Krooninen sairaus

tiivistelmä

Karsinoomat syntyy monimutkainen mikroympäristön koostuu useita erillisiä epiteelin suvusta ympäröi valikoima peruskudoksen solutyyppejä. Ymmärtäminen syöpä etiologies edellyttää arvioidaan välisiä suhteita solutyyppien aikana tauti aloittamisen ja kautta etenemistä. Geneettisesti hiiren (GEM) mallit helpottaa mahdollinen tutkimisen alussa onkogeenisten tapahtumien, mikä ei ole mahdollista ihmisissä. Koska useimmat kiinteitä kasvaimia satama poikkeamia RB verkossa kehitimme indusoituva GEM lähestymistapa toteamista ja arviointia karsinooman aloittamista monipuolisia epiteelikudosten ja alatyyppejä kun RB-välittämää tuumorisuppressiogeeneksi (RB-TS). Järjestelmä mahdollistaa riippumaton arvio epiteelin alatyyppejä, jotka ilmentävät joko sytokeratiineja (K) 18 tai 19. Cre riippuva proteiinin ilmentymistä, joka vallitsevasti inaktivoi RB ja toiminnallisesti tarpeeton proteiineja p107 ja p130, kasvaimet saattavat aloittaa joko K18 tai K19 ilmentävien solujen lukuisia kudoksia. Suunnittelun, koska vain yksi polku poikkeavuus oli suunniteltu, karsinoomat kehitetty stokastisesti vasta pitkän viiveen. Näin ollen tämä järjestelmä, joka mahdollistaa suunnatun solutyyppispesifiselle karsinooma aloittamista, helpottaa edelleen määrittely tapahtumia, jotka voivat edetä kasvainten aggressiiviseen syövät kautta suunniteltu, karsinogeeni aiheuttama ja /tai spontaaneja.

Citation: Song Y Gilbert D, O’Sullivan TN, Yang C, Pan W, Fathalizadeh A, et al. (2013) carcinoma aloittaminen kautta Rb tuumorisuppressoriproteiinia inaktivointi: Monipuolinen lähestymistapa epiteelikasvaimet alatyyppi riippuva Cancer aloittaminen erilaisissa kudoksissa. PLoS ONE 8 (12): e80459. doi: 10,1371 /journal.pone.0080459

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22. heinäkuuta 2013; Hyväksytty: 03 lokakuu 2013; Julkaistu: 02 joulukuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain National Cancer Institute, National Institutes of Health, alle sopimuksessa nro HHSN261200800001E, ja osittain apurahoja RO1-CA046283 NCI ja PC040619 päässä puolustusministeriön, ja Eturauhassyöpä säätiön TVD. YS tukivat postdoctoral koulutus palkinto (PC050306) päässä puolustusministeriön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Pohjimmiltaan tämä julkaisu ei välttämättä edusta tai politiikan Department of Health and Human Services, eikä mainita kauppanimiä, kaupallisia tuotteita, tai organisaatioiden merkitse, Yhdysvaltain hallituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

pahanlaatuiset syövät kehittyvät mekanismien kautta valikoivan kasvun, selviytyminen, ja invasiivisia ominaisuuksia monipuolisesti mikroympäristön. Siten syövät ovat heterogeenisiä monimutkaisen vaalipiiristä useita solutyyppejä. Geneettisesti hiiri (GEM) mallit tarjoavat tehokkaan lähestymistapa arvioida sekä syy /seuraussuhteita ja solutyypistä alttius. Viime vuosikymmeninä on edistytty tunnistamisessa molekyyli poikkeamia, jotka voivat edistää kasvainten synnyssä, mikä tarjoaa käsityksen mahdollisten syy-mekanismeja ja terapeuttisia tavoitteita. Koska monet tapahtumia on suunniteltu yhdessä ja eivät useinkaan aloittaa sairaus, suhteellisen harvat tutkimukset ovat tutkineet etiologiaa kasvaimen kehittyminen aloittamisesta kautta etenemisen pitkälle sairaus. Täällä me pyrkineet kehittämään ”GEM syöpä-aloittaja”, joita voitaisiin indusoida aloittaa tuumorigeneesiä monenlaisia ​​epiteelikudoksissa ja erillisiin alatyyppi osastoissa jatkokäytön määrittelyssä kudosten ja solujen erityisiä mekanismeja karsinooman etenemistä.

