Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuolleisuuden maailmanlaajuisesti. Puute kasvainspesifisyys edelleen merkittävä haitta tehokkaalle kemoterapian ja aiheuttaa annosta rajoittavat toksisuudet. Kuitenkin, ligandi-välitteisen lääkeaineen järjestelmän pitäisi pystyä tehdä kemoterapian tarkempia kasvainsoluihin ja vähemmän myrkyllisiä normaaleille kudoksille. Tässä tutkimuksessa olemme eristäneet uusia peptidi-ligandia faagin peptidin kirjasto, joka sitoutuu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat. Kohdennusvektori faagi sitoutunut useisiin NSCLC solulinjoja mutta ei normaaleihin soluihin. Sekä kohdistaminen faagi ja synteettisen peptidin tunnustettu kirurgisista näytteistä NSCLC positiivisen osuus 75% (27 36 yksilöt). Vuonna sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiirillä NSCLC ksenografteissa, kohdentamiskriteerit faagi sitoutui spesifisesti kasvaimen massoja. Kasvaimen ohjautumisen kyky kohdistaminen faagin inhiboitui sukulais synteettinen peptidi, mutta ei kontrollilla tai WTY-mutatoitunut peptidi. Kun kohdistus peptidi kytkettiin kantavia liposomeja doksorubisiini tai vinorelbiini, terapeuttinen indeksi kemoterapeuttisten aineiden ja eloonjäämisluvut hiirten ihmisen keuhkosyöpä ksenograftien selvästi lisääntynyt. Lisäksi kohdistaminen liposomien lisääntynyt huumeiden kerääntymistä kasvaimen kudoksiin 5,7-kertainen verrattuna vapaan huumeiden ja parannettu syöpäsolujen apoptoosia johtuvat suurempaa biologisesti doksorubisiinin. Nykyinen tutkimus viittaa siihen, että tämä kasvain spesifinen peptidi voidaan käyttää luomaan kemoterapian spesifisesti kasvainten solujen hoidossa NSCLC ja suunnitella kohdennettuja geeninsiirtovektoreita tai sitä voidaan käyttää yhdessä diagnosointiin tämän maligniteetti.

Citation: Chang DK, Lin CT, Wu CH, Wu HC (2009) uudentyyppinen peptidin Parantaa terapeuttinen Liposomaalisen syöpälääkkeet hiirissä mallit Human Lung Cancer. PLoS ONE 4 (1): E4171. doi: 10,1371 /journal.pone.0004171

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2008; Hyväksytty: 02 joulukuu 2008; Julkaistu: 12 tammikuu 2009

Copyright: © 2009 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Research Apurahat Academia Sinica (# 5202402020-0 HCW) ja National Science (NSC-96-2323-B-002-015 ja NSC96-3114-P-001-006-Y02 HCW).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu pahanlaatuinen kasvain kehittyneissä maissa ja on kasvava ongelma kehitysmaissa maissa [1]. On olemassa kaksi päätyyppiä keuhkosyöpään: ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC). NSCLC muodostavat noin 80% kaikista keuhkosyöpää [2] ja on rajallinen vaste nykyisiin kemoterapia-aineiden, joissa kasvaimen kutistuminen vain 20%: lla potilaista ja kahden vuoden eloonjäämisaste välillä 10% ja 16% [3] . Yksi merkittävä syy tähän epätyydyttävän tuloksen kemoterapiaa vaarantuu lääkkeen toimitus keuhkosyöpä kudoksiin johtuen korkeasta soluvälinesteessä paineet (IFP) sisällä kasvain [4]. Systeemisesti kemoterapia ei voida riittävästi toimitettavaan kiinteitä kasvaimia, koska kehittymätön verisuoniston kanssa epänormaali arkkitehtuuri [5] ja vuotavat, heterogeeninen verisuonten seinämien [6], sekä korkea IFP kasvainkudosten sisällä [7], [8]. Lisäksi ei ole kasvaimen spesifisyyden avulla syöpälääkkeet jakaa mielivaltaisesti normaaliin elimiin ja kudoksiin. Näin ollen syövän solut altistetaan pienempi lääkkeen pitoisuus kuin normaalit solut [9], mikä ei ole vain vähentynyt tehokkuutta, vaan myös lisätä toksisuutta. Siksi on tärkeää kehittää strategia parantaa lääkkeiden määrää toimitettiin tuumorikudoksista kohdennetusti säästäen normaalit kudokset.

parhaillaan pyritään parantamaan terapeuttista indeksiä syöpälääkkeiden, joko lisäämällä lääkepitoisuus sisällä kasvain tai pienentämällä sitä normaalissa isäntä kudoksissa [10]. Verrattuna tavanomaisesti antaa kemoterapeuttisten aineiden, lipidejä tai polymeeriin perustuva nanolääketiede lääkeaineen järjestelmillä on se etu, että parannetaan farmakologisten ja terapeuttisten ominaisuuksien sytotoksisten aineiden [11]. Useimmat pienimolekyylisiä kemoterapia-aineilla on suuri määrä jakelu laskimoon [12] ja kapea terapeuttinen ikkuna takia vakavia myrkyllisyys normaaleissa kudoksissa. Kapseloimalla huumeiden nanohiukkaset kuten liposomit, tutkijat voivat vähentää merkittävästi jakelu- ja lisätä pitoisuus vaikuttavaa lääkeainetta tuumorin sisällä [13]. PEGyloitiin liposomaalinen doksorubisiini (jossa tuotenimiä Doxil Yhdysvalloissa ja Caelyxillä Euroopassa) [14] on osoitettu merkittävästi parantaa terapeuttisen indeksin doksorubisiiniin niin prekliinisissä [15] – [17] ja kliinisiä tutkimuksia [18] – [21 ]. Useat lääkeainekuljetussysteemeihin tällaisia ​​on hyväksytty markkinointi [22], [23].

