Krooninen sairaus

tiivistelmä

FBXW7

toimii tuumorisuppressorina kautta ubikinaation ja hajoamista useita onkoproteiineja. Menetys FBXW7 ilmentymisen, joka voi osittain johtua, että genominen deleetio tai mutaatio FBXW7 lokuksen, havaitaan usein monissa ihmisen syövissä. Kuitenkin sääntelymekanismeissa FBXW7 ilmaisu edelleen huonosti. Tässä selvitimme 5′-alue

FBXW7

geeni tutkimaan sääntelyn FBXW7 ilmaisua. Havaitsimme seitsemän vaihtoehtoisen silmukoinnin (AS) 5′-UTR muotoja FBXW7α, jotka koostuvat useista uusia ei-koodaavan eksonit. Merkittävä ero translaation tehokkuuteen näistä 5′-UTR variantteja havaittiin in vivo lusiferaasireporttiterilla määritys ja Western blot. Lisäksi olemme havainneet, että mRNA taso AS lomakkeen suurella translaation hyötysuhde oli nimenomaan vähennetty yli 80% rintasyöpään solulinjojen ja yli 50% ihmisen primäärisyövästä eri kudoksista. Lisäksi olemme myös tunnistettu mutaatioita FBXW7 eturauhassyövissä (5,6%), munuaisen syövät (16,7%), ja virtsarakon syöpien (18,8%). Tuloksemme viittaavat siihen, että lisäksi mutaatio, erilaiseen ekspressioon FBXW7α AS muotoja eri translaation ominaisuudet voivat toimia uudella mekanismilla inaktivoimiseksi FBXW7 ihmisen syövässä.

Citation: Liu Y, Ren S, Castellanos-Martin A, Perez-Losada J, Kwon YW, Huang Y, et ai. (2012) Multiple Novel vaihtoehtoiset jatkaminen muodot FBXW7α Onko Translational Moduloivat Function ja Näytä ellei muutos Human Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49453. doi: 10,1371 /journal.pone.0049453

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2012; Hyväksytty: 09 lokakuu 2012; Julkaistu: 14 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: JPL on osittain tukevat EAKR ja MICINN (PLE2009-119), FIS (PI10 /00328) ”Fundación Eugenio Rodríguez Pascual”, ja Fundación Inbiomed (Instituto Oncologico Obra Social de la Caja Guipozcoa-San Sebastian, Kutxa). YS tukee National Basic Research Program of China (2012CB518300) ja Ministry of Science Technology Shanghai (08410701500). JHM tukee National Institutes of Health, National Cancer Institute avustuksen R01 CA116481, Low Dose Scientific Focus Area, Office of Biological Environmental Research, US Department of Energy (DE-AC02-05CH11231), laboratorio Ohjaus tutkimus Development Program (LDRD), ja NASA Erikoistunut Center for Research in Radiation Health Effects (NNX09AM52G). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

FBXW7

geeni on transkription kohteena p53, jonka ilmentymistä on yliaktiivista p53-riippuvaisen-tavalla sädehoidon [1].

FBXW7

geeni koodaa F-box-proteiini, joka on olennainen ubikitinaation eri onkoproteiineja, mukaan lukien c-Myc [2], [3], c-Jun [4], sykliini E [5] [6], eri jäsenten Notch perheen [7], [8], Aurora-A [1], [9], mTOR [10], [11], ja KLF5 [12], [13]. Yliekspressio useita näistä tavoitteista, kuten sykliini E [14], c-Myc [15] ja Aurora-A [16] on liitetty aiheuttaa genomin epästabiilisuuden. Nämä havainnot osoittivat, että

FBXW7

on ihmisen tuumorisuppressorigeeniä, johtopäätös tukee myös löytö

FBXW7

geenimutaatioita syövät valittu laajasta valikoimasta ihmiskudosten, kuten sappi kanava, veri, luu, aivot, rinnan, paksusuolen, kohdun limakalvon, mahan, keuhkojen, munasarjojen, haiman, ja eturauhasen, yleisten 6% pistemutaatio taajuus [17].

poistaminen

Fbxw7

geeni hiirissä johtaa alkion kuolleisuutta, mutta heterotsygoottinen hiiret kehittävät yleensä [18], [19]. Vaikka ne eivät kehity spontaaneja kasvaimia, säteilylle altistuminen aiheuttaa erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien erilaisia ​​epiteelisyöpien [1]. Hiiret, jotka kuljettavat inaktivoidun alleelin molempien