Cell alatyyppejä epiteelin voidaan karakterisoida erityisesti pariksi sytokeratiini (K) ilmentymisen profiilit [1] – [3]. Sytokeratiineja ovat solun tukirangan proteiini väli säikeitä koottu heterodimeerisiä alayksiköistä happamien tyypin I (K9-K28) ja perus tyypin II (K1-K8 ja K71-K80) proteiinit [4]. K18, yleensä pariksi K8, on ensimmäinen keratiini ilmaistu kahdeksan soluvaiheessa hiiren kehityksen [5], [6], jonka jälkeen K19 ja K7 [7]. Kuitenkin K19, pienin tunnettuja happamia keratiini, ei tiettävästi perustyyppi II keratiini kumppani. Vaikka sekä K18 ja K19 ilmaistaan ​​yksinkertaisesti epiteeli, ne ilmentyvät differentiaalisesti alatyyppiä joidenkin epiteeli (esim. K18 sateenvarjo soluissa ja K19 basaali ja väli- solujen uroteeliin [2], [3], [8]). Siksi erillinen keratiini ilmaisu kuvioita voidaan käyttää pohjana kohdistamista kasvaimeen aloittamista tapahtumissa tiettyihin epiteelin alatyyppejä.

retinoblastoomasolulinjassa 1 (RB) on negatiivinen säätelijä proliferaation eukaryoottisen solusyklin, varsinkin aikana solujen erilaistumisen [ ,,,0],9], ja RB polku on kriittinen rooli kasvainten synnyssä. Poikkeava RB signalointia, jotka johtuvat viat RB itsessään CDKN2A, CCND1 tai CDK4, havaitaan vahvimmista ihmisen syövissä [10]. Niissä harvoissa syöpätyyppejä, joissa alussa ihmiskudoksen on rutiininomaisesti saatavilla, kuten poikkeavuudet ovat usein läsnä, viitaten rooliin aloittamista [11] – [15]. Kuitenkin joissakin tapauksissa, ensimmäinen yhdistys RB reitin poikkeama on ilmeinen kehittyneempi syöpä, väittäen rooli etenemisessä [16]. Todellakin, syy-seuraus suhteet todennäköisesti riippuvat monista muuttujista, mukaan lukien solu- ja kudosten alkuperän ja stokastiset järjestys syy tapahtumia, jossa korostetaan mallia sen määrittelemiseksi uskottavalta rooleja taudin etiologiassa. Koska toiminnalliset irtisanomisten keskuudessa RB ja sen perheenjäsenten p107 ja p130 useimmissa hiiren solutyypeissä [17] – [20], olemme käyttäneet määräävässä inaktivoiva proteiini, T

121, inaktivoimiseksi RB tuumorisuppressiogeeneksi (RB-TS) hiiren [21] – [25]. T

121 on johdettu N-terminaalisesta 121 aminohapon Simian Virus 40 (SV40), suuren T-antigeenin, joka kehittyi inaktivoimiseksi RB-välitteistä solusyklin jarru. Kun ohjannut kudosspesifisiä promoottoreita siirtogeenisiä hiiriä, T

121 riittää käynnistämään tuumorigeneesiä eturauhasen [26], rintarauhasen [27], munasarjojen [28] ja suonipunoksen [29] epiteelisolujen, samoin kuin keskushermoston järjestelmä astrosyytit [30], [31]. Aloittamisesta fenotyyppi on riippuvainen T

121 RB /p107 /p130 sidoskohdalla osoituksena pistemutageneesi [32]. Kussakin tapauksessa tutkitut toistaiseksi aloittamista liittyy poikkeavaan leviämisen mukana apoptoosin, ja kasvaimen etenemistä on ajanut suunniteltu ja /tai stokastiset poikkeamia erityisten syöpään liittyvien molekyylien verkkojen [28], [31], [33].

