Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

profiiliin RNA ilmentymistä mahasyövässä anatomiset Alisivustoja kuin ensimmäinen askel tunnistamisessa molekyyli- alatyyppejä ja tarjoamalla tavoitteet varhaisen havaitsemisen ja hoidon.

Methods

suoritettiin transcriptome analyysi käyttäen Affymetrix GeneChip- U133A mahalaukun cardia adenokarsinoomat (n = 62) ja mahalaukun noncardia adenokarsinoomat (n = 72) ja niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin potilailta Shanxi, ja validoitu valittu säädeltyyn geenit ylimääräisiä RNA tutkimuksia. Expression of säädeltyyn geeneistä liittyi myös selviytymisen tapauksista.

Tulokset

pääkomponenttianalyysiin osoitti, että näytteet ryhmittyivät kasvain vs. normaali, anatominen sijainti, ja histopatologisia ominaisuuksia. Parilliset t-testit kasvain /normaaleissa kudoksissa tunnistettu 511 geenejä, joiden ilmentyminen oli väärin säädellystä (

P

4.7E-07 ja vähintään kaksinkertaiseksi suuruuseron) in cardia tai noncardia syöpien, mukaan lukien lähes -Puoli (n = 239, 47%) väärin säädellystä sekä cardia ja noncardia, neljäsosa väärin säädellystä in cardia vain (n = 128, 25%), ja noin neljäsosa in noncardia vain (n = 144, 28%). Muita RNA tutkimukset vahvistivat profiloinnin tuloksia. Expression liittyi tapauksessa selviytymisen 20 geenien cardia ja 36 geenien noncardia mahasyövistä.

Johtopäätökset

säädeltyyn geenit tunnistettu tässä edustaa kattavaa lähtökohta tulevalle pyrkimyksiä ymmärtää etiologic heterogeenisuus, kehittää diagnostisia biomarkkereita varhaiseen havaitsemiseen, ja testaa molekyylirakennetta kohdistettuja hoitomuotoja mahasyövän.

Citation: Wang G, Hu N, Yang HH, Wang L, Su H, Wang C, et al. (2013) vertailu Global Gene Expression Mahalaukun Cardia ja Noncardia Syövät peräisin High-Risk Population Kiinassa. PLoS ONE 8 (5): e63826. doi: 10,1371 /journal.pone.0063826

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 03 tammikuu 2013; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2013; Julkaistu: 22 toukokuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus on rahoitettu Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Cancer Institute, Division of Cancer Epidemiology and Genetics , ja Center for Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Carol Giffen työskentelee Information Management Services, Inc. Ei ole patentteja, tuotteita kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Seurauksena sen suuri väestö ja korkeat hinnat, Kiinan osuus 42% kaikista mahasyöpäkuolemaa maailmassa vuosittain [1]. Shanxi on yksi niistä alueista, joilla on korkein esiintyvyys mahasyövän Kiinassa [2], [3]. Itse asiassa, mahasyövän edelleen johtava kuolinsyy syöpään sekä miehillä (36%) ja naisista (28%) tällä alueella [4], vaikka lasku ilmaantuvuus tähän syöpään Pohjois-Kiinassa.

Mahasyöpää hinnat Kiinassa ovat korkeimmat pohjoisessa ja riskitekijöitä sekä cardia ja noncardia mahasyövistä tutkittu jo aiemmin siellä. Lisääntynyt ikä, miessukupuoli, suvussa ylemmän ruoansulatuskanavan syöpään, tupakka altistuminen, ja

helikobakteeri

infektio ovat kaikki olleet johdonmukaisia ​​riskitekijöitä sekä mahalaukun cardia adenokarsinoomaa (GCA) ja mahalaukun noncardia adenocardinoma (GNCA) [ ,,,0],5] – [13]; lisäksi kehittyvien todisteet tukevat lisääntynyt riski lämpövaurioilta kuumasta ruoka [6]. Ruokavalio, erityisesti mikroravinteiden, ilmeisesti tärkeä suojaava tehtävä, mistä on osoituksena tulokset suuri, satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa, johon osallistui Linxian joka oli vähentynyt GCA ja GNCA kuolleisuuden antioksidantti yhdistelmä seleeni, E-vitamiinia ja beetakaroteenia [14 ], [15]; muut kyselyyn perustuvan ravitsemukselliset tutkimukset tukevat ravinnon mahasyövän etiologiassa [6].