Fbxw7

ja

p53

osoittavat kiihtyvyys kasvaimen kehitystä. Haploinsufficient menetys

Fbxw7

havaitaan useimmissa lymfoomat tässä hiirimallissa, jopa ne, jotka aiheutuvat

Fbxw7 /p53

kaksinkertainen heterotsygoottinen hiirillä, eli menetys vain yhden kopion geenistä voi tuottaa merkittävä biologinen vaikutus [1]. Samanlaisia ​​havaintoja on heterotsygoottista mutaatioiden sittemmin löydetty ihmisen kasvaimissa [20]. Näin ollen on todennäköistä, että kokonaisvaikutus tämän tuumorisuppressorigeenin ihmisen syöpä on suurempi kuin 6% pistemutaatio taajuus edellä mainittiin, koska menetys vain yhden geenin kopion voi olla huomattava vaikutus kasvainten kehittymiseen. Deleetioita kromosomissa 4q31, jonka mukaisesti

FBXW7

sijaitsee, ovat yleisiä monissa eri ihmisen syövistä [21] – [25], mikä viittaa siihen, että häiriöt tämä reitti voi olla tärkeä piirre monissa tai jopa suurin, ihmisen syövissä.

5 ’transloitumaton alue (5′-UTR), on tärkeä rooli valvonnassa eukaryoottisen geenin ilmentymistä [26]. Viimeaikaiset tutkimukset nisäkkäiden transcriptome viittaavat siihen, että suurin osa geeneistä ilmaista useita vaihtoehtoisen silmukoinnin (AS) 5′-UTR-alueet, ja UTR heterogeenisuus tietyn geenin todennäköisesti on ero vaikutus proteiinien ilmentyminen [27], [28]. Erityisesti monet onkogeenien ja kasvaimet synnyssä ovat myös omiaan ilmaisemaan epätavallisen monimutkaisia ​​5′-UTR [29], [30]. Lisäksi on ilmeistä, että sopimaton ekspressio 5’-UTR AS on osoitettu edistää syövän [31], [32].

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet 5′-alue on

FBXW7

ymmärtää sääntelymekanismit, ja tunnistettu useita uusia koodaamattomalla eksonien FBXW7α isoformin, joka tuotti useita 5′-UTR AS muotoja. Toiminnallinen vaikutukset ovat 5′-UTR tehokkuuteen käännöksen osoitettiin myöhemmin säädellä FBXW7α ilme. FBXW7α 5′-UTR ilmentyvät differentiaalisesti eri normaaleissa ja tuumorikudoksissa, joka todennäköisesti johtaa muutokseen tasot FBXW7α ilmaisun aikana karsinogeneesiin. Meidän tietämyksen aiheen olettaa, että ero ilmentyminen FBXW7α muotoina tarjoaa uuden mekanismin inaktivoiva

FBXW7

ihmisen syövässä.

Tulokset

Useita uusia vaihtoehtoisia silmukointimuotoa tunnistettu

FBXW7

geenin

kolme FBXW7 isoformeja (α, β ja γ) on raportoitu tähän mennessä. Ne eroavat toisistaan ​​ensimmäisen eksonin ja jakaa seuraavan 2-11 eksonit. Jotta voidaan tutkia sääntelyn

FBXW7

ilmaisua, me tunnettu 5 ’alueelle FBXW7α, β ja γ isoformin käyttämällä 5’ RACE tekniikka cDNA ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen (HMEC) 184A1. Sekvensointianalyysin 115 RACE-kloonien paljasti viisi novel koodaamattomalla eksonien sisällä

FBXW7α

5′-UTR rinnastettuna ihmisen genomista sekvenssiä, kun taas mitään ylimääräistä eksonia havaittu alkaen

FBXW7β

ja

FBXW7γ

sekvensoimalla 27 ja 31 RACE-kloonien (kuvio 1).

FBXW7α

5′-UTR läpikäy vaihtoehtoisen silmukoinnin (AS) tuottaa seitsemän mRNA-transkriptien kanssa sama ensisijainen translaation aloituskohdan (kuvio 1, taulukko S2). Nämä tulokset varmistettiin vielä räjäyttämällä sekvenssit vastaan ​​tietokantaan ilmenevän geenin osiksi (dbEST). Sekvenssit seitsemän vaihtoehtoisen silmukoinnin muotoja talletettiin Genebankin pääsy numero HQ873864-HQ873870.

Rakenteelliset esimerkki useiden liitos muotojen FBXW7α. Seitsemän eri liitoksen muotoja FBXW7α tunnistettiin 5′-RACE käyttäen geeniä alukkeen (GSP) ja pesä pohjamaali (Rs1). Pesäkkeiden lukumäärä kunkin liittämiseen muodossa havaitut seulonta näytettiin. N-terminaalinen sekvenssi isoformin β ja γ tutkittiin myös 5′-RACE käyttäen vastaavaa alukkeita GSPβ, GSPγ, Nestβ ja Nestγ. Nuolet edustavat alukkeita tässä tutkimuksessa käytetyt ja niiden asemaa vastaavassa järjestyksessä.