Tässä kuvaamme siirtogeeninen hiiri rivejä, joissa RB-TS inaktivointi voidaan saada aikaan joko K19 tai K18-ilmentäviä epiteelin alatyyppien Cre rekom- riippuvalla tavalla. Siirtogeeniset linjat perustettiin joka Cre-ehdollinen ilmentymä T

121 ohjasi alle cytokeratin18 tai 19 transkriptionaalisen säätelyn avulla bakteerin keinotekoinen kromosomi (BAC) siirtogeenien, jotka säilyttävät endogeenisen ilmaisua malleja erilaisissa kudoksissa. Siten yksittäinen kanta kunkin alatyypin voidaan ajaa syöpä aloittamista kudos-nimenomaan kautta elinspesifiseen Cre ilmentymisen jälkeen ituradan tai somaattiset käyttöön

Cre

siirtogeenin. Selektiivisellä RB–TS K18- tai K19-ilmentäviä soluja, osoitamme laaja käyttökelpoisuus näiden ”syöpä-aloittaja” hiiristä mekaaniset tutkimukset syövän kehityksen ja osoittavat roolit RB-TS inaktivaatiota ja epiteelin alatyypin erityisyyttä neoplastisten aloittamisen sisällä lukuisia epiteelin elimissä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi Animal Care ja Käytä komitea (ACUC) on UNC-Chapel Hill (Luvan numero: 04-+232,0), ja National Cancer Institute (NCI) -Frederick (Luvan numero: 11-030). Kaikki eläimet tässä tutkimuksessa lopetettiin kohti ”suuntaviivat eutanasia Hiiren ja rotan sikiöön ja Vastasyntyneet” määrittelemät ACUC on UNC-Chapel Hill ja NCI-Frederick minimoida kipua ja kärsimystä.

Generation of alatyyppi-specific Keratiini-suunnattu BAC siirtogeenisiä hiiriä

Floxed eGFP lopettaa T

121 kasetti (siirtogeenin kasetti, kuvio 1A) oli peräisin MFT

121 konstruktio [34]. T

121 käsittää ensimmäisen 121 aminohapon (aa) on SV40: n suuren T-antigeenin seurasi 11 missensemutaatio aminohappoa johtuvat 31 emäsparin deleetio. Siirtogeeni voi ilmaista pieni t antigeenin takia toinen poisto, joka poistaa sen akseptorisilmukointikohtien sivustolla [35]. T

121 inaktivoi RB ja perheenjäsenten p107 ja p130 eikä sisällä p53 ja p300 inaktivoimalla domain [36]. RPCI-22 hiiren genomisesta DNA-kirjastosta seulottiin käyttäen koettimia suunniteltu K18 (Krt1-18 kromosomissa 15) ja K19 (Krt1-19 kromosomissa 11) kautta RPCI BAC seulontapalvelun (Roswell Park Cancer Institute, NY). Positiiviset kloonit käytettiin recombineering suunnatun lisäys [37], [38] on Floxed eGFP-stop-T

121 kasetit eksoni 1 aloituskodoneja of K18 ja K19. BAC DNA puhdistettiin (MTR Scientific, Ijamsville, MD) ja injektoidaan hedelmöittyneen munia korjattu peräisin B6D2F1 (JAX Laboratory, Bar Harbor, Maine) cross pitoisuudella 4 ng /ul ilman linearization kuvatulla [39]. Tuloksena ja seuraaville sukupolville hiiret tunnistettiin PCR-monistamalla 215 bp: n fragmentti käyttäen alukkeita 5 ’GAATCTTTGCAGCTAATGGACC 3’ ja 5 ’GCATCCCAGAAGCTCCAAAG 3’ ja digit- tai korva-johdettu genomista DNA: ta templaattina. Pyöräilykomponenttien profiili oli: 94 ° C, 2 minuuttia; jota seurasi 35 sykliä 94 ° C, 20 sekuntia; 62 ° C, 45 sekuntia; 72 ° C, 45 sekuntia; ja lopullinen inkubaatio 72 ° C: ssa, 2 minuuttia. Hiiren linjat ylläpidettiin pariutumisen villityypin B6D2F1 hiirille ja siksi on nimetty

B6, D2-Tg (K18GT

121) TVD

(

TgK18GT

121

) ja

B6, D2-Tg (K19GT

121) TVD

(

TgK19GT

121

).