Muut kuin PEGyloidun liposomeja, suurempi ja selektiivinen syövän vastaista aktiivisuutta voidaan saavuttaa ligandivälitteinen kohdistaminen liposomien. Tässä uusi lääkkeen antojärjestelmä, ohjaavia osia on kytketty liposomien pintaan edistämään valikoivaa sitoutumista kasvaimen antigeenejä ja helpottaa lääkeaineen sisältävien liposomien aiotun solun paikoista. Tämä järjestelmä on etuja korkeamman huumeiden ja kantoaallon suhde kuin immunokonjugaattien ja moniarvoisen esittäminen ligandien mikä lisää sitovaa aviditeetin [24]. Tutkijat ovat jo tuottaneet liposomeja konjugoituna eri peptidiligandeiksi jotka on kohdistettu erityisesti tiettyjen kasvainsolujen tai kasvaimen verisuoniston [25] – [29].

Koska edullinen selektiivisyys ja spesifisyys, ligandi-konjugoitu liposomaalinen syöpälääkkeiden ovat lupaava lähestymistapa uusien kemoterapia tutkimukseen. Käyttöä peptidien ligandien ohjata liposomeja tuumoreihin on potentiaalisesti mahdollista menetelmää lisäämiseksi spesifisyyden ja tehokkuuden liposomin sisältäviä lääkkeitä [26], [30]. Faagi-display on tekniikka, jossa valitaan kohdistaminen peptidejä, joissa peptidi ilmentyy pinnalla bakteriofagin fuusio- proteiini, jolla on yksi virionin oma kuoriproteiinien [31]. Faagin peptidikirjastojen mahdollistaa tutkijoiden kartta proteiini-proteiini yhteyksiä kuten B-soluepitooppeja [32] – [35] ja reseptori-ligandi-vuorovaikutusten [36]. Tällaiset peptidikirjastot voidaan myös käyttää tunnistamaan jär- ja solu-tyyppi-spesifisten peptidien [26], [27], [37] – [39].

Tässä tutkimuksessa käytimme faagin peptidin kirjasto tunnistaa uusi peptidi, joka sitoutuu spesifisesti NSCLC solulinjojen ja kirurgisista näytteistä keuhkosyöpään potilailla. Liposomaalinen doksorubisiini ja vinorelbiinin konjugoitiin tämän kohdistamista peptidi osoitti parannettu kertymistä lääkeaineiden kasvain kudosten ja parantaa terapeuttista indeksiä ihmisen keuhkosyövän ksenograftien SCID-hiirissä.

Tulokset

eristäminen faagien sitoutuminen NSCLC solut

Käytimme faagin satunnainen peptidikirjasto eristää faagien, jotka pystyivät sitoutumaan NSCLC CL1-5 soluihin. Viiden kierrosta affiniteettiselektiolla (biopanning) kanssa CL1-5, solujen lisääntynyt tiitteri faagin 40-kertaisesti (kuvio. 1A). Rikastettu faagit kolmannesta viidenteen biopanning kierrokset valittiin satunnaisesti. Sitten sekvensoitiin faagiklooneista korkeamman CL1-5 sitovaa toimintaa. Käyttäen Genetics Computer Group (GCG) ohjelmisto analyysi, huomasimme, että nämä valitut faagit (PC3-1, PC4-1, PC4-5, PC5-2 ja PC5-4) näytetään konsensuksen aihe, tryptofaani (W) -threonine ( T) /tyrosiini (Y) -tyrosiini (Y) (taulukko 1). Mielenkiintoista, faagi PC5-2 ilmestyi kolmas (PC3-1), neljäs (PC4-1) ja viides (PC5-2) biologisessa seulonnassa kierrosta. Aikana biopanning kierroksilla, taajuus PC5-2 kasvoi 20% (1/5) kolmannella syklin 90% (27/30) viidennessä jaksossa (taulukko 1). Päätimme keskittyä uusi peptidi näyttää PC5-2, TDSILRSYDWTY, jatkotutkimuksiin.

