Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka lisääntynyt ekspressiotaso XIAP liittyy syöpäsolumetastaasi , taustalla molekyylitason mekanismit ovat edelleen paljolti hyödyntämättä. Voit tarkistaa tietyn rakenteellinen XIAP säätelyyn syöpäsolun muuttoliikkeen, olemme ottaneet käyttöön erilaisia ​​XIAP verkkotunnuksia XIAP

– /- HCT116-soluissa, ja totesi, että reconstitutive ilmentyminen täyspitkän HA-XIAP ja HA-XIAP ΔBIR, molemmat joilla on ehjä RING domain, kunnostettu β-Actin ilme, aktiini polymerointi ja syövän solun liikkuvuus. Kun taas käyttöön HA-XIAP ΔRING tai H467A mutantti, joka poisti sen E3-ligaasi-toiminto, eivät osoittaneet selvää palauttamista, mikä osoittaa, että E3-ligaasi aktiivisuus XIAP RING verkkotunnuksen ollut ratkaiseva rooli XIAP säätelyssä syövän solun liikkuvuus. Lisäksi RING verkkotunnus eikä BIR verkkotunnuksen vaadittiin vuorovaikutukseen RhoGDI riippumaton sen E3 ligaasin aktiivisuutta. Yhteenvetona voidaan todeta, tämänhetkisiin tutkimuksissa havaittiin, että asema XIAP säätelyssä solun motiliteettia irrotettuna sen kaspaasi-estäviä ominaisuuksia, mutta jotka liittyvät fyysiseen vuorovaikutusta RhoGDI ja sen RING domain. Vaikka E3 ligaasiaktiivisuus RING verkkotunnuksen osaltaan solujen vaeltamiseen, se ei ollut osallisena RhoGDI sitova eikä sen ubiquitinational muutos.

Citation: Liu J, Zhang D, Luo W, Yu J, Li J, Yu Y, et ai. (2012) E3 ligaasiaktiivisuus of XIAP RING Domain tarvitaan XIAP välittämän Cancer Cell Migration, mutta ei sen RhoGDI sitoutumisaktiivisuus. PLoS ONE 7 (4): e35682. doi: 10,1371 /journal.pone.0035682

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 joulukuu 2011; Hyväksytty: 20 maaliskuu 2012; Julkaistu: 19 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia Yhdysvaltojen National Institutes of Health /NCI CA112557 ja CA119028-05S110, NIH /NIEHS ES012451, ja ES010344. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

X-linked apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP) on jäsen inhibiittorit apoptoosin proteiinin (IAP) -perheen [1]. XIAP todettiin ensimmäisen kerran sen voimakas ominaisuuksia säätelyssä solussa apoptoosin [2], [3]. Myöhemmin tutkimukset osoittivat, että XIAP voi säädellä muita solureiteillä irrotetaan sen kaspaasin estovaikutuksista [4], [5], aikuinen innoittamana löydökset XIAP-hiirillä, jotka näkyvät ilman ilmeisiä apoptoottisia fenotyyppiä [6]. Äskettäin monenlaisia ​​tutkimusten mukaan osallisuudesta XIAP kuparin aineenvaihduntaan [7], soluliikkuvuus [8], [9] ja aktivointi JNK ja NFKB reittejä [10], [11] ei liittynyt sen estävää vaikutusta kaspaaseiksi.

monikäyttöisyyden XIAP juuren sen rakenteellinen perusta. XIAP koostuu kolmesta bakuloviraalisia IAP repeat (BIR) verkkotunnuksia aminopäässä ja yksi karboksipään RING domain [12]. Jokainen BIR domeeni koostuu noin 70 aminohappoa, joka koordinoi sinkki-ionin kautta histidiiniä ja kysteiinitähdettä, [13]. Sen voimakas anti-apoptoottisen ominaisuudet riippuvat pääasiassa toimintoja uraan BIR3 domain ja kaksi pinnat BIR2 domeeni, joka on raportoitu sitovan ja inhiboivan kaspaasi-9 ja kaspaasi-3/7 vastaavasti [14]. RING verkkotunnuksen määritellään läsnäolo seitsemän kysteiiniä ja yksi histi-, jotka muodostavat rajat ahdin arkkitehtuuri ja koordinoida kaksi sinkki-ioneja [15]. RING verkkotunnuksia toimivat usein moduloi jotka antavat ubikitiinipromoottori ligaasilla (E3) toimintaa [13]. Mutatoimalla avain histidiini aminohapossa 467 alaniiniksi ihmisen XIAP, Lewis et al havaitsivat, että E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla funktiona RING tarvittiin aktivointia NFKB, mutta ei Smad-riippuvaisen transkription [16], mikä osoittaa, että rakenne- pohjainen toiminnot XIAP ovat myös solujen tilanneriippuvaista.

