PLoS ONE: Kasvain-Associated Makrofageilla Recruit CCR6 + Regulatory T Cells ja edistää peräsuolen syövän kautta tehostaminen CCL20 Tuotanto Hiiret
tiivistelmä
Background
kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) uudistaa peräsuolen syöpä (CRC) microenvironment. Silti havainnot roolista TAMeja CRC näyttävät olevan ristiriitaisia verrattuna muihin syöpiin. FoxP3
+ säätelijä-T (Treg) soluja, dominantly tunkeutua CRC. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismi, jossa TAM voi edistää kaupan Treg-solujen kasvain massa on tuntematon.
Menetelmät /Principal Havainnot
CRC oli joko indusoitiin N-metyyli- N-nitrosoureaan (MNU) ja H.
pylori
tai perustettu ihonalaisella hiiren peräsuolen kasvaimen solulinja (CMT93) hiirillä. CMT93 soluja viljeltiin yhdessä ensisijaisen makrofagien on transwell laitteessa. Rekrytointi FoxP3 vihreää fluoresoivaa proteiinia positiivinen (FoxP3
GFP +) Treg-solut arvioitiin käyttämällä IVIS Imaging System tai immunofluoresenssivärjäyksen. Rooli varten makrofagit kaupan Treg-solujen ja kehittämisessä CRC tutkittiin CD11 difteriatoksiinin reseptori (CD11-DTR) siirtogeenisiä C57BL /6J hiiriä, joissa makrofageja voidaan valikoivasti tyhjentynyt. Treg-solujen huomattavan tunkeutunut kiinteä kasvain, ja pääasiassa ilmaisi homing kemokiinireseptoria (CCR) 6. aiheuttama CRC mallia. Molemmat CMT93 syövän solut ja makrofagit tuotti suuren määrän CCL20, ainoa ligandi CCR6
in vitro
ja
in vivo
. Injektion rekombinantti hiiren CCL20 osaksi tuumorikohdat edistänyt kehitystä huomattavasti rekrytointi Treg-solujen siirteen CRC mallia. Ehdollinen makrofagi ablaatio vähentynyt CCL20 tasoilla, tukossa Treg-solujen rekrytointi ja esti kasvaimen kasvua CD11-DTR hiiret oksastettu CMT93.
Johtopäätökset /merkitys
TAM rekrytoida CCR6
+ Treg-solujen kasvaimen massan ja edistää sen kehitystä kautta tehostamalla tuotantoa CCL20 vuonna CRC hiirimallissa.
Citation: Liu J, Zhang N, Li Q, Zhang W, Ke F, Leng Q, et al. (2011) Tumor-Associated Makrofageilla Recruit CCR6
+ Regulatory T Cells ja edistää peräsuolen syövän kautta tehostaminen CCL20 tuotanto hiirissä. PLoS ONE 6 (4): e19495. doi: 10,1371 /journal.pone.0019495
Editor: Sven G. Meuth, University of Muenster, Saksa
vastaanotettu: 27 lokakuu 2010; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011
Copyright: © 2011 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukee avustusta National Natural Science Foundation of China (nro: 30972787), jonka ohjelma professori Special nimeäminen (Eastern Scholar) Shanghai korkeakouluissa, tiede- ja teknologianeuvoston komissiolle Shanghai kunta (No. : 09140902600), ja jonka johtava Academic Kuri projekti Shanghai Municipal Education komissio (nro: J50208 ja nro: J50207). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti, ja neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman [1]. Samanlaisia muiden syöpien, CRC syntyy kroonisesti tulehtuneeseen kudokseen, ja sen kehitys on alle immuunivalvonnan ja riippuu sytokiinien ja kemokiinien erittää kasvaimeen infiltroituneen immuunisolujen [2].
Regulatory T (Treg) – solut perin tunnusomaista niiden CD4
+ CD25
+ FoxP3
+ fenotyyppi ja niiden ajatellaan tasapainottamiseksi tarvittavat aggressiivisuutta vastaan vastustajiaan toleranssi itse aineosien [3]. Lisääntynyt määrä Treg-solujen on raportoitu, että veren ja kasvaimia eri syöpiä sairastavien potilaiden, mukaan lukien rintasyöpä, paksusuolen ja peräsuolen syöpä, ruokatorven syöpä, mahasyöpä, hepatosellulaarinen karsinooma, leukemia, keuhkosyöpä, lymfooma, melanooma, munasarjasyöpä, ja haiman syöpä [4]. Lisäksi tutkimukset että köyhdytettyä Treg-solujen paransi kasvaimenvastaista koskemattomuutta ja merkittävästi vähensi kasvainten kasvua muutama hiiren kasvainmalleissa [4]. Potilailla, joilla on CRC, lisääntynyt määrä Treg-solujen ääreisverenkierrossa, suoliliepeen imusolmukkeiden ja suoraan kasvaimeen havaittiin [5], [6]. Lisäksi vasta-aine-välitteinen FoxP3 proteiinin hoito aiheutti kliinisesti merkittävä väheneminen tuumoritaakka syngeenisellä malli paksusuolensyöpä etäpesäke maksan Balb /c-hiirissä [7].
