Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant aktivointi β-kateniinin /Tcf-4 signalointi on liitetty ihmisen Karsinogeneesin lukien peräsuolen syöpä. Tässä tutkimuksessa olemme verrattiin Tcf-4 Knockdown kanssa β-kateniinin Knockdown soluproliferaatioon, apoptoosin, ja kemosensi- SW480 ja HCT116 koolonkarsinoomasoluissa käyttäen adenovirusvektori välittämää lyhyt hiusneula-RNA (shRNA). Tuloksemme osoittavat, että verrattuna p-kateniinin pudotus, Tcf-4 pudotus tehokkaammin estyy pesäkkeiden muodostumista, indusoi apoptoosin, ja kasvoi 5-FU: n ja oksaliplatiini-välitteistä sytotoksisuutta paksusuolen syöpäsoluissa. Tutkimme lisäksi mekanismeja eri tehokkuudet havaittu β-kateniinin ja Tcf-4 knockdovvn paksusuolen syöpäsoluissa. FOXO4 kuuluu alaheimoon nisäkkään FOXO forkhead transkriptiotekijöiden, ja sillä on tärkeä rooli säätelyssä soluproliferaatioon, apoptoosin, ja DNA: n korjaukseen. Meidän tiedot osoittivat, että proteiini taso FOXO4 ei muuttunut hoidon jälkeen sekä β-kateniinin ja Tcf-4 shRNA. Kuitenkin β-kateniinin shRNA todettiin lisäävän fosforyloidun FOXO4 S193 ja vähentää ilmentymistä FOXO kohdegeenien p27Kip1 ja MnSOD, kun taas Tcf-4 shRNA osoitti päinvastainen vaikutus. Näin ollen, verrattuna p-kateniinin pudotus, Tcf-4 pudotus osoittaa parempi teho proliferaation ja apoptoosin indusoiva peräsuolen syövän soluja, jotka voivat liittyä lisääntyneeseen FOXO4 transkriptionaalista aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Tcf-4 on houkutteleva potentiaalia terapeuttisena kohteena peräsuolen syövän hoidossa.

Citation: Xie J, Xiang D-B, Wang H, Zhao C, Chen J, Xiong F, et ai. (2012) esto Tcf-4 indusoi apoptoosia ja parantaa Kemosensitiivisyys Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (9): e45617. doi: 10,1371 /journal.pone.0045617

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 23 elokuu 2012; Julkaistu: 24 syyskuu 2012

Copyright: © Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Avustukset National Natural Science Foundation of China (nro 30700978). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kanoninen Wnt-signalointireitin on keskeinen rooli useissa solun prosesseissa, mistä alkionkehityksen aikuisen kudosten homeostaasin [1]. Aktiivisuus Tämän signalointireitin määritetään määrä β-kateniinin läsnä sytoplasmassa. Koska Wnt signalointia, sytoplasminen β-kateniinin pidetään normaalisti alhaisella tasolla jatkuvalla ubikitiinistä proteasomin välittämää hajoaminen β-kateniinin, joka säätelee tuhoaminen monimutkainen koostuu adenomatoottisen polypoosin coli (APC), glykogeenisyntaasi kinase- 3β (GSK-3β), ak- siini /Conductin, Kaseiinikinaasi 1α (CK1α), ja muut proteiinit, jotka välittävät nämä biokemiallisia reaktioita. Sitovat Wnt-proteiinien solun pinnan reseptoriin monimutkainen Fz /LRP helpottaa fosforylaation sytoplasminen häntä LDL-reseptorin kaltainen proteiini (LRP), sytoplasminen häntä GSK-3β [2]. Tämä laukaisee vuorovaikutus Fz /LRP monimutkainen Dishevelled (DSH) ja ak- siini, joka johtaa inaktivointi tuhoaminen monimutkainen, jolloin kertyminen ei-fosforyloitua β-kateniinin sytoplasmassa. Kertynyt β-kateniinin sitten translokoituu tumaan ja sitoutuu Tcf /Lef transkriptiotekijät säädellä alavirran kohdegeenien, kuten c-Myc ja sykliini D1 [3] – [5].

