Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

PP2A on seriini /treoniini fosfataasi kriittisiä fysiologisia prosesseja, kuten apoptoosin . Cell tunkeutuva peptidit ovat molekyylejä, jotka voivat siirtävät soluihin aiheuttamatta kalvon vaurioita. Tavoitteena oli kehittää solu-tunkeutuva fuusiopeptidien suunniteltu häiritä kaspaasi-9 /PP2A vuorovaikutusta ja arvioida niiden terapeuttista potentiaalia

in vitro

ja

in vivo

.

Koejärjestely

tuotti peptidin, joka sisältää tunkeutuva sekvenssin liittyy vuorovaikutukseen motiivin välillä ihmisen kaspaasi-9 ja PP2A (DPT-C9h), jotta kohdentamaan -alueella. Käyttämällä kasvainsolulinjoja, primäärisistä ihmisen solut ja primaariset ihmisen rintasyöpä (BC) ksenografteja, tutkimme kapasiteettia DPT-C9h herättää apoptoosia in vitro ja kasvaimen kasvun inhibitiota (TGI)

in vivo

. DPT-C9h oli vatsaontelon sisäisesti annoksina 1-25 mg /kg /vrk 5 viikkoa. Suhteellinen Kasvaimen Volume (RTV) laskettiin.

Tulokset

osoittaneet, että DPT-C9h kohdistaa kaspaasi-9 /PP2A vuorovaikutus

in vitro

ja

in vivo

ja indusoi kaspaasi-9-riippuvaista apoptoosia syöpäsolulinjoissa. DPT-C9h myös indusoi merkittäviä TGI BC ksenografteissa malleissa. Hiiren peptidi DPT-C9 indusoi myös TGI keuhkojen (K-Ras malli) ja rintasyöpä (PyMT) malleja. DPT-C9h on erityinen vaikutus transformoituja B-soluja eristettiin krooninen lymfaattinen leukemia potilailla, joilla ei mitään vaikutusta ensisijaisesti terveitä soluja. Lopuksi, ei ole myrkyllisyyttä eikä immunogeenisiä vasteita.

Johtopäätös

käyttäminen solun läpäisevä peptidien kaspaasi-9 /PP2A vuorovaikutus, olemme osoittaneet, että DPT-C9h oli voimakas terapeuttinen vaikutus

in vitro

ja

in vivo

hiirimalleissa syövän etenemisen.

Citation: Arrouss I, Nemati F, Roncal F, Wislez M, Dorgham K, Vallerand D, et al. (2013) kohdentaminen kaspaasi-9 /PP2A Vuorovaikutus Potential New Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (4): e60816. doi: 10,1371 /journal.pone.0060816

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 lokakuu 2012; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Arrouss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos Inserm ja Institut Curie rahoitukseen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Apoptoosi on geneettisesti ohjelmoitu solukuolema ja sen vapauttaminen liittyy muun patologioita, joissa syöpiä. Useat fosfataasit ovat viime aikoina tullut houkuttelevia kohteita hoidettaessa erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien syöpiä [1], [2], [3], [4]. Kuitenkin ainoa kliininen lääkkeiden kohdistettu fosfataasi ovat immunosuppresssive syklosporiini A: n ja FK506, jotka estävät seriini /treoniini fosfataasi 2B (kalsineuriini) ja NFAT aktivointi [5], [6], [7], [8], [9]. Mutta pitkäaikainen käyttö nämä lääkkeet voivat aiheuttaa ei-toivottuja sivuvaikutuksia [10].

Ser /Thr fosfa- PP1 ja PP2A ovat sekaantuneet niin solukuoleman induktioon kautta 1) defosforylointia Bad [11 ] ja kaspaasi-9 [12] 2) stimulaation sytokromi

c

julkaisu [13], ja 3) defosforyloimalla retinoblastoomaproteiiniin [14], [15]. Kuitenkin nämä fosfataasit enimmäkseen hallita fosforylaation taso Bcl-2 ja kaspaasi-9, joka määrittää toiminnalliset ominaisuudet [16], [17], [18]. Toisaalta, esto PP1 [19], PP2A [20], tai PP2C [21] laukaisee solukuoleman, mikä osoittaa myös mahdollinen anti-apoptoottisen funktion näiden fosfataasien, ja osoittaa monimutkaisen vuorovaikutuksen fosfataasin toimia. Olemme aiemmin osoittaneet vuorovaikutusta kaspaasi-9 ja PP1α. Tässä monimutkaisessa, aktivoitu PP1α indusoi kaspaasi-9 defosforyloinnilla, ja sen seurauksena, sen aktivointi johtaa apoptoosin [12]. Olemme havainneet tämän monimutkaisen, lisäksi PP1αactivity, toinen okadahappo herkkiä entsyymiaktiivisuus yhteensopiva PP2A toimintaa, mikä viittaa mahdolliseen vuorovaikutukseen kaspaasi-9 ja PP2A jotka saattavat olla mukana solukuolemaan asetuksessa.