Tieto alkuperästä Treg-solujen sisälle kerääntyvä tuumorileesioissa peräisin eläimistä kasvaimen mallien tutkimus. On ehdotettu, että sekä jo olemassa luonnollisesti esiintyviä Treg-solut (nTreg-solut) ja mukautuva Treg-solut (aTreg-soluja) indusoi ei-Treg esiastesolujen kokonaisvaatimukseen altaan kasvaimeen infiltroivien FoxP3
+ Treg-solut [8], [9]. Kasvaimensisäisenä Treg-solut antigeenin kokenut, erittäin aktivoitu ja näyttävät tehtävä laajoja soluproliferaatioon koska suurin osa kasvaimensisäisenä Treg-solut ovat menettäneet CD62L ja CD45RB ilme, mutta niiden ilmentymä CD25, CTLA-4 ja GITR voimakkaasti kasvanut [8], [10]. Ehtyminen ennestään nTreg-soluissa käyttäen anti-CD25 mAb johti nopeampaan ja laaja muuntaminen esiastesolujen aTreg-soluja, jotka voivat pitkälti kompensoida menetystä nTreg-solujen [8]. Aktivointi ja laajentaminen joko nTreg-soluja tai aTreg-solujen kasvain sivustoja on antigeeni riippuvainen, ja edistää kasvaimen toleranssin [4]. Erityisesti antigeeniä esitteleviä soluja, kuten kasvaimeen infiltroivien DC ja makrofagit ovat todennäköisesti mukana paikallisen aktivoinnin ja laajentamisen nTreg-solujen sisällä tuumorileesioissa [11]. Lisäksi ihmisillä, kasvain antigeenispesifisiä FoxP3
+ Treg-solut on onnistuneesti eristetty kasvain kudoksista sekä ääreisverenkierrossa Melanoomapotilaiden ja kohdunkaulan syöpä [12], [13].
FoxP3
+ Treg-solut alkavat tunkeutuu alkava kasvainleesion hyvin varhaisessa vaiheessa kasvaimen kehitystä [14]. Tutkimukset ihmisen munasarja- syöpiä ovat osoittaneet, että Treg-solut liikennöit kasvaimen massan ja askites kautta kemokiinireseptorin CCR4 vastaa CCL22 vapauttaa tuumorisolujen ja kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM). Tämä viittaa siihen, että kemokiinin ja kemokiinireseptoreita ovat tärkeitä Treg-solujen homing kasvaimiin [15]. Kuitenkin muita kemokiinireseptoreita, esimerkiksi, CXCR3, ja CCR6, jotka on jaettu muisti Th1, Th2 ja Th17 soluja, on myös osoitettu ilmaistaan kasvaimen infiltroituneen Treg-solujen [16], [17]. CCR6 on kemokiinireseptori, jossa on vain yksi spesifistä kemokiini ligandin, tulehdus- ja homeostaattisia kemokiini CCL20, joka tunnetaan myös maksan ja aktivointi-kemokiini (LARC) [18] tai Moos [19]. Toisin kuin monien muiden kemokiinien, CCL20 on suhteellisen spesifinen reseptori ja sitoutuu lähes yksinomaan kemokiinireseptoriin CCR6, joka ilmaistaan myös CD45RO
+ muisti-T-solut ja muut. [20]
Huolimatta se, että kasvaimen kehitystä voitaisiin edistää osittain immuunijärjestelmää itse, tukahduttava toiminta Treg-solujen sekä molekyylimekanismin taustalla niiden kaupan kasvaimen sivustoja edelleen heikko. Tässä tutkimuksessa tutkimme itseohjautuva ominaisuudet Treg-solujen ja mahdollinen kasvain mainostaisi of TAM on CRC malliin. Me raportoimme, että kiinteiden kasvainten hiirten CRC, Treg-solut olivat merkittävästi lisääntynyt verrattuna kontrolliryhmiin. TAM kasvatti osaltaan CCL20 tuotantoa kasvain ympäristössä ja palvelukseen Treg-soluja, jotka ilmensivät runsaita tasoja CCR6. Injektion rekombinantti hiiren CCL20 osaksi CRC edistää kasvaimen kehitystä merkittävästi rekrytointi Treg-solujen villityypin hiirissä, ja stimuloi kasvaimen kasvua suoraan aktivoimalla CMT93 soluja CCR6 – /- hiirissä. Tärkeintä on, käyttäen CD11-DTR siirtogeenisen hiiren mallia osoitamme ensimmäistä kertaa, että ehdollinen makrofagi ablaatio paitsi vähentynyt ilmentyminen CCL20 ja FoxP3 mutta johti merkittävään eston CRC. Tuloksemme viittaavat siihen, että valikoivasti kohdistamista CCL20 alas- säätelemällä TAMeja tai sen vasta reseptorin CCR6 estää muistin Treg-solujen rekrytointi voi edustaa uutta terapeuttista strategiaa vastaan CRC ihmisillä.