Poikkeava Wnt /β kateniinin signalointi on raportoitu myötävaikuttaa erilaisten ihmisen sairauksia, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC) [6], [7]. APC-geenin tai GSK-3β fosforylaatiokohdan eksonissa 3

β-kateniinin

geenin (

CTNNB1

) on mutatoitunut monia syöpäsoluja, mukaan lukien CRC, jolloin aktivoitu transkriptionaalista aktiivisuutta ja β-kateniinin /Tcf signaloinnin [8]. Lisäksi tumaansiirtymiseen of β-kateniinin CRC liittyy merkittävästi taudin etenemiseen ja huono selviytyminen [9], [10]. Siksi valvonta β-kateniinin ja /tai valvonnan sen loppupään kohdegeenin ilmentymisen edustaa ihanteellinen kohde syöpähoitojen ja kemopreventiossa [11], [12], [13] .Van de Wetering

et al

. kertoi, että knockdovvn β-kateniinin pienet häiritsevät RNA: t (siRNA: t) tai knockdovvn TCF-4 hallitseva negatiivinen TCF-4 (dnTCF) tehokkaasti inhiboi TCF-toimittaja TOPFlash ja indusoi solusyklin pysähtymiseen ja kasvun pidätyksen LS174T paksusuolen syöpäsolut [14], [15]. Kuitenkin Tang

et al.

Raportoitu että knockdovvn TCF-4 siRNA lisääntynyt solujen kasvua DLD-1 koolonsyöpäsoluihin [16]. Nämä eroavuudet viittaavat siihen, että eri solulinjoilla saattaa reagoivat eri TCF-4 knockdown.

FOXO4 on yksi jäsen alaryhmään nisäkkäiden FOXO forkhead transkriptiotekijöiden [17], jotka ovat tärkeitä erilaisissa prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen , erilaistuminen, apoptoosi, DNA: n korjaukseen ja suojaa stressistä [18]. Se on AKT alavirran kohde ja fosforyloituu kolmeen erittäin säilyneitä seriini- ja treoniinitähteitä (Thr-28, Ser-193 ja Ser-258), kun PKB /AKT aktivointi. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että β-kateniinin sitoutuu FOXO transkriptiotekijä, jolla on kasvaimia estävä rooli erilaisia ​​syöpiä. β-kateniinin sitoutuu FOXO ja parantaa transkriptionaalista aktiivisuutta [19]. Lisäksi cGMP-riippuvaisen proteiinikinaasin (PKG) estää TCF signalointi koolonkarsinoomasoluissa estämällä β-kateniinin ilmentymistä ja aktivoimalla FOXO4 [20]. Siksi β-kateniinin näyttää palvelemaan kahdenlaisia ​​vaikutuksia tasapainottamalla positiivinen (kautta Tcf-4) ja negatiivinen (kautta FOXO4) solujen jakautumisen ja apoptoosin.

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että loppupään transkriptiotekijä TCF-4 on lupaavampi terapeuttinen kohde kuin β-kateniinin hoitoon CRC. Tavoitteena oli verrata vaikutuksia Tcf-4 Knockdown ja β-kateniinin Knockdown soluproliferaatioon, apoptoosin, ja kemosensitiivisyys että SW480 (mutantti

APC

, villityypin

CTNNB1

) ja HCT116 (mutantti

CTNNB1

, villityypin

APC

) koolonsyöpäsolulinjaa lyhyillä hiusneula-RNA (shRNA). Osoitamme, että verrattuna P-kateniinin knockdovvn, Tcf-4 Knockdown merkittävästi estää soluproliferaatiota, indusoi apoptoosia, ja parantaa kemosensitiivisyys paksusuolen syövän solujen kautta säätelyä FOXO4 transkriptionaalisen aktiivisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmä ja reagenssit

