Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdunkaulan syöpä on yksi yleisimmistä syövistä naisilla maailmanlaajuisesti, että riskiryhmään HPV tartunnan, johtava etiologinen tekijä. RAF-kinaasia inhiboiva proteiini (RKIP) on liittynyt kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden useissa ihmisen kasvainten kuitenkin sen roolia kohdunkaulan syöpä on epäselvä. Esillä olevassa tutkimuksessa, 259 kohdunkaulan kudoksissa, mukaan lukien kohdunkaulan, kohdunkaulan epiteelin sisäinen leesioita ja karsinoomat, analysoitiin RKIP ekspressiota immunohistokemiallisesti. Huomasimme, että RKIP ilmentyminen merkitsevästi väheni pahanlaatuinen etenemisen, on erittäin ilmaistaan ​​ei-neoplastisten kudosten (54% näytteistä, 73/135), ja ilmaisi alhaisilla tasoilla kohdunkaula invasiivisia karsinoomia (-15% (19/124 ). sen jälkeen

in vitro

downregulation of RKIP, havaitsimme elinkelpoisuutta ja proliferatiivista etu RKIP inhiboimatonta soluissa ajan, joka liittyi muuttuneeseen solukierron jakelu ja suurempi siirtomaa numeron pesäkemuodostusta.

in vitro

haavojen testi osoitti, että RKIP kumota liittyy lisääntynyt muuttavien ominaisuus. RKIP downregulation myös liittyy lisääntynyt vascularization kasvainten

in vivo

käyttäen CAM-määritystä. lisäksi RKIP esto aiheuttama kohdunkaulan syöpäsolujen apoptoottisen vastustuskykyä sisplatiinihoitoon. Lopuksi me kuvaili RKIP proteiini merkittävästi tyhjentynyt aikana pahanlaatuinen etenemistä kohdunkaulan kasvaimia. puutteesta huolimatta yhdessä potilaan kliinisistä tuloksista, osoitamme,

in vitro

ja

in vivo

, että menetys RKIP ilmaisun voi olla yksi niistä tekijöistä, jotka ovat takana aggressiivisuus, pahanlaatuinen etenemistä ja kemoterapia vastus kohdunkaulasyövän.

Citation: Martinho O, Pinto F , Granja S, Miranda-Gonçalves V, Moreira MAR, Ribeiro LFJ, et al. (2013) RKIP esto in Kohdunkaulan syöpä liittyy Higher Kasvain aggressiivista käyttäytymistä ja kestävyys sisplatiinihoidon. PLoS ONE 8 (3): e59104. doi: 10,1371 /journal.pone.0059104

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia

vastaanotettu: 23 marraskuu 2012; Hyväksytty: 11 helmikuu 2013; Julkaistu: 19 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Martinho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain jota Portugalin Fundação para a Ciência e Tecnologia (myöntävät PTDC /SAU-TOX /114549/2009). Olga Martinho ja Sara Granja olivat vastaanottajat PhD apurahoja (SFRH /BD /36463/2007 ja SFRH /BD /51062/2010, vastaavasti), ja Filipe Pinto ja Vera Miranda-Gonçalves oli vastaanottajat tutkimusapurahoja (UMINHO /BI /016 /2011 ja SFRH /BI /33503/2008, vastaavasti), niin FCT, Portugali. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä ja neljänneksi suurin syy syövän kuoleman naisilla maailmanlaajuisesti, mikä on 9% (529,800) koko uutta syöpätapausta ja 8% (275,100) koko syöpäkuolemista naisten keskuudessa vuonna 2008 [1]. Pysyvät infektio korkean riskin tyyppejä ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on

sini-qua-non

edellytys kohdunkaulan syövän kehittymisen. HPV infektoivat epiteelisoluja ja aiheuttavat erilaisia ​​vaurioita vaihtelevat tavalliset syylät ja kohdunkaulan neoplasian ja syöpä [2] – [4]. Kasvaimia kohdunkaula on jaettu kolmeen eri histologisia alatyyppejä: Kohdun okasolusyöpää (SCC) on yleisin, jota seurasi adenokarsinooma (AC) ja adenosquamous karsinooma (ASC), joka on harvinainen alatyypin [5]. HPV-infektio ei yksin riitä laukaisemiseksi kohdunkaulan syövän ja HPV-välitteisen oncogenesis edellyttää myös kertyminen geneettisiä muutoksia, joita tapahtuu seuraavien alkuperäinen infektio [6]. Se voi kestää useita vuosia varten

in situ

kasvain edetä invasiivisen karsinooman. Mekanismi klonaalisen kehittyminen, johon liittyy solujen valinnan invasiivista tai metastaattinen potentiaali, on myös edelleen ratkaisematta.

