Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA on hiljattain tunnustettu pelaa merkittävä rooli kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeitä. Täällä me raportoimme että miR-338-3p oli epigeneettiseltä vaiennettu mahasyövän, ja sen alassäätöä korreloi merkitsevästi mahasyövässä kliinis. Silmiinpistävän, palauttaminen miR-338-3p ilmentymisen SGC-7901 mahalaukun syöpäsolujen estivät proliferaatiota, migraatiota, invaasio ja tuumorigeenisyystesti

in vitro

ja

in vivo

, ainakin osittain aiheuttamaan apoptoosin. Lisäksi osoitamme onkogeeni SSX2IP on tavoite miR-338-3p. Ehdotamme, että miR-338-3p toimii tuumorisuppressori mahasyövän, ja metylaatiostatuksen sen CpG-saarekkeen voisi toimia mahdollisena diagnostinen markkeri mahasyövässä.

Citation: Li P, Chen X, su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) Epigeneettiset vaiennettu miR-338-3p Auttaa tuumorigeenisyystesti mahasyövän mukaan Targeting SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 17 tammikuu 2013; Hyväksytty: 10 toukokuu 2013; Julkaistu: 24 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (numerot 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 ja 81272749), Science and Technology komission Shanghai kunta (numerot 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 ja 101409042000), Shanghai Key Discipline ( S30204), ja Key hankkeet National Science Teknologia pilari ohjelma Kiinassa (numerot 2008BA152B03 ja 2011BA203191), Kiina Postdoctoral Science Foundation (numero 2011M500796). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on maligniteetti korkea esiintymistiheys ja toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti [1]. Varhainen diagnostinen määrä mahasyöpä on alhainen, ja potilaat ovat yleensä vaikea diagnosoida, kunnes syöpä on kehittynyt pitkälle tai etäpesäke. Näin ollen on suuri merkitys suorittamaan perusteellisen tutkimuksen synnyssä mahasyövän ja etsiä uusia molekyyli päättäjille ja terapeuttisina kohteina.

MikroRNA ovat pieniä RNA: ita, jotka säätelevät geeniekspressiota, ja ne ovat mukana erilaisia ​​biologisia signalointireittien [2]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet merkittävää eroa MikroRNA ilmentymisen profilointi välillä kasvainsolujen ja solujen, jotka ovat peräisin normaaleista kudoksista, mikä osoittaa, että MikroRNA on ollut tärkeä rooli tuumorigeneesissä [3], [4]. Siten MikroRNA on viime aikoina tullut hotspot geneettisen diagnoosin ja hoidon kohde uusina onkogeenien tai synnyssä [5], [6]. Epänormaali ilmentyminen MikroRNA kudoksissa tai seerumissa liittyy läheisesti useisiin ihmisen syöpäsairauksia kuten mahasyövän [7], [8], ja useat alassäädetty MikroRNA mahasyövän kudoksissa on kasvain tukahduttaa toimintoja. Esimerkiksi Anna-7 microRNA perhe löytyi ensimmäisen repressorina RAS, tukahduttaa RAS ja c-myc ilmentymisen translaation tasolla [9]. Ilmentymisen taso let-7a on merkittävästi vähentynyt mahalaukun kasvaimet, kun taas Ras-proteiini on huomattavasti korkeampi mahakasvaimen [10]. Lisäksi miR-15b, miR-16 ja miR-21 jne on yhdistetty kehittäminen ja kliininen diagnoosi mahasyöpä [11], [12]. Ryhmämme on myös raportoitu syöpää estävän roolia miR-126, miR-409-3p ja miR-155 mahasyövän [13] – [15].