Mahalaukun syöpien histopatologisesti luokitellaan hajanainen ja suoliston tyypit [16] sekä cardia ja noncardia. Anatomisesti, cardia välissä pään ruokatorven ja rungon mahan, ja on pieni makroskooppisesti epäselvä vyöhyke välittömästi distaalisesti maha-ruokatorven risteyksessä. Siinä yhdistetään distaalisesti osaksi silmänpohjan ja on toisistaan ​​ainoastaan ​​sen histologiset kuvio.

Sen lisäksi, että anatomisesti vieressä, GCA ja ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) molemmat esiintyvät epidemian hinnat tässä potilasryhmässä, jakaa joitakin etiologic riski tekijät, ja ennen laajaa käyttöä tähystys ja koepala, diagnosoitiin yksittäisen sairauden kutsutaan ”ruokatorven syöpä” tai ”kovan nielemisvaikeuksia tauti” [17]. Kyky diagnosoida GCA ja tarkasti sen erottamiseksi ESCC on johtanut lisääntymistä mahasyövän tällä alueella [18]. Syynä korkeat GCA ja ESCC tällä maantieteellisellä alueella ja niiden suhde toisiinsa on edelleen epäselvä, mutta on lähes varmasti yhteisiä etiologisesti tärkeä ympäristöaltisteiden, ja äskettäin genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa ituradan DNA löytäneet yhteisen geenin (

PLCE1

) liittyy vaara sekä GCA ja ESCC [19].

Mahalaukun adenokarsinooman ovat heterogeeninen ryhmä kasvaimia. GCAs osoittavat biologinen, epidemiologiset ja viittaavia tekijöitä lähemmin muistuttavissa ruokatorven adenokarsinoomat (EACS) kuin GNCAs, mikä viittaa siihen, että kasvaimia, jotka johtuvat vatsassa voi olla erillisiä etiologies. Esimerkiksi useissa tutkimuksissa havaittu huomattavasti suurempia

TP53

mutaationopeudet tapauksissa, joissa GCA kuin GNCA, kun taas

TP53

mutaatio taajuuksien GCA muistuttaa enemmän EAC [20]. Joukko muita geneettisiä muutoksia on raportoitu mahasyövän, mukaan lukien

CDH1

[21],

β-kateniinin

[22],

TFF1

[23], ja

Met

[24], mutta ei tutkimuksessa verrattiin näiden muutosten anatomiset alisivuston. Edelleen, vaikka useat mahasyövän geeniekspressioprofilointi tutkimuksia on aiemmin raportoitu [25] – [31], ei yhtään on suoraan verrata GCA ja GNCA tapauksia korkean riskin maantieteellisellä alueella käyttäen yhteistä protokollaa.

Tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa genomista eroja mahasyövän anatomiset alatyyppien tukea ymmärrystämme etiologies näiden kahden erillisen syöpien ja kehittämisen helpottamiseksi sopiva kohdennettuja strategioita varhainen havaitseminen, ennuste, ja terapia.

Materiaalit ja menetelmät

1. Potilaiden valinta ja seuranta

Tutkimus hyväksyi Institutional Review Boards Shanxi syövän sairaalan Kiinassa ja National Cancer Institute (NCI) USA: ssa. Tuotujen potilaiden Shanxi Cancer sairaalan välillä 1998 ja 2001, joiden diagnoosi GCA tai GNCA ja pidetään ehdokkaina parantavaa poistettu kirurgisella tunnistettiin ja rekrytoitiin osallistumaan tutkimukseen. Yhdelläkään potilaalla ei ollut ennen hoitoa, ja Shanxi oli vanhaan kotiin kaikille. Saatuaan tietoon perustuvan suostumuksen, potilaita haastateltiin saada tietoa väestöstä ja elämäntapojen syövän riskitekijät ja kliiniset tiedot ja näytteet saatiin.

Mahasyöpää tässä määriteltiin histologia (vain adenokarsinooman olivat mukana) ja anatomiset kohtaa määritettiin kuten mahalaukun cardia adenokarsinoomaa (GCA) ja mahalaukun noncardia adenokarsinoomaa (GNCA). Cardia syövät olivat mahasyövistä sijaitsee proksimaalisen kolme senttiä mahan (C16.0), kun taas noncardia syövät olivat vuonna jäljellä mahassa (silmänpohjan, runko, antrum, pylorus (C16.1-8), ja määrittelemätön sijainti (C16.9), joka perustuu päällä koodit kansainvälistä luokitusta pahanlaatuiset kasvaimet (seitsemäs painos)) [32].

Vuosien 2005 ja 2007, kaikki potilaat (tai heidän perheensä) tämän tutkimuksen valittiin uudelleen yhteyttä selvittää elintärkeä asema. Niille, jotka olivat kuolleet, päivämäärä ja kuolinsyy määritettiin.