(

) faagiesityskirjasto satunnainen peptidikirjasto käytettiin valita faagien, jotka sitoutuvat NSCLC solulinja CL1-5. (

B

) visualisointi PC5-2 sitoutumisen CL1-5 ja PC13 keuhkosyövän soluja (nuolenpäät) kanssa immunohistokemiallisella värjäyksellä. Ohjaus faagi ei sitoudu CL1-5 soluihin. Mitta-asteikko: 10 um. (

C

) FITC-leimatun peptidin SP5-2 sitoutuneen viisi NSCLC solulinjoja mutta ei NPC-TW01 soluissa havaittuna immunofluoresenssivärjäyksellä. Mitta-asteikko: 10 um. (

D

) edustaja fotomikrograafeja tuumorisektioiden kirurgisista näytteistä ihmisen keuhkosyövän havaittiin käyttäen sekä PC5-2 (a, nuolenkärki) ja biotinyloitu SP5-2 (c, nuolenkärki), tässä järjestyksessä. Vertailun vuoksi kontrolli faagi- tai biotinyloitua verrokkipeptidin ei sitoudu näihin kirurgisista näytteistä (b ja d). PC5-2 kilpailukykyisesti inhiboi synteettinen peptidi SP5-2 (e). Mutatoitunut peptidi, MP5-2, menetti tämä kilpailu kyvyn (f). Mitta-asteikko: 25 um.

tunnistaminen faagikloonia sitoutumaan spesifisesti NSCLC soluihin

Sen tutkimiseksi, PC5-2 sitoutuisi NSCLC soluihin, käytimme immunohistokemia paikantaa faagipartikkelien eri solutyyppejä. Tuloksemme osoittivat, että PC5-2 sitoutui spesifisesti NSCLC solulinjojen CL1-5 ja PC13 (Fig. 1 B, nuolenpäät). Ohjaus auttajafaagin ei sitoudu CL1-5 soluihin. PC5-2 sitoneet muihin syöpäsolulinjoja, mukaan lukien suun syöpä (SAS), ja nenänielun karsinooman solut (NPC-TW01), eikä normaalin epiteelisolujen (NNM) peräisin nenän limakalvon (Fig. 1 B).

CL1-5 sitova kyky PC5-2 varmistettiin edelleen peptidin kilpailevan eston kokeessa käyttäen immunofluoresenssivärjäyksellä. Tulokset osoittivat, että sitovaa aktiivisuutta PC5-2 faagin CL1-5 soluihin estyi synteettisen peptidin SP5-2 annoksesta riippuvalla tavalla. Pitoisuutena 27 ug /ml, SP5-2 estivät täysin sitova aktiivisuus PC5-2 (Fig. S1). Ohjaus faagi ei sitoudu CL1-5 soluihin, ja PC5-2 ei sitoudu NPC-TW01 tässä määrityksessä (kuvio. S1 ja teksti S2).

varmistamiseksi edelleen, että PC5-2 faagi sitoutuisi kohdemolekyyliin ilmaistaan ​​pinnalla CL1-5 solujen, mittasimme PC5-2-sitoutuneiden solujen virtaussytometriaa käyttämällä (kuva. S2 ja teksti S1, S2). Kontrolli faagia käytettiin arvioitaessa epäspesifisen taustan sitoutumisen (kuvio. S2b). Tulokset osoittivat, että 42,6% ja CL1-5 solut sitovat PC5-2 (Fig. S2C), ja tämä sitoutuminen inhiboitui täysin 27 ug /ml SP5-2 peptidin (Fig. S2D). PC5-2 ei sitoudu SAS tai NNM (Fig. S2 e ja f).

Sidonta synteettisen peptidin SP5-2 keuhkosyöpä solujen ja ihmisen keuhkosyövän kirurgisista näytteistä

määrittämiseksi onko peptidisekvenssejä näytetään PC5-2 todella vuorovaikutuksessa NSCLC-soluja, käytettiin fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla SP5-2 peptidi (FITC-SP5-2) sijasta PC5-2 faagin peptidi-sitoutumiskoe kautta immunofluoresenssivärjäyksellä. FITC-SP5-2 sitoutuu spesifisesti kaikki NSCLC solulinjojen testasimme, mukaan lukien CL1-5, H460, A549, PC13 ja H23, mutta ei sitoudu NNM. Saman pitoisuuden FITC-leimatun ohjaus peptidi (FITC-Con-P) ei ole havaittu sitovaa aktiivisuutta (Fig. 1 C). Olemme myös arvioineet suuruus ja spesifisyys SP5-2 sitoutumisen avulla virtaussytometrialla. Osuudet CL1-5, H460, A549, PC13 ja H23-solujen sitoo SP5-2 olivat 43,0%, 45,8%, 44,3%, 20,1% ja 44,0%, tässä järjestyksessä (Kuva. S3 ja teksti S2).

onko tämä kohdistaminen ligandi oli affiniteetti ihmisen keuhkosyöpä kirurgisista näytteistä, testasimme reaktiivisuus PC5-2 ja SP5-2 keuhkojen adenokarsinooma soluihin käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Sekä PC5-2 ja biotiini-leimattu SP5-2 (B-SP5-2) tunnustettu kasvainsoluista NSCLC kirurgisista näytteistä (Fig. 1 D a ja c, nuolenpäät), ja ohjaus- faagi ja biotiini-leimattu kontrollipeptidiä (B- Con-P) ei (Fig. 1 d b ja d). SP5-2 (TDSILRSYDWTY) kilpaili PC5-2 sitoutumisesta kirurgisista näytteistä keuhkojen adenokarsinooma (Fig. 1DE), mutta sama pitoisuus mutatoitunut peptidi, MP5-2 (TDSILRSYDGGG) ei (Fig. 1Df). Seitsemänkymmentä viisi prosenttia (27/36) keuhkojen adenokarsinooma näytteitä 36 potilaista ilmaisi kohdemolekyylin, joka tunnisti tämän peptidin (taulukko S1). Nämä tulokset osoittivat, että SP5-2 voisi tunnistaa tunnistamaton molekyylejä ekspressoituu NSCLC solulinjoissa ja todellisen syöpäsolujen kirurgisesta yksilöitä keuhkosyöpään.