. Siirtogeeniekspressio kasetti: an eGFP seis kasetti reunustaa loxP ja T

121-geeni sijoitettiin alavirtaan. B. Keratiini bakteeri-keinotekoinen kromosomi (BAC) siirtogeenin konstruktit: siirtogeenin kasetti (A) lisättiin ylävirtaan alun ATG: n eksonissa 1. K18 (peräisin hiiren kromosomin (Chr.) 15) ja K19 (johdettu hiiren Chr 11) in BAC: käyttäen recombineering. Pistokohtaan varten loxP-eGFP-stop-loxP-T

121 kasetti on merkitty katkoviivalla ”V”. Edustavia geenit alavirtaan keratiini geenien sarakkeissa. Kiinteät mustat palkit osoittavat eksonit (E). C. Siirtogeeniekspressio kopioluvun per diploidinen genomi määritettiin qPCR.

Siirtogeenisten jalostusstrategioita

TgK18GT

121

ja

TgK19GT

121

hiiret risteytettiin

β-aktiini Cre

hiiriä (FVB tai C57BL6 /NCR tausta), ja

TgK19GT

121

osoitteeseen

K19CreER

hiiriä ( C57BL /6 tausta, tri Guoqiang Gu at Vanderbilt University) [40] määrittää kasvaimen sytytysteho upon RB-TS inaktivaatio K19 ja K18 alatyyppejä.

Siirtogeeniekspressio Kopioi numero määritys

Tail genominen DNA uutettiin käyttäen Qiagen DNeasy Veri ja Tissue kit, ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR käytettiin tunnistamaan transgeenin kopion numeroita. PCR-monistukset suoritettiin 96-kuoppalevyillä ABI 7500-sekvenssin ilmaisinta. 30 ul näytteet ovat 10 ui (50 ng) genomista DNA-näytettä ja 20 ui PCR-reaktioseoksen. Monistus oli 10 minuuttia 94 ° C: ssa, jota seuraa 40 sykliä 15 sekuntia 94 ° C: ssa ja 1 minuutti 60 ° C: ssa. Alukkeita ja koetin sekvenssit T

121 geeniä olivat: eteenpäin: 5 ’CTT TGC AGC TAA TGG ACC TTC 3’, käänteinen: 5 ’TGC CTT TCT CAT CAG AGG AAT 3’, ja koetin: 5 ’Fam TC CCC CAG GCA CTC CTT TCA AGA C Tamra 3 ’. Endogeeninen β-aktiini-geenin kontrollialukkeet olivat: eteenpäin: 5 ’CTG CCT GAC GGC CAG GTC 3’, käänteinen: 5 ’CAA GAA GGA AGG CTG GAA AAG A3’, ja koetin: 5 ’Fam CA CTA TTG GCA ACG AGC GGT TCC G Tamra 3 ’. Suhteelliset erot siirtogeenin kopio luvut on laskettu käyttämällä standardi DCT menetelmällä tunnetun määrän valvontaa plasmidin.

histopatologia ja immunodetektio

Siirtogeeniset leikeltiin ilmoitetuilla ikäisille ja kiinteä yön yli 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin, siirrettiin 70% etanolia, rutiininomaisesti käsitelty, ja upotettiin parafiiniin. Leikeltiin 10 peräkkäisten kerrosten 5 um välein paitsi imukudosmuutosten (4 um) ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

transgeeniekspressiota kuvaa tarkasti epiteelikasvaimet alatyyppi erityisyys

Voit kohdistaa RB-TS inaktivoitumista ja epiteelin alatyyppeihin, käytimme keratiini määräys BACS ajamaan ehdollinen transgeeniekspression. Cre-ehdollinen loxP-eGFP-stop-loxP (LSL) T

121 kasetti (kuva 1A) tuotiin ensimmäistä eksonia joko K18 tai K19-geeni vastaavissa BACia tuottaa

TgK18GT

121

ja

TgK19GT

121

siirtogeenisiä hiiriä (kuvio 1 B). Siten eGFP ilmaistiin alle K18 tai K19 asetuksen kunnes ilmaus /aktivointi Cre, joka välittämä

eGFP

poisto ja indusoi T

121 ilme. Kaksi lähettävää kantaisälinjasta kutakin konstruktia syntyi ja ominaista. Kuten kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR, hiiret kanna yksi siirtogeeni kopio riveissä

TgK19GT

121-34

ja

-43,

ja

TgK18GT

121-36

, ja 3 siirtogeenin kopiota linjassa

TgK18GT

121-34

(kuvio 1 C).

havaitsemiseksi endogeenisen K19 ja K18 ilmaisun ja siten kaavoja tarkka transgeenisäätelyä, villityypin epiteelikudoksissa tutkittiin IHC tai IF. Yhdenmukainen tulokseen [2], [3], [8], sekä K19 ja K18 laajasti ilmaistu erilaisissa hiiren epiteelikudoksissa (kuva S1 ja taulukko S1).