SW480 ja HCT116-solut ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja pidettiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 U /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä tavanomaisissa viljelyolosuhteissa. Oksaliplatiini, 5-fluorourasiili (5-FU), ja metyyli-tiatsolyyli tetratsolium (MTT) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Plasmidi pDC316-EGFP-U6 toimitti Vector Gene Technology Company Limited (VGTC, Peking, Kiina) ja plasmidi pBHGloxΔE1, 3Cre saatiin Microbix Biosystems, Inc. (Microbix, Toronto, Kanada).

rekombinanttiadenovirusvektoreita

pohjalta cDNA-sekvenssien (

β-kateniinin

GenBank no.

NM_001098209,

Tcf-4

GenBank no. NM_030756), yksi erityinen oligonukleotidiparia lyhyt hiusneula ja sen negatiivisen kontrollin sekvenssi suunniteltiin ja syntetisoitiin ja insertoitiin sitten pieneen shuttle-plasmidi pDC316-EGFP-U6 on BamH I ja Hind III restriktioentsyymikohdat. Oligonukleotidit suunniteltiin seuraavat alukkeet: [21]

Forward β-kateniinin shRNA aluketta.

’- GATCCCGTGGGTGGTATAGAGGCTCTTCAAGAGAGAGCCTCTATACCACCCACTTTTTGGAAA-3′, reverse β-kateniinin shRNA aluke: 5’-AGCTTTTCCAAAAAGTGGGTGGTATAGAGGCTCTCTCTTGAAGAGCCTCTATACCACCCACGG-3 ”

Eteenpäin Tcf-4 shRNA Primer

5′-GATCCCCGGAGCGACAGCTTCATATGTTCAAGAGACATATGAAGCTGTCGCTCCTTTTTGGAAA-3 ’, reverse Tcf-4 shRNA pohjamaali:

5′-AGCTTTTCCAAAAAGGAGCGACAGCTTCATATGTCTCTTGAACATATGAAGCTGTCGCTCCGGG-3;

Ohjaus shRNA: eteenpäin.

5′-GATCCCCCAGTAACTGAATAGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCTATTCAGTTACTGTTTTTGGAAA-3 ’, päinvastaiseen suuntaan. 5’-AGCTTTTCCAAAAACAGTAACTGAATAGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCTATTCAGTTACTGGGG-3 ’. Ohjaus shRNA ei ollut homologiaa mihinkään asiaan ihmisen geenejä. Kaikki konstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla. Saatu shuttle plasmidit kotransfektoitiin adenoviruksen pelastus plasmidi pBHGloxΔE1, 3Cre 293-soluihin hankkia rekombinantti-adenoviruksen. Rekombinantti adenovirus tehokkuus havaittiin tutkimalla sytopaattisen vaikutuksen ja EGFP ilmentymistä soluissa. Adenovirus tiitterit mitattiin sen jälkeen, kun monistus ja puhdistus käyttämällä TCID50 määrityksiä.

Colony muodostumisen määritys

SW480-soluja infektoitiin yhdistelmä-adenovirusten 90 min, ja 24 tunnin kuluttua, ne ympättiin 300-soluja /kuoppa 6-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Inkubaation jälkeen elatusaine vaihdettiin ja levyjä inkuboitiin vielä 10 päivää samoissa viljelyolosuhteissa. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 100% etanolia ja sitten laskettiin. Kloonit, vähintään 50 solut laskettiin yhdeksi pesäke.

sytotoksisuusmääritykset

SW480-solut infektoitiin rekombinantti adenovirusten 90 minuuttia, ja sen jälkeen 24 h, ne maljattiin 96-kuoppaisille levyille 4000 solua /kuoppa. Seuraavat 24 h viljelyn jälkeen solut käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina 5-FU tai oksaliplatiinin 72 tuntia. Sitten 20 ui MTT: tä (5 g /l) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia lisää. Elatusaineet sitten heitettiin pois, 0,15 ml dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin, ja levyjä inkuboitiin vielä 10 minuuttia tärinää. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (malli 550, Bio-Rad, USA).