Raf-kinaasia inhiboiva proteiini (RKIP; tunnetaan myös nimellä PEBP1, ja fosfatidyylietanoliamiinia sitova protein1), kuten on esitetty nimi, tunnistettiin ensin endogeeninen estäjä RAF /MEK /ERK-reitin, estämällä Raf-1 aktivointi [7] – [9]. Itse asiassa, RKIP on liitetty eri solunsisäiset signaalireitit, jotka ohjaavat solujen kasvua [10], [11], liikkuvuuteen [12], [13], epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) [14] ja erilaistumista [15]. RKIP ilmentyy laajalti normaaleissa ihmisen kudoksissa, korostaen sen rooli erilaisissa fysiologisissa prosesseissa [16], mutta pidetään aggressiivisuutta vähentävänä syövässä [17], että sen menetys tai pienentää ilmentymisen liittyvä maligniteetti ja ennusteen monenlaisissa metastaattisen ja aggressiivinen syövät [10], [11], [18] – [34].

Aiemmassa tutkimuksessa on, tehdään pieni osa potilaista, saapuvat ilmaisu mikrosiruanalyysillä että RKIP on yksi geenien ilmentyy differentiaalisesti välillä kasvaimen näytteitä kohdunkaulan syövän potilaille, joilla on tai ei ole imusolmuke etäpesäke [35]. Viime aikoina, todettiin suuri joukko potilaita, jotka RKIP proteiini on merkittävästi vaimentua kohdunkaulan syövän ja imusolmuke etäpesäke [36]. Lisäksi toinen tutkimus HeLa kohdunkaulan syöpäsolut osoittivat RKIP kautta sääntely ERK-reitin, on tärkeä rooli mitoosi tarkistuspiste asetuksessa [37]. Näin ollen aiempien tulosten, sai meidät selvittää biologisen roolin RKIP kohdunkaulan syövän maligni kehittyminen ja kemoterapia vasteen. Siksi meidän ensimmäinen arvioi ekspressiotasot RKIP proteiinin sekä ei-pahanlaatuisia ja kasvainten kohdunkaulan näytettä, ja arvioi sen rooli kliininen tulos kohdunkaulan syöpäpotilailla. Toiseksi arvioitiin

in vitro

ja

in vivo

biologisen toiminnan RKIP downregulation kohdunkaulan syövän maligniteetti ja kemoterapiaa vastausta.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue Näytteet

Tässä työssä, 259 kohdunkaulan kudokset analysoitiin, joka sisälsi 45 kohdunkaulan, 47 heikompilaatuisen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia vauriot (LSIL), 43 korkea-asteen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia vauriot (HSIL), 70 okasolusyöpää (SCC), 41 adenokarsinoomat (AC) ja 13 adenosquamous karsinoomat (ASC) (taulukko 1). Parafiini sisältävät näytteet kohdunkaulan ei-pahanlaatuisten vaurioiden haettiin tiedostot patologian jako Adolfo Lutz Institute São Paulo, Brasilia, ja invasiivisen kohdunkaulan kasvain näytteet noudetaan Araújo Jorge Hospital ja School of Medicine of Federal University of Goiás (Goiânia, Goias valtion, Brasilia). Histopatologisten diagnoosit tarkistettiin tekijät ja luokitellaan sen mukaan, WHO: n luokituksen. Kaikki potilaat, joilla kohdunkaulan syöpä oli naisia ​​brasilialaista alkuperää, joiden keski-ikä oli 49 vuotta (vaihteluväli 23-74 vuotta). Seurantatietoja oli käytettävissä 72 potilasta, ja kerätään suoraan haastattelussa potilaiden tai heidän omaisilleen, ja tarkastelu sairaalassa potilaan tiedostoja. Mediaani seuranta-ajan (kokonaiselossaoloaika) oli 35,5 ± 42,0 kuukautta (vaihteluväli 2-144 kuukautta).

Kaikki näytteet ilmoittautunut tässä tutkimuksessa olivat linkitys ja tunnistamattomia niiden luovuttajilta. Johtuen taannehtivuus saakka, mitään kirjallista suostumus potilailta saatiin. Paikallinen eettinen Review valiokunnat osallistuvat toimielimet (eettinen komitea Human Research Adolfo Lutz Institute São Paulo ja Araújo Jorge sairaalan School of Medicine liittovaltion yliopiston Goiás, Brasilia) hyväksyi työ ja luopua tarvetta kirjallinen suostumus .

solulinjat

Tässä tutkimuksessa sitä käytettiin kolmea kohdunkaulan sinoomasolulinjoja: HeLa-solulinja, jonka toimitti ystävällisesti Dr.