Näistä eksonit, 1αa ja 1αc näkyvät useimmissa AS muodoista, kun taas 1αd on vain yksi seitsemästä liitos muotoja (kuvio 1). Mielenkiintoista, 1αb ja 1αd näyttävät toisin rinnakkain samassa AS muodossa. Jotta voitaisiin vahvistaa tämän, olemme suunnitelleet erityisiä PCR-alukkeita, jotka vastaavat sekvenssejä 1αb ja 1αd, vastaavasti (kuvio S1) ja voineet havaita mitään kaistan kudosten mRNA käytettiin tässä tutkimuksessa RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi ei ole uusia ORF esiintyy kaikissa seitsemässä AS muodot FBXW7α, mikä osoittaa, että nämä uudet eksonit vain muodostaa erilaisia ​​5′- UTR erilaisten alueiden muodoiksi.

Erot käännös tehokkuutta eri

FBXW7α

AS muotoja

tutkimiseksi toiminnallinen vaikutus näiden 5′-UTR on translaation tehokkuuteen myöhempien FBXW7α ORF, ensin käytetään lusiferaasireport- määritys verrata seitsemän 5′-UTR-sekvenssit. Tätä varten me kloonattiin kukin 5′-UTR ylävirtaan tulikärpäsen lusiferaasi (LUC) geenin pGL3-promoottori reportteri-vektoriin (Promega), ja transfektoitiin ne HeLa-soluissa. Tyhjät pGL3-promoottori käytettiin kontrollina (LUC-ctrl). Renilla-normalisoitu lusiferaasivaikutusta kullekin konstruktia verrattiin LUC-ctrl. Tulokset näistä määrityksistä johdonmukaisesti osoittivat merkittäviä eroja LUC toimintaan Näistä seitsemän 5′-UTR variantteja (kuvio 2A). Spli2-UTR aina, osoitti suurinta LUC toimintaa ja samalla tasolla LUC aktiivisuuden Spli1-UTR, Spli4-UTR, ja Spli5-UTR oli väli, mutta huomattavasti korkeampi kuin LUC-ctrl; LUC aktiivisuus Spli3-UTR, Spli6-UTR, ja Spli7-UTR ei ollut tilastollisesti merkitsevä verrattuna LUC-ctrl (kuvio 2A). Voidakseen vahvistaa, että nämä erot LUC toimintaan eivät johtuneet vaihteluista LUC transkriptio, suoritimme kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR (qRT-PCR). Kuten osoitti kuvassa 2B, ei ollut merkittäviä eroja tasojen LUC transkription eri 5′-UTR varianttien verrattuna LUC-ctrl. Tämä tulos osoittaa selvästi, että 5′-UTR of FBXW7α säätelee translaation tehokkuutta alavirran ORF.

(A) vaikutus

FBXW7α

5′-UTR variantteja on LUC toimintaa. LUC toimittaja konstrukteja, jotka sisälsivät kukin

FBXW7α

5′-UTR ylävirtaan LUC reportterigeenin pGL3 vektori, transfektoitiin HeLa-soluissa. LUC aktiivisuus mitattiin Firefly /Renilla suhde. Tulokset edustavat data kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Mean data ja keskihajonnat on esitetty. * P 0,05 verrattuna LUC-ctr. (B) LUC transkription tasot tutkittiin qRT-PCR. LUC mRNA sisältö normalisoida Renilla mRNA sisältöä kaikille näytteille ja suhteellinen LUC mRNA pGL3p (tyhjä vektori, Promega) mielivaltaisesti pidetään 1 (kontrolli). (C) vaikutus 5′-UTR on FBXW7α proteiinin tasot. Immunoblot kehitettiin anti-HA-vasta-uutteista kanssa osoitti konstruktilla. Intensiteetti pcDNA3.1 (+), joka sisälsi FBXW7α geenin (kontrolli) katsottiin 1. GFP konstruktia käytettiin transfektiotehokkuutta ohjaus, ja β-aktiini kuin latauskontrollina. Kaikki transfektiot suoritettiin kolmena kappaleena, ja palkit osoittavat standardipoikkeaman. * P 0,05 verrattuna hallita. (D) cDNA frangments varten FBXW7 (ylempi paneeli), GFP (keskimmäinen paneeli) ja GAPDH (alempi paneeli) oli erityisesti monistettiin RT-PCR: llä HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu osoitettu konstruktioita.