Cell tunkeutuva peptidejä (CPP) ovat molekyylejä, jotka voivat siirtävät soluihin aiheuttamatta kalvon vahinkoa, mikä johtaa niiden ehdotettu käyttö vektoreina terapeuttisten lastin [22]. Nämä peptidit voivat ylittää kalvon ja päästä sytoplasmassa ja /tai tumassa [23]. Käyttämällä CPP, olemme aiemmin raportoitu kokeellista näyttöä todisteena mukainen lääke fosfataasin teknologia (DPT), [24], [25].

Tältä pohjalta päätimme analysoida, modulaatioon PP2A ja kaspaasi-9 vuorovaikutus saattaa vaikuttaa induktion kasvainsolun deathing vaikuttamatta terveitä soluja, ja osoittivat DPT-C9h ja DPT-C9 vastaavat sitoutumiskohdat ihmisen ja hiiren kaspaasi-9 ja PP2A vastaavasti, on erityinen anti -tumour vaikutus.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja kulttuuri

Ihmisen Daudi, Jurkat, ja HeLa solulinjoja viljeltiin RPMI täydennetty 10% FCS. LKR10 ja LKR13 on aiemmin kuvattu [26], ja viljeltiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FCS: ää. Ihmisen rintasyöpä (BC), uveal melanooma (UM), ei pienisoluinen keuhkosyöpä, ja pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat on eristetty ensisijainen ihmisen syövän ksenograftien [27], [28], [29]. Kolme UM solulinjat on saatu suoraan potilaiden. BC solulinjoja viljeltiin DMEM tai RPMI 10%: sta 20% FCS: ää, lukuun ottamatta HBCx-15, joka oli täydennetty 10% hevosen seerumia. UM ja keuhkosyövän solulinjoja viljeltiin RPMI, jota oli täydennetty 10% tai 20% FCS: ää, vastaavasti. BC ja UM solulinjat eristetään suoraan vastaavasta kasvaimesta. Daudi, HeLa- ja Jurkat solulinjat saatiin kokoelmasta Department.

Immunosaostaminen ja western blot

immuunisakkautuksen ja western blot tehtiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [12]. Anti kaspaasi-9, ja anti-PP2A vasta ostettiin Santa Cruz, Cell Signalling, Sigma tai Abcam. Anti-Tim 23 ja anti Cyt c saatiin Transduction Laboratories.

Peptidisynteesi ja sekvenssin

Peptidit syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [30].

havaitseminen apoptoosin anneksiini värjäys

Apoptoosi havaittiin anneksiini V-FITC: llä värjäyksen mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti (BD Bioscience).

kaspaasi-9 -aktiivisuuden

kaspaasi-9 aktiivisuutta havaittiin käyttämällä kaspaasi-Glo 9 kit (Promega) ja sen jälkeen valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Serum entsyymi-immunologinen määritys (seerumin ELISA) B

ELISA-testi suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [31], [ ,,,0],32].

Miochondrial kalvojännite- määritys

havaitsemiseksi muutosten mitokondrion kalvon potentiaalia, käytimme Cell Meter JC-10 iinianalyysikitissä jälkeen valmistaa suositusten.

Solusyklianalyysiä

yhteensä 1 x 10

6 solut kiinnitettiin etanolissa 70% 1 tunti 4 ° C: ssa. Solut sentrifugoitiin ja pestiin värjäyspuskurissa (DPBS /2% FCS). Pesun jälkeen soluja käsiteltiin 50 ui RNAasi (1 mg /ml kantaliuos) ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Solut värjättiin 5 ug propodim jodidia 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solujen DNA pitoisuus analysoitiin FACS.

eristäminen Mitochondria murto

Yhteensä 40 x 10

6 solua pestiin jäähdytetyllä PBS. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 5 tilavuuteen jääkylmää puskuria A (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF: , 250 mM sakkaroosi), johon oli proteaasinestäjät. Solut hajotettiin Dounce- homogenisaattorilla, tumat sentrifugoitiin (1000 x g, 10 min, 4 ° C), ja supernatantti sentrifugoitiin edelleen (10000 G, 10 min, 4 ° C), mitokondrioiden pelletti suspendoitiin uudelleen puskuriin A ja säilytettiin -80 ° C.

eristäminen solupopulaatioiden

tuore veri terveiltä luovuttajilta keräsivät Etablissement Francais du Sang. Krooninen lymfosyyttinen leukemia (CLL) näytteet saatiin Hematologia yksikön Pitié Salpêtrière sairaalaan. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) eristettiin potilailta tai terveiltä luovuttajilta pidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FCS, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 1% Hepesiä, 1% natriumpyruvaattia ja 1% glutamiinia. B-solut eristettiin käyttäen Dynal negatiivinen eristyspakkausta (Invitrogen). Puhtaus eristetty solut saavuttivat jopa 98%. Ihmisen lymfosyytit eristettiin värjättiin anti-hCD19-AP ja varhaisen apoptoosin tapahtumia määritettiin anneksiini-V-FITC.