Tulokset
numerot FoxP3
+ Treg-solut lisääntyivät kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä CRC hiirillä
merkittävä tavoite tämän tutkimuksen tarkoituksena oli antaa lopullista osoitus kaupan mekanismi FoxP3
+ Treg-solujen CRC
in vivo
. Tätä varten me aiheuttama CRC hiirissä MNU ja H.
pylori
. MNU on suora alkyloiva aine, joka ei edellytä metabolista aktivaatiota ja näin on voimakas ajankohtainen karsinogeeni [21]. Aiemmin peräsuoleen tiputtamisen MNU on raportoitu indusoivan CRC rotilla [21]. Kuten odotettua, kun 80 viikkoa, 85% hiirissä, joita käytettiin tässä tutkimuksessa on kehitetty nähtävissä CRC aiheuttama MNU ja H.
pylori
(kuvio 1A-C). H 0,0001 Studentin t Test). Edustavat tiedot näkyvät joka oli toistettu 3 itsenäisestä kokeesta.
Sen tutkimiseksi, FoxP3
+ Treg-solut infiltroituneen kasvaimia indusoitiin MNU ja H.
pylori
vuonna hiiret, immunofluoresenssivärjäyksen kasvain ja normaali paksusuolen FoxP3 suoritettiin. Kuten havaitaan PBMC ihmisen potilaista (kuvio S1), FoxP3 (punainen värjäys) oli runsaasti ilmaistu kasvainkudoksen peräisin hiiristä hoidettiin MNU ja H.
pylori
verrattuna normaaliin paksusuolen käsittelemättömän hiirillä tai IgG ohjaus värjäys (kuvio 1 F-H). Tarkastella tarkemmin taajuudella Treg-solujen tunkeutuu CRC, yksisolususpension CRC ja normaali limakalvo valmistettiin ja taajuus Treg-solujen määritettiin Flow cytomery. Olemme vahvistaneet, että merkittävästi suurempi taajuus CD4
+ FoxP3
+ Treg-solut olivat läsnä kasvain, verrattuna normaaliin paksusuoli (keskiarvo 9,095% ± 1,038% vs. keskiarvo 0,478% ± 0,095%,
p
0,0001) (kuvio 1 I-K). Lisääntynyt tiheys Treg-solujen kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) viittaa vahvasti siihen, että Treg-solut voivat olla keskeinen rooli moduloimaan kasvaimen vastaisen immuunivasteen hiirimallissa CRC aiheuttama MNU ja H.
pylori
.
CCR6 tarvittiin rekrytointi Treg-solujen CRC hiirillä
sen kysymyksen siitä luonnossa esiintyviä FoxP3
+ Treg-solut kykenevät siirtymään kasvain kudokset jälkeen adoptiovanhemmat siirto, me pistetään 0,5-1 x 10
6 Treg-soluja, jotka eristettiin FoxP3
GFP siirtogeenisen hiiren sisään hiirille CRC aiheuttama MNU ja H.
pylori
tai terve valvontaa. Kaksi viikkoa post adoptiovanhemmat siirto, kryoleikkeet peräisin kasvainkudoksen injektoitujen hiirten kanssa FoxP3
GFP + soluja tutkittiin GFP
+ Treg-soluja. Havaitsimme, että GFP
+ Treg-solujen massiivisesti kertynyt kasvaimeen (kuvio 2A). Erityisesti olemme määritelleet, että nämä kertyvät GFP
+ Treg-solujen ja peräsuolen kasvaimen ilmaistuna CCR6, The Treg-solujen homing-reseptori (kuvio 2B). Kuitenkin naiivi Treg-solut, jotka ovat peräisin FoxP3
GFP siirtogeenisiä hiiriä ei näihin CCR6 (kuvio 2C-D). Lisäksi olemme pilkottu peräsuolen kasvain hiirille on MNU ja H.