TgK18GT

121

ja

TgK19GT

121

eGFP ilmentymistä tehtiin näkyväksi kokonaan kudoksissa käyttäen stereo fluoresenssimikroskooppia (stereo Discovery.V20, Carl Zeiss Meditec, Inc). Vahva havaittiin vihreän fluoresenssin joissakin kudoksissa molempien linjojen

TgK19GT

121

hiiriä (esim suolistosta, vatsasta, virtsarakko, ja sappirakon), mutta vähän tai ei lainkaan vihreän fluoresenssin toisissa (esim maitorauhasen, munasarja-, ja haima, kuva S2). Monissa kudoksissa osoitti vahvaa vihreän fluoresenssin molemmissa riviä

TgK18GT

121

hiiriä (esim suolistosta, vatsasta, kateenkorva, rintarauhasen, munasarja, sylkirauhasen, virtsarakon ja siemenjohtimista lisäkivesten, ja sappirakon), mutta ei haima-, keuhko-, ja maksassa (kuvio S3). Vuonna

TgK19GT

121

hiiriä, immunovärjäystä kudosleikkeiden osoittivat johdonmukaisesti vahvaa ja laajaa eGFP ilmaisun suolessa, mahassa, virtsarakon, sappirakon ja munuaisaltaan epiteelin. Helposti havaittavissa olevaa värjäytymistä rajoittui pienemmän prosenttiosuuden solujen keuhkojen, rintarauhasen ja eturauhanen (kuva S4 ja taulukko S1). Muut kudokset oli erittäin heikko tai ei lainkaan havaittavissa eGFP lauseke (taulukko S1). Vuonna

TgK18GT

121

hiiriä, eGFP ilme oli yleinen käytäntö useimmissa K18-positiivisten epiteelikudoksissa (kuva S5 ja taulukko S1). Tärkeää on, perustuvat kahden IF, eGFP koekpsressoitiin vastaavien endogeenisten keratiineista in

TgK19GT

121

(kuva S4) ja

TgK18GT

121

hiirillä (kuva S5), mutta jätetty K14 soluista (kuvio S6). Kuitenkin kaikki K19 tai K18 positiivisia soluja ilmaisivat eGFP. Molemmat linjat

TgK19GT

121

hiiret osoittivat samanlaisia ​​eGFP ilme. Kudoksille

TgK18GT

121-34

hiiret osoittivat voimakkaampi eGFP värjäytyminen verrattuna iältään

TgK18GT

121-36

hiiriä (tuloksia ei ole esitetty), mahdollisesti johtuen suuremmasta transgeenin kopioluvun linjassa 34 (kuvio 1 C).

RB-TS Inaktivointia indusoituu Erityiset epiteelikasvaimet alatyypit

Voit selvittää T

121 ilmaisua voidaan indusoida laajan epiteelikudoksissa kanssa alatyypin spesifisyys ja arvioida vaikutusta RB-TS inaktivaation, ylitimme hemizygous siirtogeenisiä hiiriä kaikki linjat siirtogeenisiä

β-aktiini Cre

homotsygoottinen hiirillä. Todennäköisesti johtuu laaja RB-TS inaktivoitumista in K19 ilmentävät alkion solujen (katso jäljempänä), jotkut alkion kuolleisuutta havaittiin

TgK19GT

121; β-aktiinin Cre

hiirillä. Elävät syntynyt bi-siirtogeenisten hiirten olivat aliedustettuja suhteessa pesuetove- valvontaa (34% vs. 66% ja

TgK19GT

121-34

, 45% vs. 55% ja

TgK19GT

121-43

, vastaavasti; taulukko S2), mikä viittaa siihen, että RB-toiminto K19 solut voivat olla kriittinen kehittämiseen. Vuonna elossa hiiret, sopusoinnussa leveys endogeenisen K19 ilmaisun (kuva S1), T