MicroRNA microarray tehtiin havaitsemiseksi miRNA profiileja mahalaukun syöpä, ja huomasimme, että miR-338-3p oli merkitsevästi alassäädetty (julkaisematon data). miR-338-3p, joka sijaitsee kromosomissa 17q25.3, joiden pituus on 22 nt, raportoitiin ensimmäisen kerran prionin aiheuttama hermoston rappeutumiseen, sillä se osoittaa miR-338-3p pienenee hiirien aivoissa tartunnan hiiren mukautettu raaputtaa [ ,,,0],16]. miR-338-3p voisi säädellä mRNA-tasolla sen isännän geenistä Apoptosis liittyvä tyrosiinikinaasi (AATK) rotan neuronien [17]. Toisaalta, miR-338-3p oli säädelty potilailla, joilla on satunnaista amyotrofinen lateraaliskleroosi (Sals), muunlaista hermoston vaurioiden [18]. Tärkeää on, roolin miR-338-3p kasvainten synnyssä on aiemmin ehdottanut, kuten miR-338-3p on alaspäin säännellään peräsuolen syöpä [19], ja säätelee hepatiitti B -virus X-proteiini (HBx) estää proliferaatiota ja invaasio of hepatoomasolujen sitoutumalla kohdegeeneihin CyclinD1 ja tasaantunut maksasyövän [20] – [22]. Kuitenkin rooli miR-338-3p GC on vielä tuntematon.

Tässä tutkimuksessa olemme edelleen analysoineet alassäätöä ilmentymisen miR-338-3p GC kudoksissa verrattuna potilaan vastaaviin normaaleihin kudoksia, ja määritetään, että ilmentymistaso miR-338-3p läheisesti korreloi ennusteeseen viittaavia muuttujia GC. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-338-3p estää leviämisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden mahalaukun syövän solujen, vähentää kasvaimia kyky mahasyövän solujen nude-hiirissä, ja edistää apoptoosia. Samalla osoitetaan, että miR-338-3p voi toimia kuin tuumorisuppressoriproteiinia suoraan kohdistaminen SSX2IP. Siten tulokset viittaavat siihen, että miR-338-3p on mahdollinen diagnostinen markkeri ja terapeuttisena kohteena mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

1. Solulinjat ja kulttuurin

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa SGC-7901, NCI-N87, BGC-823 ja AGS ostettiin Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia [23] – [26]. KATO-III ja SNU-1 hankittiin ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 ja MKN45 saatiin Japani Cancer Research Resources Bank [28] mukaan kuolemattomaksi mahalaukun epiteelisolujen linja, GES -1, saatiin lahjoituksena Prof. Feng Bi (Huaxi sairaala, Sichuanin yliopiston Chengdu, Sichuan, PR China) [29], [30]. HEK293T-, ihmisalkion munuais- solulinja, oli säilynyt meidän instituutti. Mahasyövän solulinjoja viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää (naudan sikiön seerumia) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2: ta. HEK293T-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine), johon oli lisätty sama viljeltiin ehto edellä.

2. Etiikka lausunto

kirjallinen suostumus tutkimukseen saatiin kaikille osallistujille. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea on Ruijin sairaala, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston.

3. Tissue Näytteet

Ensisijainen mahasyövän kudoksiin ja vastaavan ei-kasvain kudokset kerättiin 66 potilaalla, joille radikaali gastrostomian laitoksella Kirurgian Ruijin sairaala, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Kukaan potilaista ei saanut ennen leikkausta hoitoa. Kaikki kudosnäytteet kerättiin potilaiden tietoisen suostumuksen ja vahvistanut patologinen tutkimus, ja histologinen kirjoittamalla perustui Lauren luokitukseen. TNM luokittelu määritelmiä mukaan International Union syöpää vastaan ​​(2002).

4. RNA: n eristäminen ja qPCR

Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista ja kudosten näytteiden

mir

Vana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Laatu ja määrä RNA-näytteet arvioitiin standardin elektroforeesilla ja spektrofotometrinen menetelmiä. Ilmaisu taso miR-338-3p solulinjoissa ja kudosnäytteiden mitattiin qPCR ja laskettiin edellä kuvatulla [13]. Ilmentymisen taso SSX2IP mRNA mitattiin qPCR mukaan TaqMan® Gene Expression Assays protokollan (Applied Biosystems). GAPDH mRNA taso käytettiin normalisointi.

5. DNA eristäminen ja Metylointi analyysi

Genominen DNA kudosnäytteistä puhdistettiin käyttäen DNAzol (Invitrogen). Natriumbisulfiitti konversio suoritettiin käyttäen Qiagen Epitect bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Metylointi patsaat suoritettiin metylaatiospesifisen PCR (MSP). Alukkeet metyloituja tai metyloitumattoman DNA suunnitellut ohjelmiston metyyli Primer Express v1.0 (ABI) kantavassa metylaatio eteenpäin primeri CpG Mir-338-3p: 5′-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 ’ja käänteinen aluke: 5’ -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ’, The unmethylation eteenpäin aluke CpG Mir-338-3p: 5′-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3′ ja käänteinen aluke: 5’-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 ’.