varmistamiseksi edelleen vaikutus 5′-UTR sääntelystä käännöksen, me kloonattu seitsemän 5′-UTR osaksi ylävirtaan FBXW7α ORF pcDNA3.1 koodattu HA-epitoopin ja sen jälkeen transfektoidaan ne Hela soluihin. Western blotting -analyysi osoitti ekspressoitumista tasolta Spli2 konstrukti oli johdonmukaisesti suurempi kuin on havaittu muiden UTR ja valvonta-konstruktit, kun normalisoitu tasolle transfektion tehokkuuden valvonnan GFP-proteiinia (kuvio 2C), mikä on sopusoinnussa tulosten lusiferaasireportterisysteemillä määritys . Olemme vahvisti, että ilmaisu ero ei johdu transkription vaikutuksia, koska mRNA: n tasot eivät ole merkittävästi erilaisia ​​(kuvio 2D). Yhdessä olemme tulleet siihen tulokseen, että 5′-UTR variantteja FBXW7α on translationaalisen modulatory toimintoa.

Expression profiilit

FBXW7α

AS muotoja ihmisen normaaleissa kudoksissa

Koska 5 ”-UTR voi säädellä käännös alavirran ORF: ien, seuraavan kerran pyrittiin tutkimaan ekspressiokuviota

FBXW7α

AS muotoja ihmisen kudoksissa. Tätä tarkoitusta varten puoliksi määrä RT-PCR suoritettiin 21 ihmisen normaaleissa kudoksissa, joilla on eri alukkeita, jotka vastaavat vasta tunnistettu eksonit (kuvio 1, taulukko S1). RT-PCR aluksi suoritettiin alukkeiden parin (F2 /Rs1), jotka voivat tunnistaa kaikki AS muotoja. Kuten odotettua, useita AS lomakkeita ilmaistiin kaikissa ihmisen kudoksissa (kuvio 3A, yläpaneeli). AS muodostavat Spli5, Spli4 ja Spli2 vastaten band koot 386 emäsparin, 435 emäsparin, 478 emäsparin vastaavasti, osoittivat korkean mRNA-ilmentymisen tasoa (kuvio 3A, yläpaneeli), vastaa meidän havainnot 5 ’RACE tutkimuksia, joissa numero kloonien, jotka vastaavat näitä AS muotojen havaittiin paljon korkeampi taajuus (kuvio 1). Ilmentymistaso eri FBXW7α AS muotoja vaihteli kudoksiin. Esimerkiksi Spli4 on hallitseva muodossa kivekset (kaista 12 kuviossa 3A, yläpaneeli), kun taas Spli2 on kaikkein ilmaistu yksi muissa kudoksissa (kuvio 3A, ylempi paneeli), mikä viittaa kudoksiin liittyvän jakautumiskuvion.

(A)

FBXW7α

AS muodostaa ekspressiotasoja havaittiin semikvantitatiivinen RT-PCR käyttäen erilaisia ​​alukeparia. (B) tasot Spli1 2 ja Spli3-5 ilmentyminen kvantitoidaan esitetyssä kokeessa (A) alempi paneeli. Normaalit kudokset ovat: 1-ruokatorvi, 2-rasva, 3-sydän, 4-rakon, 5-munuainen, 6-brain, 7-maksa, 8-keuhko, 9-kohdunkaula, 10-paksusuoli, 11-perna, 12- kivekset, 13-kateenkorva, 14-thyraoid, 15-henkitorvi, 16-ohutsuolessa, 17-luurankolihasten, 18-eturauhasen, 19-istukan, 20-munasarja, 21-rinta. ”M” tarkoittaa DNA: ita tikkaat Marker.

Koska seitsemän AS lomakkeet sisältävät crossover useiden eksonien 5′- UTR, on vaikea erottaa näitä variantteja. Näin ollen olemme suunnitelleet alukkeet F2 /R2 sijaitsee eksonissa 1αa ja 1αc verrata ilmentymistason Spli1 2 (a summa Spli1 ja Spli2 lauseke) kanssa muodostaa Spli3-5 (summa Spli3, Spli4 ja Spli5 ilmaus) . Huomasimme, että Spli1 2 pääasiallisesti ilmaistu useimmissa kudoksissa (kuvio 3A, alapaneeli, ja kuvio 3B). Mutta joissakin kudoksissa, kuten perna, kateenkorva ja ohutsuolessa osoittivat yhtä suuri ekspressiotasot Spli1 2 ja Spli3-5 (kaistat 11, 13 ja 16 kuviossa 3A, alempi paneeli, ja kuvio 3B), kun taas Spli3-5 on korkea vain ilmaistuna kivekset (kaista 12 kuviossa 3A, alapaneeli, ja kuvio 3B).