pylori
, ja määritetään CCR6 ilmentyminen kasvaimen infiltroituneen Treg-solujen Flow cytomery. Johdonmukaisesti, löysimme kasvain infiltroituneen Treg-soluista lähes yksinomaan ilmaistaan CCR6 (kuvio 2E, F). Jotta voitaisiin vahvistaa, onko CCR6 tarvittiin migraation Treg-solujen kasvain sivustoja, me oksastettu hiiren peräsuolen tuumorisolulinja CMT93 osaksi CCR6 – /- hiirissä. Kahden viikon kuluttua CMT93 varttaminen, kasvaimen infiltroituneen Treg-soluja CCR6 – /- hiiret tutkittiin Flow cytomery. Havaitsimme, että infiltraatio Treg-solujen esti täysin ilman CCR6 in CCR6 – /- hiirillä verrattuna CCR6 + /+ hiirillä (kuvio 2G, H). Nämä tiedot viittaavat siihen, että itseohjautuva ja kaupan kasvaimen infiltroituneen Treg-solujen kasvain massa on riippuvainen kemokiinireseptoria CCR6
in vivo
CRC hiirimallissa oksastettu CMT93.
Treg soluissa (0,5-1 x 10
6) puhdistettu pernat FoxP3
GFP hiiret adoptiivisesti siirrettiin hiirillä CRC aiheuttama MNU ja H.
pylori
. (A) Jääleikkeitä kasvaimen värjättiin soluytimet DAPI tutkia soluttautuminen FoxP3
GFP + Treg-solujen kasvain massa (alkuperäinen suurennos, × 20). (B) Co-paikallistaminen GFP CCR6 värjäystä. (C, D) Virtaussytometrinen analyysi CCR6 on FoxP
GFP + Treg-solut, jotka ovat peräisin perifeerisen veren naiivien FoxP3
GFP-hiirissä. (E, F) virtaussytometrianalyysin varten CCR6 tunkeutuvien Treg-soluista peräisin CRC aiheuttama MNU ja H.
pylori
hiirillä. Vahvistamaan, onko CCR6 tarvitaan FoxP3
+ Treg-soluliikennettä, CMT93 solulinja oksastetaan CCR6 – /- ja CCR6 + /+ hiirillä. (G, H) virtaussytometrinen analyysi kasvainta infiltroivien CD4
+ FoxP3
+ Treg-solujen kahden viikon kuluttua CMT93 solulinja siirrännäisten CCR6 – /- (G) ja CCR6 + /+ (H) hiiriä. Edustavat tiedot näkyvät joka oli toistettu 4 itsenäisestä kokeesta.
TAM osaltaan tuotantoa CCL20, ligandi CCR6
CCL20 on toistaiseksi tiedetään olevan ainoa ligandi for CCR6 ja kykenee ohjaamaan muuttoa CCR6
+ soluihin [20]. Tutkia mahdollisia tuotannon CCL20 kasvainkudoksessa, kasvaimen kryoleikkeet otettu C57BL /6J hiiriä hoidettiin MNU ja H.
pylori
immunovärjättiin anti-hiiri CCL20 mAb. Havaitsimme, että ilmaus kemokiinin CCL20 (punainen värjäys) oli merkittävästi lisääntynyt CRC kudoksissa verrattuna normaalin limakalvon (kuvio 3A, B). Koordinoitu välinen signalointi kasvainsolujen ja ei-pahanlaatuisten tulehdussolujen kasvaimen mikroympäristössä tarvitaan kasvainten kehittymisen. Joukossa, makrofagit ovat merkittäviä proinflammatoristen sytokiinien, kuten tuumorinekroositekijä-a (TNF-α), IL-1β, ja IL-6, ja on ratkaiseva rooli moduloinnissa immuunivastetta [22]. Sen tutkimiseksi, onko makrofagit ovat tärkeä lähde CCL20 vuonna tuumorikohdat, kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin kylmäpresipitaattien osissa johdettu kasvainbiopsioissa hoidettujen hiirien MNU ja H.
pylori
. Havaitsimme, että sen lisäksi, F4 /80
+ makrofagien, muut solut tuotetaan myös CCL20 kasvaimen sivustoja hiirten (kuvio 3C), mikä osoittaa, että CCL20 vapautuu TAM tai muut voivat aiheuttaa Treg-solujen siirtymistä kasvaimia. Selventää, mitä muut solut tuottavat CCL20, me transduktoi- CMT93 GFP, ja oksastettu ihonalaisesti C57BL /6J-hiirten (kuvio 3D). Kolme viikkoa myöhemmin, havaitsimme että suurin osa CCL20
+ soluja (78,98%) on GFP
+ CMT93 kasvainsoluja, mikä viittaa siihen, useimmat muut CCL20 tuottavat solut ovat kasvainsoluja (kuvio 3E). Sen määrittämiseksi, onko makrofagit ovat vastuussa ylituotanto CCL20 kasvaimen massan, yhteisrahoittaisimme viljellyt CMT93 syöpäsolujen tuoretta hiiren vatsakalvon makrofageissa 48 tuntia on transwell laitteessa. Olemme osoittaneet, että yhdessä viljelemisen sekä makrofagien ja CMT93 syövän solut tuottivat kohonneita CCL20 verrattuna joko makrofageja tai CMT93 kulttuuri yksinään (kuvio 3F, G). Silmiinpistävän, että yhteistyössä kulttuurin CMT93 ja hiiren vatsakalvon makrofageissa, CMT93 syövän solut tuottivat 26,4-kertaisesti enemmän CCL20 kuin makrofagit mRNA tasoilla, mikä viittaa siihen, että makrofagit voivat vuorovaikutus syöpäsoluja tuotantoon CCL20 kasvaimen mikroympäristössä (kuvio 3F). Lisäksi lisääntynyt proteiinin tasot CCL20 varmistettiin ELISA Yhdessä viljelemisen (kuvio 3H).