2. Näytteenotto

Kasvain ja vastaaviin normaaleihin kudosten leikkauksen aikana olivat snap-jäädytetty nestemäisessä typessä ja säilytettiin -130 ° C: ssa käyttöön asti. Kotelot valittiin tässä tutkimuksessa kolmen kriteerin perusteella: (i) histologinen diagnoosi GCA tai GNCA vahvistanut patologit sekä Shanxin Cancer sairaalan ja NCI; (Ii) kasvaimeen näytteet, jotka olivat vähintään 50% kasvain; ja (iii) kudoksen RNA laatu /määrä riittävä testausta.

3. Näytteen valmistelu ja Chip Hybridisaatio

Kokonais-RNA eristettiin jäädytetyistä kasvain ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaisesti valmistajan ohjeita. RNA puhdistus suoritettiin valmistajan ohjeita RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) ja RNase-Free DNaasia Set ruoansulatus (Qiagen Inc, Valencia, CA). RNA laatu ja määrä määritettiin käyttäen RNA 6000 LabChip /Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Germantown, MD).

Microarray kokeet suoritettiin käyttäen 8 ug kokonais-RNA: ta; yksityiskohdat käänteistranskriptiokierroksella, merkintöjä, ja hybridisaatio mukaan valmistajan protokollan (https://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx; näytetty 2013 14 huhtikuu). Lyhyesti, menettelyt sisältyvät ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi, toisen juosteen cDNA-synteesi, kaksijuosteinen cDNA siivota,

in vitro

transkriptio, cRNA puhdistus, ja pirstoutuminen. Kaksikymmentä ug biotinyloitu cRNA käytettiin kunkin matriisin hybridisaatio. Näytteet hybridisoitiin päälle Affymetrix GeneChip- Human Genome U133A pelimerkkejä (Affymetrix, Santa Clara, CA). Hybridisaation jälkeen 45 ° C: ssa yön, taulukot myöhemmin kehitettiin fykoerytriinikonjugoidulla streptavidiinilla fluidistorijärjestelmä station (GeneChip- Fluidics Station 450, Santa Clara, CA) ja skannattiin (GeneChip- Scanner 3000, Santa Clara, CA), jolloin saadaan kvantitatiivista geeniekspressiotasot . Pariksi kasvain ja normaali kudosnäytteiden Kunkin potilaan käsiteltiin samanaikaisesti koko kokeellisen prosessin. Keskimääräinen läsnä vaatimuksensa 124 pelimerkkejä 62 GCA potilaista oli 50,0%; varten 144 pelimerkkejä 72 GNCA potilailla se oli 51,5%.

4. Tilastollinen analyysi

On 22283 koetin sarjat Affymetrix GeneChip- Human Genome U133A (HG_U133A). Robust Multiarray keskiarvo (RMA) algoritmi [33], [34] toteutetaan Bioconductor T (https://www.bioconductor.org; näytetty 2013 14 huhtikuu) käytettiin taustakorjausta ja normalisointi kaikissa näytteissä. Kaikki tilastolliset menetelmät kehitettiin R. GEO hakunumerolla näille array tiedot GSE29272.

Principal Components Analysis (PCA) käytettiin kokosi analyysi kaikista mahasyövän analysoitujen näytteiden täällä. PCA vain, olemme myös tietoja Äskettäin julkaistussa ilmaisu joukko tutkimuksen ESCC tapauksissa vertailu [35].

sovellettu parillista t-testejä kullekin 22283 probesets tunnistaa geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvaimet ja niiden vastaaviin normaaleihin näytteitä, mutta esitämme tulokset vain 21130 probesets että kartoitettu 13003 geenejä. Tilille monimuuttujille, valitsimme geenit, jotka osoittivat merkittäviä eroja

P

-arvot alle 4.73E-07 (vastaa 0,01 jaettuna 21130, eli konservatiivinen Bonferronin säätö). Sen lisäksi, että

P

-arvon sulku, differentiaalisesti ilmentyvien geenien oli osoitettava vähintään kaksinkertainen ero geenien ilmentyminen suuruus välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa (eli taita muutos joko ≥2 tai ≤0.50) .

tunnistamiseksi säädeltyyn geenejä, joiden ilmentyminen liittyi henkilökohtaisia ​​(sukupuoli ja suvussa ruoansulatuskanavan yläosan tai UGI syöpä) ja kliininen (kasvain vaiheessa laatu, imusolmuke etäpesäke) ominaisuudet, suoritimme pariton t-testit geenien ilmentymisen eroja näytteiden avulla suhdetta kasvaimen geeniekspression jaettuna vastaaviin normaaleihin geenien ilmentymisen.