Hiiret mallien tutkimiseen PC5-2 kohdistaminen kyky

tutkimiseksi kohdistaminen kyky PC5-2 faagin

in vivo

, me ruiskutetaan faagit häntälaskimoon hiirillä, CL1-5 johdettu kasvaimia ja sitten talteen ne perfuusion jälkeen. Selvitimme tiitterit faagi kasvain massat ja normaali valvonta elimet (aivot, sydän ja keuhkot) [26], [30]. PC5-2 osoitti erityistä homing kasvaimen massoja, joiden konsentraatiot 15-kertaa korkeampi kuin sen pitoisuus ohjauselimet (Fig. 2A). Ohjaus apufageis- eivät osoittaneet mitään erityistä kohdistusta tuumorikudoksissa (Fig. 2A).

(

) SCID-hiirissä, joilla on ihmisen keuhkosyöpä ksenografteja sai i.v. injektiot PC5-2, ja faagi otettiin talteen perfuusion. Talteenotto PC5-2 kasvain oli huomattavasti korkeampi kuin aivojen, sydämen tai keuhkojen. (

B

) kohdistaminen aktiivisuus PC5-2 kasvaimen kudoksista inhiboi kilpailevasti SP5-2 mutta ei ohjaus peptidin tai mutantti peptidin. (

C

) immunohistokemiallinen paikallistaminen PC5-2 jälkeen i.v. injektio hiiriin kanssa CL1-5 johdettuja ksenografteissa. Faagi paikallinen kasvaimen kudokset (d ja e), ja ei lokalisointi havaittu normaalissa elimissä, kuten aivoissa (a), sydän (b), ja keuhkojen (c), tai kudosleikkeiden käsiteltiin kontrolli-faagin ( f-i). Vuorovaikutus PC5-2 kanssa kasvaimen osassa estyi synteettinen peptidi SP5-2 (j). Mitta-asteikko: 25 um.

kasvain-homing kyky PC5-2 varmistettiin edelleen peptidin kompetitiivisen inhibition kokeessa, jossa synteettinen peptidi SP5-2, ruiskutetaan yhdessä PC5-2, selvästi esti elpyminen faagia kasvain massoja (Fig. 2B). Sata mikrogrammaa SP5-2 esti 92% ja PC5-2 sitoutumisen kasvainmassojen, mutta sama pitoisuus kontrollipeptidiä ei ollut tällaista estävää vaikutusta (Fig. 2B).

alkaen

in vitro

faaginäyttö seulonta tunnistimme kaksi kloonia (PC5-2 ja PC5-4) kanssa yhteisymmärrykseen motiivi WT /YY (taulukko 1). Kuten PC5-2, kasvaimeen ohjautuvat kyky PC5-4 myös inhiboi kompetitiivisesti SP5-2 (Fig. S4 ja teksti S2), mikä viittaa siihen, että nämä kaksi faagit voidaan sitoa läpi tämän motiivin samaan kohdemolekyylin solukalvon keuhkosyövän soluja. Olemme ehdottaneet, että nämä kolme aminohappotähdettä voi olla ratkaiseva rooli kotiutuvaa tuumorikudoksissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, muutimme nämä kolme aminohappotähdettä SP5-2 (TDSILRSYDWTY) ja GGG on mutantti peptidi, MP5-2 (TDSILRSYDGGG). Vaikka kasvainta homing kyky PC5-2 oli merkittävästi estyy peptidin SP5-2, tämä kilpailevan eston hävisi MP5-2, joka sisältää GGG jäännöksen sijasta WTY jäämien SP5-2 (Fig. 2B) . Nämä tiedot osoittavat, että WTY tähteet olivat tärkeitä sitomiskykyä SP5-2 NSCLC-soluihin.

kudosjakauma PC5-2 tutkittiin myös käyttäen immunovärjäystä. Me pistetään SCID hiirillä NSCLC ksenografteissa kanssa PC5-2 ja sitten poistettiin ja kiinteä kasvain ja valvonta elimet lokalisointia faagipartikkelien. PC5-2 todettiin paikallistaa kasvaimen kudoksissa (kuvio. 2cd). Suurennettuna, immunoreaktiivisuus faagin havaittiin solukalvon joidenkin diffuusio ympäröivän sytoplasmassa kasvainsolujen (Fig. 2C-E). Ei ollut mitään reaktiota tuotteen havaita tavanomaisin elinten, kuten aivojen, sydämen ja keuhkojen kudoksiin (Fig. 2C a-c), eikä kasvaimen kudoksia käsiteltiin kontrolli faagi (Fig. 2CI). Erityiset kohdentaminen PC5-2 NSCLC-ksenograftissa inhiboitui synteettisen peptidin SP5-2

in vivo

homing kokeessa (kuvio. 2Cj).