Apoptosis Assay

SW480-soluja maljattiin kuuden kuoppalevyille tiheydellä 0,5 x 10

6 solua /kuoppa. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, solujen 70%: n konfluenssiin infektoitiin adenoviruksilla 90 minuutin ajan ja sitten pestiin poistamiseksi adenovirukset. Seuraavat vielä 24 h viljelyn jälkeen apoptoottisten indeksi arvioitiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini-V-FITC Kit kuten aiemmin on kuvattu [22].

Western blot -analyysi

Solut kerättiin ja kokonais-proteiineja uutettiin RIPA-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita. Western blot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, yhtäläinen proteiini alikvootit (50 ug) kussakin näytteessä erotettiin 10 tai 12% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF). Kun oli salvattu 5% rasvatonta kuivamaitoa, kalvoja inkuboitiin vasta-aineita P-kateniini (1:5,000), Tcf-4 (1:1,000), c-myc (1:2000), sykliini D1 (1: 2000), FOXO4 (1:1000), FOXO4 S193 (1:500), p27Kip1 (1:2000), MnSOD (1:2000), kaspaasi-3 (1:500), ja β-aktiini (1:3000) . Sitten membraanit inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:2000) (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteiinit tunnistettiin tehostetun kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä (Pierce), ja valon emissio vangittiin Kodak röntgenfilmille.

Transfektio ja reportterigeenimäärityksessä

mittauksiin β-kateniinin /TCF-4 transkriptionaalisen aktiivisuuden, pari lusiferaasireportteri- plasmidien (TOPflash /FOPflash; Upstate Biotechnology) käytettiin. PRL-TK-lusiferaasi-reportterigeeni-plasmidia (Promega) kotransfektoitiin normalisoimaan transfektion tehokkuutta. Ohimenevä transfektio suoritettiin käyttäen Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut infektoitiin rekombinantti adenovirusten 90 minuuttia, ja sen jälkeen 24 h, oli tämän jälkeen ko-transfektoitiin TOPflash lusiferaasireportterigeenin (tai mutantti-ohjaus FOP flash-vektori) ja PRL-TK. Vielä 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen ja lusiferaasi-aktiivisuuden mittaus käyttäen dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega). Kolme rinnakkaista koetta suoritettiin.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (S.D.). Tilastollinen merkitys erot määritettiin yksisuuntaisella varianssi (ANOVA) käyttäen SPSS v12.0 ohjelmistoa (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. Knockdown TCF-4 tai β-kateniinin by Adenovirusvälitteinen transduktio shRNA

pudotus ilmentymisen Tcf-4 tai β-kateniinin, adenovirusvektoreita luotiin ilmaista shRNA kohdistaminen Tcf-4 tai β- kateniinin. Western blot -analyysi paljasti annoksesta riippuvan väheneminen Tcf-4 tai β-kateniinin proteiinin ekspressiota 48 h infektion jälkeen vastaavien adenovirusvektoreiden SW480 ja HCT116-soluissa, kun taas mitään muutosta proteiinin ekspressio havaittiin tartunnan jälkeen adenovirus sisältävät salattu shRNA (Fig. 1).

SW480 ja HCT116-soluja käsiteltiin eri infektiokertoimella (MOI) adenoviruksen kuljettaa shRNA. Näytteitä kerättiin 48 tuntia infektion jälkeen. Western blot-analyysi solulysaateista proteiinia ilmentyminen β-kateniinin (a) ja Tcf-4 (b).

