Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pramanicin (PMC) on sienilääke, joka oli aiemmin osoitettu näytteille antiangiogeenistä ja syövän vastaisia ​​ominaisuuksia muutaman

in vitro

tutkimuksissa. Alussa seulotaan useita PMC analogeja niiden sytotoksisia vaikutuksia HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. PMC-A, analoginen kanssa voimakkain antiproliferatiivinen vaikutus valittiin edelleen kuulustella taustalla vaikutusmekanismi. PMC-A johti apoptoosin kautta kaspaasi-9 ja -3. Apoptoottisen luonne solukuoleman vahvistettiin kumota solukuoleman kanssa esikäsittely erityisiä kaspaasi-inhibiittorit. Stressiin liittyviä MAPK JNK ja p38 olivat molemmat aktivoidaan concomittantly kanssa luontainen apoptoottisen reitin. Lisäksi farmakologinen p38 osoittautui heikentävän solukuoleman induktioon, kun taas esikäsittely JNK-inhibiittori eivät osoittaneet suojaava vaikutus. Resistanssi Bax – /- solut ja suojaava luonne kaspaasi-9 esto osoittavat, että mitokondriot ovat keskeisessä asemassa PMC-A aiheuttamaa apoptoosia. Varhainen altistuksen jälkeinen nousu solun Bim ja Bax seurasi marginaalinen Bcl-2 ehtyminen ja Bid pilkkominen. Tarkempi analyysi paljasti, että Bcl-2 downregulation tapahtuu mRNA-tasolla ja on kriittinen välittäjänä PMC-A aiheuttaman apoptoosin, kuten kohdunulkoinen Bcl-2: n ilmentymisen merkittävästi säästynyt soluja kuolemalta. Kääntäen, pakko ilmaus Bim osoittautui merkittävästi solukuolemaa. Lisäksi analyysit p53 – /- solut osoittivat, että Bcl-2 /Bim /Bax modulaatio ja MAPK aktivoinnit tapahtua riippumatta p53 ilmaisua. Yhdessä, p53-riippumattoman transkription Bcl-2 downregulation ja p38 signalointi näyttää olevan keskeinen moduloivia tapahtumia PMC-A: n indusoiman apoptoosin.

Citation: Bodur C, Kutuk O, Karsli-Uzunbas G, Isimjan TT, Harrison P, Basaga H (2013) Pramanicin Analoginen indusoi apoptoosia ihmisen koolonkarsinoomasoluissa: Kriittinen teht Bcl-2, Bim, ja p38 MAPK Signaling. PLoS ONE 8 (2): e56369. doi: 10,1371 /journal.pone.0056369

Editor: Jose Vina, Valencian yliopisto, Espanja

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2012 Hyväksytty: 8. tammikuuta 2013 Julkaistu: 18 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Bodur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus työlle tarjosi Sabanci yliopiston tiedekunnan tutkimusvaroja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lukuisat luonnossa esiintyviä tai synteettisesti molekyylejä on seulottu niiden terapeuttista käyttöä ihmisten tai eläinten lääkinnässä. Koska pitkään hyödynnetty desinfiointiaineet ja säilöntäaineita teollisuudessa, sienilääkkeet eivät ole poikkeus tästä. Pramanicin (PMC) on sieni fermentointituote, joka kuuluu luokkaan sienilääkkeiden määritelty erittäin functionilized polaarinen pää ja on alifaattinen sivuketju. Edellisen

in vitro

analyysejä viljellyissä endoteelisolujen ja leukemiasolujen T-solujen vahvisti terapeuttista potentiaalia sekä verisuonten kasvua vastustavan ja syöpälääkettä [1], [2].

Pitkäaikainen

in vitro

tehokkaat annokset PMC oli aiemmin osoitettu vähentävän solujen elinkelpoisuuden ja laukaista kaspaasi-riippuvaista apoptoosia [2]. PMC-solukuolema on osoitettu välittyvän aktivoinnin sekä stressiin liittyvien kinaasien p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) ja c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) ja solunulkoisen säännelty kinaasin (ERK) aktiivisuus ilmoitettiin merkittävästi vähenemään altistuminen ainetta. Vaikka ohimenevä solunsisäisen kalsiumin lisäys oli raportoitu seurata PMC altistumisen viljellyissä keuhkojen endoteelisolujen, tämä ilmiö ei ole synkronoitu joko endoteelin toimintahäiriö tai solukuolemaan [1].

Fysikaalinen tai kemiallinen ympäristön rasituksille, mukaan lukien säteily, osmoottinen stressi ja oksidatiivisen stressin tai solupintareseptoriligandien kuten kasvutekijöitä, tulehdussytokiinejä tai kuoleman reseptorin ligandeja voi aktivoida kinaasikaskadin joka lopulta stimuloi stressi-aktivoidun MAPK p38 ja JNK. Upstream seriini /treoniinikinaaseja MAP-kinaasikinaasikinaasien (MEKKs) ja MAP-kinaasin kinaasien (MKKs) ovat vastuussa aktivoinnin fosforylaation ja myöhempää tumaansiirtymiseen JNK ja p38 [3]. Kun se on aktivoitu, JNK: n ja p38 tiedetään kykenevän apoptoottisten modulaatio aktivoimalla /pois päältä useita transkriptiotekijöitä.