In vivo

malleissa Ihmisen primäärisen tuumoriksenografteja

primaaristen ihmisen rintasyöpä (BC) ksenograftit saatiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [27], [28], hiiren rintasyöpä kasvaimia saatiin käyttämällä siirtogeenisiä

polyomasta Lähi-T

Mouse PyMT malli [33]. Spontaanisti kasvava nisäkasvainten esiintyvät hiiret ksenosiirrettyjä osaksi

nude

immuunivajaisiin hiiriin jotta farmakologisen arviointeja, ja ylläpidetään

nude

hiirtä

nude

hiiri sarjatuotantona kulkee.

hiiri malli ensisijainen keuhkojen adenokarsinooma mutatoitu

K-ras

K-ras

LA1 hiiret toimitti NCI Mouse mallit ihmisen syövissä Consortium (MMHCC) (NCI Mouse Repository /NIH, Rockville, MD). Ne kantavat piilevä

K-ras

alleeli kaksi kopiota eksoni 1: yksi oli villin tyypin ja toinen G12D mutantti (Tyler Jacks). Piilevä alleeli stokastisesti aktivoituu soluissa homologisen rekombinaation kautta, mikä johtaa poistamista villityypin kopion eksonin 1 ja ilmaus onkogeeninen muoto

K-ras

geenin. Multifokaalinen keuhkojen adenokarsinoomia kehittää spontaanisti 100% näiden hiirten.

terapeuttinen määrityksissä

terapeuttista kokeellisia määrityksiä ihonalaisen siirrettyjen ksenografteja (ihmisen primaarisia kasvaimia ja PyMT kasvaimet), 5- 8-viikon ikäisiä Swiss nu /nu-naaraita hiiret saivat ihonalaisen siirteen tuumorifragmentteja, joiden tilavuus on noin 15 mm

3, kuten aikaisemmin on kuvattu [29].

terapeuttista kokeellisia määrityksiä K-ras

LA1 hiiret 16-viikon ikäisiä hiiriä satunnaistettiin ohjaimen välillä (n = 17) tai hoitoryhmässä (n = 16) ja 4 viikkoa. Hiiret punnittiin kerran viikossa. Lopussa hoidon ruumiinavaus suoritettiin lumelääkettä tai hoitoryhmissä ja keuhko- kasvainten laskettiin. Tulokset ilmaistaan ​​kasvaimen määrä /hiiri, keskiarvo ± SEM.

Tuumoritilavuus laskettiin mittaamalla kaksi kohtisuorassa halkaisijat jarrusatulat. Kukin kasvaimen tilavuus (v) laskettiin seuraavien kaavojen: V = axb

2/2, missä a ja b ovat suurimmat ja pienimmät kohtisuorassa kasvain halkaisijat. Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: RTV = (Vx /V1), jossa Vx on tuumorin tilavuus päivänä X ja V1 on tuumorin tilavuus hoidon aloittamisen (päivä 1) .Growth käyrät saatiin piirtämällä keskimääräinen tilavuus RTV Y-akselilla vastaan ​​aika (X-akseli, joka ilmaistaan ​​päivän kuluttua alkaa hoidon), Antituumoriaktiivisuus arvioitiin mukaan kasvaimen kasvun estymistä (TGI), lasketaan seuraavan kaavan avulla: prosenttia GI = 100 – (RTVt /RTVc) x 100, jossa RTVt on väline RTV käsiteltyjen hiirien ja RTVc on mediaani RTV valvonnan sekä tiettynä ajankohtana, kun antituumorivaikutus oli optimaalinen.

DPT- C9h ja DPT-C9 peptidit laimennetaan vedellä /glukoosi (1 25 mg /kg) annettiin vatsakalvonsisäisesti reitti 5-7 päivää viikossa, mukaan mallien ja terapeuttinen aikataulut.

Bioluminescence määritykset

HBCx-12A-solulinja perustettiin päässä HBCx-12A-ksenograftissa ja ylläpidettiin RPMI, jota oli täydennetty 20% vasikan sikiön seerumia ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Solut transdusoitiin lentiviruksen sisältävä supernatantti lusiferaasi [19] ja Ds-Red ja yhteensä 1,9 x 10

6 soluja, jotka ilmentävät Ds-RED-Luc istutettiin ihonalaisesti

nude

hiirissä. Kasvua kasvain mittaamalla tulkilla ja optisen kuvantamisen.