(A, B) Jääleikkeitä hiiren CRC aiheuttama MNU ja H.
pylori
tai hiiren normaali paksusuoli värjättiin CCL20 (punainen, alkuperäinen Magni-fication, × 20). Immunohistokemiallisen anti-hiiri CCL20 ja F4 /80 mAb suoritettiin kryoleikkeet peräisin hiiren CRC. (C) Co-paikallistaminen CCL20 F4 /80 värjäytymistä (alkuperäinen suurennos, × 20). (D) CMT93 oli transduktoi- GFP, ja vahvistettu virtaussytometrialla. (E) virtaussytometrinen analyysi CCL20
+ solujen kolmen viikon kuluttua GFP
+ CMT93 solujen oksastamalla C57BL /6J-hiirissä. (F) mRNA tasot CCL20 varten yhdessä viljelemisen hiiren vatsakalvon makrofagien CMT93 syöpäsoluja. AU, mielivaltaisia yksiköitä. (G) Protein tasot CCL20 varten yhdessä viljelemisen hiiren vatsakalvon makrofagien CMT93 syöpäsoluja. Edustavat tiedot näkyvät joka oli toistettu ainakin 2 itsenäisen kokeen. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001, Opiskelijan
t
testiä.
Samanaikainen injektion rekombinantti hiiren CCL20 tuloksia kaupan CCR6
+ Treg-solujen kasvaimia, ja edistäminen CRC kasvun hiirillä
Kasvain infiltroituneen Treg-solujen tukahduttaa pohjustus ja efektoritoiminnan kasvaimen tappaa efektori-T-soluja, mikä edistää kasvaimen kasvua ja kehitystä [11]. Voit selvittää roolin CCL20 vuonna muuttoa Treg-solujen
in vivo
, me s.c. pistetään CMT93 hiiren CRC solut yhdessä rekombinantti hiiren CCL20 osaksi FoxP3
GFP siirtogeenisiä hiiriä. Käyttämällä koko kehon pieneläinten fluoresenssikuvantamisella valvontajärjestelmän muuttoa Treg-solujen [23], osoitimme, että yhdistelmä-hiiri CCL20 palkattu useita GFP
+ Treg-solujen kasvaimia (valkoinen nuoli) verrattuna PBS käsiteltyjen ryhmien (kuvio 4A-C). Jotta voitaisiin edelleen vahvistaa, GFP leimattuja Treg-solujen siirtynyt syöpäkasvaimen vasteena rekombinantti hiiren CCL20, yksisolususpensioita kasvainkudoksen valmistettiin ja FoxP3
GFP + Treg-soluja havaittiin Flow cytomery lopussa kokeen . Toisin kuin PBS hoitoon, havaitsimme, että GFP
+ Treg-solut huomattavasti sisällä kasvain, joka käsiteltiin hiiren rekombinantti CCL20 (kuvio 4D). Lisätutkimuksia patologisen merkityksen CCL20, me hallinnoimassa rekombinantti hiiren CCL20 ympärillä kasvain sivustoja viikoittain 4 viikon ajan. Olemme osoittaneet, että kasvaimen koko oli merkittävästi lisääntynyt käsitellyissä hiirissä hiiren rekombinantti CCL20 verrattuna PBS kontrolleihin (kuvio 4E), mikä viittaa siihen, kriittinen rooli CCL20 CRC kasvua ja kehitystä. Ihmisen CRC potilailla, CCR6 havaittiin myös ilmaistaan ensisijainen CRC-solujen [24]. Siksi lopullista uudistettuun tutkimuksessa olemme oksastetut CMT93 CRC syöpäsolujen osaksi CCR6 – /- hiirissä. Tässä mallissa kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) ei esitä CCR6. Kaksi viikkoa myöhemmin analysoitiin virtaussytometrialla CCR6 ilmentyminen yksittäisten solujen suspensio valmistettiin siirteen CRC. Yhdenmukainen tutkimuksessa ihmisen CRC potilailla [24], totesimme, että CCR6 – /- hiirissä, peräti 73,71% siirteen CRC-soluista ilmensi CCR6 (kuvio 4F). Mitä mielenkiintoisinta on, me havaitsimme, että rekombinanttinen hiiren CCL20 stimuloitiin CMT93 CRC solujen kasvua suoraan aktivoimalla CCR6 kasvainsoluihin puuttuessa CCR6
+ TIL in CCR6 – /- hiirissä (kuva 4G). Tämä CCL20 välittämä vaikutus on todennäköisesti tapahtua houkutella Treg-solujen kasvaimen massaan tai suoraan stimuloimalla CRC syöpäsoluja tai molemmat.