2. TCF-4 Knockdown vaimentaa Wnt Signaling

SW480 ja HCT116 solulinjaa on olennaisesti aktiivinen β-kateniinin /TCF-4 transkriptionaalista aktiivisuutta. Näin ollen, solut transfektoitiin ohimenevästi TCF reportteriplasmidilla, TOPflash, joka koostuu kolmesta TCF sitoutumiskohdat ylävirtaan minimaalisesta tk-promoottorin ja lusiferaasi avoimen lukukehyksen, tai kontrolli-plasmidi, FOPflash, joka on identtinen TOPflash paitsi että se sisältää mutantti toimeton TCF sitoutumiskohtia. Kuva 2a osoittaa, että sekä β-kateniinin shRNA ja Tcf-4 shRNA merkittävästi tukahdutti endogeenisen β-kateniinin /Tcf-4 transkriptionaalista aktiivisuutta verrattuna kontrolliin shRNA sekä SW480 ja HCT116-solulinjat.

SW480 ja HCT116-soluja käsitelty adenovirukset (50 MOI) kuljettavat shRNA. a, 24 tunnin infektion jälkeen, solut kotransfektoitiin reportterigeenejä kätkeminen Tcf-4 sitoutumiskohtia (TOPflash) tai mutantti Tcf-sitoutumiskohta (FOPflash), vastaavasti, yhdessä PRL-TK. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin 24 h transfektion jälkeen, normalisoidaan arvojen vastaavien PRL-TK aktiivisuutta. Arvot edustavat keskiarvoja ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. *

P

0,01 vs. kontrolli shRNA. b, 48 h infektion jälkeen, solut kerättiin ja proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blot.

sykliini D1

ja

c-Myc

tunnetaan β-kateniinin /Tcf-4 kohdegeenien, ja sen vuoksi tutkimme myös proteiinin ilmentymistä sykliini D1 ja c-Myc western blot. Kuvio 2b esittää, että β-kateniinin shRNA tai Tcf-4 shRNA käsittely johti vähentyneen merkittävästi sykliini D1 ja c-Myc-proteiinin sekä SW480 ja HCT116-soluissa.

3. TCF-4 Knockdown Parantaa FOXO4 Activity

analysoida proteiinin taso ja aktivoinnin FOXO4 proteiinia, SW480 ja HCT116-soluja kasvatettiin 48 tuntia tartunnan jälkeen adenovirukset, ja proteiini taso arvioitiin western blot. Proteiini taso FOXO4 ei muuttunut merkittävästi hoidon jälkeen β-kateniinin shRNA tai Tcf-4 shRNA (Fig. 3). Kuitenkin proteiinin taso fosforyloidun FOXO4 S193 lisääntyi merkittävästi hoidon jälkeen β-kateniinin shRNA, ja väheni käsittelyn jälkeen Tcf-4 shRNA (Fig. 3). Ilmentymistasojen FOXO kohdegeenien p27Kip1 ja MnSOD laskivat tuntuvasti käsittelyn jälkeen β-kateniinin shRNA ja lisääntynyt käsittelyn jälkeen Tcf-4 shRNA (Fig. 3).

SW480 ja HCT116-soluja käsiteltiin adenovirukset ( 50 MOI) kuljettavat shRNA. Näytteitä kerättiin 48 tuntia infektion jälkeen. Proteiini taso FOXO4, fosforyloidun FOXO4 S193, p27Kip1, ja MnSOD määritettiin western blot.