Apoptoosi on tiukasti säänneltyä solukuoleman mekanismia, joka aktivoituu vasteena erilaisille sisäisen /solunulkoisen ärsykkeet kuten oksidatiivisen stressin ja sähkömagneettinen säteily, joka vahingoittaa solun makromolekyylien tai signaaleja, jotka sisältävät tulehdusta edistävien sytokiinien ja kasvutekijöiden. Apoptotic suoritus olettaa perheen kysteiiniproteaasien kutsutaan caspases jotka aktivoituvat hyvin määritelty tavalla [4]. Vaikka sisäisen reaktiotien laukaisee apoptogenic molekyylin vapautumisen mitokondrioissa ulkoista reitti aktivoituu kautta ligandin sitoutumista syöttämällä reseptoreihin solun pinnalla. Onko luontaisia ​​tai ulkoisia apoptoottista polku on toiminnassa määritetään yleisesti luonteen ärsyke. Riippumaton polku, joka aktivoitiin perin, sekä ulkoisen ja sisäisen reitit voivat olla mukana vahvistamaan apoptoottisen signaalin eri tilanteissa.

Sytokromi c vapautumista mitokondrioissa joka merkitsee josta ei ole paluuta ominaisvaarojen apoptoottista aktiivisuutta on taidokkaasti säätelee vuorovaikutus Bcl-2-perheen proteiinien. Herkkä tasapaino anti ja proapoptoottiset perheenjäsenten määrää apoptoottisten kuormitus solussa. Multidomain proapoptoottiset Bcl-2-proteiinien Bax ja Bak on kyky homo- /heterooligomerization ulomman mitokondriokalvon (OMM), joka aiheuttaa permeabilisaation OMM ja vapautumista apoptogenic molekyylien, kuten sytokromi c sytosoliin. Vaikka antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien, kuten Bcl-2, Bcl-x L, A1 ja Mcl-1 pitää proapoptoottiset Bax /Bak eristettyä estää niitä aloittamasta OMM läpäiseväksi, proapoptoottiset BH3 (Bcl-2-homologia 3) -vain proteiineja, mukaan lukien Bim, Bid, Noxa, Bad ja Puma voisivat työskennellä neutraloimaan antiapoptoottisten perheenjäsenet [5], [6]. Vaikka tarkkaa mekanismia moduloiva Bcl-2-proteiinien edelleen epäselviä suurelta osin, tasapaino suhteellinen solujen määrän ja toiminnan pro- ja antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinien tiedetään valvotaan tiukasti geenin ja proteiinin tasot terveitä nisäkässoluissa . Tässä suhteessa, solujen tasot proapoptoottiset BH3 vain Bcl-2-proteiinien suhteessa niiden antiapoptoottisten vastineet on kriittinen asettaa Bax /Bak vapaa aloittamaan luontaisia ​​apoptoottisen reitin.

Sen lisäksi, että roolit DNA: n korjaukseen ja solukierron säätelyssä, tunnettu tuumorisuppressori p53 on osoitettu voi suoraan säädellä apoptoosia. Toistaiseksi tämä asetus on osoitettu tapahtuvan modulaation kautta Bcl-2-perheen proteiinin tai kuoleman reseptori ilmaisuja. Sen lisäksi, että transkriptionaalisesti säätelemällä Bax, Bid, Puma, Noxa, Bak: n ja transmembraani syöttämällä reseptorit transkriptiotekijänä, p53 on myös raportoitu, että ne kykenevät suoraan aktivoimaan Bax proteiinitasolla [7] – [13]. Viimeaikaiset todisteet osoittavat myös, että p53 voi itse myös käyttäytyä BH3 vain proapoptoottiset proteiinin antagonisoida antiapoptoottisten Bcl-2-proteiineja sekä aiheuttaa transrepression of antiapoptoottisten Bcl-2-geenin transkription [14] – [17].

tässä tutkimuksessa määritellään mekanismi luontaisen apoptoottista reitin aktivaatio laukaisee PMC-A, joka on voimakas PMC analoginen joissa epoksiryhmän puolella ketjun PMC on korvattu aikeeni (Fig. 1). PMC-A välittämää apoptoosia p53-riippumattoman aktivoinnin p38: n ja Bcl-2 downregulation in HCT-116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Samanaikaisesti Bax ja Bim molemmat kertyneet soluissa altistuvat PMC-A myöhempien Bid katkaisu.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hoidot

Wild- tyyppi (paino), p53 – /-, ja Bax – /- HCT116 ihmisen paksusuolen syövän solut ystävällisesti Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University, USA) [18], [19], viljeltiin McCoyn 5A täydennetty 10% HI FBS: ää ja 100 IU /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Viljelmiä ylläpidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Etanoli (max 0,5%, v /v), lisättiin kaikkiin kontrollikuoppiin /levyt kussakin kokeessa. Solut kerättiin, määrällisesti täydellisessä väliaineessa ja ympättiin (100000 solua /ml) 12-kuoppaisille, 6-hyvin tai 60 mm elylevyillä riippuen kokeilu. Pramanicin ja analogeja lisättiin viljelmän levyjä 36 tuntia myöhemmin. Pre-hoitoja estäjien tehtiin 30 minuuttia ennen PMC-A hoito.