vuorottelevat ilmaus

FBXW7α

erityisiä AS muotoja ihmisen syövissä

Koska ero lauseke 5′-UTR AS muodot on yhdistetty syövän etenemiseen, tutkimme ilmaus profiilia tunnistettu FBXW7α AS muotoja ihmisen syövän semikvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen samoja edellä kuvattuja alukkeita. Tulos paneelin 20 rintasyövän solulinjat osoittivat, että useimmat rintasyövän solulinjat ovat laskeneet ekspressiotasot FBXW7α erityisiä AS muotoja verrattuna normaaliin ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen (HMEC) (184A1 ja 184B5) (kuvio 4A). Lähes kaikki rintasyövän solulinjoissa osoitti huomattavaa vähenemistä ilmaus Spli1 2 taas ei ole muutoksia ilmaus Spli3-5 verrattuna tasoa HMECs (kuvio 4A, alapaneeli, kuva 4B). Nämä havainnot vahvistettiin lisäksi joukon 92 ihmisen primaarisista rintasyövistä. Verrattuna yhdistetyistä normaalin rintakudosten, Spli1 2: n ilmentymisen tasoja osoittivat merkittävää vähenemistä yli 50%: kasvaimia. Yllättäen huomasimme, että Spli3-5 ekspressiotasot osoitti merkittävää kasvua yli 30% kasvaimista (kuvio 4C ja D).

(A) mRNA: n ilmentymisen profiili FBXW7α AS muotoja ihmisen rintasyövän ja HMEC solulinjoissa määritettiin semikvantitatiivisella RT-PCR: llä käyttäen erilaista aluketta. ”B1 B20” edustaa 20 eri rintasyövän solulinjat, ”A1” tarkoittaa 184A1, ”B5” varten 184B5. (B) tasot Spli1 2 ja Spli3-5 ilmentyminen kvantitoidaan esitetyssä kokeessa (A) alempi paneeli. (C) Edustaja mRNA ilmaisun profiilia FBXW7α AS lomakkeita 92 ihmisen primaarisista rintasyövistä semi-kvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen erilaista aluketta. (D) kvantifiointi Spli1 2 ja Spli3-5 ilmentymistason 92 ihmisen primaarisista rintasyövistä. (E) mRNA ilmaisun profiilia FBXW7α AS lomakkeiden 24 ihmisen ensisijainen munuaisen syöpien semikvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen erilaista aluketta. (F) kvantifiointi Spli1 2 ja Spli3-5 ilmentymistason 24 ihmisen ensisijainen munuaisen syövistä. ”N” yhdistettiin RNA: iden normaaleista kudoksista, ”M” nimetyille tikkaat Marker.

Seuraavaksi määritetään, onko ero ilmaus

FBXW7α

erityisiä AS tapahtunut myös muun tyyppisiä ihmisen syöpä. Todellakin,

FBXW7α

ilmentyminen vaihdetaan Spli1 2 Spli3-5 ihmisen munuaisen, eturauhasen ja virtsarakon syöpien (kuva 4E ja F, kuvio S2A ja S2B). Tämä ero ekspressiokuviota FBXW7α AS muotoja erilaisissa ihmisen syövissä merkittävästi tukee hypoteesia, että FBXW7α AS muotoja osalliseksi säätelyssä FBXW7α aikana tuumorigeneesin. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että koko FBXW7 proteiinin tasoja voidaan alentaa kasvainsoluissa kautta ero ilmentyminen FBXW7α muotoina, ja lasku FBXW7 runsaasti vaikuttaa huomattavasti sen toiminnon ubikinaation ja hajoaminen tavoitteensa (onkoproteiineja), johtaen tuumorin kehitykseen ja etenemiseen.

mutaatioanalyysiin

FBXW7

ihmisen urologinen syövissä

Vaikka mutaatiot havaitaan harvoin rintasyöpiä, geneettiset muutokset löytyy edelleen eturauhassyövissä [35], ja ei ole raportti siitä geneettisten muutosten virtsarakon ja munuaisten kasvaimet. Lisäksi syöpä erot on havaittu eri etnisten ryhmien välillä. Ei ole myöskään mitään raportti koskee

FBXW7

mutaatio taajuuksien syöpä Chinese potilailla. Tämä juonittelusta meitä tutkimaan, onko olemassa mutaatioita ja mikä on taajuus mutaatioiden Kiinan syöpäpotilailla. Niinpä teimme mutaation analyysi