Lisääntynyt ilmentyminen XIAP on monissa syövän kudoksissa ja liittyvät chemoresistance, taudin etenemisen ja huonon ennusteen [9], [17], [18], [19 ], [20], [21], [22]. Viimeaikaiset havainnot laboratoriossamme ja muiden osoitettu, että XIAP voisi säädellä tuumorietäpesäke [8], [23], [24]. Kasvaimen metastaasi on merkittävä kuolinsyy suurimmalla osalla potilaista [25]. Monet molekyylit mukana metastaattisen kaskadin ohjataan jäsenten Ras-superperheen pienten GTP-sitovia proteiineja, jotka kykenevät sitomaan hen /GTP ja hydrolysoivat GTP aktivoitumiseen johtavat alavirtaan efektoriproteiinien [26]. Ihmisen Rho-GTPaasina alaperhe käsittää 23 molekyylejä, joista RhoA, RhoB, Rac1 ja Cdc42 eniten tutkittu laajasti ja raportoitu hallita eri osa solujen liikkuvuutta ja invaasio, eli solujen napaisuus, ctyoskeletal organisaatio, ja signaalitransduktion [27], [28].

Rho-GTPaasi-aktiivisuus on tiukasti kontrolloitua neljän avainkomponenttien mukana BKT /GTP-sidottu GTPaa- ajan myös GTPaasia aktivoivat proteiinit (GAP), GDP-dissosiaatio estäjät (GDIs), GDI dissosiaation tekijät (GDF: t), ja guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEFs) [29]. RhoGDI avainasemassa tasapainottaa koko GTPaasi syklin ehkäisemällä BKT dissocation ja ylläpitää GTP yhdistyksen kautta vuorovaikutuksessa prenylaatio ryhmän GTPaasi. Siten se sitoo GTPaasi sytoplasmassa, kun lokalisointi sisempi solukalvon tarvitaan GTPaasi aktivointia. Estovaikutukset RhoGDI on GTPaasi toimintaa on tuettu useita rivejä todisteita [30], [31], [32]. Esimerkiksi Leffers

et al

. On havaittu, että yli-ilmentyminen RhoGDI ihmisen keratinosyyttien aiheuttanut häiriöitä aktiinitukirangan ja esto motiliteetin [32]. Siksi RhoGDI pidetään houkuttelevana ehdokas säätelemällä Rho GTPaasina syövän hoidossa [26].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että XIAP välittämä syöpäsolujen motilities kautta RhoGDI riippuvalla tavalla sääntelyn solun tukirangan [ ,,,0],23]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme edelleen selvitetty molekyylitasolla mekanismeista XIAP-RhoGDI proteiini vuorovaikutuksen ja kunhan rakenteellinen XIAP rahoitusosuuteen sovittelu syövän solun liikkuvuus.

Tulokset

RING domeeni tarvitaan XIAP välittämää β-Actin ilmentyminen

XIAP ilmentyminen on kohonnut monissa syövän solulinjoissa ja läheistä sukua etenemistä ja aggression pahanlaatuinen syöpä [33], [34]. Viimeaikaiset työ osoitti, että XIAP voisi säädellä β-Actin ilmaisun [23]. Tämän seurauksena ehtyminen XIAP ilmaisun heikennetty solu maahanmuuttoluku ja invasiivisia valmiudet esitetään haavan paranemista määrityksessä ja trans-hyvin määritys, vastaavasti (kuviot. 1A-1E). Huomata, oli vain marginaalinen ero proliferaationopeus välillä WT ja XIAP

– /- soluja viljeltiin normaalissa soluviljelyalustassa (10% FBS) enintään 5 päivää, johon sisältyi aikajakso haavan määritystä ( Kuva. 1 F), mikä osoittaa, että alennettu solumigraatiota verrattuna vuoteen XIAP

– /- solut eivät johtuneet viallinen solujen lisääntymistä. Lisäksi dynaaminen induktio aktiini polymerointi, eli F-Actin muodostumista, EGF myös jyrkästi vuonna XIAP

– /- solut detektoitiin spektrofotometrillä (Fig. 1G). Johdonmukaisesti, selvä muutos solun luuranko morfologia ja oheislaitteiden röyhelöt /kalvo röyhelöt havaittiin EGF-käsiteltyjen WT HCT116-soluissa mutta ei XIAP

– /- solut (kuviot. 1H 1I). Nämä ilmiöt olivat toistettavissa kaatamalla XIAP in HCT116-soluissa (kuvio. 2). Siksi osoitti, että XIAP ollut keskeinen rooli sovittelun syöpäsolun muuttoliikettä ja invaasiota.