P

-arvo kynnys (

P

0,005) käytettiin merkitys näiden analyysien; no kertaluokkamuutos kriteereitä sovellettiin.

arvioimiseksi suhteessa geenin ilmentymisen selviytymiseen, Kaplan-Meier (KM) tontteja käytettiin visualisoimaan selviytymistä erot korkea (yli mediaani) vs matala (alle mediaani) geenien ilmentyminen tila ja log-rank testejä käytettiin testaamaan eroja käyttäen kasvaimen probeset signaali kullekin differentiaalisesti ilmaistu geeni tunnistettu kasvain /normaali parillista t-testiä edellä kuvaillun analyysin. Geenejä, joiden ilmentyminen oli merkittävästi liittyvät eloonjäämisen log-rank kokeet arvioitiin edelleen Coxin suhteellisen vaaran malleja korkea vs matala ilmaisutapoja säätö demografiset ja kliiniset ominaisuudet kasvaimia (eli ikä, sukupuoli, vaihe, laatu, etäpesäke). Kaikkien selviytymisen analyysien, käytimme kaksipuolista

P

-arvo 0,05 meidän kynnyksen tilastollista merkittävyyttä.

5. Validointi Differentially-ilmentyvien geenien käyttäminen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

yhteensä 21 differentiaalisesti ilmentyvien geenien (12 GCA ja 9 GNCA) valittiin validointi käyttäen kvantitatiivista Real-Time RT-PCR ( qRT-PCR). Teknisten validointi, qRT-PCR määritykset suoritettiin käyttäen samaa kasvain ja normaali RNA: t analysoitiin microarray kokeilu osajoukon GCAs (n = 41 62) ja GNCAs (n = 50 72). Replikointiin validointi, kasvain ja vastaaviin normaaleihin RNA: iden uudet GNCAs (n = 44) testattiin.

Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen 3 ug kokonais-RNA oligo (dT)

12-18 (500 ug /ml) 20 ui reaktiossa Superscript II käänteistranskriptaasilla järjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNA-tuotteet sitten laimennettiin 1:100. Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Kaikki alukkeet ja koettimet seitsemän kohdegeenien ja sisäisen valvonnan geenin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

) hankittiin Applied Biosystems. qRT-PCR-reaktiot suoritettiin valmistajan protokollan, kuten aiemmin on kuvattu [36]. Lämpötilasyklit olosuhteet sisälsivät alkuperäisen denaturoinnin vaihe 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C: ssa kukin 15 sekunnin ajan, 60 ° C: ssa yhden minuutin ajan, ja 72 ° C: ssa yhden minuutin ajan. Geenien ilmentyminen analysoitiin käyttämällä 2

-ΔΔCT algoritmia.

Tulokset

1. Tiedot potilaista

Yhteensä 62 GCA ja 72 GNCA potilaat analysoitiin käyttämällä Affymetrix U133A array. Henkilökohtainen ja kliiniset tiedot tutkittujen potilaiden on koottu taulukkoon 1 (Clinical ominaisuudet yksittäistapauksissa tutkittu tässä on esitetty taulukossa S1). Keskimääräinen ikä diagnoosin oli keski-myöhään 50s, urokset vallitsevia, ja noin neljännes oli suvussa ruoansulatuskanavan yläosan (UGI) syöpä (eli ruokatorven tai mahalaukun syövän ensimmäisen, toisen tai kolmannen asteen sukulaiset). Sekä GCA ja GNCA, useimmiten tutkittu olivat myöhäisessä vaiheessa, korkea laatu, ja suoliston solutyyppi kasvaimista imusolmuke etäpesäke. Eloonjäämismediaani for GCA tapauksia oli 20,3 kuukautta, ja GNCA tapauksia oli 27,8 kuukautta, joka perustuu yhteensä 50 ja 52 kuolemantapausta, vastaavasti.

2. Pääkomponenttianalyysiin of Gene Expression Microarray Data

Käytimme Principal Component Analysis (PCA) saada käsitys globaalin geeniekspression näistä näytteistä. Tässä analyysissa arvioitiin 124 näytettä 62 GCA potilaista (molemmissa kasvain ja normaali pari) ja 144 näytettä 72 GNCA potilaista (molemmissa kasvain ja normaali pari) sekä 106 näytettä ESCC potilaista (molemmissa kasvain ja normaali pari ) edellisestä tutkimuksen [35]. PCA paljasti kaksi suurta klustereita näytteiden erottaa kaikista syöpien yhdistetty (GCA punaisella, GNCA sinisellä) alkaen ESCC (vihreä) on PC1 akselilla (kuva 1). Kaksi klusterit jaettiin edelleen normaalin ja kasvaimen kudoksista PC2 (kasvain ja normaali on merkitty t ja n, vastaavasti). Ero GCA (punainen) ja GNCA (sininen) oli myös havaittavissa, erityisesti normaaleissa kudoksissa. Sitten keskittyi analyysien mahasyövän. PCA GCA (kuvio 2) ja GNCA (kuvio 3) kävi ilmi, erottamisen näytteet kasvain (t) ja normaali (n) klusterit.

