korkeampi kuin säteilytettyjen NSP solujen (

P

0,05). B, vasta lajiteltu 769P SP solut ovat vastustuskykyisempiä mitoksantronilla kuin NSP solut (

P

0,01), kun taas tämä vastus on päinvastainen verapamiilia esikäsittelyä. C, SP solut ovat myös vastustuskykyisiä 5-fluorourasiilin kuin NSP solut (

P

0,05). Vastus voitaisiin myös päinvastainen verapamiilia esikäsittelyä. D, herkkyys SP solujen sunitinibille on samanlainen kuin NSP solut (

P

0,05).

Lisäksi mitattiin herkkyys lajitellaan 769P SP ja NSP solujen MTX, 5-FU, ja sunitinibin. SP solut osoittivat voimakasta vastarintaa MTX, kun taas NSP solut olivat herkkiä MTX (

P

0,001). Verapamiili, ABC transporter estäjä, parannettu estävää vaikutusta muihin MIX SP-soluissa, joiden leviämisen esto samanlainen kuin NSP soluja samoissa olosuhteissa (

P

0,05); kuitenkin, verapamiili ei voimistaa MIX on NSP-soluissa (

P

0,05) (Fig. 4B). Olemme myös havainneet, että SP solut olivat paljon vastustuskykyisempiä 5-FU kuin NSP solut (

P

0,05; Fig. 4C), mutta niiden herkkyydet sunitinibille olivat samanlaisia ​​(

P

B-solut erillään kasvain on muodostettu 20000 769P NSP-soluja. Osuus SP solujen oli suurempi SP solujen muodostunut kasvain kuin NSP solun muodostunut kasvain (1,5% vs. 0,2%).

edelleen määrittämiseksi kasvainten muodostumista kykyä toisen sukupolven SP solut, me ympätty 5000 SP soluja (2 kasvaimista muodostettu 20000 ja 2000 SP-soluissa, vastaavasti) tai 5000 NSP soluja (2 kasvaimista muodostettu 200000 ja 20000 NSP soluja, tässä järjestyksessä) osaksi NOD /SCID-hiiriin. Kaikki hiirille kehittyi kasvaimia 6 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Toisen sukupolven NSP kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä ja kevyempiä kuin toisen sukupolven SP kasvaimet (

P

0,01; Fig. 7A ja B). Kaikki toisen sukupolven olivat histologisesti identtisiä ensisijaisen ksenograftikasvaimissa (Fig. 7C). Nämä tulokset osoittivat, että SP-soluja, jotka kykenevät tuottamaan kasvainten sarjaan.

A, NOD /SCID-hiiriin istutettiin 5000 toisen sukupolven SP-soluja kasvaimen muodostettu 2000 SP-solujen tai 5000 toisen sukupolven NSP-soluja kasvaimesta muodostettu 200000 NSP soluihin. Kasvaimet poistettiin hiiristä 6 viikkoa ymppäyksen jälkeen. B, toisen sukupolven SP kasvaimet ovat huomattavasti raskaampia kuin toisen sukupolven NSP kasvaimet (**

P

0,01). C, patologinen tutkimus osoittaa, että sekä toisen sukupolven SP kasvain ja toisen sukupolven NSP kasvain ovat histologisesti samanlaisia ​​kuin ensisijainen ksenograftikasvaimissa.

Keskustelu

Viime vuosina tutkimukset on CSCS kiinteissä kasvaimissa osoittaneet merkittävää havaintoja. Tässä tutkimuksessa olemme eristetty SP soluja ihmisen selvä munuaissyöpää solulinjojen määrittämiseksi biologisia ominaisuuksia tämän solupopulaation.

Havaitsimme, että 4,8% RCC 769P soluja SP soluja, jotka osoittivat kykyä itse- uudistaminen ja monilinjainen erilaistumista. Klooni muodostumisen tehokkuutta SP-solujen korkeampi kuin NSP-solujen havaittiin. Lisäksi, SP-solut osoittivat kasvaimen muodostumisen mahdollisuuden ainakin 100 kertaa suurempi kuin NSP soluja. Kasvaimet muodostettiin NOD /SCID-hiiriin, jotka rokotettiin vain 200 vasta lajiteltu SP soluja, kun taas vähintään 20000 NSP solua muodostamiseen tarvitaan kasvaimia hiirissä. Nämä tulokset tarjoavat suoraa näyttöä korkean tuumorigeenisyyteen SP soluja.

Self-uudistaminen ja monilinjainen eriyttäminen kapasiteetit ovat tunnusmerkkejä kantasoluja. Sarjasiirteillä solujen eläinmalleissa, vaikka epätäydellinen, voi auttaa arvioimaan vakautta SP solujen biologista käyttäytymistä. Meidän SP uudelleen lajittelu analyysin jälkeen sarjasiirteillä SP solujen hiirillä osoittivat, että toisen sukupolven SP peräisin olevia soluja SP solujen ksenograftikasvaimissa yllä kykyä itseuudistumisen ja monilinjainen erilaistumista. Lisäksi solut molemmista SP ja NSP ksenograftikasvaimissa säilyy kyky muodostaa kasvaimia hiirissä, mutta toisen sukupolven SP kasvaimet olivat merkittävästi raskaampi kuin toisen sukupolven NSP kasvaimia, mikä viittaa siihen, että 769P SP solut ovat tuumorigeenisemmiksi kuin NSP soluja.