FBXW7

geenin 18 eturauhasen, 24 munuais-, ja 16 virtsarakkokasvain kudokset kiinalaisille potilaille. Sekä mutaatiot ja poistot löydettiin näissä kasvaimissa, kuten on esitetty joko geelielektroforeesilla tai sekvensoimalla kartan kuvassa 5. sekvensointi lyhentää RT-PCR-fragmentit vahvisti kaksi virtsarakkonäytteet ja yksi munuainen näyte on deleetioita. Virtsarakon tuumori deleetioita, yksi kasvain on deleetio osan eksonin 8 plus koko eksoni 9, kun taas muissa virtsarakon tuumorin koko eksonin 2 ja 3 sekvenssit puuttuvat. Munuaisten syöpä on deleetio osa eksonien 8 ja 10 sekä koko eksonin 9 (kuvio 5B-D, taulukko 1). Yleinen mutaationopeus FBXW7 eturauhassyövissä on 5,6%, 16,7% munuaisissa syöpiä, ja 18,8% vuonna virtsarakon syöpiä kiinalaisten potilaiden yhteenveto taulukossa 1.

(A) RT-PCR-analyysi

FBXW7

, RT-PCR-tuotteet, jotka sisältävät deleetiot on merkitty tähdellä. (B-D) sekvensointi vahvisti poistetaan kaksi virtsarakon syöpien (B ja C), ja munuaissyövän (D). (E) edustaja järjestyksessä jälkiä osoittavat mutaatiot

FBXW7

.

Keskustelu

Tutkimus tarjoaa uusia oivalluksia mekanismeja, jotka säätelevät FBXW7α ilmaisun uusi silmukoinnin. Olemme tunnistaneet seitsemän uusia AS muodot

FBXW7α

5 ’RACE tekniikka. Vaikka ne tuottavat olennaisesti samaa proteiinia,

FBXW7α

AS muodot näyttävät ohjaamaan proteiinin ilmentymistä kautta asetuksen translaation tehokkuutta näiden AS muotoja, koska olemme osoittaneet, että FBXW7α 5′-UTR variantit on translaation moduloivaa funktio. Useita AS lomakkeita löytyy vain

FBXW7α

, ei

FBXW7β

tai

FBXW7γ

. Olemme kuitenkin havainneet, että

FBXW7

α dominantly ilmaistuna lähes kaikissa ihmisen kudoksissa tutkittiin taas

FBXW7

β mRNA on rikastunut aivoihin ja kateenkorva ja on poissa tai pienen määrän muissa kudoksissa, ja

FBXW7

γ mRNA havaitaan rajoitetaan sydämen ja luuston lihaksen (kuva S3), jossa korostetaan mahdollista merkitystä

FBXW7

α toiminnalle FBXW7. Näin ollen useita AS muotoja esitetään FBXW7α voi sallia tarkaksi säätämiseksi sen ekspression aikana biologisia prosesseja.

ensimmäistä kertaa havaittu, että proteiini tasot FBXW7α säännellään translaation kontrollisekvenssit osoittamalla ero translaation tehokkuutta eri FBXW7α AS muodoissa.

in vivo

kokeellisesti LUC toimittaja määrityksiä osoittivat johdonmukaisesti, että Spli2 muoto on korkein translaation tehokkuutta verrattuna muihin. Useat tekijät ovat tunnettuja määrittämiseksi translaation tehokkuutta [33]. Erot translaation tehokkuuteen keskuudessa FBXW7α 5′-UTR varianttien on epätodennäköistä johtuen niiden pituudesta sekvenssin ympärillä translaation aloituskohta, ja määrä aloituskodoneja sisällä niitä sama määrä aloituskodoneja ja samassa järjestyksessä noin luennanaloituskeskus löytyivät kaikissa FBXW7α 5′-UTR variantteja. Pituus Spli2-UTR on selvästi pidempi kuin Spli6-UTR ja Spli7-UTR, lyhyempi kuin Spli3-UTR, mutta Spli2 oli korkeampi käännös tehokkuutta. Lisäksi tarkastelimme erot sekundäärirakenteissa ja vapaa energia kunkin

FBXW7α

5′-UTR variantteja käyttämällä online RNA-taitto-ohjelmiston (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin /RNAfold.cgi.). Ei ole merkittäviä eroja vapaan energian arvo normalisoinnin jälkeen pituuteen näistä 5′-UTR (tuloksia ei ole esitetty). Jatkotutkimuksissa myönnetään tutkia mahdollisuuksia mekanismeja, joilla 5′-UTR säännellä translaation tehokkuutta.