terapeuttinen teho SP5-2 -välitteisen liposomien kohdentami-

sen määrittämiseksi, keuhkosyöpä kohdistaminen peptidi SP5-2 voitaisiin käyttää parantamaan kemoterapeuttisten tehoa syövän hoidossa, me kytketty peptidiä sisältävien liposomien syöpälääkkeet. SCID-hiirillä, joilla on koko haun, CL1-5 johdettu -ksenografteja käsiteltiin (1) SP5-2-konjugoidun liposomaalinen doksorubisiini (SP5-2-LD), (2) mutantti-peptidi-konjugoitua liposomaalinen doksorubisiini (MP5-2-LD) (3) ei-kohdennettu liposomaalinen doksorubisiini (LD), (4) vapaan doksorubisiinin (FD), tai (5), joka vastaa tilavuutta fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Kaikki formulaatiot injektoitiin suonensisäisesti (iv) on yhteensä doksorubisiinin annos 8 mg /kg (1 mg /kg kahdesti viikossa yhteensä kahdeksan injektiota).

hiirissä, jotka saivat SP5-2 -LD (Fig. 3A ryhmä a) olivat merkittävästi pienempiä kuin ne, jotka MP5-2-LD, LD, FD, ja PBS ryhmät (

P

0,01) (Fig. 3A ryhmä b-e) . Kasvain koot LD ja MP5-2-LD ryhmät olivat 2,1 ja 2,6 kertaa suuremmat kuin vuonna SP5-2-LD ryhmä, vastaavasti. Kasvain koot FD ja kontrolli-PBS-ryhmät olivat 7,0 ja 8,3 kertaa suurempi kuin, että SP5-2-LD ryhmä, vastaavasti (Fig. 3A). Mielenkiintoista on, sitä suurempi terapeuttinen teho SP5-2-LD katosi, kun WTY motiivi peptidi oli muutettu GGG in MP5-2-LD. Vapaa doksorubisiini näytteillä pieni terapeuttinen teho tässä pitoisuudessa, koska kasvaimen koko tässä ryhmässä oli vain 16% pienempi kuin PBS-ryhmässä (Fig. 3A).

(

) Mediaani kasvaimen tilavuus ajan käsitellyillä hiirillä PBS: llä, FD, LD, MP5-2-LD, tai SP5-2-LD. Kasvaimen kasvu oli merkittävästi vaimennetaan SP5-2-LD hoidetussa ryhmässä. SP5-2-LD on suurempi terapeuttinen teho kuin LD ja MP5-2-LD (

n

= 6 kussakin ryhmässä; **

P

0,01). (

B

) Hiiret joissa koko yhteensopivat CL1-5 johdettu keuhkosyöpä kasvaimen koon noin 500 mm

3 hoidettiin SP5-2-LD, LD, tai PBS (

n

= 6 kussakin ryhmässä, **

P

0,01). (

C

) Hiiret, H460 johdettuja keuhkosyöpä hoidettiin SP5-2-LD, LD, FD, tai PBS (

n

= 6 kussakin ryhmässä, *

P

0,05). (

D

) vaikutukset eri hoitoja muutos ruumiin painossa hoitojakson aikana (

n

= 6 kussakin ryhmässä). (

E

) Hiiret joissa CL1-5 johdettuja keuhkosyöpä hoidettiin SP5-2-LV, LV, tai PBS (

n

= 6 kussakin ryhmässä; **

P

0,01). (

F

) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä osoitti pitempään käsiteltyjen hiirien SP5-2-LV kuin niillä, joita hoidettiin LV ja PBS (n = 5 kussakin ryhmässä).

Voit tarkistaa, onko suuri ksenograftit vastaisi SP5-2-LD hoito, hiirillä suuri keuhkosyöpä ksenograftien (500 mm

3) jaettiin kolmeen hoitoryhmään. Kurssin jälkeen doksorubisiinin käsittelemällä yhteensä annostuksella 16 mg /kg (2 mg /kg kahdesti viikossa kahdeksan injektiot), kasvain koot kontrolli-PBS ja LD ryhmien nostetaan asteittain 3,3 ja 2,1 kertaa kasvaimen kokoa SP5-2-LD ryhmä (

P

0,01) (Fig. 3B). Nämä tulokset paljastivat, että SP5-2-LD myös lisääntynyt terapeuttinen teho doksorubisiinin SCID hiirillä suuri keuhkosyöpää ksenografteissa.

lisätestejä onko SP5-2 optimoi terapeuttinen indeksi keuhkosyövän hoidossa, SP5- 2-LD hoidetaan eri keuhkosyövän ksenograftin (H460-johdettu kasvaimen). SCID hiirillä koko haun, H460-johdettu -ksenografteja hoidettiin SP5-2-LD, LD, FD, tai vastaava tilavuudella PBS kautta i.v. injektio yhteensä doksorubisiinin annos 8 mg /kg (1 mg /kg kahdesti viikossa kahdeksan injektiota). Lopullinen kasvaimen koon SP5-2-LD ryhmä oli huomattavasti pienempi kuin LD, FD ja PBS ryhmät (