Elsa Logarinho (IBMC, Portugali) [38] , SiHa ja C-33A solulinjoja, jotka ystävällisesti toimitti Dr.

Luisa Villa (INCT-HPV, Brasilia) [39]. Kaikki solulinjat kasvatettiin ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM 1 x, korkea glukoosi, Gibco, Invitrogen), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco Invitrogen ) ja 1% penisilliini /streptomysiiniliuosta (Gibco, Invitrogen) (DMEM-10).

Drugs

Sisplatiini (cis-Diammineplatinum (II) dikloridia) saatiin Sigma-Aldrich ja laimennettu 0,9% NaCl kantaliuosta 10 mM. Lääke myöhemmin valmistettiin, kuten välitetyn laimennoksia saada yhtä suuri määrä lääkeainetta ajoneuvon (1% loppukonsentraatio) kussakin tutkituissa olosuhteissa. Kaikissa koeolosuhteissa lääkkeet laimennettiin 0,5% FBS kulttuuri (DMEM-0,5).

immunohistokemia ja Immunosytokemia analyysi RKIP

Histologinen diat 4 pm paksu kudosleikkeiden alistettiin immunohistokemiallinen analyysi mukaan streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin järjestelmän (UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP, LabVision Corporation), käyttäen ensisijaisena vasta-ainetta vastaan ​​RKIP (Millipore, viite 07-137) laimennettuna 1:600, inkubointi 1 H at RT, kuten aiemmin on kuvattu [18], [25], [40], [41].

Osiot pisteytettiin kaksoissokkoutettu varten sytoplasmaattinen ilmaisun jälkeen puolikvantitatiivinen kriteeri: (

–

), 0% immunoreaktiivisia soluja; (+),

5% immunoreaktiivisia soluista; (++), 5-50% immunoreaktiivisia soluja; ja (+++),

50% immunoreaktiivisia soluista. Näytteitä pistein (

–

) ja (+) katsottiin negatiivinen, ja ne, joilla tulokset (++) ja (+++) pidettiin positiivisina.

RKIP immunosytokemiallisessa analyysi kohdunkaulan sinoomasolulinjoja, solut maljattiin lasipeitinlevyille laitettiin 12-kuoppalevyille, ja annettiin kiinnittyä yön yli. Immunosytokemia menettely suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [41].

Generation of shRKIP, jotka ilmentävät stabiilisti Cell Lines

sukupolven solulinjojen, jotka ekspressoivat stabiilisti shRKIP, käytimme PQY15 vektori, joka sisältää 19 bp shRNA varten RKIP, kuten aiemmin on kuvattu [37], [41], [42]. Transfektio tehtiin käyttämällä Fugene HD-reagenssia (Roche), kuten valmistajan suosittelemia, 2 ug plasmidia suhteessa 06:02 (Reagent: Plasmidi). Solut (2 x 10

5) maljattiin 12-kuoppalevylle, kunnes 80% konfluenssiin ja transfektoitiin DMEM ilman FBS tai antibiootteja Lisäksi 24 tunnin aikana [41]. Sen jälkeen, vakaa transfektantit valittiin 0,5 ug /ml (HeLa) tai 2 ug /ml (C-33A ja SiHa) puromysiiniresistenssin DMEM-10. Tyhjä vektori transfektoitiin myös kontrollina.