Hiiri peräsuolen solulinjan, CMT 93 (1 x 10
6) tai ilman 0,5gg hiiri yhdistelmä-hiiri CCL20 100 pl PBS injektoitiin sc osaksi FoxP3
GFP hiiriä, ja 0,5 ug yhdistelmä-hiiri CCL20 100 pl PBS injektoitiin s.c. viikossa 28 päivää. Ohjaus FoxP3
GFP hiirille annettu ainoastaan 100 ui PBS: ää injektiona. (A) Normaali FoxP3
GFP hiiren käytettiin tekniikan ohjaus. (B, C) Vihreä fluoresenssi FoxP3
GFP + soluja hiirissä, joita käsiteltiin PBS: ää tai hiiren rekombinantti CCL20 (valkoinen nuoli) seurattiin käyttämällä IVIS Imaging System päivänä 28. (D) määrä sekä kasvaimeen infiltroivien FoxP3
GFP + Treg-solut, jotka ovat peräisin oksastetun CRC hiirissä, joita käsiteltiin PBS: llä tai hiiren rekombinantti CCL20 analysoitiin virtaussytometrialla. (E) koot kasvaimet mitattiin mittaharpilla tällä ilmoitettuina ajankohtina 28 päivää. Injektio hiiren rekombinantti CCL20 johti merkittävään kasvaimen koossa (n = 5). (F) Expression tasot CCR6 mukaan oksastettujen CRC CCR6 – /- hiirissä. (G) CMT 93 (1 x 10
6) kanssa tai ilman 0,5 ug hiiren yhdistelmä-hiiri CCL20 100 pl PBS injektoitiin s.c. osaksi CCR6 – /- hiirissä, ja 0,5 ug yhdistelmä-hiiri CCL20 100 ui PBS: ää tai 100 ui PBS: ää injektoitiin s.c. klo joka toinen päivä 21 päivän ajan. Kasvaimen paino CRC mitattiin kokeen lopussa. Edustavat tiedot näkyvät joka oli toistettu 3 itsenäisestä kokeesta. *
p
0,05, **
p
0,01, Studentin
t
testiä.
valikoiva ehtyminen makrofagien CD11b -DTR hiiret väheni CCL20 kasvain tasoilla, tukossa CCR6
+ Treg-solujen rekrytointi kasvaimeen massaan ja esti kasvaimen kasvua
CD11-DTR siirtogeenisiä hiiriä on CD11 promoottori välittämää ilmentymistä ihmisen difteriatoksiinin (DT ) -reseptorin, ja tämä indusoituva järjestelmä valikoivasti kuluttaa makrofagit
in vivo
kun DT pistetään [25]. Sen tutkimiseksi,
in vivo
DT hoito voisi poistaa TAMeja in CMT93 siirteen CRC mallia, ensin pistetään DT tai DT
MU pitoisuutena 25 ng /g hiiri paino yhtä vuorokautta ennen varttaminen CMT93 vuonna CD11b -DTR siirtogeenisiä hiiriä. Sen jälkeen olemme käsitellyistä hiiristä DT: n tai DT
mu pitoisuutena 5 ng /g kolmen päivän välein 14 päivää. Yhteisymmärryksessä muiden kanssa, osoitimme, että DT valikoivasti köyhdytettyä F4 /80
+ makrofagien 24 tuntia injektion jälkeen, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta T-soluihin, neutrofiilit, syöttösolut tai kypsyvät Langerhansin solut /dendriittisolut (tuloksia ei ole esitetty) [ ,,,0],26]. Lopussa kokeen, meidän data paljasti, että DT hoito kokonaan eliminoitu F4 /80
+ TAMeja CRC verrattuna DT
MU injektio (kuvio 5A, B). Olemme edelleen tutki CCL20 ilmaisun kasvainkudoksessa peräisin hiiristä hoidettiin DT, huomasimme, että valikoiva ehtyminen makrofagien johtivat vähentyneen merkittävästi sekä CCL20 mRNA tasolla (kuvio 5C) ja CCL20-proteiinin taso (kuvio 5D) kasvainmassan verrattuna DT
mU hoitoa. Sen tutkimiseksi, TAM edistää vapautumista CCL20 peräisin CMT93 kasvainsoluja
in vivo
, me oksastettu GFP
+ CMT93 kasvainsolujen CD11-DTR siirtogeenisiä hiiriä. Käsittelyn jälkeen DT: n tai DT
MU 14 päivää, havaitsimme, että valikoiva ehtyminen TAMeja ilmeisesti inhiboi CCL20 mukaan CMT93
GFP hiiren kasvainsoluja, viittaa siihen, että TAM eivät ole vain merkittävä lähde CCL20 mutta myös selvästi edistää vapautumista CCL20 CRC soluista hiirissä (kuvio 5E). Lisäksi osoitimme, että DT hoito ei laskenut CCR6 ilmentymisen CMT93
GFP hiiren kasvainsoluihin verrattuna DT