FBXW7

on tullut merkittävä ihmisen tuumorisuppressorigeeniä. Useita mekanismeja on raportoitu inaktivoimiseksi FBXW7 ihmisen syövässä kuten mutaatio, deleetio ja hypermetylaation [17], [21] – [25], [34]. Paljon on keskitytty toteamus FBXW7 mutaatio erilaisissa ihmisen syövän ja ovat osoittaneet, että yleinen pistemutaatio taajuus on vain 6% ihmisen syövissä [17], mutta ei ollut merkittävää vaihtelua kasvaintyypeissä. Noin 30% Mutaatiofrekvenssi löydettiin kolangiokarsinooma ja T-solujen akuutti lymfaattinen leukamias taas mutaatio taajuuksia eturauhasessa, kohdun limakalvon syövät sekä ruoansulatuskanavan syöpään järjestää 4%: sta 15% [35]. Muodostuu näistä havainnoista, raportoimme täällä ensimmäistä kertaa mutaatiot FBXW7 havaittu ihmisen munuaisen ja virtsarakon kasvaimia taajuuden 16,7% (4/24) ja 18,8% (3/16) (taulukko 1), tässä järjestyksessä. Taajuus eturauhassyövän kiinalaisten väestöstä on 5,6%, samanlainen kuin edellinen tutkimuksen valkoihoisilla [36].

Tärkein havainto tässä tutkimuksessa on, että

FBXW7

geenin vapautettu kautta ero ilmentyminen AS muotoja ihmisen syövissä. Yhteys kasvainten kehittymiseen ja sääntelyn AS on tullut uusi ja tärkeä osa syövän biologian. Tuloksemme osoittavat, että transkription kuvio

FBXW7

AS muotoja ihmisen syövissä on erilainen kuin normaali kudos osastoon. Kuten on esitetty kuviossa 4,

FBXW7α

ekspressiokuvioita useimmissa ihmisen syövissä on siirtynyt Spli1 2 Spli3-5 verrattuna normaaliin kudokseen. Tämän seurauksena kytkin aiheuttaa vähentäminen

FBXW7

proteiinin taso, ja puolestaan ​​johtaa osittaiseen menetykseen sen funktio. Tämä tulos viittaa siihen, että sääntelemätön AS on

FBXW7α

geeni voi olla ylimääräinen mekanismi inaktivoimiseksi

FBXW7

ihmisen syövissä. Koska ero ilmentyminen

FBXW7α

AS muotoja on löydetty yli 50% syövistä, ehdotimme, että tämä uusi mekanismi on merkittävä rooli ihmisen syövän kehittymisessä.

Yhteenvetona, analysoimalla

FBXW7

5’alueella tunnistimme romaani

FBXW7α

5′-UTR variantit, jotka säätelevät

FBXW7α

geenien ilmentymisen kautta järjestelyihin translaation tehokkuutta. Nämä AS muodot ilmaistaan ​​kudoksessa liittyvän tavalla monipuolinen tasoilla eri kudoksissa. Tutkimuksemme tarjoaa uuden käsityksen muuttaminen

FBXW7α

ilmaisun aikana ihmisen syövän kehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Ihmisen ensisijainen rinta kasvaimet kerättiin aikaan kirurgisen resektion at Hospital Universitario Salamancan Salamanca, Espanja. Kerääminen ja käyttö potilaan näytteitä hyväksynyt institutionaalisten eettisen Review Board sairaalan Universitario Salamancan. Ihmisen ensisijainen eturauhasen, virtsarakon ja munuaisten kasvaimet kerättiin aikaan kirurgisen resektion at Changhai sairaala, Kiina. Kerääminen ja käyttö potilaan näytteitä nojalla hyväksyttyjen institutionaalisten eettisten Review Board of Changhai sairaala, toinen Military Medical University. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta tutkimusta näiden tuumorinäytteessä.

Potilasnäytteet

sekä sairaaloissa, tuore kasvain otettiin kudosnäytteet aikaan kirurgisen resektion potilaan kasvaimia. Näytteet välittömästi napsautussovitettu pakastettiin nestemäisessä typessä ja sen jälkeen varastointia -80 ° C: ssa pakastimessa ennen käyttöä. H 80%).

Cell linjat

Rintasyöpä solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, tai RMPI1640 täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 100 mM streptomysiiniä ja penisilliiniä; yksityiskohdat kuvattiin edellisessä tutkimuksessa [37]. Hela-soluja viljeltiin MEM, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 100 mM streptomysiiniä ja penisilliiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Kokonais-RNA uuttamalla soluja ja kudoksia

Yhteensä-RNA: t valmistettiin 80% konfluentteja kulttuurin rintojen syöpäsolulinjoissa, HeLa-soluissa 36 tuntia transfektion jälkeen ja jäädytettiin ihmisen rinta-, munuais-, eturauhas- ja virtsarakon tuumorikudokset käyttäen Trizol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutetun RNA-näytteet käsiteltiin DNA-sarjaa (Ambion) ennen tarkempaa analysointia, jotta voidaan poistaa mahdolliset jäljellä oleva määrä genomista DNA: ta. RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin kanssa Nanovue spektrofotometrillä (GE Healthcare). Ihmisen kokonais-RNA: ta eri normaaleista kudoksista ostettiin Ambion.