PCA paljasti kaksi suurta klustereita näytteiden erottamiseksi mahasyövän (CC [ ,,,0],GCA] punaisena, N = 62; BC [GNCA] sinisenä, N = 72) EY: n [ESCC] (vihreä, N = 53) on PC1 akselilla. PC2 edelleen jaettu klustereita osaksi kasvain (t) ja normaali (n) näytteistä. (Huomautus koskee vertailukelpoisuus ilmaisun tulokset: Tapauksia ESCC, GCA, ja GNCA otettiin samanaikaisesti yhdestä sairaalasta käytetään yhteistä protokollaa, kerättiin, käsitellään, varastoidaan ja kuljetetaan samalla tavalla, ja laboratorio- analyysit tehtiin aikana samana ajanjaksona, samassa laboratoriossa, saman teknisen henkilöstön, käyttäen samaa alustaa ja samaa teknistä lähestymistapaa.).

Red ”t” edustaa kasvain ja vihreä ”n” edustaa Hyväksytty normaalia kudosta.

Red ”t” edustaa kasvain ja vihreä ”n” edustaa Hyväksytty normaalia kudosta.

3. Tunnistetiedot Genes Up tai Down-säätelemä GCA ja GNCA

GCA, yhteensä 367 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvainten ja niiden vastaaviin normaaleihin näytteitä. Näistä geeneistä, 199 geenejä säädellään ylöspäin ja 168 olivat alassäädetty (kuva 4). Saat GNCA, yhteensä 383 geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvainten ja sovitettu ei-kasvain näytteissä, mukaan lukien 192 geenit säädellään ylöspäin ja 191 geenien alaspäin säädellä (kuva 4).

4. Vertailu Gene Expression in GCA ja GNCA

Vertasimme kaksi geeniä, jotka osoittivat merkittäviä eroja geenien ilmentyminen varten GCA ja GNCA ja tunnistaa 239 geenejä, jotka olivat väärin säädellystä sekä GCA ja GNCA, joista 113 oli ylös – ja 126 alassäädetty (kuvio 4 ja taulukko S2). Lisäksi olemme havainneet, että 128 geenit väärin säädellystä vain GCA (86 ylä- ja 42 alassäädetty) (kuvio 4 ja taulukko S3), ja 144 geeniä väärin säädellystä vain GNCA (79 ylä- ja 65 alas-säännelty) ( kuvassa 4 ja taulukossa S4).

Niistä 113 geenit säädellään ylöspäin sekä GCA ja GNCA olivat liittyviä geenejä solusyklin Checkpoint (esim

cdc2, TOP2A

), Wnt signalointia (esim

SULF1

,

SFRP4, LEF1, LAMB1

), adheesio (esim

FN1

), ja TGF-β-reitin (esimerkiksi

COL1A1

,

COL1A2

,

COL3A1

). Sen sijaan 126 alas geenien yhteinen sekä GCA ja GNCA rikastuneet prosessien aineenvaihdunnassa (esim

AADAC

,

CA2

,

CA9

), ruoansulatus (esim

ATP4A, ATP4B

), ja kehittämällä gastrointestinaalisen kudoksen (esim

GIF

,

MUC5A

,

MUC6

,

TFF1

,

TFF2

) (taulukko S2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että GCA ja GNCA paljon yhteisiä etiologic polkuja.

geenit säädellään ylöspäin ainoastaan ​​GCA olivat mukana solusyklin Checkpoint asetuksen (esim

CCNB1

,

CCNB2

,

CCNE1, CDC25B, SFN

), CXC-kemokiini (esim

CXCL1

,

CXCL10

), ja soluväliaineen (esim

MMP-9, MMP11

); kun taas GCA-Ainoa alas geenien liittyi vieroitus (esim

GPX3

) ja onkogeenien (esim

FOS

,

kesäkuu

) (taulukko S3).

joukossa geenien muuttunut merkittävästi GNCA vain, jopa geenien mukana ne epiteeli–to-mesenkymaalitransitioon (esim

CALD1

,

IGFBP4

) ja aktiinisäikeiden ( esimerkiksi

DES, FLNA

). Sen sijaan alas geenien toiminut vieroitus (esim

CYP2C9

) ja epiteelipinnoilla (esim

MUC1

) (taulukko S4).