(A), Knockout on XIAP vuonna HCT116-soluissa varmistettiin Western blotting -tekniikalla määrityksessä. (B ja C), Cell muuttoliike käyttäytymistä arvioitiin suorittaessa haavan paranemista määrityksessä, ja kuvat otettiin eri ajankohtina. Mittakaava on 300 um. Haava-alue kvantifioitiin käyttäen Cell Migration Analysis ohjelmisto, ja määrälliset tiedot näytettiin kuten (virhepalkin edustavat S.D, n = 3). Tähti (*) osoittaa merkittävää eroa haavan pinta-alan osuuden eroksi solulinjojen (

p

0,05). (D ja E), Invasion of WT (Vector), XIAP

– /- (Vector), ja XIAP

– /- (HA-XIAP) HCT116-solut määritettiin määrällisesti ja ilmaistaan ​​prosenttiosuutena hyökkäystä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. peräisin olevia tietoja kolmen itsenäisen kokeen kanssa Rinnakkaiskuoppien kullekin kokeelle. Tähti (*) osoittaa merkittävä lasku invaasio prosentteina verrattuna WT (vektori) ja XIAP

– /- (HA-XIAP) solut (

p

0,01). (F), The lisääntyvät nopeasti hinnat osoitetun solulinjoja arvioinut CellTiter-Glo® Luminescent solunelinkykyisyysmääritys kit. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. ja rinnakkaisesta kuopasta. (G-I), Ilmoitettu solut käsiteltiin tai ilman EGF: n ja F-aktiini induktio analysoitiin spektrofotometrillä (G), tai tarkasteltiin konfokaalimikroskoopilla (H), vastaavasti. Fluoresenssia soluihin kvantitoitiin ohjelmiston ImageJ (I). Määrälliset tiedot osoitettiin kuten (virhepalkin edustavat S.D, n = 3). Tähti (*) osoittaa merkittävä lasku verrattuna WT soluissa (

p

0,01).

(A), knockdovvn XIAP vuonna HCT116-soluissa varmistettiin Western-blottaus määrityksessä. (B ja C), Cell muuttoliike käyttäytymistä arvioitiin suorittaessa haavan paranemista määrityksessä, ja kuvat otettiin eri ajankohtina. Mittakaava on 300 um. Haava-alue kvantifioitiin käyttäen Cell Migration Analysis ohjelmisto, ja määrälliset tiedot näytettiin kuten (virhepalkin edustavat S.D, n = 3). Tähti (*) osoittaa merkittävää eroa haavan pinta-alan osuuden eroksi solulinjojen (

p

0,05).

XIAP-proteiini sisältää neljä toiminnalliset domeenit, mukaan lukien kolme BIRs ja RING domain (Fig. 3A). Anti-apoptoottisen funktion XIAP BIRs ilmoitettiin johtua niiden sitoutumista ja heikentynyt kaspaasin aktivaation [1]. Rengas verkkotunnus XIAP kuuluu E3 ligaasilla ja välittää proteiinin ubikitinaatio ja hajoaminen [1]. Voit tarkistaa tietyn rakenteellinen XIAP säätelyyn syöpäsolun maahanmuuton transfektoimme erilaisia ​​HA-tagged XIAP cDNA rakentaa, mukaan lukien täyspitkät (HA-XIAP), RING domain-poisto (HA-XIAPΔRING), yhteensä BIR poisto (HA -XIAPΔBIR), ja pistemutaatio H467A, mikä johtaa menetykseen E3 ubikitiinipromoottori ligaasin toiminnan, osaksi XIAP

– /- soluissa, ja stabiilit transfektantit havaittiin (Fig. 3B). Re-perustuslaillinen ilmentymistä HA-XIAP tai HA-XIAP ΔBIR joka sisältää RING verkkotunnuksen osaksi XIAP

– /- solut johti lisääntymiseen β-Actin ilmentyminen verrattuna että XIAP

– /- (Vector) solut, kun taas ekspressio HA-XIAP ΔRING joka sisältää BIR verkkotunnuksia, tai HA-XIAP H467A joka tekee poistaminen E3 ligaasiaktiivisuus, ei antanut vastaava korjaaminen (Fig. 3C). Siksi osoitettiin, että XIAP RING domain ja sen E3 ligaasiaktiivisuus ollut merkitystä sääntelyn β-Actin ilme.