6. Ohimenevä transfektio miRNA Mimics

miRNA-338-3p matkii ja negatiivisen kontrollin jäljittelee ostettiin GenePharma (Shanghai, Kiina) .Cells ympättiin soluviljelmälevyihin 20 h ennen transfektiota varmistaa 70% cell yhtymäkohta on hetki transfektion. Transfektio miRNA jäljittelee soluihin suoritettiin käyttäen Iipofectamine2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan menettelyä. Mirna jäljittelee työskenteli lopullinen pitoisuus 100 nM. 48 h transfektion jälkeen, qPCR ja Western blot suoritettiin.

7. Cell Proliferation Assay

Solujen proliferaatio määritettiin WST (vesiliukoinen tetratsoliumsuola) määrityksessä, jossa käytettiin Cell Counting Kit-8 (Dojindo) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 24 h transfektion kanssa miRNA jäljittelee solut (2 x 10

3 solua /kuoppa) siemeniä 96-kuoppaisille levyille. Levyjä inkuboitiin 5 päivää. Lukumäärä eläviä soluja arvioitiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä.

8. Soft Agar Colony muodostumisen määritys

GC: llä transfektoitujen solujen miRNA jäljittelee suspendoitiin uudelleen 0,3% pehmeää agaria RPMI1640, joka sisälsi 10% FBS: ää ja kerrostettiin 0,6% kiinteytyi agaria RPMI1640, joka sisälsi 10% FBS: ää 6-kuoppalevyille (1 × 10

3 solua /kuoppa). Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Pesäkkeet, jotka sisältävät vähintään 50 solut laskettiin.

9. Cell Migration ja invaasiomääritys

Migration solujen tehtiin käyttämällä QCM

TM24-Well Kolorimetrinen Migration Assay Kit (Millipore) mukaan valmistajan ohjeiden. Sillä invaasiomääritys, Cell Invasion Assay Kit (Millipore) käytettiin noudattamalla valmistajan ohjeita. -Soluja (1 x 10

5) 300 ui: aan seerumia lisättiin yläkammioiden ja viljeltiin 48 tuntia. Non-muuttolintuja tai ei-tunkeutuvat solut poistettiin puuvilla vanupuikkoja, solut, jotka kulkeutuivat tai tunkeutuneet pohjaan kalvon värjättiin solun tahra puskurin annetaan iinianalyysikitissä ja laskettiin mikroskoopilla ja valokuvataan. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin samoissa olosuhteissa.

10. Apoptosis Analysis

Solun apoptoosin analyysi muotoon anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD) mukaan valmistajan ohjeiden. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa itsenäisesti. Piirre ydin- kutistuminen liittyy apoptoosin osoittivat Hoechst 33342 (Beyotime) mukaan protocol.The morfologia visualisoitiin fluoresenssimikroskooppia joka viritettiin aallonpituudella 350 nm ja mitattiin 460 nm: ssä.

11. Plasmidien ja Luciferase Activity Assay

fragmentti villityypin (wt) 3’UTR SSX2IP tai sivustoja mutantti (mut) 3’UTR SSX2IP sisältävät otaksutun miR-338-3p sitoutumiskohtia syntetisoitiin . Fragmentit kloonattiin pMIR-Report sivektorissa (Ambion), joka sisälsi

Firefly

ja nimettiin pMIR /SSX2IP-3’UTR

paino ja pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut.Cells olivat siemenen 24-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen transfektiota. 500 ng pMIR /SSX2IP-3’UTR

paino- tai pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut transfektoitiin kuhunkin kuoppaan, jossa on 20 ng PRL-TK-vektoria (Promega), joka sisälsi

Renilla

lusiferaasi ja 60 pmol miR-338-3p tai ohjaus jäljittelee. Solut kerättiin 48 tunnin jälkeen transfektion.

Firefly

ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasireportteri määritys (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden.