5. Suhde Gene Expression and Patient Personal /Kliininen Ominaisuudet

GCA, differentiaalisesti ilmentyvien geenien havaittiin liittyvän suvussa UGI syöpä (taulukko S5a) ja imusolmuke etäpesäke (taulukko S5b), mutta ei muita ominaisuuksien (sukupuoli, kasvaimen vaiheessa kasvaimen; tuloksia ei ole esitetty). Kuusikymmentäseitsemän geenien merkittävästi väärin säädellystä (47 ylä- ja 20 alassäädetty) potilailla, joilla on suvussa UGI syöpä (n = 16 tapausta) verrattuna potilaisiin ilman tällaista historia (n = 46 tapausta), mutta kertamuutoksia olivat yleisesti pieni: suurin kertaluokkamuutos joukossa jopa geenien oli 1,39 (eli

JDP1

), kun taas neljä alas geenien (

LMO4

,

ABHD2, LAMA3

,

MAP17

) vähenivät kolmanneksella tai enemmän (taulukko S5a). Kliinisiin ominaisuuksiin, tunnistimme 57 geeniä, jotka olivat merkittävästi väärin säädellystä (9 ylä- ja 48 alassäädetty) in GCA potilailla, joilla on positiivinen imusolmukkeet (n = 50 tapausta) verrattuna imusolmuke negatiivinen potilailla (n = 12 tapausta); 11 näistä geeneistä (kuusi alas- ja viisi säädelty) oli 1,5-kertainen muutos (taulukko S5b).

GNCA, 37 geenit oli merkitsevästi erilainen ekspressiotasot suvussa positiivinen (n = 16) versus negatiivinen (n = 56) tapauksissa (taulukko S6a), mutta kertamuutoksia olivat kaikki alle 1,5. Merkittävät differentiaalisesti ilmentyvien geenien on havaittu myös useita kasvainten kliinisiä piirteitä, kuten myöhäinen (III /IV) versus aikaisin (I /II) vaiheen (n = 90 geenejä), ja korkea (3) verrattuna alhainen (1/2) luokka ( n = 89 geenejä) (taulukot S6b ja S6c). Imusolmuke etäpesäke, vahvin kliininen ominaisuus ennakoivaa säilyminen, liittyi myös ilmentymistason 57 geenejä (taulukko S6d).

6. Gene Expression ja Survival

arvioitiin suhteessa RNA-ilmentymisen selviytymisen kunkin geenien /probesets microarray. Sillä GCA, 20 geenit liittyivät merkittävästi eloonjäämisen (nimellinen

P

-arvo 0,05) log rank testit (taulukko 2). Kuvaava esimerkki selviytymisen käyrän yhdelle näistä geeneistä (

MMP-9) B on esitetty kuviossa 5. Yksitoista geenit säilyi merkitsevänä jälkeen lisäsäätöjä varten covariates Cox malleja. Samanlaisia ​​analyysejä varten GNCA osoitti, että 36 geenit liittyivät merkittävästi selviytymistä log rank testeissä, mukaan lukien 27, joka säilyi merkitsevänä jälkeen kovariaattina säädön (taulukko 3); selviytymisen käyrä yksi 36 (

ESRRG

) on esitetty kuviossa 6.

pilkullinen Punaiset viivat kuvaavat korkea (yli mediaani) ilmaisun ja rikki siniset viivat pieni (alle mediaani ) ilme.

pilkullinen punaiset viivat kuvaavat korkea (yli mediaani) ilmaisun ja rikki siniset viivat matala (alle mediaani) ilmaisua.

7. Validointi Differentially-ilmentyvien geenien käyttäminen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

Me tehdään tekninen validointi kokeita varten 12 geenien 41 62 GCA tapaukset, joiden näytteet oli vielä riittävästi RNA määrä päätyttyä jono tutkimuksen. Neljä säädelty (

SULFI, cdc2, TOP2A, BUB1B) B ja kahdeksan alassäädetty (

CA9, CCKBR, PIK3C2G

,

FOS, kesäkuu, Klf4

,

KLK11, NUCB2

) geenit analysoitiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (qRT-PCR). Tuloksemme osoittivat, että geeniekspressiomalleja olivat hyvin samankaltaisia ​​RNA array kokeilun tulokset (taulukko 4 ja taulukko S7).