Reagenssit ja Analog Synthesis

Yleiset.

Protoni-NMR-spektrit rekisteröitiin CDCI

3 tai CD

3OD: ssä Bruker AC-200 tai AC-600 -spektrometriä ja ilmoitetaan seuraavasti: kemiallinen siirtymä δ (ppm); protonien lukumäärä, moninaisuus, kytkentävakio J (Hz), ja tehtävä. Jäljellä proottisia liuottimia CHCl

3 (δ = 7,26 ppm) ja CH

3OH (δ = 3,30) käytettiin sisäisenä viitteenä.

13C-NMR-spektrit rekisteröitiin CDCI

3 tai CD

3OD 50 MHz: ssä Bruker AC-200 ja 150 MHz: ssä Bruker AC-600 -spektrometrillä käyttäen keskeinen resonanssi CDCI

3 (δ = 77,16 ppm) sisäisenä viitteenä. Infrapuna-spektrit tallennettiin Perkin-Elmer 983G kone. Massaspektrit saatiin Micromass Quattro Ultima (LC-ESI /APCI kolmoiskvadrupolisen Mass Spectrometer) on kemian laitos, McMaster University. Seuraavat ionisaatio tekniikoita käytettiin: elektroni ionisaatio (EI), ja sähkösumutus (ES). Sulamispisteet määritettiin Reichert kuuma levylaitteessa. Optiset rotaatiot tallennettiin Perkin-Elmer (241 MC -polarimetriä, λ = 589, Na-lamppu).

Pramanicin (PMC) ja pramanicin A (PMC-A) valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Flash-pylväskromatografia suoritettiin silikageelillä (silikageeli 60). Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin esipäällystetyillä silikageelilevyillä (Alugram SIL G /UV

254) ja visualisoitiin UV, vanilliini tai seriumammoniumnitraattia ratkaisu. Vesipitoiset liuokset tyydyttynyt, ellei toisin mainita. Suhde liuottimien seoksissa viittaa määriä käytetään. Kaikki reaktiot suoritettiin typpi- tai argonatmosfäärissä uunissa kuivatuissa lasiastioissa, joka jäähdytettiin alle jatkuvan typpivirran välittömästi ennen käyttöä, ellei toisin mainita. THF: a tislattiin natriumista sofenoniketyylistä, CH

2CI

2 ja tolueeni kalsiumhydridistä ja EtOAc päässä kaliumkarbonaattia. Muut liuottimet ja reagenssit käytettiin sellaisena.

3-tetradekanoyyli-1-vinylpyrrolidin-2-oni (2).

Juuri tislattua

N

-vinylpyrrolidin-2- yhden (1) (0,96 ml, 9 mmol) lisättiin NaH: ta (1,44 g, 36 mmol) refluksoimalla THF: ssä (15 ml). Seosta sekoitettiin 30 minuutin ajan 90 ° C: ssa, ja sitten etyyli-myristaatti (4,3 ml, 10,3 mmol) lisättiin. 3 tunnin kuluttua liuos lämmitettiin huoneen lämpötilaan, sammutettiin kyllästetyllä vesipitoisella NH

4CL, ja uutettiin eetterillä. Uutteet kuivattiin (Na

2SO

4), suodatettiin ja konsentroitiin. Saatu kiinteä aine liuotettiin CH

2CI

2, suodatettiin ja konsentroitiin, ja puhdistettiin kromatografialla (CH

2CI

2 /EtOAc, 01:01), jolloin saatiin 2 valkoisina kiteinä (3,54 g , 82%): sp 39-40 ° C; IR (filmi) 2920, 2851 (C-H, str.), 1685, 1637 (C = O, str.), 1459 (C = C, mutka.), 1391, 861 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 200 MHz) δ 7,01 (1 H, dd,

3J = 9,0,

3J = 16,0, NCH = CH

2), 4,46 (2 H, m , NCH = CH

2), 3,68 (1 H, dd,

3J = 9,0,

3J = 6,0, COCHCO), 3,54 (1 H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,5, CH

2 N), 3,47 (1 H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,7, CH

2 N) , 3,01 (1 H, m, CH

2CH

2CO), 2,68 (1 H, m, CH

2CH

2CO), 2,67 (1 H, dddd,

2J = 13,8,

3J = 5,7,

3J = 8,5,

3J = 6,0, CH

2CH

2 N), 2,12 (1 H, dddd,

2J = 13,6,

3J = 8,5,

3J = 9,0,

3J = 5,5, CH

2CH

2 N), 1,57 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,24 (20H, m, C

10H

20), 0,87 (3H, t,

2J = 6,7, CH

3CH

2);