12. Stabiili transfektio miR-338-3p Expression Vector

pSilencer-miR-338-3p vektori ja pSilencer-miR-ohjaus transfektoitiin SGC-7901-soluissa käyttäen Iipofectamine2000 (Invitrogen), ja valitaan 100 ug /ml hygromysiini B (Invitrogen) ja 4 viikkoa. Transfektoitu stabiilisti solun kloonia poimittiin ja ylläpidetään puolet valinnan keskittyminen.

13. Ksenograftimallissa

SGC-7901-soluja (2 x 10

6 solua /hiiri), jotka on transfektoitu stabiilisti pSilencer-miR-338-3p tai pSilencer-kontrollivektorin ihonalaisesti injektoitiin 4 viikon ikäisiä urospuolisia karvattomia hiiriä (Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia, Shanghai, Kiina) kantavassa hiiret tarkistaa viikoittain, kasvaimen kyhmyjä mitattiin paksuus. Hiiret lopetettiin 4 viikkoa injektion jälkeen, ja tuumorit poistettiin ja punnittiin. Kasvaimen tilavuus arvioitiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus = (leveys + pituus) /2 x leveys x pituus x 0.5236.Tumor kasvukäyriä laskettiin.

14. Immunohistokemia

havaitseminen SSX2IP suoritettiin parafiinileikkeillä anti-SSX2IP-vasta-aine (Abcam, laimennus 1:1000). Immunokompleksista visualisoitiin kanssa Dako REAL

TMEnVision ™ Detection System, Peroxidase /DAB, Kani /hiiri (Dako), mukaan valmistajan menettelyä. Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä.

15. Tilastollinen analyysi

Suhde miR-338-3p ekspressiotason ja ennusteeseen viittaavia parametreja analysoitiin Person

X

2 testiä. Erot ryhmien välillä analysoitiin käyttäen Studentin

t

testi. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), ja

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

1 . Expression of miR-338-3p on Down-säädellään GC Solulinjat ja kudokset

tutkia roolia miR-338-3p GC, ensin verrataan ilmentymistason miR-338-3p in kahdeksan mahasyövän solulinjoja kuolemattomaksi normaalin mahan limakalvon epiteelin solulinja (GES-1). Kuten on esitetty kuviossa. 1A, miR-338-3p merkittävästi säädellä vähentävästi GC solulinjoissa verrattuna GES-1. Vahvista tämä tulos, vertasimme myös ilmaisuja miR-338-3p GC kudoksissa ja viereisen ei-kasvainkudoksia. 66 GC pariksi näytteet mukana tässä tutkimuksessa. Tulokset osoittavat, että keskimääräinen ekspressiotaso miR-338-3p oli merkittävästi alassäädetty kasvainkudoksissa verrattuna viereiseen ei-tuumorikudoksissa (Fig. 1 B). Lisäksi olemme selvitetty korrelaatio miR-338-3p ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä. Kuten taulukosta 1 59,1% (39/66) GC näytteiden osoitti alas-säätely miR-338-3p alle kaksinkertaisesti cut-off (suhteellinen ilmaisu suhde 0,5), tämä tilanne katsottiin merkittävästi alas -regulated. Tämän perusteella cut-off, 66 kliinisiä tapauksia jaettiin kahteen ryhmään: miR-338-3p alempi ilmentymisen ryhmässä (n = 39) ja miR-338-3p korkeampi lauseke (n = 27). Alempi ilmaisu ryhmä osoitti taipumusta suurempi kasvaimen kokoa, lisää imusolmuke etäpesäke, syvempi paikallista invaasiota ja kehittyneempiä TNM, mutta mitään merkittävää korrelaatiota iän, sukupuolen tai histologinen tyyppi (taulukko 1).

(A) suhteellinen ilmentyminen miR-338-3p mahalaukun solulinjoissa ja kuolemattomaksi normaali mahan limakalvon epiteelisolujen linja (GES-1) (*

P

0,05, **

P

0,01) havaittiin qPCR. (B) qPCR ilmentämiseksi miR-338-3p suoritettiin käyttäen 66 tapauksissa mahasyövän kudosten ja sovitettu viereisiin kudoksiin. Keskiarvo ja keskihajonta näytettiin (**

P

0,01).

2. miR-338-3p on epigeneettiseltä Silenced mahasyövän

Kuten epigeneettisellä hiljentäminen on yleinen keino alas-säätely miRNA ilmaisun [31], [32], päätimme analysoida CpG-saarekkeen jakelun promoottori alue miR-338-3p by metyyli Primer Express v1.0 ohjelmisto. Tulokset osoittivat, että CpG saaret olemassa osassa (-690–241) ylävirtaan transkription aloituskohdasta (TSS). Olemme tutkineet metylaatiostatuksen CpG-saarekkeiden, että promoottorialueen metylaatiospesifinen PCR (MSP), joka kattaa alueen -366–576 (Fig. 2A). Käyttämällä MSP, huomasimme, että miR-338-3p CpG saari laajasti metyloitavaa GC solulinjoissa verrattuna mahalaukun limakalvon epiteelisolujen linja (GES-1). Kuten odotettua, hoito 5-AZA aiheuttama merkittävä demetylaation (Fig. 2B). Edustaja tulokset MSP analyysin miR-338-3p GC kasvain kudosten ja sovitettu viereisen ei-tuumorikudokset kuvassa. 2C. Metylointi hinnat miR-338-3p CpG saaria kasvain kudosten ja viereisen ei-tuumorikudoksista 66 GC potilaat olivat 78,79% ja 24,24%, tässä järjestyksessä (**

P

0,01, Fig. 2D) . Kun vastaanotin käyttöominaisuudet käyrä ja pinta-ala (AUC) metyloidulle tilan miR-338-3p GC laskettiin, AUC oli 0,773 ± 0,042, huomattavasti korkeampi kuin nollahypoteesin (

P

0,001), ja 95%: n luottamusväli oli +0,690-,856 (Fig. 2E). Siten metylaatiotilan miR-338-3p CpG saari voisi toimia mahdollisena molekyyli- merkkiaine GC.

(A) Kaavamainen sijainnit CpG sivustojen sisällä CpG-saarekkeiden, jotka ympäröivät miR-338-3p promoottori alue. (B) MSP-analyysin miR-338-3p metylaation GC solulinjoissa. M: MSP metylaation alukkeita; U: MSP ei-metylaation-spesifisiä alukkeita (C) edustaja tulokset MSP-analyysin miR-338-3p mahasyövän kudoksiin (T) ja viereisen normaaleissa kudoksissa (N). (D) metylointi tasot miR-338-3p CpG saari GC kasvain kudosten ja sovitettu viereisen ei-tuumorikudoksista 66 potilaalla (78,79% ja 24,24%, **

P

0,01). (E) Vastaanotin käyttöominaisuuksia käyrä metylaatiostatuksen miR-338-3p. AUC oli 0,773 ± 0,042 (

P

0,001), 95%: n luottamusväli oli (0,690, 0,856).

3. miR-338-3p Estää Mahalaukun Syöpäsolut leviämisen

Koska miR-338-3p on merkittävästi säädellä vähentävästi GC, kuten edellä on esitetty, se voi toimia tuumorisuppressorina. Siksi me seuraavaksi ratkaistava, onko yli-ilmentymisen miR-338-3p mahalaukun syöpäsoluissa voisi vaikuttaa solujen kasvuun. Synteettinen miR-338-3p jäljittelee tai negatiivinen kontrolli matkii transfektoitiin SGC-7901-solut, joissa ilmentymistason miR-338-3p on pienin, sen jälkeen WST-määritys seurata solujen kasvua.

ektooppinen ilmentyminen miR-338-3p in SGC-7901-soluissa varmistettiin qPCR ja SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-338-3p jäljittelee kasvoi merkittävästi hitaammin kuin kontrolliryhmä (Fig. 3A) (*

P

0,05, **

P

0,01). Edelleen karakterisoimiseksi vaikutus miR-338-3p solun kasvuun, pehmeä-ikäinen pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin. Olemme havainneet, että pesäkkeiden määrä välillä SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-338-3p jäljittelee oli huomattavasti vähemmän kuin kontrolliryhmän (Fig. 3B-C) (**

P

0,01) . Tasaisen, esto miR-338 aiheuttama leviämisen SGC-7901 (kuvio. S2 File S1, *

P

0,05). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin kontrolliryhmässä GES-1-soluissa (kuvio. S1 A-B File S1, *

P

0,05). Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-338-3p tukahduttaa kasvuvauhtia sekä GC-solujen ja mahalaukun epiteelisolujen

vitro.

(A) SGC- 7901-solut leviämisen suoritettiin WST-määritys. SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-338-3p jäljittelee tai ohjaus jäljittelee lopullisessa pitoisuudessa 100 nM.The WST-määritys suoritettiin 24 tunnin välein 4 päivän ajan. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen itsenäisen kokeen ± S.D. (*

P

0,05, **

P

0,01). (B-C) vaikutusta miR-338-3p on SGC-7901-solujen lisääntymistä arvioitiin pesäkemuodostusta. SGC-7901-soluja transfektoitiin 100 nM miR-338-3p jäljittelee tai ohjaus jäljittelee ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Pesäkkeiden lukumäärä laskettiin 14

päivänä sen jälkeen, kun kylvö. (B) edustaja valokuvia pesäkkeiden. (C) Pesäkkeet laskettiin. Tulokset olivat kolmen riippumattoman kokeissa ± S.D. (**

P

0,01).

4. miR-338-3p Estää Migration ja Invasion of GC Solut

in vitro

Perustuu ajatukseen, että miR-338-3p toimii tuumorisuppressorina GC, me tutkia tarkemmin sen vaikutuksista solujen migraation ja invaasion, kriittinen määrätty pahanlaatuisten etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kuten on esitetty kuviossa. 4, määrä vaeltavia SGC-7901 transfektoitujen solujen miR-338-3p matkii oli merkittävästi pienempi kuin kontrolliryhmässä (105,00 ± 11,16 vs. 145,00 ± 7,00, **

P

0,01. Fig. 4 A-B), ja useita invasiivisia SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-338-3p oli huomattavasti vähemmän verrattuna kontrolliryhmään (41,33 ± 4,04 vs. 76 ± 10,54, **

P

0,01. Fig. 4 C-D). Tasaisen, esto miR-338-3p aiheuttama muuttoliike ja hyökkäys SGC-7901-soluissa (kuvio. S3 File S1, *

P

0,05). Sen sijaan miR-338-3p ei ollut vaikutusta migraatio GES-1 (Fig. S1 E File S1), todennäköisesti koska GES-1 soluista puuttuu migraation ja invasiivisen luonteen syöpäsoluja. Nämä tulokset näkyvät roolin miR-338-3p estossa sekä muuttoliike ja invaasion GC soluja.

(A) edustaja valokuvia vaeltavien solujen kalvolle (suurennus 100 x). (B) Keskimääräinen vaeltavien solujen useita kolmen erillisen kokeen ± SD (**

P

0,01). (C) edustaja valokuvia invasiivisia solujen kalvolle (suurennus 100 x). (D) Keskimääräinen invasiivisia solujen lukumäärä kolmen erillisen kokeen ± S.D. (**

P

0,01).

5. miR-338-3p voi aiheuttaa mahalaukun Syöpäsolut Apoptosis

selvittämiseksi mekanismi miR-338-3p GC solun kasvua inhiboivia vaikutuksia, testasimme apoptoosin analyysi virtaussytometrialla. Tulokset osoittivat, että apoptoottinen nopeus lisääntyi merkitsevästi miR-338-3p matkii transfektoitujen ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään jäljittelee transfektoitu ryhmä (**

P

0,01) (Kuva. 5A-B). Olemme edelleen tutki morfologisia piirteitä apoptoosin kuten tiivistyneen chromatin ja ydinvoiman pirstoutumista Hoechst 33342 värjäys, ja vahvisti, että apoptoottinen nostettiin vuonna miR-338-3p matkii transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5C). Tasaisen, esto miR-338 inhiboi apoptoosia SGC-7901-soluissa (kuvio. S4 File S1, *

P

0,05). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin kontrolliryhmässä GES-1-soluissa (kuvio. S1 C-D File S1, **

P

0,01). Nämä tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-338-3p indusoi apoptoosia GC soluissa, jotka voivat edistää kasvua estäviä ominaisuuksia Mir-338-3p.