MU (Kuva 5F). Kuitenkin hiiren CRC solut ovat alhaiset CCR6 ilmaus ennen oksastamalla isännät (kuvio 5F). Tärkeintä on, makrofagien ehtyminen antamalla DT johti huomattavaan määrän vähenemiseen kasvaimen infiltroituneen FoxP3
+ Treg-soluja (kuvio 5G, H). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TAM tukevat kertyminen CCR6
+ kasvainta infiltroituneen Treg-soluja, ja ainakin osittain tämän mekanismin kautta, edistää vapautumista CCL20 CRC hiirillä. Lopulta huomasimme, että valikoiva poistaminen TAMeja dramaattisesti esti kasvua CRC hiirillä (kuvio 5I, J), jotka osoittavat kriittistä kasvaimen edistävää roolia TAMeja CRC hiirimallissa.
(A, B) Flow sytometrinen analyysi TAMeja peräisin oksastettu CRC CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
mU tai DT. (C) CCL20 mRNA tasot oksastetun CRC CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
MU tai DT (tiedot 5 hiirtä kustakin ryhmästä yhdistettiin yhteen). (D) lysaatit oksastettujen CRC CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
MU tai DT alistettiin western blotting varten CCL20 ilmaisun. Aktiini – kuormituksen valvonta. (E) immunofluoresenssi anti-hiiri-CCL20 suoritettiin jääleikkeet GFP
+ CMT93 oksastettu syöpäkasvaimen johdettu CD11-DTR hiiriä, joihin injektoitiin DT
mu tai DT 14 päivää. (F) virtaussytometrianalyysin CCR6 ilmaisun GFP
+ CMT93 soluja ennen siirtämisestä (vasen paneeli), ja CCR6 värjäytymisen kryoleikkeet GFP
+ CMT93 oksastettu syöpäkasvain johdettu CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
mu tai DT 14 päivää (keskimmäinen ja oikea paneeli). (G, H) lukumäärä kasvainta infiltroituneen FoxP3
+ Treg-solujen oksastettu CRC CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
MU tai DT. (I) CRC oksastettaisiin CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
MU tai DT 14 päivää. (J) Kasvaimen paino CRC oksastettu CD11-DTR hiiriin ruiskutettiin DT
MU tai DT 14 päivää. Edustavat tiedot näkyvät joka oli toistettu kaksi riippumatonta koetta.
Keskustelu
synnynnäisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmän voivat edistää kasvainten kehitystä tulehduksen-riippuvainen mekanismeja [2], [27 ]. Tämä tapahtuma on koordinoi monia tulehdussoluja, joukossa FoxP3
+ Treg-solujen ajatellaan tukahduttaa T-solun immuniteetin kasvaimeen liittyviä antigeenejä ja helpottaa kasvaimen etenemiseen [4]. FoxP3 on kaikkein lopullinen valmistaja Treg-solujen, ja sen havaitseminen saattaa mahdollistaa ymmärtää paremmin mekanismeja, joiden kautta Treg-solut ovat mukana autoimmuunisairauksien ja tarttuvien tautien sekä elinsiirron ja kasvainimmuniteetin [28]. Vaikka monet tutkimukset ovat keskittyneet roolista Treg-solujen valvontaan itsensä reaktiivisuus, on yhä enemmän todisteita osoittaa, että Treg-solut on merkittävä vaikutus isännän vaste syöpään [29], [30], mukaan lukien CRC [31], [32]. Aiemmin raportoitu, että potilailla, joilla on korkeat taajuudet soluttautua CD3
+ T-solut niiden Kolorektaalituumorien on ajateltu on parempi 5 vuoden pysyvyys (73%) kuin ne, joilla on alhainen CD3
+ T solut (30%) [33]. Kuitenkin tämän CD3
+ T-solujen populaation, lukuun ottamatta efektori-T-solujen, Treg-solujen katsotaan tukahduttaa kasvaimen vastaisen immuunivasteen potilailla, joilla on CRC [34]. Tässä tutkimuksessa olemme myös vahvistaneet, että FoxP3
+ Treg-solut ovat erittäin kertynyt mikroympäristön CRC hiirimallissa, tukee käsitystä, että läsnäolo Treg-solut voivat sallia paon syöpäsolujen immuunivalvonnan sytotoksiset T- lymfosyyttejä CRC potilailla.