GNCA yhdeksän differentiaalisesti ilmentyvien geenien (viisi ylä- ja neljä alas-säännelty) valittiin tehtävän hyväksynnän qRT-PCR. Näyte paria 50 72 tutkittavien asioiden RNA siru arvioitiin teknistä replikointi ja osoittivat tulokset samanlaisia ​​kuin array (taulukko 5 ja taulukko S8a). Lisäksi sovitettu kasvain /normaali näytteitä uudet 44 GNCA tapauksia testattiin replikaation validointi. Tulokset olivat yhdenmukaiset ilmaisusta array (taulukko 5 ja taulukko S8b).

Keskustelu

GCA on yksi harvoista syöpäsairauksia joka on kasvanut voimakkaasti kehittyneissä maissa viime vuotta syistä, jotka eivät vielä selittämättömiä, ja molekyyli tapahtumia ympäröivän tämän mahasyöpä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia [37], [38]. Jotta paremmin ymmärtää molekyylitason tapahtumia mahasyövän ja sen anatomiset alatyyppejä, me profiloitu geeniekspression GCA ja GNCA potilaita korkean riskin väestöä Kiinassa käytetään korkean tiheyden RNA ilmaisun mikrosiruja. Havaitsimme 511 geenejä, joiden ilmentyminen oli väärin säädellystä mahasyövän yleistä, myös lähes puolet (n = 239, 47%) väärin säädellystä sekä GCA ja GNCA, neljäsosa väärin säädellystä in GCA vain (n = 128, 25%), ja noin neljännes in GNCA vain (n = 144, 28%). Yhdistysten suvussa UGI syövän aavistuksen geneettinen alttius etiologialtaan, kun taas yhdistyksille kliinisiä piirteitä ja selviytymisen ehdottaa mahdollisia terapeuttisia kohteita lisäarviointia.

Yhteinen up geenien tunnistettu ovat mukana monissa polkuja liittyvä syövän kehittymiseen, mukaan lukien solusyklin, solujen kasvun ja lisääntymisen, solusyklin Checkpoint, soluväliaineen remontin, ja angiogeneesiä (esim Wnt signalointia ja solusyklin Checkpoint reittejä, kuten

SULF1, SFRP4, LEF1, TOP2A,

ja

cdc2

[26], [26], [27], [39] – [41], ja integriini-signalointireitin (

ARPC1B

,

COL1A1

COL4A1

,

FN1

, ja

LAMB1))

. Jotkut geenit liittyvät myös mukautuva immuunivaste (esim

CD14

) ja kasvaimen etäpesäke (esim

CD9

). Yhteinen alas geenien löytyy GCA ja GNCA ovat yhdenmukaisia ​​muiden tutkimusten mahasyövässä käyttäen mikrosiruja, kuten

AKR1B10

,

ALDH3A1

,

ATP4B

,

CA2

,

IGFBP2

,

Klf4

,

MUC5AC

,

MUC6

,

TFF1

, ja

TFF2

[25], [29], [39]. Alas geenien tutkimuksessamme ovat pääasiassa mukana metaboliareitit, ruoansulatuskanavan kehitys, tai limakalvon eheyttä. Useita geenejä uskotaan kuitenkin erityistoimintoja mahalaukun epiteelin, kuten

PGC

ja

GIF

, mikä tarkoittaa, että erilaistamattomuuden on yhteinen piirre syövän [26].

BUB1B

on kara-kokoonpano tarkistuspiste geeni. Tuoreessa raportissa tapauksesta useita ruoansulatuskanavan neoplasioihin, kuten mahalaukun adenokarsinoomat, jonka tunnuksena ituradan homotsygoottinen introni mutaatio

BUB1B

, joilla on alhainen

BUB1B

mRNA ja proteiini lymfosyyteissä ja fibroblasteissa, mikä viittaa että

BUB1B

on alttius geeni tälle kasvain [40]. Tutkimuksessamme

BUB1B

oli säädelty sekä GCA (2,56-kertainen) ja GNCA (2,11-kertainen), joka on vastakkainen tapausselostelomakkeet mainittu, viittaa siihen, että olisi hyödyllistä tutkia

BUB1B

mutaatiostatusta meidän GCA ja GNCA potilaita.

geenejä väärin säädellystä merkittävästi GCA vain toteamme muutamia mielenkiintoisia esimerkkejä tästä.

SOX9

osoitti 2,13-kertainen muutos GCA potilaalla mutta ei suurentunut merkitsevästi GNCA tapauksissa.