121 ilmentymistä havaitaan heti erilaisissa kudoksissa ensimmäisen arvioidaan 2 kuukauden iässä (kuvio 2), vaikka eGFP ilmaisu olisi ollut alhainen tai alle IHC tunnistustason joissakin näistä kudoksista (esim munasarja, rintarauhasen ja haima, kuviot S2 ja S4, ja taulukko S1). Tärkeää on, kuten EGFP uskollisesti ilmaistu K19 soluissa, T

121 tuotiin esiin myös K19-positiivisten solujen (ei esitetty), mutta jättää K14 soluista (kuvio S6). T

121 ekspressiotasot vastasivat toisiaan

TgK19GT

121-34; β-aktiini Cre

ja

TgK19GT

121-43; β-aktiini Cre

hiiriä (ei kuvassa).

Strong ruskea värjäytyminen osoittaa positiivisia T

121 ilmaisua.

Toisin kuin

TgK19GT

121 ; β-aktiini Cre

hiiriä, molemmat linjat

TgK18GT

121; β-aktiinin Cre

hiirille kehittyi normaali Mendelin taajuuksilla (ei esitetty). T

121 laajasti ilmaistu K18 ilmentävät epiteelin Tiettyjen kudosten 2 kuukautta vanha

TgK18GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä (esim kateenkorva, rintarauhasen, ja munasarja), mutta osoitti rajoitettu induktion toisissa, vaikkakin sopivien solujen (esim suolen, eturauhasen, ja haima, kuva 3), vaikka eGFP ilmaisu olisi ollut yleisempää joissakin tapauksissa (kuviot S3 ja S5, ja taulukko S1). Tärkeää on, T

121 ilmentyi K18 positiivisten solujen (kuvio 3B), mutta jättää K14 soluista (kuvio S6). Intensiteetti T

121 ilmaisu olivat yhtä

TgK18GT

121-34; β-aktiini Cre

ja

TgK18GT

121-36; β-aktiinin Cre

linjat (ei esitetty), vaikka eGFP: n ilmentyminen oli suurempaa

TgK18GT

121-34

kuin

TgK18GT

121-36

hiiret (ei esitetty) . Tämä havainto saattaa heijastaa somaattisia Cre-välitteinen kopioluvun vähennys tandem geenijärjestelyillä.

. T

121 ilmentymisen IHC. Mustat nuolet osoittavat T

121 positiivisia soluja. Asteikko bar = 50 uM. B. Double immunofluoresenssivärjäyksen T

121 vihreänä ja endogeeninen K18 punaisina kudoksissa esitetään yhdistyivät konfokaali kuvia. Valkoinen nuolet osoittavat suolen epiteelisolujen positiivisia sekä endogeenisen K18 ja T

121. Asteikko bar = 25 uM.

RB-TS inaktivointi aiheuttaa neoplasia

Verrattuna villityypin hiirille (kuvio S7A), kaikki

TgK19GT

121-43; β-aktiini Cre

hiirille kehittyi multifokaalinen hyperplastic vaurioita useimmissa K19 positiivinen epiteelikudoksiin [esim. haiman (haimatiehyen epiteelin), rintarauhasen, munasarjojen (munasarjojen pinnan epiteelisolujen OSECs), keuhkojen bronchiole, maksan sapen ductule, sappirakon, munuaisen (munuaisaltaan epiteelisolut), virtsarakon, eturauhasen, ohutsuolen, paksusuolen, mahan rauhasten foveolar solut; Kuva 4 ja taulukko 1]. Tämä fenotyyppi oli samanaikainen korkea leviämisen hinnat vaikutusalueella soluissa (kuviot 5 ja 6) villityyppiin verrattuna kudoksiin (kuviot 6 ja S8). Kuten aiemmissa raporteissa rajoitettu kudosten [26], [27], [30], lisääntyvän leviämisen kudoksissa

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiirien liittyy merkittävä nousu apoptoosin (kuvio S9) verrattuna villityypin hiirillä (kuva S10). Nämä tulokset osoittavat, että RB on tärkeää vaimentamiseksi hyperplasian K19 positiivisia soluja. Jotkut