Bioluminescence kuvantaminen suoritettiin IVIS kuvantamisjärjestelmä (IVIS100, Caliper Life Sciences, USA). Nukutettiin hiiriin injektoitiin i.p. kanssa lusiferiini 150 mg /kg. Imaging hankinta aika oli 1 s 1 min, riippuen bioluminisenssimääri- signaali. Analyysi suoritettiin käyttäen ohjelmistoa Living Image V. 2,50 (Caliper Life Sciences).

Tilastolliset testit

in vivo

kokeiluja ”analyysit, tilastollista merkitystä välisistä eroista yksittäisten RTVs vastaa ryhmän käsiteltyjen hiirten ja kontrolliryhmässä, jossa 9-10 hiirtä per ryhmä on sisällytetty, laskettiin pariksi Studentin t-testiä [29]. K-ras

L1 hiirimallissa, käytämme Mann Whithney testi.

Peptidit järjestyksessä

DPT-SH1: VKKKKIKREIKI

C9: YIETLDGILEQWARSEDL

C9h: YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPT-C9h: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPC-C9: VKKKKIKREIKI YIETLDGILEQWARSEDL

DPT-C9h Mut: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQAAHSEDL

Kaikki peptidit solubilisoitiin steriili vesi.

Koemenettely ja eläinsuojina olivat vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti ehdottaman Ranskan eettinen komitea (sopimus B75-05-18, Ranska). Ei suostumus tarvittiin tätä tutkimusta varten. Kaikki Leikkaus suoritettiin yhteensä zylazine /ketamiinianestesiassa ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Kaikki potilaat olivat aiemmin antaneet tietoisen suostumuksen kokeellisen tutkimuksen jäljellä kasvainkudoksen jälkeen käytettävissä histophatologic ja sytogeneettisen analyysejä. KLL näytteet ovat kasvaimen jäämät ja potilaat antaneet tietoisen suostumuksensa. Tämä tutkimus ei suoritettu ulkopuolella maamme. Etiikkaa valiokunnat hyväksyvät tämän menettelyn.

rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Tulokset

DPT -C9h peptidi estää kaspaasi-9 /PP2Ac vuorovaikutukseen rintasyövän solulinjoissa

Olemme aiemmin määrittäneet sitoutumiskohta ihmisen ja hiiren kaspaasi-9 PP2A (patentti PCT-EP2010 /054134, kotisivuilta: espacenet .com tai worlwide.espacenet.com varten peptidisekvenssi, katso materiaalit ja menetelmät) ja niihin liittyvät tämä vuorovaikutus motiivi soluun läpäisevä sukkula [24], [25]. Jotta kohdentaa kaspaasi-9 /PP2Ac vuorovaikutus, päätimme käyttää patentoitua sisältävän peptidin aiemmin julkaistu tunkeutuu järjestyksessä liittyvät paikalle vuorovaikutus hiiren (DPT-C9) tai ihmisen (DPT-C9h) kaspaasi-9. Kontrolleina, me syntyy shuttle DPT-SH1 yksin, peptidit C9 ja C9h, joka ei sisältänyt sukkulan ja peptidi DPT-C9h mut, jossa on mutaatio kaspaasi-9 /PP2A sitovan sekvenssin, ja joka ei sitoudu PP2A (tuloksia ei ole esitetty).

Olimme ensimmäinen kiinnostuneita vahvistetaan, että tietty kohde DPT-C9h peptidi oli monimutkainen kaspaasi-9 /PP2A. Tätä varten analysoimme onko ihmisen peptidi DPT-C9h wasable kohdistaa

in vivo

ja

in vitro

kaspaasi-9 /PP2A vuorovaikutusta. Sillä

in vivo

kilpailua, lysaatit ohjaus käsittelemättömän tai DPT-C9h-käsitellyn HBCx-12A-solut immunosaostettiin anti-kaspaasi-9-vasta-ainetta ja, kun läsnä on kaspaasi-9 /PP2A kompleksi analysoitiin western blot . Kuvio 1A osoittaa, että kompleksin määrä havaittu DPT-C9h-käsitellyissä soluissa on voimakkaasti alentunut verrattuna ei-käsiteltyihin kontrollieläimiin soluja. Sillä

in vitro

kompetitiomäärityksessä, lysaatit HBCx-8-solut immunosaostettiin anti-kaspaasi-9-vasta-aineen ja vuorovaikutus PP2A kilpaili DPT-C9h peptidi (kuvio 1A). PP2Ac havaittiin ohjaus kaspaasi-9 immunosaostumissa, kun se oli lähes mahdoton havaita jälkeen kilpailun 1,5 mM DPT-C9h peptidi. Molemmissa, (

in vitro

ja

in vivo

kilpailuissa), kaspaasi-9 /PP2A kompleksi ei ole muutettu sukkulan DPT-SH1 (kuvio 1 B). Tämä viittaa vahvasti siihen, että DPT-C9h peptidi kohdistuu erityisesti vuorovaikutukseen ihmisen kaspaasi-9 ja PP2Ac.