4. TCF-4 Knockdown Estää Cell proliferaatiota ja indusoi solukuoleman in peräsuolen syövän solut

vieressä tutkineet vaikutusta TCF-4 Knockdown soluproliferaatioon ja apoptoosin SW480 ja HCT116-soluissa. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen pesäkemuodostusta. Kuten kuviossa 4a on esitetty, Tcf-4 pudotus aiheutti merkittävästi vahvempi soluproliferaation inhibointi verrattuna p-kateniinin pudotus sekä SW480 ja HCT116-soluja (p 0,05, s 0,01, vastaavasti). Sen tutkimiseksi, onko Tcf-4 shRNA-välitteistä kasvun esto liittyy apoptoosiin, käsitellyn ja käsittelemättömän solut analysoitiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa 4b, sekä β-kateniinin shRNA ja Tcf-4 shRNA indusoi merkittävää kasvua apoptoottisten solujen määrässä verrattuna käsittelemättömiin soluihin ja ohjaus shRNA käsiteltyjen ryhmien (p 0,01), ja Tcf-4 shRNA indusoi suuremman määrän apoptoottisten solujen kuin p-kateniinin shRNA (p 0,01). Proapoptoottiset entsyymi kaspaasi 3 aktivoidaan pisteen lähentymistä ulkoisen ja sisäisen apoptoosin induktio reittejä [23]. Siksi tutkimme kaspaasi-3 pilkkominen markkerina apoptoosin. Yhdenmukainen virtaussytometrillä havainnot, Tcf-4 shRNA indusoi korkeamman kasvu kaspaasi-3-pilkkoutumisen verrattuna p-kateniinin shRNA (Fig. 4c).

Soluja käsiteltiin adenovirukset (50 MOI), joka kantaa shRNA varten 24 h. a Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen pesäkemuodostusta. b, Cell apoptoosia määritettiin käyttämällä anneksiini-V-FITC: llä värjäys. c ilmentyminen proapoptoottiset entsyymin kaspaasi-3 määritettiin western blot. Kukin tietopiste on keskiarvo ± S.D. Kolmen tai useamman itsenäisen määrityksen. *

P

0,01 vs. kontrolli shRNA;

#

P

0,05 versus β-kateniinin shRNA;

##

P

0,01 versus β-kateniinin shRNA.

5. TCF-4 pudotus Parantaa Kemosensitiivisyys in peräsuolen syövän solut

SW480 ja HCT116-soluja esikäsiteltiin yhdistelmä-DNA-adenoviruksia, joka lähettää asianomaisen shRNA ja käsiteltiin sitten 5-FU tai oksaliplatiinin eri pitoisuuksilla 72 tunnin ajan. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa 5, β-kateniinin shRNA hoito lisäsi 5-FU: hun ja oksaliplatiinia sytotoksisuus. Lisäksi, Tcf-4 shRNA hoito johti enemmän merkittävää lisäystä sytotoksisuuden verrattuna p-kateniinin shRNA hoidon jokaisessa pitoisuus kohdassa 5-FU: hun ja oksaliplatiinia (p 0,01).

Solut infektoitiin adenovirusten (50 MOI) kuljettaa shRNA; 48 h infektion jälkeen soluja käsiteltiin 5-FU tai oksaliplatiinin eri pitoisuuksilla 72 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Pylväsdiagrammit edustavat keskiarvoja kolmen määrityksen ± sd

Keskustelu

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä aikuisten pahanlaatuisten kasvainten esiintyy maailmanlaajuisesti kannalta sekä sairastuvuutta ja kuolleisuutta . Huolimatta parannuksista lääkehoito, tulosten käsittely paikallisesti levinneen ja etäpesäkkeitä jää pettymys, 5-vuoden eloonjäämisluvut pienempi kuin 10% potilailla, joilla oli etäpesäkkeitä. Poikkeava WNT reitin signalointi on varhainen eteneminen tapahtuma 90% CRC. Sitä esiintyy mutaation pääasiassa

APC

(jopa 80%) ja harvemmin on

β-kateniinin

(noin 10%) tai AXIN2 [24]. Mutaatiot

APC /β-kateniinin

geenejä, mikä johtaa poikkeavaan aktivointi β-kateniinin /Tcf-4-reitin, ovat yleisiä CRC, viittaa siihen, että kohdennetun inhibitio tämän reitin voisi olla potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa kontrolloida CRC. Me ja muut olemme raportoineet aiemmin, että luonnollisia yhdisteitä ja ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (NSAID: t) estävät Wnt /β-kateniinin signalointireitin [22], [25], [26], [27], [28]. Kuitenkin, tällä hetkellä ei ole selektiivinen tämän reitin saatavilla terapeuttisena aineena. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että shRNA-välitteinen geenien ja β-kateniinin estää merkittävästi solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [29], [30], [31].