Western blot -analyysi

Soluja levy 6 kuoppaiseen levyyn tiheyteen 8 x 10

5 solua kuoppaa kohti, ja sen annettiin noudattamaan vähintään 24 tunnin ajan. Soluja seerumia 6 tuntia ennen proteiinien eristämiseksi. Kun on tarpeen, solut stimuloitiin myös 10 ng /ml EGF: ää 10 minuuttia ennen loppua 6 tuntia nälkään. Myös Sisplatiiniannos kokeissa solut altistettiin eri pitoisuuksia sisplatiinin vielä 24 tunnin ajan DMEM-0.5. Solut kaavittiin kylmässä PBS: ssä ja lyysattiin puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris, pH 7,6-8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM NaPyrophosphate, 1% NP-40 ja 1/7 proteaasi cocktail-inhibiittorit (Roche). Western blottaus tehtiin käyttämällä standardia 12% SDS-PAGE-geelissä, lastaus 20 ug proteiinia kaistaa kohti, detektiolla tehostetun kemiluminesenssin (SuperSignal West Femto Suurin herkkyys Substrate, Pierce). RKIP ilmentyminen mitattiin käyttämällä spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​RKIP (laimennus 1:2000, Upstate Biotechnology). Aktivoitu ERK ja EGFR arvioitiin käyttäen vasta-ainetta fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) ja fosfo-EGFR (Y1068) (laimennus 1:1000, Cell Signaling Technology). Yhteenlaskettu muoto ERK ja EGFR arvioitiin myös vasta-aineiden kanssa p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (klooni 137F5, laimennus 1:1000, Cell Signaling Technology) ja EGFR (laimennus 1:500, klooni 31G7, ZYMED Laboratories). Apoptoosin arviointi sitä käytettiin vasta-aineita lohkaistaan ​​PARP (klooni Asp214, laimennus 1:1000, Cell Signaling Technology), pilkotaan kaspaasi-9 (klooni Asp330, laimennus 1:1000, Cell Signaling Technology) ja PARP (laimennus 1:1000, Cell Signaling Technology). Lastaus- ohjaus käytimme β-Tubulin (klooni AA2, laimennus 1:5000, Upstate Millipore). Kaikki primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin yhden tunnin ajan RT: ssä.

blotit havaitseminen tehtiin kemiluminesenssin (ECL Western Blotting Detection Reagents, RPN2109, GE Healthcare) in ImageQuant ™ LAS 4000 mini (GE Healthcare) tai käyttämällä X100 Hyperfilm ECL (Amersham, GE Healthcare).

elinkykyyn ja lisääntymismääritykset

solut maljattiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena tiheydellä 3 x 10

3 solua per kuoppa ja annetaan kiinnittyä yön yli DMEM-10. 6 tunnin seerumistarvaatio elinkykyisten tai lisääntyvät solut kvantitoitiin käyttämällä Cell Titer96 Aqueous soluproleferaatiomäärityksessä (Promega) tai solun lisääntymis- ELISA, BrdU (kolorimetrinen, Roche Applied Science) ja käytettiin aika 0 arvo. Sitten soluja inkuboitiin DMEM-alustassa ilman seerumia aikana 24, 48 ja 72 tuntia ja solujen elinkelpoisuus ja proliferaatiota jälleen arvioitiin Cell Titer96 Aqueous soluproleferaatiomäärityksessä ja Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolorimetrinen), vastaavasti. Tulokset kalibroitu lähtöarvoihinsa (aika 0 h, pidetään 100% elinkelpoisuuden /leviämisen) ja ilmaistiin keskiarvona ± SD. Määritys tehtiin kolmena kappaleena vähintään kolme kertaa.

määrittää pitoisuus, jossa 50%: n solujen kasvu estyy sisplatiinihoitoon (IC

50 pitoisuus), solut maljattiin 96- kuoppaisille levyille tiheydellä 3 x 10

3-5 x 10

3 solua per kuoppa, ja annettiin kiinnittyä yön yli DMEM-10. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla lääkkeen laimennettu DMEM-0,5. 48 tunnin jälkeen solujen elinkykyisyys määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen Cell Titer96 vesiliuosta soluproleferaatiomäärityksessä (MTS) (Promega). Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD elävien solujen suhteellisen huumeiden pelkästään vehikkeliä (katsotaan 100% elinkelpoisuuden). IC

50 pitoisuus on laskettu epälineaarinen regressioanalyysillä GraphPad Prism-ohjelmiston.

haavan paraneminen migraatiokokeessa

Solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja viljeltiin vähintään 95% of yhtymäkohta. Yksikerroksinen solut pestiin PBS: llä ja raaputettiin muovinen 200 ui pipetin kärjen ja inkuboitiin sitten tuoreella DMEM-väliaineella ilman seerumia. ”Haavoittunut” alueet valokuvattiin faasikontrastimikroskopiassa 12, 24 tai 48 tunnin ajankohtina. Suhteellinen vaellusetäisyydet on laskettu seuraavalla kaavalla: prosentuaalinen osuus haavan (%) = 100 (A-B) /A, jossa A on leveys solun haavojen ennen inkubaatiota, ja B on leveys solun haavojen inkubaation jälkeen [ ,,,0],41]. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Määritys tehtiin kolmena kappaleena vähintään kolme kertaa.