)

In vivo

kilpailua kaspaasi-9 /PP2Ainteraction. HBCx-12A rintasyövän solulinjaa viljeltiin 24 h: n läsnä tai poissa (kontrolli) DPT-C9h (100 uM); solut hajotettiin ja sytoplasman uutteita immunosaostettiin anti-kaspaasi-9-vasta-aineen ja immunoblotattu anti-PP2Ac ja anti-kaspaasi-9-vasta-aineita.

In vitro

kilpailussa kaspaasin 9 /PP2A vuorovaikutusta. Sytoplasmisen lysaatit HBCx-12A-solut immunosaostettiin anti-kaspaasi-9-vasta-aine; kaspaasi-9 /PP2Ac vuorovaikutus kilpaili

in vitro

1,5 mM DPT-C9h peptidi 30 min huoneenlämmössä; Immunosaostumat pestiin ja immunoblotattiin anti-PP2Ac ja anti-kaspaasi-9, viimeksi mainittu sisäisenä kontrollina proteiinia loading. B) toinen HBCx-12A solulinjaa viljeltiin läsnä ollessa tai puuttuessa (kontrolli) sukkulan DPT-SH1 (100 uM) 24 tunnin ajan ja

in vitro

ja

in vivo

kilpailu kaspaasi-9 /PP2A vuorovaikutus analysoitiin kuten edellä.

Lävistyselintä peptidit DPT-C9 ja DPT-C9h aiheuttaa lajikohtaisia ​​apoptoosin

Analysoimme kykyä kaksi läpäisemään peptidit DPT-C9h ja DPT-C9, sekä negatiivisena kontrollina peptidit C9, C9h ja DPT-SH1 apoptoosin. Kuten kuviossa 2A, DPT-C9h aiheuttaman apoptoosin, havaittuna anneksiini V värjäys ihmisen Daudi, Jurkat, ja HeLa-solulinjojen kun 20 h hoidon, kun taas C9 ja C9h peptidejä ilman shuttle ja sukkula yksin, ei indusoida apoptoosia ihmisen solulinjoissa. Samoin DPT-C9h peptidi ei ollut apoptoottista vaikutusta hiiren keuhkosyöpä solulinjat LKR10 ja LKR13, kun taas peptidi DPT-C9, joka on spesifinen hiiren kaspaasi-9 indusoi apoptoosia sekä solulinjoissa, kun 24 h hoito ( Kuva 2B). Lisäksi meillä ei havainnut apoptoottista vaikutusta hoitoon solulinjojen kanssa sukkula (kuvio 2B). Pohjapinta apoptoosin taso ei-käsiteltyjen kontrollisolujen on myös esitetty. Nämä tulokset tukevat voimakkaasti lajien erityispiirteet sekä DPT-C9 ja DPT-C9h peptidejä.

A) Daudi, Jurkat, ja HeLa solulinjoja viljeltiin läsnäollessa DPT-C9h, DPT-SH1, C9h, tai C9 peptidit 20 tuntia 100 uM ja apoptoosi arvioitiin anneksiini-V-värjäyksellä. B) Hiiren keuhkosyövän solulinjat LKR10 ja LKR13 viljeltiin, kun läsnä on DPT-C9h, DPT-C9 tai DPT-SH1 100 uM. 24 tunnin inkubaation, apoptoosi arvioitiin anneksiini värjäys. Pohjapinta taso apoptoosin valvonnan ei-käsitellyt solut näytetään. P-arvot esitetään myös (* 0,05; ** 0,001; *** 0,0001). C) Breast, uveal melanooma ja keuhkosyövän solulinjat eristetty primäärisistä ihmisen xenografs viljeltiin läsnä ollessa tai poissa ollessa DPT-C9h peptidi (100 uM) 24 tunnin ajan, ja apoptoosi arvioitiin anneksiini V-FITC: llä. Perustason apoptoosin ilman peptidin lisäys näkyy (harmaa väri) p-arvot näkyvät. D). Rintasyövän solulinjat on johdettu primäärisistä ihmisen ksenografteja, inkuboitiin C9h kasvatusväliaineeseen 150 uM ja apoptoosin arvioitiin eri aikoina. E) Rintasyöpä solulinjoja eristettiin primäärisistä ihmisen ksenografteja BCx-3 ja BcX-12 viljeltiin läsnä ollessa tai puuttuessa (kontrolli) peptidin DPT-C9h 24 h ja apoptoosi arvioitiin.