(A), Kaavioesitys XIAP proteiinin ja tunnistettu toiminta jokaisen verkkotunnuksen. (B ja C), tunnistus vakaa transfektanttien kätkeminen XIAP ja sen eri poisto plasmidien XIAP

– /- HCT116-soluissa. Numerot alla kaistojen densitometrinen analyysi suhteellisesti vähiten β-Actin tasoilla lastaus valvonta (GAPDH) arvioitiin ohjelmiston ImageQuant Versio 5.2 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Tulokset olivat edustavia vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

E3 ligaasin aktiivisuuden XIAP RING verkkotunnuksen oli mukana sovittelu solumigraation ja aktiini polymerointi

Tutkimaan edelleen biologista merkitystä β aktiini-ilme muutos säätelee XIAP RING domain, haavoja määritys suoritettiin vertaamaan siirtymisen keskuudessa eri transfektantit kuljettaa eri aloilla on XIAP yksilöityjä kuvassa. 3B. Mukaisesti puutteita β-Actin ilmentyminen, käyttöönotto ei HA-XIAP ΔRING eikä HA-XIAP H467A voisi kääntää vajaatoiminta solujen kulkeutumista XIAP

– /- solut, kun taas ilmaus täyspitkän HA-XIAP tai Ha- XIAPΔBIR, jotka molemmat pitää koskemattomana RING domain, palautti vähentäminen solun migraatiokykyä aiheuttamia XIAP ehtyminen (Fig. 4A). Kun taas, koska suhteellisen alhaisen ilmentymisen HA-XIAPΔBIR verrattuna, että HA-XIAP yksittäisissä transfektanttien (Fig. 3B), haavan paranemisen nopeus havaittiin HA-XIAPΔBIR-ilmentävät transfektantit oli hitaampaa kuin HA-XIAP- ilmentäviä soluja (kuvio. 4A). Prosenttiosuus haavan alue vasemmalla un suljettu 4

th päivä verrattuna 0 päivänä kvantifioitiin käyttäen Cell Migration Analysis ohjelmisto, joka osoitti, että haava alueet XIAP

– /- (vektori), Ha- XIAP ΔRING ja HA-XIAP H467A transfektantit olivat merkittävästi korkeammat kuin WT HCT116-soluissa (kuvio. 4B). Siksi ehdotetaan, että E3 ligaasiaktiivisuus RING verkkotunnuksen ollut tärkeä rooli XIAP välittämä solun liikkuvuus.

(A), Cell muuttoliike käyttäytyminen arvioitiin haavan paranemista määrityksessä, ja kuvat otettiin eri ajankohtina. Mittakaava on 300 um. (B), Haava alue vasemmalla un suljettu 4

päivänä kvantifioitiin käyttäen Cell Migration Analysis ohjelmisto, ja määrälliset tiedot osoitettiin kuten (virhepalkin edustavat S.D, n = 2). Tähti (*) osoittaa merkittävää eroa prosentteina haavan alue verrattuna WT (Vector) solut (

p

0,05).

aktiinisäikeiden keskeisessä rooli lukuisissa solujen toimintoja, kuten solujen vaeltamiseen ja morfologiset sääntelyä [35]. Määrittämään mahdollisia osallistuminen eri domeenien XIAP sääntelyssä aktiini polymerointi, käsittelimme solut EGF, ja sitten uutetaan solujen määrittämiseksi F-aktiini tasot virtaussytometrialla käyttämällä vakaa transfektantit edellä. Jälleen F-aktiini kokoonpanojen aiheuttama EGF hoito oli ilmeisesti saatu WT HCT116-soluissa, XIAP

– /- (HA-XIAP) ja XIAP

– /- (HA-XIAP ΔBIR) transfektantit, vaikkei ollut mitään havaittavissa F-aktiini induktio XIAP

– /- (vektori), XIAP

– /- (HA-XIAP ΔRING) tai XIAP

– /- (HA-XIAP H467A) transfektanteilla (Kuva. 5A) . Kvantifiointia tulos oli kuvassa. 5B. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että toiminta XIAP RING verkkotunnuksen sääntelyssä aktiini polymerointi ja soluliikkuvuus välitti sen E3 ligaasin aktiivisuutta.

(A), Ilmoitettu solut käsiteltiin tai ilman EGF ja F- aktiini induktio analysoitiin virtaussytometrialla. (B), Kvantitatiivinen aineisto esitettiin kuten (virhepalkin edustavat S.D, n = 2). Tähti (*) osoittaa merkittävää eroa F-aktiini induktio verrattuna WT (Vector) solut (

p

0,05).

XIAP RING Domain vuorovaikutuksessa RhoGDI, riippumaton sen E3 ligaasiaktiivisuus

viime työtä osoittaneet RhoGDI oli mukana aktiini polymerointi säätelevät XIAP [23]. Siksi havaitaan fyysinen vuorovaikutus näiden kahden molekyylin samanaikainen immunosaostus käyttäen anti-XIAP spesifistä vasta-ainetta. Tulokset osoittivat, että RhoGDI havaittiin yhteistyössä immunosaostettiin monimutkainen XIAP

+ /+, mutta ei XIAP

– /- HCT116-solut (Fig. 6A), mikä viittaa siihen, että RhoGDI saattavat vuorovaikutuksessa endogeenisten XIAP. Vuorovaikutus XIAP ja RhoGDI Lisäksi todennettiin vastavuoroisesti havaitsemalla XIAP yhteistyössä immunosaostus kompleksi vedetty alas anti-GFP-vasta käyttäen transfektantteja XIAP