Cell Cycle Analysis

Solut maljattiin 6-kuoppaiseen levyyn tiheydellä 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja annetaan kiinnittyä yön yli. 6 tunnin kuluttua seerumin nälkään soluja inkuboitiin tuoreella DMEM-väliaineella ilman seerumia 24 tunnin ajan. Solut tripsinized ja kiinnitettiin 70% etanolilla vähintään 30 minuuttia ja sitten värjättiin 1 tunnin ajan 50 ° C: propidiumjodidilla (PI) (20 ug /ml PI: n ja 250 ug /ml RNAasi liuoksessa, jossa on 0,1 % Triton X-100 PBS: ssä). Solusyklianalyysiä PI värjättyjen solujen suoritettiin virtaussytometrialla (LSRII, BD Biosciences). Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin ohjelmiston FlowJo version 7.6.3. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD prosenttiosuus soluja G1 vaiheessa tai G2 /M-plus S-vaiheessa [41]. Määritys tehtiin kolmena kappaleena vähintään kolme kertaa.

Soft Agar Colony muodostumisen määritys

pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys tehtiin käyttäen standardimenetelmiä, kuten aikaisemmin on kuvattu meidän [43]. Lyhyesti, 1 ml pohjustuskerrosten (base agar kerrosta), joka koostuu 0,6% agar-alustalla, valmistettiin 6-kuoppaisille levyille yhdistämällä yhtä suuret määrät 1,2% Noble-agaria, jossa joko 2 x DMEM 20% FBS: ää. Solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin, ja ressuspended vuonna 0,35% agaralustalla (ylin agarkerros; yhtä suuret tilavuudet 0,7% Noble-agaria ja 2 x DMEM 20% FBS); 2 x 10

3-solut maljattiin sitten aikaisemmin valmistettu pohja agar kerroksia. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-atmosfäärissä 15 päivää, ja muodostuneiden pesäkkeiden värjättiin 0,05%: violetti kide 15 minuuttia. Stained pesäkkeet valokuvattiin käyttäen stereomikroskoopin (Olympus S2 × 16) ja digitaalinen kamera (Olympus DP71) ja laskettiin Image J ohjelmisto. Vain pesäkkeet, joiden koko on yli 775 um

2 (noin 31,4 um halkaisijaltaan) laskettiin [43]. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Määritys tehtiin kolmena kappaleena vähintään kolme kertaa.

Chick rakkokalvon (CAM) määritys

arvioimiseksi

in vivo

kasvaimen leviäminen ja angiogeneesin käytimme CAM-määritystä aikaisemmin on kuvattu [41], [43]. Hedelmöittynyt kananmunissa inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 70%: n kosteudessa, ja päivänä 3 kehitystä, ikkunan tehtiin kuoreen, joka suljettiin teipillä, ja munat palautettiin inkubaattoriin. Päivänä 9 kehitystä, pieniä muovisia renkaita asetettiin CAM ja 10. päivänä kehityksen 3 x 10

6 solua, suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan DMEM-alustassa, injektoitiin renkaat yli CAM. Päivänä 17 kehitys, kasvain muodostunut valokuvattiin

in ovo

käyttäen stereomikroskoopin (Olympus S2 x 16), ja kehä kasvaimen mitattiin Cell B ohjelmistoa (Olympus). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

Lopuksi kananmunia lopetettiin -80 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja CAM ja kasvaimet kiinnitettiin paraformaldehydillä 4% ja valokuvattiin

ex ovo

verisuonia laskentaa. Kasvaimet upotettiin parafiiniin ja käsitellään histologista analyysiä.

Tilastollinen analyysi

väliset korrelaatiot RKIP ilmaisun ja kliiniset tiedot potilaista suoritettiin käyttäen chi-neliö testi (χ2-testi). Kumulatiivinen selviytyminen todennäköisyydet laskettiin käyttäen Kaplan-Meier-menetelmällä. Erot eloonjäämisprosentti testattiin log-rank-testi. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SPSS Windowsille, versio 17.0. Sillä

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä, single vertailuja eri tutkituissa olosuhteissa tehtiin käyttäen Studentin t-testiä, ja ryhmien välisiä eroja testattiin käyttämällä kaksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA) . Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä Graph Pad Prism versio 5. taso merkitys kaikissa tilastollinen analyysi asetettiin p 0,05.

Tulokset

RKIP ilmentäminen Kohdunkaulan kudokset

immunohistokemiallista lähestymistapa tehtiin havaitsemaan RKIP proteiinin ilmentymistä ja jakelu kohdunkaulan solumuutoksia (Fig. 1).