SOX9

(sijaitsee 17q24.3-q25.1) uskotaan olla keskeinen rooli sukupuoliasioissa ja merkitsee esiaste solupopulaation aikana fysiologisia solujen korvaaminen lukien regeneratiivisen prosessin loukkaantumisen jälkeen [41], [42 ]. Ilmaisu on

SOX9

on aiemmin raportoitu useissa elimissä, kuten haimassa ja suolistossa [41], mutta ei vatsa. Hiljattain julkaistu tutkimus osoitti, että ”

Sox9

merkitsee oletetun aikuisen kantasolujen populaatio, joka edistää itseuudistumisen ja korjaus maksassa, haimassa ja suolistossa, kolme elinten endodermaalinen alkuperä” [41].

COL2A

on ehdokkaana sääntelyn tavoite

SOX9

[42]. Meidän GCA tapauksissa

COL2A1

oli alassäädetty (kertainen muutos 0,27), mikä saattaa olla seurausta

SOX9

ylössäätöä.

Osa differentially- ilmaistuna geenejä raportoitu GCA myös väärin säädellystä samanlaisessa rakenteessa kuin ruokatorven okasolusyöpää (ESCC) tarkasteltiin tästä samasta korkean riskin väestöä, kuten

CDC25B

ja

COL1A2

[43]. Tämä samankaltaisuus viittaa siihen, että huolimatta eroista solutyypissä, GCA ja ESCC tästä korkean riskin väestöä Kiina todennäköisesti yhteisiä geneettisiä ja /tai ympäristötekijöistä niiden etiologiasta. Todisteet yhteinen geneettinen vaikutus on ilmeistä tulokset äskettäin genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa, joka löytyi yhteinen alttius lokukseen

PLCE1

sekä GCA ja ESCC [19].

Niistä geenit merkitsevästi väärin säädellystä in GNCA vain,

DES

on ainoa, joka osoitti eri ilme suuntatoiminto in GNCA (3,24 kertainen muutos) kuin GCA (0,85 kertainen muutos).

DES (desmiinivasta

2q35) koodaa desmiinin, lihas-erityinen tukirangan proteiini sileä, sydämen, ja sydänlihaksessa. Olemme määrittäneet useita geenejä, jotka liittyvät aktiinisäikeiden, kuten

FLNA

,

ACTN1

,

SVIL

ja

TPM1

. Useita geenejä väärin säädellystä vain GNCA myös liittyvät soluväliaineen, kuten

EMILIN1

ja

TNC

. Tutkimukset

TNC

osoitti, että säätely ylöspäin

TNC

häiritsi solusubstraattia tartunta [44].

Toinen Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten geenien ilmentyminen profiileja kasvaimia erosivat potilailla, joilla on erilaiset kliiniset fenotyyppejä. Vaikka olemme tunnistaneet useita yhdistyksiä meidän nimetty

P

-arvo kynnys 0,005, vain kolme jäi merkittävästi jälkeen Bonferroni korjauksen monimuuttujille (eli

P

2.36E-06 ). Merkittävimmät yhdistysten olivat

COL11A1

ja

ITGAX

kasvaimen vaiheessa GNCA, ja

UNG

metastasiaa, myös GNCA.

COL11A1

[45] ja

ITGAX

[46] ovat molemmat olleet aiemmin liittyvät kasvaimen vaiheessa muiden syöpien (esim melanooma, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä), mutta ei ole raportoitu for

UNG

ja etäpesäkkeitä.

Pyrimme myös arvioida eloonjäämisen geeniekspressiota geenejä, jotka olivat merkittävästi säädeltyyn. Niistä 20 geenit liittyvät GCA selviytymisen ja 36 geenit liittyvät GNCA selviytymisen olivat vain kolme geeniä, jotka päällekkäin –

CTSB

,

LEPR

, ja

LiPF

. Merkittävin tilastollinen yhdistysten havaittu eloonjäämisen (

P

0,01 log-rank testit) olivat

COL11A1, CTSB

, ja

MMP-9

varten GCA, ja

ADA

,

ESRRG

, ja

LHFP

varten GNCA. Vaikka tutkimuksia ei vielä raportoineet

COL10A1

,

ADA

tai

LHFP

ja syövän selviytymisen,

CTSB

[47] ja

MMP-9

[48] ovat molemmat aiemmin liittynyt selviytymisen mahasyövän, kun taas

ESRRG

ilme on liittynyt selviytymisen eturauhassyövässä [49].

Johtopäätös

Tämä on ensimmäinen raportti keskittyi globaalin geenien ilmentymiseen GCA ja GNCA korkean riskin väestöä Shanxi Kiinassa.