– /- (HA-XIAP /GFP-RhoGDI), kun taas oli mitään havaittavaa tasoa XIAP Co-IP monimutkainen transfektantteja XIAP

– /- (HA-XIAP /GFP-vektori) (Fig. 6B). Sitten pudotti RhoGDI WT ja XIAP

– /- solut vahvistaa osallistumisen RhoGDI in solun liikkuvuus. Haavan paranemista määrityksen tulokset osoittivat, että knockdovvn RhoGDI WT solut eivät aiheuta selvää muutosta haavan nopeudella, mutta hämmästyttävän lisääntynyt solujen vaeltamiseen havaittiin XIAP

– /- (shRNA-RhoGDI) solujen verrattuna, että ei-hiljentäminen ohjaus, XIAP

– /- (non-hiljentäminen) soluja (Kuva. 6C). Tasaisen, knockdovvn RhoGDI ilmaisun lisäsi myös F-aktiini sisällön XIAP

– /- (Si-RhoGDI) solut altistettiin EGF (Fig. 6D, p 0,05). Sekvenssit RhoGDI geenin (401-419), joka oli komplementaarinen siRNA oligonukleotidin pEGFP-C3 /RhoGDI-re-konstrukti, mutatoitiin estää tuhoutumisen eksogeenisen mRNA RhoGDI siRNA [36]. Kuten on esitetty kuviossa. 6E, yli-ilmentyminen pEGFP-C3 /RhoGDI-re tunnistettiin XIAP

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re). Tämä reconstitutive ilmaus RhoGDI vuonna XIAP

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) dramaattisesti heikennetty aktiini polymerointi aiheuttama EGF kohtelu verrattuna että XIAP

– /- (Si-RhoGDI) soluja (2 % vs. 14%, p 0,01, Fig. 6F). Lisäksi reconstitutive ilmentyminen RhoGDI vuonna XIAP

– /- (Si-RhoGDI + RhoGDI-re) soluihin palautettu estävää roolia RhoGDI kuitumaisilla aktiini muodostumiseen (Fig. 6G), mikä viittaa siihen, että uudelleen RhoGDI-re käytössä menetyksen korvaamisesta endogeenisen RhoGDI toiminnon aktiini polymerointi XIAP

– /- solut. Tuloksemme esitti näyttöä siitä RhoGDI saattaa olla mukana XIAP RING domain-säätelyyn aktiini polymerointi ja migraatiota.

(A), Lysaatit WT ja XIAP

– /- HCT116-soluja Co-Immunopresipitoidun anti-XIAP (hiiren) vasta-aine tai normaalin hiiren IgG, ja immunosaostumat alistettiin sitten immunoblottauksella anti-RhoGDI (kani) tai anti-XIAP (kanin) vasta-aineet. Viisi prosenttia lysaatit käytettiin syötteenä. (B), XIAP

– /- (HA-XIAP) soluja transfektoitiin ohimenevästi GFP-RhoGDI tai tyhjän vektorin, gFTP-vektori. Samanaikainen immunosaostus suoritettiin anti-GFP-vasta-ainetta konjugoituna agaroosihelmiin. Immunosaostumat alistettiin sitten immunoblottauksella käyttäen vasta-aineita, kuten on osoitettu. (C). Vakaa transfektantteja shRNA-RhoGDI WT ja XIAP

– /- solut tunnistettiin. Solumigraation määritettiin haavan paranemista määrityksiä ilmoitettuina aikoina välillä Non-hiljentäminen ja shRNA-RhoGDI transfektantit WT ja XIAP

– /- soluissa. Haava-alue kvantifioitiin käyttäen Cell Migration Analysis ohjelmisto, ja määrälliset tiedot osoitettiin kuten (virhepalkin edustavat S.D, n = 3). Tähti (*) osoittaa merkittävää eroa osoitettu solulinjoissa (

p

0,05). Mittakaava on 300 um. (D), Ilmoitettu soluja käsiteltiin EGF: llä 1 minuutin ajan määrittämiseksi F-Actin induktion virtaussytometrialla. (E), konstitutiivinen ilmentyminen GFP-RhoGDI-Re XIAP

– /- (Si-RhoGDI) todennettiin Western blotting -tekniikalla. (F ja G), suhteellinen induktio F-Actin läsnä EGF määritettiin spektrofotometrillä (F), ja tasot rihmamaisia ​​Actin havaittiin alle konfokaalimikroskopialla (G) osoitti transfektanttien. Tähti (*) osoittaa merkittävää kasvua verrattuna kuin XIAP

– /- (Si-Control) (

p

0,05), ja (♣) todetaan merkittävä lasku verrattuna niille in XIAP

– /- (Si-RhoGDI) solut (

p

0,001, n = 3).