13C-NMR (CDCI

3, 50 MHz); δ 204,2 (CH

2CO), 169,9 (CON), 130,0 (NCH = CH

2), 94,5 (NCH = CH

2), 57,3 (COCHCO), 44,0 (CH

2 N) , 43,5 (CH

2CH

2CO), 32,7, 30,4, 30,2, 29,8, 24,1, 23,5 (C

10H

20), 20.1 (CH

2CH

2CH

2), 14,9 (CH

3); MS (EI

+) m /z = 321 (M

⋅ +), HRMS (EI) laskettu C

20H

35NO

2 (M

⋅ +) 321,2668 , havaittu 321,2679.

3-Tetradecanoylpyrrolidin-2-oni (3).

yhdistettä 2 (520 mg, 1,6 mmol), kuumennettiin 90 ° C: ssa seokseen, jossa oli 95% C

2H

5OH (35 ml) ja konsentroitua HCI: a (0,5 ml). Reaktiota seurattiin TLC: llä. Liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, kuivattiin (Na

2SO

4), suodatettiin ja konsentroitiin. Saatu kiinteä aine puhdistettiin kromatografialla (CH

2CI

2 /EtOAc, 01:01), jolloin saatiin 3 valkoisina kiteinä (241 mg, 50,4%): sp 73-74 ° C; IR (filmi) 3226 (N-H str.), 2920, 2851 (C-H, str.), 1716, 1671 (C = O, str.), 1468, 1375, 1278 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 600 MHz) δ 5,73 (1H, leveä s, NH), 3,50 (1 H, dd,

3J = 9,0,

3J = 6,0 COCHCO), 3,44 (1 H , ddd,

2J = 9,0,

3J = 8,5,

3J = 5,5, CH

2 N), 3,34 (1 H, ddd,

2J = 9,0,

3J = 9,0

3J = 5,4, CH

2 N), 2,95 (1 H, ddd,

2J = 17,4,

3J = 7,4,

3J = 7,5 CH

2CH

2CO ), 2,57 (1 H, ddd,

2J = 17,4,

3J = 7,2,

3J = 7,2 CH

2CH

2CO), 2,65 (1 H, dddd,

2J = 11.0,

3J = 5,4,

3J = 9,0,

3J = 9,0, CH

2CH

2 N), 2,17 (1 H, dddd,

2J = 11,0,

3J = 8,5,

3J = 9,0,

3J = 5,5, CH

2CH

2 N), 1,59 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,23 (22H, m, C

11H

22), 0,88 (3H, t,

3J = 6,8, CH

3CH

2);

13C-NMR (CDCI

3, 150 MHz) δ 205,9 (CH

2CO), 171,6 (CONH), 53,9 (COCHCO), 42,9 (CH

2CO), 40,6 (CH

2N), 32,1 (CH

3CH

2CH

2), 29.8~29.2, 23,5 (CH

2CH

2CH

2CO), 22,9 (CH

2CH

2CH

2NH), 14,9 (CH

3); MS (EI

+) m /z = 295 (M

⋅ +), HRMS (EI) laskettu C

18H

33NO

2 (M

⋅ +) 295,2511 , havaittu 295,2554.

(2R, 5S) -2- (p-fluorifenyyli) -3-oksa-1-atsabisyklo [3.3.0] oktan-8-oni (4).

liuosta, jossa oli 5-hydroksimetyylipyrrolidiini-2-onia (580 mg, 5 mmol) ja

p

-fluorobenzaldehyde (810 mg, 6,5 mmol) tolueenissa (20 ml), joka sisälsi PPTS: a (30 mg), kuumennettiin palautusjäähdyttäen 13 tuntia käyttäen Dean-Stark-vedenerotinta. Jäähdytyksen jälkeen liuos laimennettiin EtOAc: llä, pestiin kylläisellä NaHCO

3 vesiliuoksella ja sitten suolaliuoksella, kuivattiin (MgSO

4), ja haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin ruskeaa öljyä. Kromatografinen erotus silikageelillä eluoiden CHCI

3 saatiin 4 vaaleankeltaisena öljynä (586 mg, 53%): IR (kalvo) 2920, 2851 (CH, str.), 1701 (C = O, str. ), 1559, 1507, 1437 (aromaattinen C = C mutka.) 1301, 1099, 821, 668 cm

-1;