käyttäen ihmisen rinta-, uveal melanooma, ei-pienisoluisen keuhkosyövän ja pienisoluinen keuhkosyöpä saatujen solulinjojen primäärisistä ihmisen ksenograftimalleissa, testasimme apoptoottinen vaikutus sekä DPT-C9h ja C9h peptidejä. Apoptoosi analysoitiin myös kaupallisessa rintasyövän solulinjoissa. Kaikissa solulinjoissa analysoitiin, DPT-C9h indusoitua apoptoosia, jotka vaihtelevat 20-75%, kun 24 tunnin viljelyn (kuvio 2C), kun taas mitään vaikutusta ei havaittu sen jälkeen, kun C9h rintasyöpähoito solulinjojen (kuvio 2D). Apoptoosin valvonnan ei-käsitellyt solut olivat 3-8%. Täydentävä lisäys DPT-C9h peptidi 27H alkuhoidon jälkeen voimakkaasti lisääntynyt apoptoosin taso (tuloksia ei esitetty). Kuvio 2E esittää kahta edustavaa apoptoosin histogrammi tonttien kahden solulinjoista eristettiin ihmisen rintasyövän ksenografti- HBCx-3 ja HBCx-12A mallit käsitelty 24 tuntia tai ilman (kontrolli) DPT-C9h peptidi. Yhdessä nämä tulokset osoittavat vahvasti

in vitro

antituumorivaikutus on DPT-C9h peptidin erilaisissa ihmisen solulinjoissa.

esto kaspaasiaktiivisuus lohkojen apoptoottista vaikutusta DPT-C9h

Koska initiaattori kaspaasi-9 on tärkeä välittäjä apoptoosin, olemme analysoineet kykyä DPT-C9h aktivoida kaspaasi-9 ihmisen rintasyövän solulinjan HBCx5. Soluja inkuboitiin peptidin kanssa ja kaspaasi-9-aktiivisuus arvioitiin eri aikoina. Olemme havainneet kasvua kaspaasi-9: n aktiivisuutta DPT-C9h käsiteltiin-solulinjassa (kuvio 3A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä solulinjoja uveal melanooman ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, käyttämällä kaspaasi-inhibiittori z-VAD, havaitsimme lasku kaspaasi-9 toimintaa.

A) HBCx-3-soluja viljeltiin 3 tai 6 h väliaineen (kontrolli), 100 uM ja DPT- C9h tai 10 uM kaspaasiestäjä Z-VAD (pre inkuboitu 1 h) ja 100 uM DPT-C9h. Kaspaasi-9 aktiivisuus arvioitiin käyttäen luminogeenisen alustaan. Tulokset esitetään vertailuryhmään nähden ei-käsiteltyjen solujen mielivaltaisia ​​yksiköitä. P-arvot näkyvät. B) HBCx-3-soluja viljeltiin 24 tunnin ajan väliaineessa (kontrolli), DPT-SH1 (100 uM), DPT-C9h (100 uM) tai Z-VAD (10 uM, pre inkuboitu 1 h) ja DPT-C9h ( 100 uM). Apoptoosi arvioitiin anneksiini-V-FITC sitova. C) HBCx-3-soluja käsiteltiin eri ajanjaksoja DPT-C9h (100 uM) ja inkuboidaan sitten 30 minuuttia 37 ° C: ssa valolta suojattuna kanssa fluoresoiva koetin JC-10. Vihreä ja punainen fluoresenssi mitattiin. Data esitetään suhteessa kontrolliin ei-käsiteltyjen solujen. P-arvot näkyvät. D) HBCx-12A ja HBCx-3 solulinjoja käsiteltiin 24 h ajan 100 uM DPT-C9 h. Mitokondriofraktiosta erotettiin kokosolulysaateista ja immunoblotattu sytokromi

c

. WB hybridisoitiin myös mitokondriaalisen merkki Tim23 sisäisen valvonnan proteiinia lastaus. E) HBCx-3-soluja ei-käsiteltyjen (kontrolli) tai käsiteltiin 10 tai 25 uM DPT-C9h 24 tai 48 tuntia ja solusyklin analysoitiin FACS: lla.

Sen määrittämiseksi, aktivoitu kaspaasi-9 on osallisena apoptoottisten toiminnan DPT-C9h, olemme analysoineet vaikutus kaspaasien inhibiittorin Z-VAD solujen apoptoosia havaita anneksiini-V-FITC sitova. Kuten on esitetty kuviossa 3B, kaspaasi-inhibiittori vähentää merkittävästi indusoiman apoptoosin peptidi. Hoito Solujen sukkulan tai estäjä yksin ei indusoi apoptoosia (kuvio 3B).

DPT-C9h indusoi mitokondrion kalvon depolarisaation ja sytokromi

c

julkaisu vaikuttamatta solusyklin

karakterisoimiseksi DPT-C9h: n indusoiman apoptoosin, tutkimme osallistumista mitokondrioita. Fluoresenssi perustuva määritys, altistuminen HBCx-5-solut peptidi aiheutti huomattavaan vähenemiseen mitokondrion kalvon potentiaali (kuvio 3C). Vahvista roolin mitokondrioiden DPT-C9h indusoiman apoptoosin, analysoimme onko DPT-C9h indusoi sytokromi

c

julkaisu. Käyttämällä mitokondrion proteiinit ohjaus ei-käsitelty tai peptidi-käsitellyissä soluissa, havaitsimme vapauttamista sytokromi

c myynnissä maassa mitokondriot DPT-C9h käsitellyt solut, kun taas ei-käsiteltyjen kontrollisolujen, sytokromi

c

säilytetään mitokondriofraktiosta (kuvio 3D). Suhde Sytokromi

c Twitter /Tim 23 käytetään sisäisen valvonnan normalisointia ja kvantifiointiin määrä vapautunut Cyt

c.