Esillä olevassa tutkimuksessa, me nimenomaan keskittyi vertaamalla tehokkuudet β-kateniinin knockdown ja Tcf-4 knockdovvn paksusuolen syöpäsoluissa, ja tutkitaan mahdollisia molekyylitason mekanismeja vastuussa näistä vaikutuksista. Olemme osoittaneet, että Tcf-4 knockdown indusoi merkittävästi vahvempi soluproliferaation inhibointi, apoptoosi ja parantaminen kemosensi- koolonkarsinoomasoluissa verrattuna p-kateniinin knockdown.

Aktivoidut β-kateniinin /Tcf-4 signalointi kertyminen β-kateniinin tumassa on liitetty ihmisen karsinogeneesissä, mukaan lukien CRC. Tämä kertyminen voi johtua mutaatiosta joko tuumorisuppressorigeenin

APC

tai

β-kateniinin

itse. Vähintään 60% satunnaisia ​​CRC tapauksista sisältää yhden APC-mutaatio, ja lähes puolet heistä osoittavat poikkeavuuksia sekä APC alleeleista [32], [33], [34]. Tässä tutkimuksessa, teimme yksityiskohtaisen mekanistinen tutkimus tehon arvioimiseksi eston β-kateniinin /Tcf-4 signalointi ihmisen CRC käyttämällä ihmisen CRC SW480 solulinjaa, joka satamat mutantti APC ja villityypin β-kateniinin, ja HCT116 solulinja, joka satamat mutantti β-kateniinin ja villin tyypin APC. Ensin rakennettiin adenovirusvektorit kuljettavat ihmisen β-kateniinin tai Tcf-4 shRNA jotta pudotus ilmentymisen β-kateniinin tai Tcf-4. Western blot -analyysi paljasti annoksesta riippuvan väheneminen Tcf-4 tai β-kateniinin proteiinin ilmentymistä SW480 ja HCT116-soluja 48 h infektion jälkeen vastaavien adenovirusvektorien. Lisäksi, sekä β-kateniinin shRNA ja Tcf-4 shRNA merkittävästi tukahdutti β-kateniinin /Tcf-4 transkriptionaalista aktiivisuutta sekä ilmaisu kahden tunnetun kohdegeenien, sykliini D1 ja c-Myc, ja SW480 ja HCT116-soluissa. Nämä tiedot osoittavat, että sekä β-kateniinin Knockdown ja Tcf-4 Knockdown tukahduttaa β-kateniinin /Tcf-4 aktiviteetti

in vitro

.

välinen koordinointi solujen lisääntymisen ja apoptoosin on erittäin tärkeä rooli että karsinogeneesi ja kehitystä paksusuolen syövän. Β-kateniinin /Tcf-4-reitti on tärkeä signalointireitille että vihjeitä tasapainon soluproliferaation ja apoptoosin syöpäsoluissa. Tutkimuksessamme β-kateniinin pudotus esti solujen lisääntymisen ja indusoi solujen apoptoosia sekä SW480 ja HCT116-soluissa. Verrattuna β-kateniinin pudotus, Tcf-4 pudotus aiheutti huomattavasti suurempi soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktion. Lisäksi olemme havainneet, että Tcf-4 Knockdown paransi merkittävästi kemosensitiivisyys sekä SW480 ja HCT116-solujen 5-FU: hun ja oksaliplatiinia.

tutki tarkemmin mekanismeja tasauspyörästön tehokkuudet β-kateniinin knockdown -että TCF- 4 knockdown in SW480 ja HCT116-soluissa. Meidän tiedot osoittivat, että proteiini taso FOXO4 ei muuttunut hoidon jälkeen sekä β-kateniinin ja Tcf-4 shRNA. Kuitenkin β-kateniinin shRNA todettiin lisäävän fosforyloidun FOXO4 S193 ja vähentää ilmentymistä FOXO kohdegeenien p27Kip1 ja MnSOD, joka on yhdenmukainen aiemman raportti, joka osoittaa, että β-kateniinin-spesifinen siRNA esti TCF toimittaja toimintaa ja FOXO- riippuvainen signalointi LS174 koolonkarsinoomasoluissa [19]. Sen sijaan Tcf-4 shRNA osoitti vastakkaista sääntelyrooli ß-kateniinin on FOXO4. Nämä havainnot viittaavat siihen, että β-kateniinin shRNA aiheuttama alas-säätely FOXO4 riippuva signalointi on riippumaton Tcf-4.