Syöpä kantasolujen katsotaan pystyy läpikäymään epäsymmetrinen itseuudistuvien solunjakautumisen jakautumassa yksi kantasolujen ja yksi kantasolujen, joka voisi tuottaa erilaisia ​​eriytetympi toiminnallisia soluja, jotka käsittävät koko kasvain yhteiskunnalle [35]. Tutkimuksessamme puhtaus järjestetty 769P SP-soluissa oli 96,61% ja lajitellaan NSP-soluissa oli 99,89%. On mahdollista, että muutaman SP-soluissa voi olla kiinnitetty NSP soluja ja näin ollen koottu yhteen. Kun 10-päivän viljelyn jälkeen lajitellaan SP solujen kehittynyt yhteisö, joka sisältää 19,51% SP-soluissa ja noin 80% NSP soluista, kun taas lajitellut NSP solujen kehittynyt yhteisö, joka sisältää vain 2,39% SP soluja, jotka voivat syntyä muutaman Salainen-SP solujen lajittelun aikana. NSP-solut voivat muodostaa muutamia pienempiä pesäkkeitä ja regeneroidaan kasvaimia vaikka kasvaimet olivat pienempiä. Otettu havainnot pitkäaikaisista erilaistumista ja sarjasiirteillä kokeita yhdessä, se erittäin suositeltavaa, että SP solut läpikäyvät epäsymmetrinen jako ja pystyvät erilaistumaan NSP soluihin ja muodostaa pääosan kasvain. Kapasiteetit NSP solujen muodostamaan pesäkkeitä ja kasvaimia, jotka olivat paljon heikompia kuin kapasiteetin SP soluja, voidaan selittää vain pieni osa salainen-SP-soluissa keskuudessa lajiteltua NSP soluja.

SP fenotyyppi on määräytyy statukset ABC kuljettajat ABCB1, ABCC1-5, ja ABCG2 [36]. Siten SP solut lajitellaan mittaamalla nopeasti ulosvirtaus lipofiilisten fluoresoivia väriaineita ABC kuljettajat [16]. Useimmat aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet toiminta ABCG2, kun välttämättömyys pumpun toiminta ABCB1 kantasolujen laajentamiseen oli alle keskustelu [37]. Tutkimuksessamme ilmaus ABCB1 oli korkea SP-soluissa, mutta alhainen NSP-soluissa havaittiin sekä RT-PCR: llä ja Western blottauksella. Mielenkiintoista on, ole ABCC1 eikä ABCG2 ilmennettiin SP ja NSP-soluja, mikä viittaa siihen, että vain ABCB1 edistää toiminnan SP fenotyypin 769P soluissa.

mukaan CSC teoriaan, CSCS on kiinteitä kasvaimia ovat resistenttejä kemoterapia ja sädehoito, ja asukas CSCS jotka selvisivät hoito voi uudistaa kasvaimia [38]. Teimme kemosensitiivisyys ja radioherkkyyttä määrityksiä verrata herkkyys SP ja NSP solujen perinteisiin hoitoihin. Olemme havainneet, että SP-solut olivat resistenttejä säteilyä kuin NSP soluja. Lisäksi, SP-solut olivat resistenttejä MIX ja 5-FU kuin NSP-solut, mikä osoittaa, että SP-solut ovat hyvin resistenttejä tavanomaisille kemoterapeuttisten. Kuitenkin tämä lääkeresistenssin voitaisiin kääntää esikäsittelemällä verapamiilin, ABC transporter estäjä, mikä viittaa siihen, että ABC kuljettajat voivat olla vastuussa lääkeresistenssin [36], [37], [39].

Yhteenvetona meidän tutkimus osoitti, että SP-solut eristetään RCC 769P solulinjaa hallussaan kantasolujen ominaisuuksia molemmista

in vitro

ja

in vivo

kokeita. Nämä SP solut ovat tyypillisesti hyvin leviämisen mahdollisia, itseuudistumisen, erilaistuminen, vastustuskykyä kemoterapiaa ja säteily, ja

in vivo

kasvainmuodostusta kyky. ABCB1 on havaittu myötävaikuttaa toiminnan SP-soluissa. Toivottavasti kehittää hoito kohteekseen solupopulaation auttaa parantamaan ennustetta RCC.

tukeminen Information

Kuva S1.

SP solulajittelussa johtaa ihmisen munuaissyövän solulinjoissa 786-O, OS-RC-2, SN12C, ja SKRC39 käyttämällä Hoechst 33342. Vain muutama SP soluja havaittiin keskuudessa 786-O ja OS-RC-2-soluissa , ja prosenttiosuus SP solujen luopumaan kun soluja esi-inkuboida verapamiili noin 30 minuuttia. Ei SP soluja havaittiin keskuudessa SN12C ja SKRC39 soluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068293.s001

(TIF) B