) Positiivinen ilmentymistä kohdunkaulan. B) Korkeatasoinen levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia vaurion negatiivinen ilmaus. C) Adenokarsinooma kudos kuvaa positiivinen ilme. D) Negatiivinen adenokarsinooma (*), jonka vieressä on normaalit solut (nuoli) kuvaa positiivista värjäytymistä. Kaikki kuvat otettiin 200 x suurennus.

sytoplasmaattinen positiivinen ilmaus RKIP havaittiin 64,5% (29/45) ja kohdunkaulan näytteistä, vuonna 44,7% (21/47) ja LSIL ja 53,5% (23/43) ja HSIL (taulukko 1) (Fig. 1A ja B). Merkittäviä eroja ei havaittu ekspressiotasot RKIP välillä LSIL ja HSIL (

p

= 0,404), ja myös välillä kohdunkaulan ja squamous intraepiteliaalisten vaurioita (SIL) yleisesti (

p

= 0,087 ), Pöytä 1). Koskevat pahanlaatuinen vaurioita, RKIP oli läsnä alhaisilla tasoilla, vain 19,5% (8/41) AC, 12,9% (9/70) SCC ja 15,4% (2/13) ASC kuvaa positiivista värjäytymistä (taulukko 1) ( kuva 1C ja D). Merkittäviä eroja ei havaittu RKIP ilmaisun eri pahanlaatuinen vauriot tutkitaan (

p

= 0,643, taulukko 1). Kuitenkin, kun ryhmittely hyvänlaatuinen vaurioita (kohdunkaulan ja SIL) ja pahanlaatuinen vauriot (AC, SCC ja ASC), tilastollinen merkittävä lasku RKIP ilmentymistä havaittiin kohdunkaulan syövän näytteissä (

p

0,001), kun verrattuna hyvänlaatuinen vauriot (taulukko 1).

Ei yhteyttä ei havaittu välillä RKIP ilmaisun ja kliinisiä piirteitä potilaiden, kuten ikä, läsnäolo etäpesäkkeitä ja seurantatietoja, riippumatta histologinen tyyppi (p 0,05, taulukko 2).

RKIP Expression ja modulaatio ERK Pathway in kohdunkaulan syöpä Solulinjat

roolin tutkimiseksi RKIP kohdunkaulan syövän, ensin seuloa RKIP ilmentymistä ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjoista (HeLa, SiHa ja C-33A) immunosolukemiallisella ja western blot (kuvio. 2). Olemme havainneet, että RKIP ilmentyy korkeilla tasoilla kaikissa solulinjoissa, ja sitä on läsnä sekä sytoplasmassa ja tumassa solut (Fig. 2A), kuten on jo kuvattu, ennen kuin [37]. Kaikki solulinjat käytettiin pudotus ilmentymistä RKIP vakaa transfektoimalla PQY15 vektorilla, joka sisältää lyhyen hiusneulan RNA RKIP (shRKIP). Tyhjä vektori transfektoitiin myös kontrollina. RKIP proteiinin tasot näissä vakaa transfektoiduissa soluissa määritettiin Western blot -analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, RKIP proteiinin tasot on tehokkaasti estyy shRKIP transfektoiduissa soluissa verrattuna tyhjän vektorin transfektoiduista soluista.

A) Immunosytokemia analyysi RKIP HeLa, SiHa ja C-33A-solut osoittavat sekä ydin- ja sytoplasmiset ilmaisun. B) RKIP inhibition, solulinjat transfektoitiin stabiilisti kanssa shRNA varten RKIP ja vastaavien tyhjän vektorin valvontaa. RKIP ekspressiotasot arvioitiin western blot. Lisäksi soluja stimuloitiin 10 ng /ml EGF 10 minuutilla ja EGFR ja ERK aktivointi (fosforylaatio) määritettiin western blot varten fosfo-ERK1 /2 ja fosfo-EGFR, mutta ei havaittu merkittäviä eroja. E: Tyhjä vektori; Sh: ShRKIP.

tutkia roolia RKIP moduloinnissa EGR kannustanut ERK signalointi kohdunkaulan syövän, transfektoituja soluja stimuloitiin EGF, ja EGFR ja ERK-fosforylaation tasoja arvioitiin western blot . Kuten voidaan havaita kuvassa. 2B, EGF stimulaatio ei johtanut merkittäviä vaikutuksia aktivointi ERK signalointi näissä soluissa riippumatta RKIP tila.