Voit selvittää tiettyjä XIAP verkkotunnuksia mukana vuorovaikutuksessa jossa RhoGDI proteiini, me kotransfektoidaan GFP-RhoGDI rakentaa HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING ja HA-XIAP ΔBIR vastaavasti osaksi XIAP

– /- solut. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, HA-tag havaittiin yhteistyössä Immunokompleksin vedettävä alas anti-GFP-vasta transfektanteissa kätkeminen HA-XIAP ja HA-XIAP ΔBIR. Lisäksi samanlainen affiniteetti GFP-RhoGDI havaittiin transfektanteissa HA-XIAP H467A, mutaatio menetys E3 ligaasin aktiivisuuden RING domain. Vaikka vain marginaalinen bändi HA havaittiin Immunoyhdistelmän HA-XIAP ΔRING transfektantit, paljastaen että XIAP RING domain ollut merkitystä vuorovaikutuksessa RhoGDI riippumaton sen E3 ligaasin aktiivisuutta. Lisäksi vaikka RING verkkotunnus XIAP voisivat sitoutua RhoGDI, niiden vuorovaikutus ei johtanut ubikinaa- of RhoGDI (kuviot. 7B ja 7C). Konjugointi ubikitiinipromoottori on RhoGDI oli tuskin havaittiin vaikka läsnä eksogeenisen villityypin ubikitiinipromoottori vuonna Immunoyhdistelmän vedettävä alas GFP joka tagged RhoGDI (Fig. 7B). Kumpikaan ei ilmentävät mutantti ubikitiinipromoottori tehdä mitään selvää vähennykset ubikinaa- of RhoGDI (Fig. 7B). Lisäksi ei ollut havaittavaa eroa RhoGDI ubikinaa- keskuudessa WT soluja ja XIAP

– /- solut (Fig. 7B). Samanlainen löydökset toistettu 293T-soluissa, kuten on esitetty kuviossa. 7C. Siksi ehdotettiin, että vaikka E3 ligaasiaktiivisuus vaadittiin XIAP välittämä solujen vaeltamiseen, se ei ollut välttämätöntä RhoGDI sitova, eikä sen ubiquitinational muuttamista.

(A), XIAP

– /- solut transfektoitiin GFP-RhoGDI yhdessä HA-XIAP, HA-XIAP H467A, HA-XIAP ΔRING, tai HA-XIAP ΔBIR. Samanaikainen immunosaostus suoritettiin anti-GFP-vasta-ainetta konjugoituna agaroosihelmiin. Immunosaostumat alistettiin sitten immunoblottauksella havaitsemiseen XIAP käyttäen HA-vasta-ainetta. (B). WT (Vector), XIAP

– /- (Vector) ja XIAP

– /- (HA-XIAP) HCT116-solut transfektoitiin konstruktit GFP-RhoGDI yhdessä Ubiquitin-WT, Ubiquitin-K48R, Ubiquitin -K63R tai Ubiquitin-K48R /K63R (KKRR). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin ja co-immunosaostettiin anti-GFP-vasta-ainetta, ja sitten immunoblotattiin anti-Ub ja anti-GFP-vasta-aineita. (C), 293T-solut transfektoitiin eri konstruktien kuten havaitsemiseksi RhoGDI ubikitinaation anti-Ub ja anti-GFP-vasta-aineita. (D), malli XIAP-säänneltyjen modulaatiota soluliikkuvuus: XIAP sitoutuu RhoGDI kautta RING domain ja estää RhoGDI SUMOylation joka johtaa alas-säätely RhoGDI tehtävästä ja edistää aktiini polymerointi ja solun liikkuvuus. Tai E3 ligaasin aktiivisuuden XIAP RING verkkotunnuksen voi säädellä joitakin un-todennettu tekijöitä, jotka myöhemmin ohjaavat Solujen migraation riippumaton RhoGDI sitovia.

Keskustelu

Aikaisemmat havainnot ovat osoittaneet, että joko tyrmäyksellä tai knockdovvn XIAP laski HCT116 solumigraatioon ja invaasiota [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme kunhan rakenteellinen XIAP sen sääntelytehtävistään syövän etäpesäkkeiden. Tuomalla eri XIAP verkkotunnuksia XIAP

– /- solut, meidän työ osoitti, että RING verkkotunnus eikä BIR verkkotunnuksen vaadittiin β-Actin ilme, solujen vaeltamiseen sekä RhoGDI vuorovaikutusta. E3 ligaasiaktiivisuus RING domain osaltaan kaksi ensimmäistä vaikutuksia, mutta ei ollut osallisena RhoGDI sitova eikä sen ubiquitinational muutos, mikä osoittaa, että asema XIAP säätelyssä solun liikkuvuudessa irtautui sen kaspaasi-estäviä ominaisuuksia, mutta jotka liittyvät sen RING toiminto, joka johtui osittain fyysisen vuorovaikutuksen RhoGDI (Fig. 7D).