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiirille kehittyi hengenvaarallinen kahdenvälistä tai yksipuolista vesimunuaisen aloitetaan jo 2 kuukauden iässä (kuvio S11A). Vesimunuaisen tulkittiin olevan toissijainen merkitty hyperplasiaa siirtymäkauden solu epiteelin risteyksessä munuaisaltaan ja virtsanjohtimen tuloksena estäminen virtsan ulosvirtaus munuainen (kuva S11A). Muita hiiriä linjan 34 jouduttiin lopetettiin johtuen laajentuneen kateenkorvat, mikä johti hengenvaarallisia rintakehän paineesta, 7 kuukauden iässä (kuvio S11B).

hyperplasiaa havaittiin useimmissa kudoksissa (keuhko- ja paksusuolen: merkitty mustat nuolet). Multifocal ductal hyperplasiaa havaittiin haimassa, sekä hiiren eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (mPIN) eturauhasessa, ja hydronefroosi kuten valkoisilla nuolilla munuaisen. Kaikki näytteet värjättiin H 0,001); #significantly erilaiset

TgK19GT

121; β-aktiini Cre ja TgK18GT

121; β-aktiini Cre

(p = 0,007); @ Merkitsevää eroa

TgK18GT

121; β-aktiini Cre

ja WT (p = 0,043).

Samanlainen

TgK19GT

121; β-aktiinin Cre

hiirillä, RB–TS: K18-positiivisten solujen pääasiassa johtanut liikakasvun (kuvio 7 ja taulukko 1), joka korreloi T

121 ilmentymistä näissä kudoksissa (kuvio 3). With leveä induktio

β-aktiini Cre

alleeli, sekä

TgK18GT

121-34

ja

TgK18GT

121-36

hiirille kehittyi vakava kateenkorvaepiteelikäsittelyn hyperplasia ja sen jälkeen imukudoksen liikakasvu (taulukko 1 ja kuvio 7). Immunovärjäys osoitti korkea T

121 ilmaisun K18 aivokuoren kateenkorvaepiteelis- (kuva S12B) liittyy korkea leviämisen (perustuu Ki-67 IHC) ja apoptoosin (TUNEL) hinnat (Kuva S12C). Koska nämä hiiret heikentyä hengenvaarallisiin rintakehä paine laajentuneen kateenkorvat (kuvio S12A) ja vaaditaan eutanasia 6 kuukauden iässä,

TgK18GT

121; β-aktiini Cre

fenotyyppejä muissa kudoksissa ei voitu tutkia aiemmin tässä iässä. 1-6 kuukauden iässä, lievä polttoväli hyperplasiaa havaittiin rintarauhasen, munasarjojen pinnan epiteeli, suoli, ja eturauhasen (kuva 7 ja taulukko 1), joka korreloi koholla leviämisen hinnat ja lisääntynyt apoptoosi (kuviot 6, 8, ja S13 ). Suurimmaksi osaksi, verrattuna

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä, laajuus liikakasvun oli vähäisempää

TgK18GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä, jotka korreloivat rajoitetusti T

121 ilmentymistä näissä kudoksissa. Korkea leviämisen hinnat havaittiin sekä K19 ja K18 positiiviset maitorauhasen epiteelin ja munasarjojen pinnan epiteeli (38,6% vs. 49,2% vuonna rintarauhasen, ja 51,2% vs. 34,2% munasarjassa, vastaavasti, kuvio 6), mikä voi selittyä yhteistyötä ilmaus K19 ja K18 näissä kudoksissa (kuva S1). Tämä ei kuitenkaan ole asianlaita muiden sivustojen yhteistyön ilmentymisen (esim eturauhas-, kuvio 6), mikä viittaa siihen, että kudosspesifisyyttä voi olla rooli Cre rekombinaation tehokkuutta.

hyperplasiaa havaittiin joissakin kudoksissa (munasarja ja eturauhasen: nuolilla). Kaikki hiiret lopetettiin 1-7 kuukauden iässä johtuen hengenvaarallisia rintakehä aiheuttama paine laajentuneen kateenkorvat. Kaikki näytteet värjättiin H β-aktiini Cre

hiiret ja osoittaa hyödyllisyyden näiden mallien tutkimiseen syövän kehityksen aikuisten elimissä, ylitimme