1H-NMR (CDCI

3, 200 MHz) δ 7,34 (2H, dd,

3J = 8,0,

4J = 5,5, H-Ph), 6,95 (2H, dd,

3J = 8,6,

4J

HF = 8,6, H-Ph), 6,20 (1 H, s, OCHPh), 4,15 (1 H, dd,

2J = 7,4,

3J = 6,4, CH

2O), 4,04 (1 H, m, NCHCH

2O), 3,40 (1 H, t,

2J = 7,4,

3J = 7,6, CH

2O), 2,74 (1 H,

2J = 17,4

3J = 9,6,

3J = 9,4, CH

2CO), 2,47 (1 H, ddd,

2J = 17,4,

3J = 3,7,

3J = 9,8, CH

2CO), 2,31 (1 H, dddd,

2J = 20,2,

3J = 3,7,

3J = 7,6,

3J = 7,0, CH

2CH

2CHN), 1,87 (1 H, dddd,

2J = 20,2,

3J = 4,7,

3J = 9,4,

3J = 9,8, CH

2CH

2CHN) ;

13C-NMR (CDCI

3, 50 MHz) δ 178,2 (CON), 163,5 (1 C, d,

1 J

CF = 244,4, CF), 129,5 (2C, d,

3J

CF = 8,2, CHCHCF), 115,4 (2C, d,

2J

CF = 21,5, CHCF), 86,7 (OCHPh), 71,8 (CH

2O), 58,9 (NCH), 33,6 (COCH

2), 23,1 (COCH

2CH

2).

(2R, 5S) -2- (p-fluorifenyyli) -7-tetradekanoyyli-3-oksa- 1-atsabisyklo [3.3.0] oktan-8-oni (5).

liuokseen, jossa oli suojattu laktaami 4 (222 mg, 1 mmol) ja HMPA: ta (5 ml) THF: ssa (15 ml), LiN (TMS)

2 (1,0 M, 1,3 ml, 1,3 mmol) THF: ssä, lisättiin -78 ° C: ssa. Reaktioseosta sekoitettiin 30 minuuttia, ja sitten etyyli-myristaatti (0,4 ml, 1,2 mmol) lisättiin. Liuos lämmitettiin hitaasti huoneen lämpötilaan. 3 tunnin kuluttua reaktioseos sammutettiin kyllästetyllä NH

4CL vesiliuosta, uutettiin eetterillä ja uute kuivattiin (Na

2SO

4), ja konsentroitiin. Saatu tuote puhdistettiin kromatografialla (heksaanit /EtOAc, 02:01), jolloin saatiin 5 valkoisina kiteinä (233 mg, 53%), joka oli muodostettu kahden diastereomeerin seoksena: sp 60-62 ° C; IR (filmi) 2918, 2851 (CH, str.), 1716, 1681 (C = O, str.), 1559, 1512 (aromaattinen C = C mutka.), 1401, 1240, 1035, 802 cm

– 1; MS (EI

+) m /z = 431 (M

⋅ +), HRMS (EI) laskettu C

26H

38NFO

3 (M

⋅ +) 43,2913 , havaittu 431,2914.

(5R) -5- (hydroksimetyyli) -3-tetradecanoylpyrrolidin-2-oni (6).

liuosta, jossa oli suojattu laktaami 5 (50 mg, 0,15 mmol) 5 ml: ssa AcOH /THF /H

2O (03:07: 1), lämmitettiin 90 ° C: ssa 3 h. Bentseeni (30 ml) lisättiin seokseen ja haihdutettiin alennetussa paineessa. Flash-kromatografia suoritettiin (EtOAc /CH

3OH, 10:01), jolloin saatiin 6 valkoisina kiteinä (22 mg, 60%) diastereomeerien seoksena: sp 73-76 ° C; IR (filmi) 3385 (NH str.), 3307 (OH, str.), 2920 (C-H, str.), 1699, 1653 (C = O, str.), 1457, 1119 cm

-1; MS (EI

+) m /z = 325 (M

⋅ +), HRMS (EI) laskettu C

19H

35NO

3 (M

⋅ +) 325,2617 , havaittu 325,2599.

(2S, 5S, 7R) -7-hydroksi- (4-fluorifenyyli) -3-oksa-1-atsabisyklo [3.3.0] oktan-8-oni (7).

yhdistettä 6 (200 mg, 0,46 mmol) lisättiin suspensioon, CeCI

3.7H

2O (5,6 mg, 0,015 mmol) 2 ml:

i

PrOH. Suspensiota sekoitettiin kuplittamalla ilmaa sen läpi 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioseos konsentroitiin. Flash-kromatografia suoritettiin (CH

2CI

2 /EtOAc, 01:01), jolloin saatiin 7 värittömänä öljynä (120 mg, 57%): IR (kalvo) 3384 (OH, str.), 1715, 1698 (C = O, str.), 1511, 1230, 1156 cm

-1; [Α]

D

23 = -0,05

0 (c = 0,8 g /100 ml, CH

3OH);