P

0,05). Hiiret LD, FD ja PBS ryhmissä oli kasvaimia koot 2.0-, 8.6- ja 10,0-kertainen suurempi kuin vuonna SP5-52-LD ryhmä (Fig. 3C). Vapaa doksorubisiinin tässä pitoisuudessa vähensi kasvaimen kokoa vain 14% verrattuna PBS ryhmiä. Ei ollut ainoastaan ​​kasvaimen kasvua merkittävästi vaimennetaan SP5-2-LD ryhmä (Fig. 3C), kehon paino tämän ryhmän hiirellä kasvoi 10,3% (2,38 g) lopussa hoitojakson aikana. Sitä vastoin LD-käsitellyillä hiirillä oli pienempi paino nousi 2,4% (0,59 g) (Fig. 3d).

varmistamiseksi edelleen SP5-2 voisi lisätä terapeuttista indeksiä keuhkosyövän, olemme sidoksissa SP5-2 peptidi toiselle syöpälääkettä, liposomaalinen vinorelbiini (SP5-2-LV) ja testattiin sen tehokkuus vastaan ​​keuhkosyöpä ksenograftien. SCID-hiirillä, joilla on koko-täsmäsi CL1-5 johdettu ksenografteja annettiin i.v. injektiot SP5-2-LV, liposomaalinen vinorelbiini (LV), tai vastaavat määriä PBS: llä yhteensä vinorelbiinin annos 24 mg /kg (2 mg /kg kahdesti viikossa kaksitoista injektiota). Kasvainta kantavien hiirten käsiteltiin SP5-2-LV (Fig. 3E, ryhmä a) oli merkittävästi pienempi kasvaimia kuin LV ja PBS ryhmät (

P

0,01) (Fig. 3E, ryhmä b ja c). Kasvain koon LV ryhmässä oli 6,75-kertainen suurempi kuin SP5-2-LV ryhmä. Keskimääräinen kasvaimen koon kontrolli-PBS-ryhmässä oli 25-kertainen suurempi kuin SP5-2-LV ryhmä (Fig. 3E). Arvioida sivuvaikutuksia hoitojen, hiiret punnittiin kahdesti viikossa. Kehon paino hiirillä kasvoi 5,7% (1,37 g) SP5-2-LV-ryhmän ja 2,4% (0,58 g), LV-ryhmän lopussa hoidon aikana (tuloksia ei ole esitetty).

Lopuksi vertasimme eloonjäämislukuja kasvain hiirillä hoidon jälkeen SP5-2-LV, LV, tai PBS: ää yli 102 päivää. Kaikki viisi eläintä PBS-käsitellyn ryhmän kuoli (eloonjäämisaste 0%). Kolme hiiristä kuoli LV-hoidetussa ryhmässä (eloonjäämisaste 40%). Vuonna SP5-2-LV-hoidetussa ryhmässä, mutta eloonjäämisaste oli 80%, mikä on huomattavasti korkeampi kuin muissa ryhmissä (Fig. 3F). Nämä kokeet osoittavat, että SP5-2 lisääntynyt terapeuttinen tehokkuus liposomiin kapseloitu doksorubisiini ja vinorelbiinin vähemmän myrkyllisyyttä.

kasvainpaikantumisen ja biologinen jakautuminen on SP5-2 konjugoitua kohdentamisen liposomien

biologista jakaantumista ja kasvaimen lokalisaatio SP5-2-LD, MP5-2-LD, LD, ja FD arvioitiin mittaamalla luontainen automaattinen fluoresenssi signaali doksorubisiinin hiirillä kanssa NSCLC ksenograftit. Doksorubisiini (

M

r 543,54), pienimolekyylinen kemoterapeuttinen aine kuin sen

M

r on 1000, on huono farmakokineettisen profiilin, ja sen pitoisuus veressä putoaa tausta tasolle yhden tunnin kuluttua lääkkeen antamisesta (Fig. S5a ja teksti S2). Farmakokineettinen profiili eri liposomaalisen doksorubisiinin muotoiluja, kuten SP5-2-LD, MP5-2-LD, ja LD, olivat selvästi suurempi kuin FD (Fig. S5a). Alue alle aikakäyrän (AUC

0-48 tuntia) doksorubisiinin kasvainkudoksissa oli 10,4 mikrog · h /g, 31,5 mikrog · h /g, 29,0 mikrog · h /g, ja 59,9 ug · h /g FD, LD, MP5-2-LD, ja SP5-2-LD-ryhmässä (taulukko S2). Keskimääräinen sisäinen kasvaimen doksorubisiinin pitoisuus SP5-2-LD-käsitellyssä ryhmässä oli 5.7-, 1.9- ja 2.1-kertaa suurempi kuin sisäisen kasvaimen doksorubisiinin pitoisuus FD, LD, ja MP5-2-LD ryhmissä (kuvio . 4A ja taulukko S2).