Nämä tulokset vahvistavat mitokondrioiden implisiittisesti DPT-C9h indusoiman apoptoosin .

Lopuksi analysoidaan onko DPT-C9h peptidi voisi puuttua solusyklin järjestyksessä. Soluja ei käsitelty (kontrolli) tai käsiteltiin eri annoksilla peptidin eri ajanjaksoina kertaa ja solusyklin jakautuminen analysoitiin (kuvio 3E). Käyttämällä

in vitro

osa-apoptoottisen annos peptidiä, osoitimme, että DPT-C9h ei indusoinut kertymistä kasvainsolujen missään vaiheessa solusyklin riippumatta käytetyn pitoisuuden ja ajan analysoitiin (kuvio 3E).

DPT-C9h on vaikutus kasvaimia soluihin, mutta ei terveitä soluja

Krooninen lymfaattinen leukemia (KLL) on ominaista kertyminen monoklonaalisia B-solujen CD5 + hematopoieettisissa elimissä, mikä heijastaa vika apoptoosin. Jotta voitaisiin arvioida apoptoottista vaikutusta DPT-C9h peptidin ensisijainen terveitä ja kasvainsolujen samaa alkuperää, käytimme perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) terveiltä luovuttajilta ja kroonisen lymfaattisen leukemian potilailla (CLL). PBMC: terveistä luovuttajista tai CLL-potilasta hoidettiin 3 tuntia DPT-C9h peptidi, pestiin, suspendoitiin uudestaan ​​täydelliseen elatusaineeseen ilman peptidiä 6 tuntia ja sitten analysoitiin apoptoosin. Kuvio 4A osoittaa, että DTP-C9h on apoptoottinen vaikutus B-soluja CLL mutta ei B-soluja terveiltä luovuttajilta vertailuryhmään nähden ei käsiteltyihin soluihin. DPT-C9h ei ole vaikutusta t, NK ja monosyytit terveistä luovuttajista tai CLL-potilailla. Shuttle DPT-SH1 tai C9h peptidejä yksin ei ollut vaikutusta (tietoja ei esitetty). Lopuksi, samanlainen pro-apoptoottinen vaikutus DPT-C9h peptidin havaittiin, kun B-solut eristettiin luuytimestä CLL (kuvio 4B). Tämä tulos viittaa vahvasti siihen, että vain kasvain B-solut vaikuttavat DPT-C9h hoitoon ilman vaikutusta soluihin terveiltä luovuttajilta, mikä korostaa tiettyjä kasvaimia vaikutus DPT-C9h.

A) Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) terveistä luovuttajista tai CLL viljeltiin, kun läsnä on DPT-C9h (150 uM) 3 h, sitten pestiin, siirrettiin täydelliseen alustaan ​​ja apoptoosi arvioitiin 6h myöhemmin. Valinta B-solujen tehtiin anti-CD19-vasta-ainetta, anneksiini V-FITC-värjäys. Ei-käsitellyt solut käytettiin kontrollina. B) Soluja eristetty luuytimestä CLL ja terveistä luovuttajista käsiteltiin kuten A ja analysoitiin apoptoosin. P-arvot näkyvät.

puute immunogeenistä aktiivisuutta ja

in vivo

myrkyllisyys DPT-C9h ja DPT-C9 peptidien

Koska meidän lopullinen korko on osoittaa, että anti-kasvain vaikutus DPT-C9h ihmisen syöpiin, päätimme analysoida

in vivo

immunogeenisen peptidin aktiivisuutta.

Nude

immuunivajaisiin T-solu-hiiriä käsiteltiin viitenä päivänä viikossa 6 viikon ajan, jonka vatsaontelonsisäisiä DPT-C9h. Seerumit kerättiin eri aikoina ja vasta-aineiden tuotantoa on suunnattu DPT-C9h tai DPT-SH1 analysoitiin. Käyttäen ELISA testi, emme havaitse, että vasta-aineita DPT-C9h tai DPT-SH1 koko kineettinen analysoitu kahteen eri annoksilla peptidin (kuvio 5A). Samoin vasta-ainevaste analysoitu myös immunokompetenteilla hiirillä, jälleen osoittaa vasta-ainetuotannon puutokseen vastaan ​​eivätkä DPT-C9h eikä DPT-SH1 peptidit (kuvio 5B). Tämä tulos viittaa vahvasti siihen, että DPT-C9h peptidi on immunogeeninen liikaa pitkänkään

in vivo

hallinnon immunokompetenteilla tai immunodefficient hiiri malleja.