kuten muutkin ihmisen sairauksien, hiiri malleja käytetään laajasti selvittämiseksi mekanismeja paksusuolen syövän synnyn (aloittamisesta, edistäminen ja eteneminen) sekä tutkimuksia kemopreventiossa ja intervention [35]. Tässä me aiheuttama CRC C57BL /6J hiiriä MNU ja H.
pylori
tutkia Treg-solujen ihmiskaupan, erilaistumisen ja toiminnan. MNU on suora alkyloiva aine, joka ei edellytä metabolista aktivaatiota ja näin on voimakas ajankohtainen karsinogeeneja [21]. Olemme löytäneet käytettyä strategiaa induktioon CRC hiirillä on varsin tehokas kuin 85% hiiristä käytettiin tässä tutkimuksessa kehitettiin nähtävissä CRC alla haaste MNU ja H.
pylori
(julkaisemattomia havaintoja).
Evidence tukeva keskeinen rooli FoxP3
+ Treg-solujen kasvain immuuni kiertäminen tulee tutkimuksista häivyttivät Treg-solut ennen kasvain haaste. Tämä käsittely johti kasvaimen hyljinnän useissa hiiren kasvain mallit [10], [36], [37], [38]. Kuten ihmisen asetukset [34], lisääntynyt määrä Treg-soluja havaittiin sekä perifeerisen veren (kuvio S2) ja kiinteää kasvaimia hiirissä, joita käsiteltiin MNU ja H.
pylori
verrattuna normaaliin paksusuolen käsittelemättömiä hiiriä . Mitä mielenkiintoisinta, kiinteissä kasvaimissa peräisin hiiristä käsiteltiin MNU ja H.
pylori
, taajuus CD4
+ FoxP3
+ Treg-soluissa oli keskimäärin 9,095% koko TIL, mikä viittaa siihen, että nämä kertyneet Treg-solut voivat käyttää yhteisenä immuuni kiertämistä mekanismi estää immuunitutkimusohjelmasta vastaan autologisia kasvainsoluja. Treg-solut suorittaa tärkeä tehtävä rajoittamaan autoimmuniteetin ja niin kohdistaminen Treg-solujen siirtyminen voi toimia uutena ja edullinen lähestymistapa immunoterapiassa yleinen syövän etenemiseen. Lisäksi olemme havainneet joitakin CD4
– soluja, jotka ilmentävät FoxP3 kasvaimen massan. Alkuperä CD4
-FoxP3
+ soluja toimitetaan tulevaisuudessa tutkimuksessa.
Toimiakseen tehokkaasti kasvaimen mikroympäristössä, Treg-solujen on siirryttävä ja toimivat eri lymfaattisessa ja ei- imukudoselimissä. Samanlainen efektori-T-solujen populaatioita, Treg-solujen populaatiot jaetaan sen perusteella, niiden ilmentymisen itseohjautuvat reseptorit alaryhmiin, joiden ennuste- siirtää valikoivasti tiettyihin kudoksiin [39]. Tutkimukset ihmisen munasarja- syöpiä ovat paljastaneet, että Treg-solut kotiin kasvaimen massan ja askites
kautta
CCR4 vastauksena kasvaimen solu- ja TAM-johdetut CCL22 [15]. Silti, kehittyvien näyttöä on siitä, että lukuun ottamatta CCR4 muulla kemokiinin reseptorit liittyvät ohjaavat Treg-solujen ihmiskaupan erityyppisiä kasvaimia sekä ihmisen ja hiirten [17], [40]. Näin ollen, kemokiini-reseptorin ilmentymisen kuviot näyttävät olevan hyvin heterogeeninen sisällä reuna FoxP3
+ Treg-solupopulaatio [11]. Tähän mennessä yksikään homing-reseptori on tunnistettu, joka on erityisesti ilmaistaan Treg-solut. Kuitenkin joukossa CD4
+ T-solujen, kemokiinireseptori CCR6 pääasiassa ilmaistaan Treg-solujen erilaisten tulehdustautien asetuksista [41]. Samoin CCR6 ligandi CCL20 ilmentävät konstitutiivisesti suolen epiteelisolujen ja yliaktiivista epiteelisoluissa tulehduksen aikana [42].