valittu ajankohtina (1, 4, 24 ja 48 tuntia) injektion jälkeen, doksorubisiinin pitoisuus tuumorikudoksissa (

) ja ytimet syöpäsolujen (

B

) mitattiin. Doksorubisiini keskittyminen sisällä kasvain kudosten ja ytimien SP5-2-LD ryhmässä oli suurempi kuin FD, LD, ja MP5-2-LD ryhmät (n = 3 kullakin ajanhetkellä, *

P

0,05, **

P

0,01).

arvioimiseksi hyötyosuutta liposomaalisen huumeita, käytimme ydin- doksorubisiinia kertymistä indikaattorina huumeiden sytotoksisuuden [40]. AUC

0-48 tuntia biologisesti doksorubisiinin (eli sidottu ytimiä) FD, LD, MP5-2-LD, ja SP5-2-LD oli 3,7 mikrog · h /g, 6,7 mikrog · h /g , 7,5 ug · h /g, ja 17,7 ug · h /g, vastaavasti (taulukko S2). Sisäiset kasvain ydinvoiman doksorubisiinin pitoisuus SP5-2-LD ryhmä oli 4,8-, 2.6- ja 2.4-kertainen verrattuna ydinvoiman doksorubisiinin pitoisuus FD, LD, ja MP5-2-LD ryhmät (Fig. 4B ja taulukko S2). Doksorubisiini keskittyminen sisällä kasvain kudosten ja ydin ei ollut merkitsevästi erilainen LD ja MP5-2-LD ryhmät (Fig. 4 ja taulukko S2).

Enhanced kasvain lääkeannostelun ja terapeuttisen tehokkuuden SP5-2 konjugoitua liposomeja

Jos haluat vertailla lääkkeenvapautusprofiilin neljän doksorubisiini muotoiluja, yritimme havaita lääkkeen tuumorikudoksissa käyttämällä fluoresenssimikroskooppia. Kuvia eri kasvaimia osoitti, että doksorubisiinin visualisoitiin kasvaimen ytimet tunnin kuluttua SP5-2-LD annettiin, mutta ei sen jälkeen, kun muita muotoiluja injektoitiin (Fig. 5A). Ajan myötä alueet tuumorisektioiden kanssa havaittavissa doksorubisiinin lisääntynyt. Alueilla, joissa havaittavissa doksorubisiinin olivat merkittävästi suurempia SP5-2-LD-käsitellyt tuumorit kuin FD, LD, ja MP5-2-LD-käsitellyt tuumorit kussakin aikapisteessä (Fig. 5A). MP5-2-LD formulaatio oli sama hajotuskuvio kuin LD, mutta alueiden FD-käsiteltyjen kasvainten ei näkynyt havaittavissa doksorubisiini (Kuva. 5A).

(

) edustaja kaksi väri kuvat osoittavat jakautumista doksorubisiinin (punainen) suhteessa ytimet (sininen) kudosleikkeissä. Kertyminen doksorubisiinin kasvainkudoksissa osoitettiin 1, 4 ja 24 tunnin kuluttua injektiosta. Bar, 50 pm. (

B

) histopatologia ja fluoresenssivärjäys kasvainkudosnäytteet kummankin hoitoryhmän tutkitaan värjäyksen jälkeen H & E, TUNEL (vihreä), lektiinin (punainen), ja DAPI (sininen). Bar, 50 pm. Enhancement lääkeaineen kertymistä kasvainkudoksissa korreloi lisääntyneen terapeuttista tehoa.

Kun kasvain kudosten kummassakin hoitoryhmässä (Fig. 3C) tutkittiin H & E-värjäystä, selvästi levitetään nekroottisen /apoptoottista alueet olivat läsnä koko osissa SP5-2-LD-käsiteltyjen ksenografteissa (Fig. 5B). Lisäksi, päätelaite deoksinukleotidyylitransferaasi-välitteisen dUTP nick end merkintöjä (TUNEL), on käytetty tunnistamaan apoptoottisten solujen ja tomaattia lektiini on sovellettu tunnistamaan kasvaimen verisuoniin. Kasvaimet olivat suurempia apoptoottisen alueilla ja pienempi tiheys kasvaimen verisuonten SP5-2-LD-hoidetussa ryhmässä kuin LD ja PBS-käsiteltyjen ryhmien (kuviot. 5B ja S6).

Suurempi kertyminen syöpälääkkeet kasvainkudoksissa ja biologisesti doksorubisiini syöpäsolun ytimiä ligandi-konjugoidun liposomit lisäksi osoittaneet, että SP5-2 peptidi tunnustettu kohdemolekyylin pinnalla keuhkosyövän soluja ja siten lisätä suoraan lääkeaineen toimitus kasvain.

keskustelu

terapeuttinen tehokkuus syöpälääkkeiden voidaan saavuttaa parantamalla lääkkeen formulaation molekyylejä, jotka sitoutuvat ensisijaisesti tuumorikudoksissa [22], [26], [37], [ ,,,0],41]. Faagi-display biopanning on ehjä solu mahdollistaa eristämisen erittäin spesifisten peptidien, jotka on kohdistettu kasvaimeen liittyviä antigeenejä. Anti-cancer hoito aseistettu näitä peptidejä voidaan käyttää ”risteilyohjuksia”, jotka ovat juuri ohjataan syöpäsoluja ja tuottaa riittävän korkea annoksina tappaa nämä solut mahdollisimman vähän vahinkoa normaaleissa kudoksissa.