5 ’nopean cDNA-päiden monistamisen (RACE) B

karakterisointi

FBXW7

-geenin N-päässä suoritettiin käyttämällä 5 ’RACE kittiä (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen (HMEC), 184A1-solujen Trizol (Invitrogen), ja cDNA luotiin käyttäen spesifistä aluketta (GSP) on lueteltu taulukossa S1. CDNA pyrstö dCTP: tä käyttämällä terminaalista deoksi-transferaasin, ja poly-G-aluketta (Invitrogen) yhdistettiin kunkin

FBXW7

cDNA PCR. Toinen PCR suoritettiin laimennuksella ensimmäisen PCR: llä käyttämällä kullekin pesä aluketta Nestα (Rs1), Nestβ tai Nestγ (taulukko S1), ja adaptamer aluketta, jonka Invitrogen. PCR-tuotteet analysoitiin geelielektroforeesilla ja kloonattiin pCR4-vektoriin. Kukin klooni sekvensoitiin.

Käänteinen transkriptio ja PCR-monistus cDNA

Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScript III cDNA-synteesi (Invitrogen). 1 ug RNA: ta tehtiin käänteistranskriptio seuraavat reaktio-olosuhteet määritelty valmistukseen. Reaktiot pohjustettiin 50 ng satunnaisia ​​heksameerejä. CDNA: t rintasyöpää solulinjoista, ihmisen normaaleissa kudoksissa paneeli, ja ensisijainen rinta-, munuais-, eturauhas- ja virtsarakon kasvaimet analysoitiin AS selostukset

FBXW7

α käyttäen PCR alukepareja F2 /RS1, F2 /R2 ja F1 /Rs1 (taulukko S1). Taloudenhoitaja geeni GAPDH monistettiin kuten valvonta alukeparia GapF /GapR (taulukko S1). Protokolla PCR-reaktio oli 26-35 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 56 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s.

havaitsemiseksi FBXW7 mutaatioiden primaarisissa eturauhasen, virtsarakon ja munuaisten kasvaimia, koodaussekvenssi

FBXW7

monistettiin RT-PCR: llä käyttäen kolmea alukepareja P1F /R, P2F /R ja P3F /R (taulukko S1), ja monistetut tuotteet sekvensoitiin ja verrattiin Genebank Database. Erikokoisten PCR-tuotteet, vyöhykkeet geeli leikattiin irti ja puhdistettiin, ja sitten varmistettiin sekvensoimalla DNA.

Plasmidi rakentaa

Seitsemän eri FBXW7α 5′-UTR (Spli1 7) monistettiin näiden positiivinen pCR4 kloonia RACE käyttäen seuraavaa alukeparia GL3F /GL3R (taulukko S1). PCR-tuotteet puhdistettiin geelissä, pilkottiin ja ligatoitiin sitten pGL3-promoottori-vektoriin (Promega) kautta Hindlll /Ncol-restriktiokohdat välittömässä läheisyydessä alavirran lusiferaasigeeniin. Syntyvä konstruktit nimettiin Spli1-UTR, Spli2-UTR, Spli3-UTR, Spli4-UTR, Spli5-UTR, Spli6-UTR, ja Spli7-UTR. Vastaavasti seitsemän 5′-UTR monistettiin alukeparia GL3F /GL3R2 vietiin ylävirtaan FBXW7α geenistä fuusioitunut HA epitoopin pcDNA3.1 (+) -vektoriin (tallennetaan tässä laboratoriossa) kautta Hindlll /EcoRI. Kaikki konstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla.

Ohimenevä transfektio

Transient transfektiot suoritettiin noin 70% konfluentteja HeLa-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen). Kaksikymmentäneljä tuntia ennen transfektiota solut käsiteltiin trypsiinillä ja siirrettiin joko 96-kuoppaisille levyille (lusiferaasin määritys) tai 60 mm: n annoksia (ja RNA: n eristämistä). Transfektio suoritettiin reagenssin kanssa sen jälkeen, kun valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 0,2 ug kokeellisia DNA laajamittaisen plasmidivalmisteilla toimitettiin jokaiselle hyvin 96-kuoppaisilla levyillä, kun läsnä on phRL-TK

Renilla

lusiferaasi ohjaus plasmidia (Promega, 0,01 ug) tai 4 ug kokeellisen DNA: ta ja 0,2 ug

Renilla

lusiferaasi ohjaus plasmidin solut siirrostettiin 60 mm: n malja, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa.