Krooninen sairaus

tiivistelmä

PIK3CA

(fosfoinositidi-3-kinaasin katalyyttinen, alfa-polypeptidi) mutaatiot voivat auttaa ennustamaan antituumorivaikutuksen fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitin inhibiittorit sekä prekliinisen ja hoitopaikassa. Valossa viime löytö kasvaimeen aloittamista syövän kantasoluja (CSCS) eri kasvaintyypeissä, olemme kehittäneet

in vitro

CSC malli ksenograftikasvaimissa perustettu hiirillä peräisin kolorektaalisyövän potilaalla kasvaimen jossa CD133 + /EpCAM + väestö edustaa kasvaimen aloittamista soluihin. CD133 + /EpCAM + CSCS rikastettiin alle kantasolujen viljelyolosuhteissa ja muodostivat 3-ulotteinen kasvain pallosia. Kasvain sferoidi solut osoittivat CSC ominaisuudet, mukaan lukien kyky erilaistumisen ja itseuudistumisen, korkeammat Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja Chemo-vastus. Geneettinen analyysi käyttäen OncoCarta ™ paneeli paljasti

PIK3CA (H1047R) B mutaatio näissä soluissa. Käyttämällä kahta PI3K /mTOR-estäjä, PF-04691502, me sitten osoitti, että tukos PI3K /mTOR-reitin estivät

in vitro

leviämisen CSCS ja

in vivo

ksenograftin kasvaimen kasvua kanssa hallittavissa myrkyllisyys. Kasvaimen kasvun estäminen hiirissä liittyy merkittävä väheneminen fosforyloidun Akt (Pakt) (S473), vakiintunut korvike biomarkkereiden PI3K /mTOR signalointireitille esto. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että PF-04691502 näyttelyitä voimakas syövän vastaista aktiivisuutta kolorektaalisyövässä kohdentamalla sekä

PIK3CA (H1047R) B mutantti CSCS ja niiden johdannaiset. Nämä tulokset voivat auttaa kliinisessä kehittämisessä PF-04691502 hoitoon alapopulaatio paksusuolisyövän heikoilla potilailla tuloksiin.

Citation: Fang DD, Zhang CC, Gu Y, Jani JP, Cao J, Tsaparikos K, et al. (2013) Antitumor tehokkuus Dual PI3K /mTOR Inhibitor PF-04691502 in Human Vieraslajisiirteen Kasvainmalli Johdettu peräsuolen syövän Kantasolut kätkeminen

PIK3CA

mutaatio. PLoS ONE 8 (6): e67258. doi: 10,1371 /journal.pone.0067258

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2012 Hyväksytty: 13. toukokuuta 2013. Julkaistu: 27 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Fang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat seuraavat edut. Kaikki kirjoittajat ovat joko nykyisiä tai entisiä työntekijöitä Pfizerin, rahoittajan tämän tutkimuksen. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja naisilla Yhdysvalloissa. Noin 103170 uutta tapausta ja peräsuolen syöpä diagnosoidaan vuosittain, noin 51690 vuotuinen kuolemaa [1]. Kolorektaalisyövässä, PI3K /mTOR reitin usein väärin säädellystä, koska mutaatioiden p110α alayksikössä

PI3K

. PI3K /mTOR signalointireitille on keskeinen säätelijä erilaisten solun prosesseja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosin, liikkuvuuteen, aineenvaihduntaa, ja autophagy. Siten onkogeeninen reitin aktivointi on tullut houkutteleva terapeuttinen kohde lääkekehityksen [2]. Prekliiniset ja kliiniset tutkimukset osoittavat, että

PIK3CA

mutaation puuttuessa

KRAS

mutaatio on ennustava markkeri vastaus PI3K ja mTOR-inhibiittorit [3] – [6].

lisäksi hiljattain mTOR-estäjä everolimuusille, jota käytetään hoidettaessa monenlaisia ​​syöpätyyppien, useita pienimolekyylisiä estäjiä PI3K /mTOR-signalointireitin on tällä hetkellä kliinisen kehitystyön [7] – [10]. Näitä aineita ovat PI3K-selektiivisiä, AKT-inhibiittorit, mTOR-katalyyttinen sivusto estäjiä, ja dual PI3K /mTOR-inhibiittorit. PF-04691502, 2-amino-8-[trans-4-(2-hydroxyethoxy)cyclohexyl]-6-(6-methoxypyridin-3-yl)-4-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one, on voimakas dual estäjä kaikki PI3K isoformeja ja mTOR (TORC1 ja TORC2). Farmakologiset ominaisuudet tämän suullisesti tehokas agentti äskettäin raportoitu [11]. PF-04691502 esti voimakkaasti yhdistelmä-luokan I PI3K ja mTOR biokemiallisten määrityksissä ja tukahdutti muutosta linnun fibroblastien välittämien villityypin PI3Ky, δ tai mutantti PI3Kα. PF-04691502 esti myös mTORC1 aktiivisuutta soluissa. In

PIK3CA

-mutant syöpäsolulinjoissa, PF-04691502 tukahdutti fosforylaatiota AKT (S473), ja se esti solujen proliferaatiota [11]. PF-04691502 osoitti kasvainten vastainen toiminta munasarjojen ja glioblastooma -tuumoriksenografti malleja peräisin syöpäsolulinjasta kuljettavat joko

PTEN

poisto tai

PIK3CA

mutaatio [11] ja geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa munasarjojen syöpä ohjaa

Kras

mutaatio ja

PTEN

poisto [12]. Antitumoorinen toiminta PI3K /mTOR-estäjät, kuten PF-04691502, peräsuolen syöpä on vielä tutkittava.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että hierarkkisesti järjestäytynyt Kolorektaalituumorien säveltää pieni joukko CD133 + /EpCAM + ilmentävien CSCS [13 ], [14]. CSCS ovat välttämättömiä kasvaimen kehittymisen ja etenemisen, sekä lääkeresistenssi ja tuumorietäpesäkkeet [15], [16]. Karkaamisen CSCS nykyisestä kemo- ja sädehoidot selittäisi kestävyys ja kasvaimen uusiutumisen [15], [16]. Tärkeys PI3K /mTOR signalointiverkolla CSC biologian on todettu äskettäin [17]. Korrelaatio AKT aktivointi ja lisääntynyt tuumorigeenisyyteen, stemness, ja invasiivisuus tunnistettiin glioblastoma malli [18]. PI3K signalointi havaittiin olevan ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä eturauhasen pohjapinta /kantasoluja [19], [20]. Yhdessä muiden aineiden, tukos PI3K /mTOR väylän haimasyövän pystyi poistamaan haiman CSCS ja leukemia kantasoluja, jotka osoittavat anti-CSC tehoa estämällä PI3K /mTOR-reitin [21], [22]. Kun otetaan huomioon tärkeitä toimintoja CSCS, on mielenkiintoista tutkia, onko terapeuttiset aineet kohdistuvat PI3K /mTOR signalointireitille ovat tehokkaita peräsuolen syövän ajaa CSCS kätkeminen somaattinen

PIK3CA

mutaatio.

Raportoimme tässä suullinen tehoa dual PI3K /mTOR-estäjä, PF-04691502, ihmisen paksusuolen syövän ksenograftimalli ohjaavat erittäin tuumorigeenisia CD133 + /EpCAM + CSCS. Potilaan kasvain, CD133 + /EpCAM + solujen edusti kasvaimeen aloittamista solujen upon ksenotransplantaatio. CD133 + /EpCAM + solut kasvatettiin ja rikastettu kasvainten sferoidiviljelmiä soluja kantasolujen olosuhteissa. Kasvain sferoidi solut hallussaan ylimääräisiä ominaisuuksia CSCS, kuten itseuudistumisen, kemoterapia-vastus, korkeampi Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

, ja kyky kerrata histopatologisen ominaisuudet alkuperäisen potilaan kasvain

in vivo

. Geneettinen analyysi 19 yhteisiä onkogeenien paljasti, että CSC väestöstä testattavan kanna

PIK3CA (H1047R)

mutaatio. Lisäksi kaksi PI3K /mTOR-estäjä, PF-04691502, merkittävästi inhiboivat CSCS

in vitro,

sekä kasvua ksenograftikasvaimissa johdettu CSC väestön hiirillä. Western blot-analyysi osoitti, että Pakt (S473) säädeltiin vähentävästi ksenograftikasvaimissa, joita oli käsitelty PF-04691502. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että PI3K /mTOR estäjää PF-04691502 on voimakas anti-proliferatiivista aktiivisuutta

PIK3CA

mutantti CSCS, jotka oikeuttavat edelleen arviointi estäjien peräsuolen syöpäpotilailla kuljettavat PIK3CA mutaatioita.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet, Patient näyte, ja perustaminen Potilaan johdettujen Vieraslajisiirteen (PDX) Kasvainmalli

Kirjallinen suostumus saatiin tutkimuksesta osallistuja, 39-vuotiaiden vanha mies peräsuolen syöpä, ennen leikkausta ja keräämiseen kudosnäytteen. Menettelyt hyväksyi University of California at San Diego Human Research Suojaukset Program Institutional Review Board (IRB). Kaikki koe-eläin menettelyjä noudatettiin Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) ja hyväksyi ne Pfizer globaalin tutkimus- ja tuotekehityksen Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Lyhyesti, resektio paljasti vaiheessa T3N2 huonosti eriytetty peräsuolen mucinous karsinooma kanssa sinettisormus-rengas solu ominaisuuksia. Kirurgisesti resektoitiin kasvain kudos leikattiin 2- 4 mm

3 fragmentteja ja ihon alle istutetaan kylkeen NOD /SCID-hiirten (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Kouraantuntuva P

0 ksenograftikasvaimissa (ensimmäisen sukupolven hiirillä) muodostettu hiirillä kuuden viikon kuluttua implantaatiosta. Kun kasvaimien koko oli noin 500 mm,

3, P

0 kasvaimia levitettiin sitten kymmenen NOD /SCID-hiirissä ihon alle uudelleen implantaatiota kasvaimen fragmenttien tuottamiseksi P

1 ksenograftikasvaimissa. Histopatologisen on ksenograftikasvaimissa tarkasteli verrattuna potilaan kasvain hallituksen sertifioitu patologi (PBL).

Kudoskäsittely ja kasvaimen Sferoidiviljelmiä of CSCS

poistaa kirurgisesti ksenografti tuumorikudoksia hiiristä oli entsymaattisesti hajotettiin käyttämällä Accumax liuosta (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) yksittäisiksi soluiksi ja viljeltiin seerumivapaassa kantasolujen väliaineessa 37 ° C: ssa, 5% CO

2, kosteutetussa ilmakehässä. Kantasolujen väliaine muodostettiin ilmastointi seerumittomalla viljelyalusta, jota käytetään rutiininomaisesti ihmisalkion kantasoluja (hESC), hiiren alkion fibroblastiviljelmät 24 tuntia ja sitten sekoittamalla kunnostettu alusta tuoreella hESC väliaineessa (klo 01:01 suhde), jota oli täydennetty 4 ng /ml bFGF, 10 ng /ml EGF: ää, 10 mg /ml naudan insuliinia (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 5,5 mg /ml ihmisen transferriiniä (Sigma-Aldrich), ja 5 ng /ml natriumseleniitillä (Sigma-Aldrich, 23). Ensisijainen kasvainsoluja viljeltiin Ultra-low kiinnityspinta pulloihin (Corning, Lowell, MA) ja 3 kk muodostaa tarttumaton kasvain pallosia. Jälkeen sferoidi soluviljelmät tuli vakaa, CSC viljelmiä siirrettiin Nunc ™ ei-käsiteltyjen polystyreeniä soluviljelmässä pulloihin (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY).

virtaussytometria ja Fluoresenssi solulajittelulla (FACS)

Standard solun pinta-antigeeni merkintöjä ja virtaussytometria arvioinnit tehtiin. Dissosioituneet kasvaimen solut analysoitiin käyttäen fykoerytriini-konjugoitua CD133 (Miltenyi Biotech), ja APC-konjugoidun epiteelin antigeenin EpCAM (CD326, epiteelisolujen pinta-antigeeni, BD Biosciences) vasta-aineita. Cell lajittelu suoritettiin FACSAria I solulajittelijaa (BD). Värjäytymättömät solut ja solut värjättiin isotyypin kontrolli vasta-aineita käytettiin negatiivisina kontrolleina. Vuonna ensisijainen eristetyt solut ksenograftikasvaimissa, kuolleita soluja ja hiiren solut jätettiin käyttäen propidiumjodidi (PI) ja anti-hiiren monoklonaalisia vasta-konjugoitu fluoreseiini (H-2k [d] -FITC, BD), tässä järjestyksessä.

solunelinkykyisyysmääritys hoidon jälkeen yhdisteen

Dissosioituneet elinkelpoinen, yhden pallojakaantuminen CSCS ja erilaistuneet solut maljattiin 10.000 ja 5.000 solua /kuoppa, vastaavasti, kirkas pohja 96-kuoppalevyille (Corning) ja käsiteltiin jossa on esitetty yhdisteitä 5 päivää. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä CellTiter Glo® luminescent solunelinkykyisyysmääritys Kit (Promega).

Solun lisääntymisen ja erilaistumisen induktio

Solulisääntyminen ja sytokeratiinia ilmentyminen mitattiin samanaikaisesti käyttäen fluoreseiini-isotiosyanaatti 5- bromideoksiuridiinia (BrdU) flow kit (BD Biosciences) ja anti-sytokeratiini vasta-aineita (fykoerytriinikonjugoitua sytokeratiini 7/8 CAM 5.2, BD Biosciences). CSC erilaistuminen indusoitiin viljelemällä sferoidi CSCS DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Invitrogen, Carlsbad, CA) säännöllisesti soluviljelmässä pulloihin.

mutaatioanalyysiin onkogeeninen mutaatioiden

Mutaatiotutkimukset sekvensointi annettiin by Sequenom (www.sequenom.com) käyttäen OncoCarta ™ paneeli v1.0, joka sisältää 238 hotspot mutaatioita 19 onkogeenien 24 kanavaa. Tulokset analysoitiin käyttämällä Oncomutations Report toiminto typer 4,0 (Sequenom Inc, San Diego, USA) käyttäen toiminto ”OncoMutation Reports”. Tämä algoritmi uudelleenkäsittelisi raaka spektritiedot ja korjaa automaattisesti piikkien pinta-alat perustuvat aiemmin vahvistettu suolaa ja matriisi addukti muodostelmia, jotka voivat peittää C A ja G: stä T mutaatioita. Tuloksena puhdistetut tiedot seulottiin sitten mutaatio huiput yli 7% verrattuna villityypin huippu, ja jokainen raportoitu määritys erikseen analysoidaan ja arvioidaan pätevyyden joko käyttämällä kriteerejä, kuten laajennus korko, muoto piikin pinta-ala ja sijainti piikin pinta odotetun huippukohdan.

In vivo

tumorigeneesin Pitoisuus

FACS-lajiteltu CD133 + /EpCAM + ja CD133- /EpCAM + soluja eristettyjen P

1 (eli 2

toisen sukupolven hiirillä) ksenograftikasvaimissa sekoitettiin matrigeelin (BD, 01:01 tilavuussuhde) ja ihonalaisesti NOD /SCID-hiiriin (The Jackson Laboratory) analysoimaan niiden kyky luoda kasvaimia. Kasvaintilavuudet, joka laskettiin pituus x leveys x korkeus x 0,5, mitattiin vuorokautena 84 implantaation jälkeen ja esitetään keskiarvona ± SEM (n = 5).

In vivo

rajoittavan laimennuksen Pitoisuus

ero tuumorigeenisia potentiaalit viljellyn CSCS ja niiden eriytetty jälkeläiset määritettiin SCID-bg hiiriä (The Jackson Laboratory) ruiskuttamalla titrattu määrä soluja sekoitettuna matrigeelin klo 01:01 suhteessa. Tuumoritilavuudet mitattiin säännöllisin väliajoin ajaksi 63 päivä ja piirretään keskiarvo ± SEM (n = 5).

In vivo

tuumorin vastaista tehokkuutta Arviointi

kasvaimen kasvun estäminen tutkimuksista tehtiin SCID-bg hiirillä. Lyhyesti, 2 x 10

6 elinkelpoisia erottaa CSCS inokuloitiin subkutaanisesti, ja hiiret, jotka kantavat noin 200 mm

3 kasvaimia jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään ja hoidettiin 10 mg /kg PF-04691502 (PO, QD x 14 ; n = 8) tai vehikkeliä (0,5% metyyliselluloosaa vedessä, PO, QD x 14; n = 8). Tuumoritilavuudet esitetään keskiarvona ± SEM. Suhteellinen muutos kehon paino (RCBW;%) laskettiin tuote (BWI-BW0) /BW0 × 100%. BWI oli kehon painoa päivänä annostelun, ja BW0 oli kehon painoa ensimmäisenä päivänä hoidon.

Western Blot analyysi

ajoneuvo- tai PF-04691502-käsitellyt tuumorit olivat flash jäädytetty nestemäisellä typellä. Jäädytetyt kasvaimet homogenoitiin ja lyysattiin 1 × soluhajotuspuskurin (Cell Signaling Technologies). Lysaatit kirkastettiin solun roskan sentrifugoimalla 14000 rpm: ssä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, supernatantit kerättiin, ja proteiini kvantitoitiin BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin polyakryyliamidigeeleillä. Siirtämisen jälkeen proteiinin nitroselluloosa, limakalvot blotattiin primaarisen vasta-aineen Pakt (Ser473, Cell Signaling Technologies) tai α-tubuliinin (Sigma). Toissijainen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Amersham Biosciences. Vyöhykkeet havaittiin kemiluminesenssin kanssa SuperSignal West Dura Substrate (Pierce), ja kuvia otettiin kiinni kanssa AlphaImager järjestelmään.

Tilastollinen analyysi

Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism (V.5.00 varten Windows). Arvot p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

perustaminen PDX Kasvain mallit ja vahvistaminen CD133 + /EpCAM + Kasvaimia synnyttävä CSC Väestö

Fragments tuoreeltaan resektoitiin kasvaimen näyte peräsuolen syöpä potilaan implantoitiin ihon alle kahdessa NOD /SCID-hiiriin perustaa peräsuolen syövän PDX mallia, jota sitten käytetään tuottamaan sferoidi CSCS viljelmässä (työnkulku sukupolven sferoidi CSCS esitetty kuviossa. 1A). Samalla vastaeroteltujen primaarisoluja potilaan näytteistä arvioitiin ilmentymisen paksusuolen CSC markers CD133 /EpCAM virtaussytometrialla (Fig. 1 B). Sen jälkeen, kun ilman ei-elinkelpoisten solujen värjäytymistä propidiumjodidilla (Fig. 1 B-a), noin 4-6%: CD133 + /EpCAM + soluja havaittiin kasvaimen kudoksessa (Fig. 1 B-c), mikä viittaa siihen, että läsnä on oletetun CSCS.

, Schema havainnollistaa työnkulku sferoidiviljelmiä CSC sukupolven ja eriytetty solupopulaatioiden kokeellisena, mukaan lukien transplantaation potilaan kasvain osaksi NOD /SCID-hiiriin, eteneminen CSCS P

1 ksenograftikasvaimissa (sferoidiviljelmiä; 10 × tavoite suurennus), ja erilaistuminen CSCS osaksi tarttuvien solujen kanssa epiteelin morfologia (eriytetty; 20 x).

B

. Virtaussytometrinen analyysi primäärisiä soluja eristettiin alkuperäisestä potilaan kasvaimeen. PI-värjäys sulkee pois kuolleita soluja (a). Apc- ja PE-konjugoidulla isotyyppikontrolleja esitetään (b). Populaatio CD133 + /EpCAM + soluja havaittiin (c).

C

. FACS of CD133 + /EpCAM + paksusuolen CSCS ensisijaiselta solupopulaatio on peräisin P

1 ksenograftikasvaimissa. Kuolleita soluja ja hiiren solut ensin suljettu pois PI värjäys ja käyttämällä anti-hiiren monoklonaalisia vasta-aineen H-2k [d], tässä järjestyksessä (a b). CD133 + /EpCAM + ja CD133- /EpCAM + populaatiot saatiin erotettua mukaan perusviivoista isotyyppikontrolleja ja lajitellaan (c). Lopuksi, rikastaminen molempien populaatioita lajiteltu näytteissä varmistettiin virtaussytometrillä (d e).

D

. Ilmentäminen CSC merkkiaineiden murto viljelty pallomainen CSCS (oikea paneeli). Vasen paneeli näyttää isotyyppikontrolleja.

Kun P

1 ksenograftikasvaimissa saavuttanut 500-700 mm

3, kasvaimen kudokset kerätään ja käsitellään virtaussytometrianalyysin ja solujen lajittelua. Virtaussytometrinen analyysi osoitti, että prosenttiosuus CD133 + /EpCAM + solujen P

1 ksenograftikasvaimissa pysyi samalla alueella kuin että primaarikasvaimen. Dissosioituneissa yksittäinen P

1 kasvainsoluja edelleen lajiteltu FACS. Jos mukaan ei lasketa elinkelvottomien solujen (Kuva. 1 C-a) ja hiiren soluja (Kuva. 1 C-b) kuvatulla Materiaalit ja menetelmät, CD133 + /EpCAM + ja CD133- /EpCAM + solupopulaatioiden eristettiin (Fig. 1 C-c ). Lajiteltu solupopulaatiot rikastettiin CD133 + /EpCAM + (~98%; Fig. 1 C-d) tai CD133- /EpCAM + (-96%, Fig. 1 C-e) soluissa. Molemmat solupopulaatiot sekoitetaan välittömästi Matrigelillä (klo 01:01 tilavuussuhde) ja ihonalaisesti NOD /SCID-hiirissä määrittää niiden tuumorigeeninen potentiaali. Joka perustuu toteutettavissa solujen määrä, CD133 + /EpCAM + ja CD133- /EpCAM + soluja istutettiin viisi NOD /SCID-hiiriä 2400 ja 25000 solua per eläin, vastaavasti. Kouraantuntuva kasvaimet ensin havaittu CD133 + /EpCAM + ryhmän 6 viikossa ja sen jälkeen havaitut CD133- /EpCAM + ryhmä 7 viikon kuluttua implantaatiosta. Kun eläimet tapettiin viikolla 12, tilavuus kasvainten peräisin CD133 + /EpCAM + soluja oli merkittävä suurempi kuin johdettu CD133- /EpCAM + -solujen (Fig. 2A; P 0,01). Nämä tulokset vahvistavat, että peräsuolen syöpä koostuu pienestä populaation kasvaimeen aloittamisen CSCS, jotka ovat positiivisia CD133 ja EpCAM ilme.

. Kasvainten keskitilavuutta NOD /SCID-hiiriin inokuloitiin CD133 + /EpCAM + (3400 solua /eläin; otaksuttu CSCS) tai CD133- /EpCAM + (25000 solua /eläin; otaksuttu eriytetty) soluja 12 viikon implantoinnin (keskiarvo ± SEM, n = 5 ).

B

. Prosenttiosuus CD133 + /EpCAM + ilmentävien solujen CSC ja eriytetty solupopulaatioiden (keskiarvo ± SEM, n = 3, parittomia, kaksisuuntainen opiskelija t-testi, P 0,05).

C

. Edustavia tulokset solujen lisääntymisen hinnat ja ekspressiotasot sytokeratiinin vuonna CSCS ja erilaistuneita soluja. Cell numerot Y-akselien säädetään prosentteina suurimmasta solujen määrä analysoitiin.

D

. Edustavat tiedot osoittavat

in vitro

huumeiden herkkyys CSCS ja niiden eriytetty jälkeläiset vastauksena oksaliplatiinia arvioimana CellTiter Glo® määrityksessä.

Generation Stabiilin Sferoidiviljelmiä of CSCS

Kun on viljelty primäärisiä soluja eristettiin P

1 ksenograftikasvaimissa seerumivapaassa kantasolujen väliaineessa, tarttumaton 3-ulotteinen sferoidit todettiin alueella 2-3 viikkoa (Fig. 1A), ja edelleen laajentamista kulttuuri syntyy suuri määrä pallosia kuluessa 2 kuukautta. Virtaussytometriset analyysit viljeltyjen pallomainen solujen osoittavat, että CD133 + /EpCAM + solujen koostuu 33,2% kaikista soluista (Fig. 1 D, oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että CD133 + /EpCAM + -soluissa runsaasti noin 5-kertaiseksi kasvaimen pallomainen kulttuurin verrattuna 4-6 % on CD133 + /EpCAM + solujen sekä alkuperäisessä potilaan näytteen ja ksenograftikasvaimissa (Fig. 1 B, ja tietoja ei ole esitetty, vastaavasti). Kasvaimen sferoidiviljelmiä soluja jatkuvasti viljeltiin

in vitro

viime 2,5 vuotta osoittamatta merkittävää muutosta CD133 /EpCAM ekspressiotasoja tai merkkejä vanhenemista. CSC: n ominaisuuksia kasvaimen sferoidiviljelmiä soluja osoitettu alla kuvatuissa kokeissa. Kasvain sferoidi soluja siten viitataan tekstissä CSCS.

suhteellisesti lepotilassa, Eriyttämätön State of CSCS

indusoida CSCS, kasvaimen pallojakaantuminen solut hajotetaan yksittäisiksi soluiksi ja viljeltiin seerumia sisältävällä elatusaineella, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kiinnittyneet solut epiteelin morfologia esiintyi 1-2 päivän kuluessa (Fig. 1A) ja edelleen lisääntyä nopeasti 2-3 kuukautta ennen leviämisen pysähtyi. Yhdenmukainen aikaisemmassa löydös CSC väestön suoraan johdettu potilaasta näytteen [23], vähentämisestä CD133 + /EpCAM + solufraktio havaittiin kiinnittyneet, erilaistuneita soluja (11,2%, Fig. 2B).

Siihen on viitattu että CSCS säilyttävät lepotilassa. Arvioimme soluproliferaatiota hinnat käyttämällä BrdU virtaussytometria kit. Tulokset osoittivat, että rikastettu CSC väestöstä sisälsi ~38.5% BrdU-positiivisia soluja verrattuna ~51.6% vuoden erilaistuneet solut. Alennettu BrdU CSC väestön osoittaa, että nämä solut olivat suhteellisesti lepotilassa verrattuna erilaistuneita soluja (Fig. 2C). Samoin osa sytokeratiini-ilmentävien solujen CSCS oli pienempi (~17.8%) verrattuna, että erilaistunut solu väestöstä (~44.7%, Fig. 2C). Koska sytokeratiinia on yleinen merkkiaine epiteelisolujen erilaistumisen, alhaisempi sytokeratiinia ilmentymisen CSCS ovat osoitus suhteellisen erilaistumattoman tilan.

Drug Resistance of CSCS

In vitro

solussa elinkelpoisuuden määritykset osoittivat, että verrattuna erilaistuneiden solujen, CSCS osoittivat merkittävää vastustuskykyä oksaliplatiinia (Fig. 2D; eron lineaarinen regressio kulmakerroin; P 0,01). Meidän havainto on yhtäpitävä aikaisempien raporttien osoittavat lääkeaineille luonne CSCS [24] – [26], mikä viittaa siihen, että nämä solut voivat olla vastuussa kliinisen uusiutumisen syöpäpotilailla kemoterapian jälkeen.

tuumorigeenisyyteen ja kasvain kehittäminen CSCS

in vivo

Vaihtelevia määriä (ts 10

3, 10

4, 10

5 ja 10

6 solua /eläin) dissosioituneista CSCS ja erilaistuneet solut istutettiin ihon alle viiden SCID-bg hiirillä. Kasvain ottaa hinnat kahden ryhmän välillä näytti olevan samanlainen (Fig. 3B); kuitenkin, kasvaimen keskimääräinen määrät olivat merkittävästi suurempia hiirissä, istutettiin 1 x 10

5 tai 1 x 10

6 CSCS kuin ryhmissä oli injektoitu sama määrä erilaistuneita soluja (Fig. 3A, ero lineaarinen regressio rinne, P 0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CSCS ovat tuumorigeenisemmiksi verrattuna niiden erilaistunut solu jälkeläisten.

. Kasvain volyymit

in vivo

rajoittavan laimennuksen määrityksen CSCS ja niiden eriytetty jälkeläiset SCID-bg hiiriin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (keskiarvo ± SEM, n = 5). Erot kasvu havaittiin välillä CSC ja erilaistunut solu ryhmien ympätty suurempi solujen määrä (1 x 10

6 ja 1 x 10

5; kaltevuus ero sukua regressiopolynomi P 0,01).

B

. Kasvain ottaa hinnat jälkeen 63 päivää implantaation jälkeen varten CSCS ja eriytetty jälkeläiset.

C

. H 0,05).

B

. Re-istuttaminen tuumorifragmentteja saatu CSCS tai eriytettyä soluperäisistä ksenograftikasvaimina toissijainen SCID-bg hiirillä. Tuumoritilavuudet esitetty keskiarvona ± SEM (n = 5). Ero kasvukäyrät näiden kahden ryhmän välillä on tilastollisesti merkitsevä (ero kulmakerroin lineaarisen regression avulla; P 0,05).

C

. Solujen lisääntyminen ensisijaisen eristetyt solut joko CSCS tai eriytettyä soluperäisistä ksenograftikasvaimina varsi-soluviljelmässä kunnossa. Elävät solut maljattiin 20000 solua per kuoppa ja viljeltiin 17 päivää. Solumäärät laskettiin manuaalisesti, ja yhteensä solumäärät on esitetty keskiarvona ± SEM (n = 6; pariton, kaksisuuntainen Studentin t-testi, P 0,01).