rooli RKIP ilmentäminen Kohdunkaulan syöpä Cell Lines Biological Behavior

arvioimiseksi onko modulaatioon RKIP ilmaisun vaikutti kasvaimia solujen ominaisuuksia, valitsimme solulinja korkein RKIP inhibition shRKIP, HeLa- ja mitataan

in vitro

elinkelpoisuuden, leviämisen, ankkurointi riippumaton kasvu ja muuttoliike valmiuksia (Fig. 3). Havaitsimme, että shRKIP transfektoidut solut on merkittävä elinkelpoisuuden etu ajan (Fig. 3A), verrattuna tyhjällä vektorilla transfektoidut solut (p 0,05). Tämä ero voi olla heijastusta lisääntynyt solujen määrä tai se voi heijastaa lisääntynyttä solujen aineenvaihduntaan. Jos haluat nähdä, onko tämä elinkelpoisuus etu johtui leviämisen hinnat, tutkimme vaikutus RKIP on BrdU, solusyklin jakelu ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. BrdU määritys, vahvisti, että shRKIP transfektoiduissa soluissa on merkittävä proliferatiivinen etuna ajan (Fig. 3B). Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen määrityksessä osoitti merkittävän (p 0,05) määrä kasvaa pesäkkeiden muodostettu shRKIP transfektoiduissa soluissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 3C). By solusyklin analyysi, havaitsimme, että shRKIP transfektoiduissa soluissa oli alentunut G0 /G1 vaiheeseen, jossa on samanaikaisia ​​merkittäviä (p 0,05) kasvu G2 /M + S vaiheessa (Fig. 3d). Nämä tulokset edelleen vahvistettu kahden muun transfektoituja solulinjoja, SiHa ja C-33A (Fig. S1A-D).

A) Cellular elinkelpoisuus ja B) Lisääntyminen mitattiin 24, 48 ja 72 tunnin MTS ja BrdU määrityksissä, vastaavasti. RKIP esti soluilla oli tilastollisesti merkitsevä elinkelpoisuutta ja proliferatiivinen etuna ajan, verrattuna kontrollisoluihin. C) Soluja analysoitiin niiden kyky lisääntyä kasvualustaan, joka sisälsi 0,35% agaria ja muodostumista monisoluisten pesäkkeiden kuvattuna x16 suurennusta sen jälkeen, kun 14 päivää. RKIP esto indusoi tilastollisesti merkittäviä kiinnittymisestä riippumaton kasvu HeLa-solujen pehmeässä agarissa. D) alassäätely RKIP HeLa-soluissa indusoi siirtyminen solusyklin jakautuminen tilastollisesti merkitsevä suurempi osuus solujen G2M + S vaiheessa verrattuna hallita soluihin. Solusyklin analyysi tehtiin 24 tunnin kuluttua pisteen virtaussytometrianalyysin propridium jodidi värjättyjen solujen. E) Standardoitu tyhjästä (haava) levitettiin yksisolukerroksiin ja digitaalisia kuvia otettiin useissa ajankohtina (0, 12, 24 ja 48 tuntia). Havaittiin, että shRKIP transfektoidut solut oli tilastollisesti merkittävät siirtymisen etuna ajan, verrattuna kontrollisoluihin (oikea paneeli). Kuvat ovat 0 ja 48 tuntia on esitetty vasemmassa paneelissa. Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina vähintään kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD ja erot

p

0,05 on kaksisuuntaista ANOVA tai opiskelijan t-testin katsottiin tilastollisesti merkitsevä (*).

Lopuksi , käsitellä vaikutus RKIP HeLa-soluissa muuttoliike, suoritimme haavojen migraatiokokeessa ja totesi, että shRKIP transfektoiduissa soluissa oli muuttoliike etu ajan, joilla on merkittävä (p 0,05) korkeampi haavan verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 3E). Sama havaittiin kaksi muuta transfektoituja solulinjoja, SiHa ja C-33A (Kuva. S1E-F).

In vivo

rooli RKIP Expression kohdunkaulan syövän kasvua ja Angiogeneesi

vaikutuksen tutkimiseksi RKIP-välitteistä kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä

in vivo

teimme CAM-määritys (Fig. 4). Transfektoidut solut istutettiin CAM kanan alkion (tyhjä vektori soluihin, n = 10; shRKIP soluja, n = 10), ja seitsemän päivän kuluttua soluistutusryhmä, kanan alkiot lopetettiin arvioida tuumorin kasvu ja angiogeneesi, kuten on kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä osassa. Keskimääräinen kehä kasvainten muodostaman ohjaus ja shRKIP transfektoituja soluja oli 4335 ± 823 um ja 4913 ± 1568 um, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, koko kasvainten muodostettu shRKIP soluja ei ollut merkittävästi korkeampi verrattuna kasvaimia muodostaman tyhjän vektorin soluihin.