A) Seerumin vasta otettu karvattomia hiiriä hoidettiin eri aikoina aika havaittiin ELISA: lla kahtena eri pitoisuuksilla DPT-C9h peptidi (10 ja 50 uM). B) Seerumin vasta-aineet villityypin hiiristä hoidettiin eri kausien ajan testattiin ELISA vastaan ​​DPT-C9h ja DPT-SH1 (50 uM). C) DPT-C9h intraperitoneaalisesti hiirille kasvaimia HBCx-12A 1, 5 tai 25 mg /kg kerran päivässä 5 viikkoa; mediaani paino hiiriä kunkin koeryhmän on edustettuna eri aikoina. Kaikkiaan 10 hiirtä otettiin mukaan ryhmää kohti. Samoin, DPT-C9h intraperitoneaalisesti hiirille kasvaimia HBCx-8 10 mg /kg kahdesti vuorokaudessa 4 viikkoa. DPT-C9 oli IP ylläpitäjä klo hiirimallissa PyMT malli annoksena 5 mg /kg. Mediaani paino hiiriä kunkin koeryhmän on edustettuna eri aikoina. Kymmenen hiirtä oli mukana ryhmää kohti.

Ennen

in vivo

terapeuttista arviointia, toksisuus DPT-C9h arvioitiin hiirissä, jotka kantoivat HBCx-8 ja HBCx-12A kasvaimia jälkeen eri aikataulut annon, eli intraperitoneaalisesti injektoimalla 1, 5 tai 25 mg /kg kerran päivässä, tai 10 mg /kg kaksi kertaa päivässä, 4-5 viikkoa. Mitä tahansa annosta, emme havaittu mitään sivuvaikutuksia kaikissa käsitellyissä hiirissä, sekä täydellinen paino vakautta käsiteltyjen hiirten (kuvio 5C). Lisäksi mitään kuolemaa ei havaittu koko kokeen ajan. Lopuksi, vahvistaa ole myrkyllisyyttä hiiren peptidin, arvioimme sietokyvystä DPT-C9 peptidi annettiin 5 mg /kg kerran vuorokaudessa siirtogeenisissä

Polyomasta Lähi-T

Hiiret PyMT (kuvio 5C) . Kaikissa kokeissa ei ole sivuvaikutuksia, kuten laihtuminen havaittiin.

DPT-C9h ja DPT-C9 aiheuttaa

in vivo

eston kasvaimen kasvua keuhkosyövän ja rintasyövän malleja

Ensimmäiselle vahvista

in vivo

induktion lajikohtaisia ​​apoptoosin, arvioimme tehoa DPT-C9 peptidi K-ras

LA1 adenokarsinooma hiirimallissa sekä transgeenisissä

polyomasta Middle -T

Hiiret (PyMT). Annettiin vatsakalvonsisäisesti annoksella 5 mg /kg 5 päivää /7 4 viikon, DTC-C9 aiheuttama merkittävä lasku keuhkojen kasvain taakka kuin kasvainten määrä per hiiri oli 24,6 ± 2,8 (keskiarvo ± SEM) lumeryhmässä verrattuna 15,4 ± 1,9 hoidetussa ryhmässä (p = 0,01) (kuvio 6A). Kuvio 6B esittää histologista analyysiä varten keuhkokudoksen valvontaa ja DPT-C9h-käsitelty edustaja hiirissä. Lisäksi

Nude

hiirillä, joilla on ksenosiirrettyjä hiiren PyMT rinta- kasvaimia käsiteltiin intraperitoneaalisesti hiirellä erityisiä DPT-C9 peptidin päivittäinen annos on 5 mg /kg. Huolimatta erittäin nopea spontaanisti kasvaimen kasvua, DPT-C9 indusoi merkittävän TGI on 46% (p 0,03) (kuvio 6C). Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät.

A) Peptidi DPT-C9 oli ylläpitäjä IP 5 mg /kg kerran päivässä, 5 päivää viikossa 4 viikon ajan K-Ras

LA1 adenokarsinooma hiirimallissa, osoittaa merkittävä lasku keuhkojen kasvaintaakkaa vertailuryhmän muotoilussa ajoneuvoon-hoidetut hiiret (p = 0,01). B) Histologinen analyysi keuhkotuumoreiden valvonnan käsitelty vain muotoilussa ajoneuvon ja DPT-C9 saaneista hiiristä. C) DPT-C9 oli ylläpitäjä IP kuten K-Ras

LA1 malli hiirillä ksenosiirrettyjä hiiri PyMT rinta- kasvaimia, joilla on merkittävä TGI 46% 11 päivän kuluttua hoidon vertailuryhmän hiiret hoidettiin muotoilussa ajoneuvo.