FOXO tekijät merkittävä rooli säätelyssä soluproliferaatioon, apoptoosin, ja oksidatiivisen stressin [17]. [18]. Niiden toiminnot säätelevät useat signalointireittien, kuten AKT. Koska AKT aktivointi, FOXO4 sijaitsee tumassa, jossa se toimii transkriptiotekijä [35]. Kun AKT aktivointi, FOXO4 fosforyloituu kolmeen erittäin säilyneitä seriini- ja treoniinitähteitä (Ser-193, Thr-28 ja Ser-258), jota seuraa inaktivoituminen ja ydin- syrjäytymistä [36]. Essers et ai. [19] osoittivat, että oli olemassa välisen funktionaalisen vuorovaikutuksen β-kateniinin ja FOXO on oksidatiivisen stressin signalointi, ja β-kateniinin-spesifinen shRNA vähentää TCF ja FOXO transkriptionaalista aktiivisuutta LS174T paksusuolen syövän soluja, jotka ilmentävät mutantti muoto β-kateniinin. Kertyvät todisteet osoittavat, että FOXO tekijät toimivat tuumorisuppressoreilla erilaisia ​​syöpiä. Tang et al. [37] havaitsivat myös, että FOXO4 esti ilmentymisen HIF-1α: n ja VEGF syöpäsoluissa. Lisäksi, äskettäin tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen villin tyypin FOXO4 johti kasvuun doksorubisiini-välitteistä sytotoksisuutta HCT116 paksusuolen syövän soluja, jotka edelleen pahentaa yliekspressio FOXO4 mutantti lokalisoitu yksinomaan tumaan [38].

Siksi oletamme, että säätelyä FOXO4 toiminta vastaa suurempaa tehoa Tcf-4 shRNA vaikutuksia paksusuolen syöpäsoluissa verrattuna p-kateniinin shRNA. Toisaalta, Tcf-4 ja FOXO4 voivat kilpailla β-kateniinin [19]. Kun Tcf signalointi on estetty, β-kateniinin sitoutuu suoraan FOXO4 ja parantaa FOXO4 transkriptionaalisen aktiivisuuden. Toisaalta, TCF4 pudotus voi downregulate tiettyjä signalointireittejä, kuten Akt. Tuore raportti osoittaa, että merkittävä väheneminen AKT2 tasoja ja fosforylaation Akt havaittiin jälkeen knockdovvn Tcf-4 käyttäen Tcf-4 siRNA glioomasoluihin [39]. Näin ollen, inaktivointi Akt TCF-4 shRNA tuloksia defosforylaatiota FOXO4, jotka näin ollen aktivoi FOXO-riippuvaisen signaloinnin.

Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että kohdennettu inhibitio β-kateniinin /Tcf-4 signalointi estää solun leviäminen, indusoi apoptoosin, ja parantaa kemosensitiivisyys paksusuolen syöpäsoluissa. Lisäksi, verrattuna p-kateniinin pudotus, Tcf-4 pudotus osoitti parempaa tehoa inhiboimiseksi CRC solujen kasvua ja apoptoosin indusoimiseksi, joka voi liittyä kasvua FOXO4 transkriptionaalista aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Tcf-4 voi olla houkutteleva terapeuttinen kohde CRC terapiassa. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan vahvistamaan nämä tulokset ja varmistaa hyödyllisyyttä kohdistaminen Tcf-4.