A) edustaja kuvia (16-kertainen suurennus) ja CAM-määrityksessä jälkeen 7 päivää kasvaimen kasvu

in ovo

ja

ex ovo

. B) Kasvaimen kasvu mitattiin

in vivo

CAM-määritys kuvatulla materiaalit ja menetelmät osassa. Havaittiin korkeampi kehä (uM) kasvainten (

in ovo

), joka muodostuu shRKIP soluja, mutta ero kontrollisoluihin ei ollut merkittävä. C) värjäys hematoksyliini-eosiinilla ja parafiiniin kasvaimia osoittaa korkeampi vascularization aiheuttama RKIP inhibition. Edustavia kuvia 10 × ja 20-kertainen suurennus ovat edustettuina vasemmassa paneelissa. D) laskenta verisuonten

ex ovo

, havaittiin tilastollisesti merkitsevä lisäystä alusten määrää palvelukseen kasvaimissa muodostama shRKIP solujen verrattuna kontrolliin. Kaikkiaan se analysoitiin 20 munaa (10 ruiskutettiin tyhjiä vektori ja 10 shRKIP solua). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD ja erot

p

0,05 on t-testiä pidettiin tilastollisesti merkitsevä (*).

vaikutusten arvioimiseksi RKIP angiogeneesissä modulaatio, laskimme

ex ovo

alusten lukumäärä ympärille kasvaimia. Laskimme keskimäärin 54 ± 16 ja 83 ± 10 alusta kasvaimissa muodostaman tyhjän vektorin ja shRKIP transfektoituja soluja, tässä järjestyksessä. RKIP inhiboi solujen paljasti tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05) nousu verisuonissa rekrytointi verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 4D). Kuten on esitetty kuviossa. 4C värjäys hematoksyliini-eosiinilla ja parafiiniin kasvaimia ja CAM: n vahvisti rikas verisuonittumista kasvainten kapillaarien ympärillä kasvain ja kapillaareja itää ulos CAM kasvaimiin. Korkeampia vascularization havaittiin kasvainten muodostama shRKIP transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4C).

rooli RKIP kohdunkaulan syövän solut vastauksena Kemoterapia

Voit selvittää RKIP proteiini voi olla mukana moduloinnissa kohdunkaulan syövän potilaan vastetta tavanomaista kemoterapiaa, määritimme herkkyys kohdunkaulan syövän solulinjat transfektoitiin shRKIP sisplatiiniin hoitoon. Kuten voidaan havaita, että sytotoksiset määritykset (Fig. 5A), kaikki shRKIP transfektoituja solulinjoja olivat vähemmän herkkiä sisplatiinihoitoon, verrattuna kontrolliin solulinjat, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla, joka ero on vähemmän ilmeistä C-33A solulinjassa. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, HeLa-solut, jotka on transfektoitu shRKIP näytetään keskimääräinen IC

50 18,55 ± 2,06 uM vastaan ​​5,91 ± 0,30 uM saavutetaan tyhjän vektorin soluja. C-33A solulinja arvot olivat samanlaisia ​​kahden transfektoituja solulinjoja, 10,37 ± 2,69 uM ja 13,25 ± 1,98 uM tyhjän vektorin ja shRKIP transfektoituja soluja, tässä järjestyksessä (kuvio. 5B). SiHa solulinja oli vähemmän herkkä sisplatiini tyhjällä vektorilla transfektoituja soluja pääsemästä 25,99 ± 0,51 uM keskimääräinen IC

50, kun taas shRKIP transfektoidut solut saavuttivat 40,69 ± 2,37 uM keskimääräinen IC

50 sisplatiinin (kuvio . 5B).

A) edustaja kuvia epälineaarinen regressioanalyysi kohdunkaulasyövän solulinjoissa sisplatiinia määrittämiseen puoleen maksimaalisesta estävät pitoisuudet (IC

50). B) graafinen esitys keskimääräisestä IC

50-arvot sisplatiinin kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Transfektoituja soluja shRKIP olivat vähemmän herkkiä sisplatiinihoitoon kolmessa eri solulinjoissa. C) HeLa transfektoituja solulinjoja altistettiin kasvaville sisplatiinin 24 tuntia. Sisplatiini indusoi ERK aktivointi (p-ERK1 /2), ja apoptoosia solujen arvioituna PARP (kokonais- ja cleaded spesifisten vasta-aineiden) ja kaspaasi-9 pilkkominen, pääasiassa tyhjän vektorin transfektoitujen solujen. Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina vähintään kolme kertaa.