TgK19GT

121-34

tamoksifeenia-indusoituva

K19CreER

hiirissä [40]. Toisin kuin

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä,

TgK19GT

121; K19CreER

hiiret syntyivät odotettua Mendelin taajuuksilla (ei kuvassa), jotka edelleen tukevat kriittisen roolin RB-TS K19 positiivisissa soluissa hiiren kehityksen aikana . Hiiriä induktiossa tamoksifeenin 6-8 viikon iässä, ja T

121 ilmentyminen arvioitiin IHC. T

121 oli ensimmäinen helposti havaittavissa sappirakon 2 viikon kuluttua induktion (ei kuvassa) ja oli laajaa eri kudoksissa 4-6 viikon induktion (kuvio S14a). Lisäksi T

121 koekpsressoitiin kanssa K19 (kuva S14B). Yhdenmukainen ilme eGFP ennen Cre ilmaisun, ja tyypillisiä Transgeeniekspression, T

121 ilmaistiin osajoukko K19 positiivisten solujen tietyssä kudoksessa.

Voit selvittää RB-TS inaktivaatiota alttiita adult K19-ilmentävien epiteelisolujen kasvaimien syntyyn, tamoksifeeni aiheuttama

TgK19GT

121; K19CreER

hiiret olivat vuotiaita. Yhdenmukainen yleisten hyperplastista fenotyyppi havaittu

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä, tiheä epätyypillinen hyperplasia havaittiin useimmissa epiteelikudoksissa (esim vatsa rauhasepiteeliin 85,7% miehillä ja 90% naisilla, ja keuhkojen bronchiole epiteelin 92,9% miehillä ja 90% naisilla; Taulukko 2), mikä on yhdenmukaista lisäsi jakautumista hinnat (ei esitetty). Vaikka matalataajuista pahanlaatuisten kasvainten ei esiinny joissakin kudoksissa (esim mahan adenokarsinooma 13,3% miehillä ja 14,3% naisilla, taulukko 3 ja kuvio 9), huono laatu leesioita läsnä useimmissa elimissä osoitti, että RB-TS inaktivoitumista riitti aloittaa mutta ei edetä tautia. Tämä on yhdenmukaista aiempien tulosten rintakasvainkudoksessa [27], eturauhas- [26], suonipunoksen [29] ja munasarjojen epiteelin [28], ja aivot astrosyytit [30], [31]. Samanlainen

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä, munuaisten vesimunuaisen havaittiin myös 75% miehistä ja 40% naisista aiheutettujen

TgK19GT

121; K19CreER

hiirillä 9-16 kuukautta induktion (taulukko 2 ). Toisin kuin

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä, kuolinsyynä oli virtsarakon johtuva tukkeuma korkea ilmentymisen K19 väli- ja tyvisoluissa virtsarakon epiteelin (kuva S7b) ja tiheä adenooma kehityksen virtsarakon (taulukko 3 ja kuvio 9 ). Mielenkiintoista, havaitsimme aikaisempaan alkamiseen virtsarakon adenooma miehillä verrattuna naisilla (9 kk vs. 14 kuukautta induktion, taulukko 3). Taustalla olevaa mekanismia ei tunneta.

Virtsarakon adenooma, keuhko- adenooma, vatsa adenokarsinooma, munuaissyöpä, ja gut intraepiteliaalisten neoplasia (GIN), ja mPIN vaurioista eturauhasen näkyvät matala ja korkea suurennoksia. Lievä haimatiehytsolujen hyperplasiaa havaittiin haiman kuten on osoitettu nuolilla. Kaikki näytteet värjättiin H β-aktiini Cre

hiiriä (enintään 6 kuukautta) eikä

TgK19GT

121; β-aktiini Cre

hiiriä (enintään 8 kuukautta) kehittämä adenoomia tai karsinoomia. Nämä tulokset vahvistavat, että RB-TS inaktivoitumista kärsivillä epiteeli vain käynnistää kasvainilmiasua. Perustuen aiempiin tutkimuksiin syövän etenemisen T

121-aloitti solut, odotamme, että ylimääräisiä vaurioita tietyissä syövän geenien tarvitaan ajamaan näin varhaisessa kasvainilmiasua vastaaviksi syöpiä.