haavan määrityksessä, huomasimme, että reconstitutive ilmentyminen täyspitkän HA-XIAP ja HA-XIAP ΔBIR, jotka molemmat ovat RING domain, osaksi XIAP

– /- HCT116-solujen palauttaa syövän solun liikkuvuus, kun taas käyttöönotto HA-XIAP ΔRING tai H467A mutantti, joka poisti sen E3-ligaasi-toiminto, eivät osoittaneet selvää palauttamista, mikä osoittaa, että E3-ligaasi aktiivisuus XIAP RING verkkotunnuksen ollut merkitystä in XIAP sääntelyn syövän solun liikkuvuus. Muutoksia β-Actin tasot herättänyt ilmaisemalla eri aloilla XIAP olivat yhdenmukaisia ​​niiden vaikutuksia solujen vaeltamiseen. Tärkein solunsisäinen ”moottori” solumigraation on aktiinisytoskeletonin [37]. Aiemmat tutkimukset ehdotti, että EGF indusoi solumigraation uudelleenjärjestelyistä aktiinisytoskeletonin ja massiivinen kerääntyminen F-aktiini [38]. Meidän tutkimuksissa toimintahäiriö aktiini polymerointi XIAP

– /- solut voidaan pelastaa uudelleen perustuslaillinen ilmentymistä joko täyspitkä HA-XIAP tai HA-XIAP ΔBIR, kun taas yli-ilmentyminen HA-XIAP ΔRING tai H467A osoitti mikään näitä täytteitä. Yhteisymmärryksessä havainnoistamme, Mehrotra n julkaisematon myös ylistämä, että E3-ligaasi aktiivisuus XIAP oli kriittinen sääntelytehtäviin solun etäpesäke perustuu havaintoon, että H467A XIAP mutantti ei synergoida surviviinille stimuloiva NFKB-riippuvaisen reitin [24]. Siksi oli selvää, että toiminta XIAP säätelyyn solumigraation oli riippuvainen sen E3 ligaasin aktiivisuuden RING verkkotunnus eikä siihen liittyviä sen antiapoptoottisia potentiaaleja.

On ehdotettu, että asema IAP: t solun motiliteetti voi olla evolutiivinen säilyneitä koska

Drosophila

IAP-homologi DIAP1 on ollut mukana solujen vaeltamiseen ja morfogeneesiin ohjaamalla kuin apoptoottista kaspaasiaktiivisuus [13]. DIAP1 on osoitettu edistävän follikkelin soluja muuttoliikettä munassa kammion aikana

Drosophila

munasolujen muodostumisen eri vaiheisiin kautta säätelevät toimintaa pienten GTPaasi, Rac. Mutaatiot DIAP1 näytteillä vikoja solumigraation todennäköisesti muutosten vuoksi aktiini-riippuvaisten solujen organisaatio [13], joka oli varsin samanlainen, mitä me havaittu XIAP

– /- solut nykyisessä tutkimuksissa. Pieni GTPaasit pelata tärkeitä tehtäviä lukuisia solu- tapahtumia, kuten säännellä rihmamaisia ​​aktiini järjestelmiä [39]. Rho perhe GTPaasit toimia molekyylikytkiminä pyöräilyn välillä aktiivinen BKT-sidottu muodossa sytosoliin ja aktiivisen GTP sitoutuneena sytoplasmassa kalvo [40]. RhoGDI luonnehdittiin alas-säätelijä Rho GTPaasit kopioimalla ne kalvot ja liuottavan ne sytosoliin. RhoGDI voi myös vuorovaikutuksessa kytkimen alueiden GTPaaseja ja rajoittaa saatavuutta GEFs ja puutteet niin pitää GTPaasina toimimattomassa valtioissa [39]. Kuten raportoitu täällä, XIAP pystyi fyysisesti vuorovaikutuksessa RhoGDI ja estää sen toiminnan säätelyssä aktiinisytoskeletonin kokoonpano. Joten kun XIAP oli hyvin ilmaisi, RhoGDI aktiivisuus tukahdutettiin joka tarjosi selityksen havaintojen kaatamalla RhoGDI WT HCT116-solut eivät vaikuta haavan korko alkaen RhoGDI aktiivisuutta jo on estyy XIAP, kun taas XIAP

– /- solujen jossa tukahduttava vaikutus RhoGDI aktiivisuus oli mitätöimisestä RhoGDI kaatamalla näytteillä paljon selvempää biologisia vaikutuksia.