Tässä tutkimuksessa, tunnistimme NSCLC-kohdistaminen peptidin ja osoitti parantunut terapeuttinen tehokkuus eläinmalleissa. Tarkemmin, olemme löytäneet faagiklooni PC5-2, että muodostuu 90% valitusta faagien sitoutuminen CL1-5 soluihin viiden kierroksen biopanning (taulukko 1). Immunohistokemia ja virtaussytometria määrityksiä vahvistaneet PC5-2 sitoutuneen NSCLC solun pintaan. Sama sitova tulokset havaittiin sukulais synteettinen peptidi SP5-2, joka korvasi PC5-2 (Fig. 1 ja kuvioissa. S1, S2, S3). Nämä kokeet tukevat tämän kohdistaminen peptidi voi sitoutua spesifisesti solun pintaan NSCLC solulinjoissa.

In vivo

kokeita myös yhdistelty Hakeutumiskykyä peptidin. Ilmaus SP5-2 peptidin (TDSILRSYDWTY) ohjaa faagin kerääntyä NSCLC ksenografteissa, mutta ei normaalissa elimissä (Fig. 2). Sitova aktiivisuus PC5-2 kasvaimen kudokset estyi synteettisen peptidin SP5-2 (Fig. 2B), mikä osoittaa, että PC5-2 vuorovaikutuksessa NSCLC-soluihin sen näyttöön peptidi eikä toisen osan faagipartikkelin. Että mutatoidun synteettisen peptidin, MP5-2, ei estänyt PC5-2 sitova osoittanut, että on tärkeää, että WTY motiivin sitoutumisen aktiivisuus (Fig. 2B). Lisäksi tämä ilmiö havaittiin immunohistokemiallisella värjäyksellä kirurgisista näytteistä ihmisen keuhkosyöpä (Fig. 1 D e ja f), eläinmalleissa ligandi-kohdistettua kemoterapiaa (Fig. 3A) ja kasvainpaikantumisen doksorubisiinin toimitetaan SP5-2- konjugoitu kohdistaminen liposomeihin (kuviot. 4 ja 5A).

immunohistokemia arviointeja keuhkojen adenokarsinooma kirurgisista näytteistä osoitti, että SP5-2 on kliininen potentiaalia kuvantamisen antureista tunnistaa NSCLC tai lääkeaineen aineina NSCLC. Sekä PC5-2 ja biotiinileimatuilla SP5-2 havaittu keuhkojen adenokarsinooma kirurgisista näytteistä meidän kokeita (Fig. 1 D). Seitsemänkymmentä viisi prosenttia (27/36) keuhkojen adenokarsinooma näytteitä 36 potilaista ilmaisi kohdemolekyylin, joka tunnusti peptidi (taulukko S1). SP5-2, mutta ei MP5-2, kilpaili PC5-2 sitoutumisesta keuhkojen adenokarsinooma kirurgisista näytteistä (Fig. 1 D), mikä edelleen vahvisti erityispiirteenä kohdistamista ligandin.

Aiemmissa tutkimuksissa, doksorubisiini on laajalti käytetty syövän hoidossa, koska sen laaja antituumorivaikutus. Kuitenkin tehoa doksorubisiinille hoidossa NSCLC edelleen epätyydyttävä, joiden vaste on 15% [42]. Tämä on osittain seurausta optimaalisella annosten sisällä kasvaimen takia summittaiset huumeiden levittämiseen koko kehossa ja vakavaa myrkyllisyyttä normaaliin kudoksia ja elimiä. Liposomaalinen kapselointi kanssa kohdistaminen ligandi voi olla tehokas strategia lääkeaineen suoraan kasvainsoluihin. Meidän tietojen mukaan tämä peptidi lisääntyi merkittävästi terapeuttista tehoa liposomaalisen kemoterapian ja siten nostanut eloonjäämisluvut hiirillä ihmisen keuhkosyöpää ksenografteja, ja rajatun sivuvaikutuksia eläimillä (Fig. 3). Tämä peptidi lisäsi terapeuttinen indeksi paitsi doksorubisiinille vaan myös vinorelbiinin, joka on alkaloidi käytetään pitkälle edenneen NSCLC [3]. Lisäksi havaitsimme laski suonitiheys ja huomattavasti lisääntynyt solujen apoptoosin tuumorikudoksissa jälkeen kohdistaminen liposomituotteen (kuviot. 5B ja S6). Tämä ligandivälitteinen liposomiformulaationa mahdollisesti ylivoimainen perinteiseen syövän vastaisen hoidon NSCLC.

in vivo

farmakokineettisissä tutkimuksissa hiirillä osoittivat, että liposomaalinen doksorubisiini muutti dramaattisesti kuljetuksen ja jakelun doksorubisiinin sydän, keuhkot, munuaiset ja maksa hiirillä (kuviot. 4 ja S5).