1H-NMR (DMSO-d

6, 600 MHz) δ 7,41 (2H, dd,

3J = 8,9,

4J = 5,5, H-Ph), 7,23 (2H, dd,

3J = 8,9,

4J

HF = 8,9, H-Ph), 6,62 (1 H, s, OH), 6,11 (1 H, s, H-Ph), 4,28 (1 H, dd,

2J = 8,1,

3J = 8,4, CH

2O), 4,01 (1 H, dddd,

3J = 6,8,

3J = 7,0,

3J = 8,4,

3J = 6,0, NCHCH

2), 3,51 (1 H, t,

2J = 8,4,

3J = 8,1, CH

2O), 2,75 (1 H, dd,

2J = 13,0,

3J = 6,8, CH

2CHN), 2,69 (2H, dd,

2J = 18,5,

3J = 7,2, CH

2CH

2CO), 1,90 (1 H, dd

2J = 13,0,

3J = 7,0, CH

2CHN);

13C-NMR (DMSO-d

6, 150 MHz) δ 209,3 (CH

2CO), 172,3 (CON), 162,2 (

1 J

CF = 244,4, C-Ph), 134,7 (C-Ph), 128,3 (2C,

3J

CF = 8,4, C-Ph), 115,2 (2C,

2J

CF = 21,7, C-Ph), 87,7 (C OH), 85,6 (CH-Ph), 72,2 (CH

2O), 54,6 (CH

2CHN), 37,2 (CH

2CHN), 36,2 (CH

2CH

2CO) , 22,6 (CH

2CH

2CO), 22.05~31.25, 13,9 (CH

3CH

2); MS (EI

+) m /z = 447 (M

⋅ +), HRMS (EI) laskettu C

26H

42FN

2O

4 [(M

⋅ + NH

4)

+] 465,3129 havaittu 465,3126.

(3S, 5R) -3-hydroksi-5- (hydroksimetyyli) -3-tetradekanoyyli pyrrolidin-2-onin (8 ).

liuosta, jossa oli yhdistettä 7 (60 mg, 0,13 mmol) 5 ml: ssa AcOH /THF /H

2O (03:07: 1), lämmitettiin 90 ° C: ssa 3 h. C

6H

6 (30 ml) lisättiin seokseen ja haihdutettiin alennetussa paineessa. Flash-kromatografia suoritettiin (EtOAc /CH

3OH, 10:01), jolloin saatiin 8 valkoisina kiteinä (22 mg, 48%): sp 74-76 ° C; IR (filmi) 3300 (NH, str.), 3226 (OH, str.), 2995, 2849 (C-H, str.), 1688, 1650 cm

-1 (C = O, str.); [Α]

D

23 = -4,25 ° (c = 0,04 g /100 ml, CH

3OH); 1H-NMR (CD

3OD, 600 MHz) ö 3,81 (1 H, dddd,

3J = 4,9,

3J = 5,4,

3J = 6,3,

3J = 7,9, CH

2CHN), 3,62 (1 H, dd,

2J = 11,1,

3J = 4,9, CH

2O), 3,53 (1 H, dd,

2J = 11,1,

3J = 6,3 , CH

2O), 2,74 (2H, m, CH

2CH

2CO), 2,38 (1 H, dd,

2J = 14,1,

3J = 5,4, CH

2CHN ), 2,10 (1 H, dd,

2J = 14,1,

3J = 7,9, CH

2CHN), 1,56 (2H, m, CH

2CH

2CO), 1,31 (3H, t,

3J = 7,0, CH

3CH

2);

13C-NMR (CD

3OD, 150 MHz) δ 212,2 (CO), 176,7 (CON), 84,5 (COH), 65,5 (CH

2OH), 54,3 (CHN), 38,7 (CH

2CO), 33.1~30.8, 24,3 (CH

2CH

2CO), 14,4 (CH

3CH

2); MS (EI

+) m /z = 341 (M

⋅ +), HRMS (EI) laskettu C

19H

35NO

4 (M

⋅ +) 341,2617 löydetty 341,2599.

PMC ja analogit liuotettiin etanoliin. McCoyn 5A, FBS ja antibiootit olivat Pan Biotech GmbH (Aidenbach, Saksa). Fosfataasinestäjällä cocktail (PhosStop) ja proteaasiestäjäseostabletit saatiin Roche (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveitsi). Anneksiini V: (FITC) oli Alexis Biochemicals (Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, USA). Lohkaista kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-9, JNK, P-JNK, p38, P-p38, Bcl-2, Bax, Bid, Bim ja β-aktiini vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA ). MAPK estäjät SP600125 ja SB203580 olivat yhtiöstä Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Kaspaasi-inhibiittorit Z-VAD-FMK (yleinen kaspaasiestäjä), Z-DEVD-FMK (kaspaasi-3: n estäjä), Z-LEHD-FMK (kaspaasi-9-estäjä), ja Z-IETD-FMK (kaspaasi 8-estäjä) olivat hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Tris, glysiini ja Tween-20 oli MOLEKULA Ltd (Shaftesburyn, UK). Kaikki muut kemikaalit saatiin yhtiöltä Sigma (Darmstadt, Saksa).