D

. Sferoidiviljelmiä CSC viljelmät uudelleen perustetun kantasolu olosuhteissa ksenograftikasvaimissa syntyy sarja- istuttaminen CSC johdettujen ksenograftikasvaimissa. P

2, CSCS viljeltiin ksenograftikasvaimissa johdettu alkuperäisestä CSCS. P

3, CSCS viljeltiin ksenograftikasvaimissa johdettu P

2 CSCS.

E

. Osittainen MALDI-TOF-massaspektri, joka esittää H1047R mutaatio

PIK3CA

. Punaiset pisteviivat osoittavat, vasemmalta oikealle, Ojentumattomassa pohjamaali huippu, 3 potentiaali piikit mutantti G tai T-alleelien ja villityypin alleelin. Korkea huippu keskellä luku on T alleelin

PDGFRA

samassa MALDI-TOF-massaspektri.

kyky uusiutua ja CSCS

kyky itse uudistaa, keskeinen ominaisuus CSCS, arvioitiin sarja- transplantaation ksenograftikasvaimissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Lyhyesti, ksenograftikasvaimissa peräisin CSCS tai erilaistuneita soluja poistettiin tuumoreita kantavaa hiirtä. Tuumorifragmentit (2-4 mm

3) istutettiin ihonalaisesti toissijainen SCID-bg hiirillä. Ksenograftikasvaimissa (nimetty P

2 ksenograftikasvaimissa) peräisin eriytettyä kasvain fragmentteja kasvoi hitaammin kasvaimia peräisin CSC tuumorifragmentteja (Fig. 4B). Tulokset edellä sarja- istutusta koe viittaa siihen, että CSC alkuperä kasvaimet kasvavat aggressiivisemmin yhdessä suuremman osuuden CSCS solussa /fragmentti implantti. Näin ollen

in vitro

viljely primaarikasvaimen solut, jotka ovat peräisin ksenografti kasvain on peräisin CSCS näytteillä on suurempi proliferatiivinen kyky mukaisesti kantasolujen olosuhteissa verrattuna eristetty kasvaimista peräisin erilaistuneita soluja (Fig. 4C). Nämä tulokset osoittavat, että ensisijainen soluja CSC johdettuja kasvaimet voivat olla kasvuetua

in vitro

johtuu todennäköisesti niiden korkeampia pitoisuuksia CSCS.

Sferoidiviljelmiä CSCS (nimetty S

2 ) peräkkäin perustetaan P

2 ksenograftikasvaimissa (Fig. 4D). Kun jotka on implantoitu hiiriin, S

2 CSCS muodosti jatkuvasti nopeasti kasvava P

3 ksenograftikasvaimissa (tuloksia ei ole esitetty). S

3 CSCS myös uudelleen käyttöön alkutuotannosta soluista tuotetaan P

3 kasvaimia (Fig. 4D). Sekä S

2 ja S

3 CSCS sisälsivät CD133 + /EpCAM + soluja vastaavia määriä kuin vanhempien CSCS (30-40%; tuloksia ei ole esitetty). Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että

in vitro

viljellyissä peräsuolen CSCS pystyvät itseuudistumisen.

Analyysi yhteisen onkogeeninen Mutaatiot CSCS ja biologisten merkkiaineiden

Tunnistaa ennustavan biomarkkerit että voi mahdollisesti ohjata kohdennettuja terapiassa, teimme geneettinen analyysi kanssa OncoCarta ™ paneeli käyttämällä DNA eristetään viljellyistä CSCS ja erilaistuneita soluja. Mutaatioanalyysiin 19 yhteisten onkogeenien, kuten

ABL1, AKT1, AKT2, BRAF, CDK, EGFR, erbB2, FGFR1, FGFR3, FLT3, JAK2, KIT, MET, HRAS, KRAS, sääntelyviranomaisten, PDGFRα, PIK3CA,

ja

RET

, tehtiin. Mielenkiintoista, vain

PIK3CA (H1047R) B mutaatio tunnistettiin molemmissa solutyypeissä (kuvio. 4E).

Syvällinen antiproliferatiivinen PF-04691502 in Mutant CSCS

sitten määritetään

in vitro

antiproliferatiivinen PF-04691502, voimakas dual estäjä kaikki PI3K isoformeja ja mTOR (TORC1 ja TORC2). Todellakin, PF-04691502 osoitti merkittävää estävää vaikutusta soluproliferaatioon CSCS (Fig. 5A). Mielenkiintoista on, että toisin kuin oksaliplatiinia (ks. 2D), PF-04691502 oli samanlainen inhiboiva vaikutus sekä mutantti CSCS ja eriytetyn jälkeläiset (IC

50 = 202 nM ja 195 nM, vastaavasti), mikä viittaa siihen, että antiproliferatiivinen PF

B

. Kuten on esitetty kuviossa.