lisäksi tutkimuksemme ovat osoittaneet, että RING domain (XIAP ΔBIR), mutta ei BIR verkkotunnuksia (XIAP ΔRING ), voisivat toimia immunosaostaa immunokompleksiin käyttäen spesifistä vasta vastaan ​​GFP-RhoGDI. Vaikka E3 ligaasiaktiivisuus RING verkkotunnuksen osoitettiin vaaditaan solujen vaeltamiseen, heikentynyt sen toiminnon H467A mutaatio ei vaikuttanut vuorovaikutus RhoGDI. Joten se hypoteesi, että lisäksi RhoGDI, saattaa olla muita alavirtaan tavoitteita E3 ligaasin aktiivisuuden XIAP kontrolloivat solun liikkuvuus, kuten NFKB [24] tai joitakin un-tutkitut tekijät. Vaikka E3 ligaasin aktiivisuuden XIAP osaltaan autoubiquitination of XIAP itsensä ja ubikitinaatio sen sitoutumispareja kuten Smac ja AIF, RhoGDI ei alistettiin ubikitiinipromoottori konjugaation vaikka XIAP yliekspressoitui.

Kokoa, nykyinen tutkimukset paljastivat että E3-ligaasi aktiivisuus XIAP RING verkkotunnuksen osaltaan aktiini polymerointi, solun tukirangan muodostumista ja solujen vaeltamiseen. Vaikka RING verkkotunnuksen vaadittiin RhoGDI vuorovaikutuskeinoja välittämän solujen motilities, sen E3 ligaasiaktiivisuus ei ollut mukana RhoGDI sitovia tai ubiqutination. Vaihtoehtona molekyylitason perustan sen E3 ligaasiaktiivisuus on vielä täysin selvitetty.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit

Plasmidit ilmentävät HA-tagged XIAP, HA-XIAP ΔRING, HA-XIAP ΔBIR, HA-XIAP H467A ja pEBB-HA ilmaisun tyhjän vektorin, oli lahja Dr. Colin S duckett (University of Texas at Austin, Austin, TX) [16]. pEGFP-C3 /RhoGDI ilmentävää vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) hännitetty RhoGDI ja Rac1 luovutti ystävällisesti Dr. Mark R. Philips (New York University School of Medicine, New York, NY, USA). pRNA-U6 /siRhoGDI ja pEGFP-C3 /mRhoGDI (RhoGDI geeni mutatoitiin 403-AAA GGC GTC AAG ATT GAC-420 403-AAG GGA GTA AAA ATC GAT-420 estää tuhoutuminen eksogeenisen mRNA vastaavilla siRNA) oli Dr. BL Zhang kuten aiemmin on kuvattu [36]. Ihmisen XIAP ja RhoGDI shRNA plasmidit ostettiin Open Biosystems (Pittsburgh, PA).

Soluviljely ja transfektio

Villityypin ja XIAP

– /- HCT116-solut (ihmisen paksusuolen syöpä solulinjoja) olivat ystävällisiä lahjoja tri Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute ja Sidney Kimmel Kattava Cancer Center, The Johns Hopkins Medical toimielimet, Baltimore, MD) [37]. WT ja XIAP

– /- HCT116-soluja viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Nova-Tech, Grand Island, NE), ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Life Technologies , Grand Island, NY). Cell transfektiot suoritettiin Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen) tai Fugenea® HD Transfection Reagent (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Stabiilia transfektiota, viljelmät altistettiin hygromysiini B tai G418 tai puromysiini (Life Technologies) lääkkeen valinta, ja solujen elossa päässä antibioottivalikoinnin yhdistettiin yhtä vakaa massa transfektantit. Nämä stabiilit transfektantit viljeltiin sitten valitun antibiootin-väliaineessa ainakin kaksi kohtaa ennen käyttöä kokeissa.

haavan paraneminen Määritys

Solut ympättiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevyille ja viljellyt kunnes 80% konfluenssiin. Haavat tehtiin steriilillä pipetillä vinkkejä. Solut pestiin seerumittomalla PBS: llä ja sitten viljeltiin normaalissa väliaineessa eri ajankohtina. Kuvat otettiin joka 24. tunti, kunnes haava oli parantunut emosoluilta [41]. Haava-alue kvantifioitiin käyttäen Cell Migration Analyysiohjelmisto (Muscale LLC, Scottsdale, AZ).

Cell invaasiomääritys

BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion jaosto (BD Biosciences, San Diego, CA) käytettiin invaasiomääritys. Solut (2,5 x 10

4) ympättiin per insert kolminkertaisena 500 ul seerumittomalla McCoyn 5A väliaineessa. Insertit pantiin kuoppiin, jotka sisältävät 500 ui väliainetta, jossa 5% FBS: ää ja TPA (20 ng /ml). Soluja inkuboitiin 72 tuntia inkubaattorissa 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. Sitten solujen yläpintaan suodattimet ensin kuvassa ja sitten kokonaan poistaa pyyhkimällä pumpulipuikolla. Kalvo leikataan terävällä veitsellä ja laitettiin 96-kuoppalevylle.