MTT elinkykyyn määrityselatusalustoihin

Solujen elinkelpoisuus altistettaessa PMC analogien määritettiin käyttäen MTT (dimetyyli tiatsolyyli difenyylitetratsoliumbromidi) määritys kit ( Roche, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, HCT116 paino- soluja 96-kuoppalevyillä käsiteltiin kuten on esitetty, ja 10 ui MTT-leimausreagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, minkä jälkeen levyjä inkuboitiin 4 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 100 ul: ssa liukenemisen liuosta 12 tuntia, ja absorbanssi mitattiin mikrotiitterilevyn lukijalla (Bio-Rad, CA, USA) testi aallonpituudella 550 nm ja viite aallonpituudella 650 nm. Prosentuaalinen elinkelpoisuus laskettiin (OD huumeisiin käsitellyn näytteen /ohjaus OD) x 100.

virtaussytometria

Solukuolemaan määritettiin anneksiini V affiniteettikoe. Wt, p53 – /-, ja Bax – /- HCT116-solut ympätään 12-kuoppalevyillä transfektoitiin /käsiteltiin kuten, siirretään virtaussytometria-putkiin ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla 300 g: llä 5 minuutin ajan. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan kylmää PBS: ää ja sentrifugoitiin uudelleen 300 g: ssä 5 minuutin ajan. Poistamisen jälkeen supernatantti, soluja inkuboitiin anneksiini V-puskurissa (140 mM HEPES, 10 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2, pH: 7,4), joka sisälsi 1% (v /v) Annexin V (FITC) ja 15 minuutin ajan pimeässä. Solut analysoitiin FACS: lla (FACSCanto, Becton Dickinson).

Protein Extraction ja immunoblottauksella

Soluja käsiteltiin kuten on osoitettu, ja kerättiin sentrifugoimalla 300 g: llä 30 sekunnin ajan. Seuraavat suspendoitu uudestaan ​​1 ml: aan jääkylmää PBS: ää ja siirrä 1,5 ml: n mikrofuugiputkiin, solut sentrifugoitiin 13200 rpm 30 sekunnin ajan. Pelletti hajotettiin inkuboimalla 30 minuuttia 200 ul: ssa kylmää solun lyysipuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH: 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia, proteaasi ja fosfataasi-inhibiittori cocktailit ja Nonidet P-40 1 % (v /v). Kun oli sentrifugoitu 13200 rpm: ssä 10 minuuttia, supernatantti, joka sisälsi koko proteiinia uute poistettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Proteiinikonsentraatiot määritettiin DC-proteiinin määritys (Bio-Rad, Munchen, Saksa). Proteiinit (30 ug) sekoitettiin latauspuskuria (4% SDS, 20% glyserolia, 10% 2-merkaptoetanolia, 0,004% bromifenolisinistä, 0,125 M Tris-HCI, pH: 6,8) ja erotettiin 10-15% SDS- PAGE ja blotattiin PVDF kalvoja. Membraanit blokattiin 5% esto-reagenssia (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Saksa) PBS-Tween 20: tä ja inkuboitiin sopivan primaarisen ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Saksa) 5% blokkausreagenssia . Sen jälkeen, kun vaaditaan pesun PBS-Tween20: llä, proteiinit lopuksi analysoitiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Saksa) ja altistettiin Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Saksa).

Transfektiot

HCT116 paino- solut transfektoitiin Bcl-2 ja Bim ekspressioplasmidien (Addgene Inc., Cambridge, MA, USA) käyttäen FuGene 6-transfektioreagenssia (Roche, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveitsi) mukaan valmistajan protokollaa. Kokonaisproteiinin uutto suoritettiin 24 tunnin päättymisen jälkeen transfektion menettely vahvistusta kohdunulkoisen ilmaisua. Plasmidi-transfektoituja soluja käsiteltiin PMC-A kuten on osoitettu, ja analysoitiin virtaussytometrialla 24 tunnin kuluttua.

Tilastollinen analyysi

Kaikki esitetty tulokset edustavat yhtä vähintään kolmen itsenäisen kokeen kanssa samankaltaisia ​​tuloksia . Kaikki numeeriset tiedot on esitetty keskiarvoina ± SD. Tilastollinen merkitys reagoivat eroja differentiaalisesti käsitelty tai eri tavalla transfektoituja solu- populaatioita arvioitiin kanssa parittomia tai pariksi opiskelijan t-testissä, vastaavasti. Arvot P 0,05 ja P 0,01 merkitään * tai **, vastaavasti.

Tulokset

PMC-A osoittautuu Sytotoksiset verrattuna sen esiasteet PMC ja useat analogit vastaan ​​HCT116 Cells

PMC osoitettiin aikaisemmin valikoivasti vahingoittaa verisuonen endoteelisolujen

in vitro

toiminnallisia tutkimukset rotan aortan ja koira valtimoissa [1], [21], [22]. PMC ja analogit osoitettu myös aiheuttavan solukuolemaa viljellyissä naudan verisuonten ja Jurkat-T-leukemia-solut [1], [2]. Tutkimuksessamme olemme ensin tutkineet aiemmin raportoitu luonnontuotteita PMC ja PMC-A [20], ja sitten syntetisoitiin useita analogeja tutkia rakenne-toiminta-suhteiden (Fig. 1). Näin ollen, PMC-C valmistettiin kaupallisesta

N

-vinylpyrrolidinone (1) muodostamalla enolaatin, sitten asyloimalla etyyli- myristaatti, jolloin saatiin 2. vinyyli suojaryhmä poistettiin sitten vesipitoisella hapolla, jolloin PMC- C (3) raseemisena seoksena on helposti epimerisoitunutta stereocentre (Fig. 2).

analogien PMC-D ja -F, kaupallinen (

R

) -5- hydroksimetyylipyrrolidiinin-2-oni muutettiin suojattu johdannainen 4, käyttäen kirjallisuuden menettelyä [23], sitten deprotonoidaan ja asyloidaan etyyli myristaatti, jolloin 5. Poistamalla suojaryhmä jälkeen saatiin PMC-D (6). Vaihtoehtoisesti, hydroksylaatio 5 hapen kanssa ja ceriumkloridia katalyyttinä mukaisesti menetelmän Christoffers [24] saatiin 7, joka sitten poistettiin suojaus, jolloin saatiin PMC-F (8). Käyttö

p

fluorifenyyli suojaryhmä kätevästi johti olennaisesti täysin stereoselektiivisellä hydroksylaatio, kun taas muut substituentit bentseenirenkaassa antoi seoksia. Stereokemia 8 perustettiin röntgenkristallografialla, joka osoitti, että hydroksiryhmä oli

trans

että hydroksimetyylisubstituentti, toisin kuin

cis

suhdetta pramanicin. Tämän vuoksi oli kiinnostavaa selvittää, onko tämä hydroksiryhmä ja sen stereokemia ovat tärkeitä aktiivisuuden, ja näin me mukana tätä yhdistettä testipaneelin.

Suoritimme sitten 24 tunnin sytotoksisuuskoetta etsiä tehokkain analogiseksi vastaan ​​HCT116-soluissa. MTT vähentäminen testi, joka epäsuorasti määrittelee solujen elinkelpoisuuden /lisääntymiseen seuraamalla metabolinen aktiivisuus, paljasti, että 100 uM PMC aiheutti noin 8%: n lasku solujen elinkelpoisuuden (Fig. 3). Kuitenkin PMC-A, jolla on C = C-kaksoissidoksen asemesta epoksiryhmän sen sivuketjussa, vähensi solujen elinkelpoisuuden lähes 70% verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Erityisesti, analogit PMC-C, -E ja -F säilytetty merkittävää aktiivisuutta, mikä osoittaa, että asyloidun pyrrolidinonia (kuten PMC-C), korkeintaan, on avain farmakoforin ja että monet substituenteista (epoksidi-, dieeni, C- 5 hydroksimetyyliryhmä, ja C-3 ja C-4 alkoholi ryhmät) eivät ole olennaisia, vaan parantaa toimintaa.

elinkykyä HCT116-solut analysoitiin MTT-määrityksellä seuraavasti 24 h käsittelemällä 100 uM kutakin PMC analogisen . Villityypin HCT116-soluja analysoitiin kolorimetrisesti seuraavan 24 tunnin hoidon PMC analogeilla. Keskimääräinen absorptio arvoiltaan käsittelemätön kontrolli näytetään jälkeen kertominen 100. Tulokset vähintään 3 riippumatonta koetta esitetty keskiarvoja ± SD. Ero keskiarvojen välillä käsitellyn ja käsittelemättömän näytettä testattiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä; ** P 0,01. Ohjaus soluja käsiteltiin pelkästään liuotinta. Kaikki testatut analogit paitsi edeltäjä PMC johtanut merkittäviin menetykseen elinkelpoisuuden /lisääntymiseen, kun taas PMC-A ja -F osoittautunut erittäin sytotoksisia soluja.

PMC-A indusoi solukuoleman kautta induktio Luonnostaan ​​Apoptotic Pathway

in vitro

tehokkaat annokset, voimakas PMC analogi PMC-A (25-100 uM) aiheutti solujen kuoleman annoksesta riippuvaisella tavalla kaikissa kolmessa HCT116 koolonsyöpäsolulinjoissa (paino-, p53 – /-, ja Bax – /-), kuten lisääntynyt anneksiini-V affiniteetit solupopulaatioissa (Fig. 4A). Sen analysoimiseksi solukuoleman ja määrittää optimaalisen annoksen käyttää 24 tunnin ajan mittakaavassa, haimme virtaussytometria seuraavien anneksiini V solujen värjäys alttiina neljä fysiologisesti relevantti PMC-A pitoisuuksia. Solukuoleman induktio oli ilmeistä kaikkien annosten kaikissa solulinjoissa ja lisääntynyt annoksesta riippuen. Ottaen huomioon, että yli 50% paino solut olivat kuolleet 24 tunnin altistuksen 100pM PMC-A, teimme loput immunoblottaus kokeet, joissa käytetään 50gM annos, jolla noin 70% soluista säilyi hengissä 24 tuntia post