(A) edustaja histogrammit esittävät apoptoosin SGC-7901-soluissa transfektoitu tilapäisesti miR-338-3p jäljittelee tai valvontaa matkii. Solut värjättiin PI ja anneksiini V-FITC 48 h transfektion jälkeen. (B) prosenttiosuus apoptoottisten solujen kolmen riippumattoman kokeen ± S.D. näytetään (**

P

0,01). (C) edustaja histogrammit esittävät ydinvoiman morfologia SGC-7901-solujen transfektoitiin väliaikaisesti miR-338-3p jäljittelee tai ohjaus matkii soluja Hoechst33342 (suurennus 200 x).

6. miR-338-3p Estää tuumorigeenisyyteen ja Lisäykset apoptoosi

in vivo

Seuraavaksi testasimme ovatko ektooppinen ilmentyminen miR-338-3p voisi vaikuttaa kasvuun ja apoptoosin mahakasvaimen

in vivo .

SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-338-3p ekspressiovektoriin (p

Äänenvaimennin

-miR-338-3p) tai kontrollivektori (p

Äänenvaimennin

-miR -ohjaus). Vakaa kloonien joko p

Äänenvaimennin

-miR-338-3p tai p

Äänenvaimennin

-miR-ohjaus valittiin ja injektoidaan subkutaanisesti nude-hiiriin, ja kasvainten muodostumista seurattiin. SGC-7901 transfektoitujen solujen miR-ohjaus osoitti progressiivista kasvua, mutta oli estetty, kun ektooppinen ilmentyminen miR-338-3p. Jälkeen 28 päivää, nude-hiiret lopetettiin, ja tuumorin paino ja tilavuus mitattiin (Fig. 6-E). Keskipaino kasvainten johtuva pSil

encer

-miR-338-3p solujen ryhmässä oli merkittävästi vähemmän kuin kasvaimia p

Äänenvaimennin

-miR-ohjaus solujen ryhmä (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, **

P

0,01).

(A-C) Valokuvia kasvainten johdettu pSilencer-miR-338-3p tai pSilencer-kontrollivektorin stabiilisti transfektoitu SGC- 7901-soluja nude-hiirissä. (D) kasvukinetiikka kasvaimia paljaissa hiirissä. Kasvaimen halkaisijat mitattiin joka 7. päivä (**

P

0,01). (E) keskipaino kasvainten nude-hiirissä. Keinot ± S.D. näytettiin (**

P

0,01). (F) edustaja valokuvia TUNEL määrityksen kasvaimen yksilöitä nude-hiirissä (suurennos, 200 x). (G) prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin. Keinot ± SD (**

P

0,01).

tutkia apoptoosin edistää tätä havaittiin

in vivo

kasvaimen kasvun estäminen upon miR-338 -3p yli-ilmentyminen, TUNEL-määritys suoritettiin kasvainkudoksessa. Tulokset osoittivat, että kasvaimen kudokset p

Äänenvaimennin

-miR-338-3p sisälsi merkittävästi enemmän positiivista värjäytymistä soluissa verrattuna kontrolliryhmään (**

P

0,01, Fig. 6F-G ). Siten tuloksemme osoittivat, että miR-338-3p estää mahalaukun tumorigeneesin

in vivo

, ainakin osittain indusoimalla apoptoosin in situ.

7. miR-338-3p tavoitteet 3′-UTR Oncogene

SSX2IP

Koska miRNA usein säätelemään kohdegeenien etsittiin miR-338-3p n otaksuttu tavoitteet käyttäen verkossa hakuvälineillä (esim TargetScan, Microrna.org ja PicTar). Geenit ennustaa kaikkien käytettyjen ohjelmien katsottiin Ehdokaskohteiden Mir-338-3p. Kaikista osumia, SSX2IP aiheutti huomiomme, aiemmat tutkimukset osoittivat, että SSX2IP on akuutti myelooinen leukemia liittyvän antigeenin ja mahdollisen immunoterapia kohde leukemia [33] – [35] ja edellisessä työ osoitti, että SSX2IP edistää hyökkäyksen ja kulkeutumista maksasyövän solut ja edistää kemoterapian resistenssin [36].

Yksi mahdollinen miR-338-3p sitoutumiskohdan ennustettiin sisällä 3’UTR SSX2IP (Fig. 7A). Validoida tämä vuorovaikutus, laitamme villityypin tai mutantti 3’UTR fragmentti SSX2IP osaksi pMIR-REPORT sivektorissa. Tuloksena saatuja konstrukteja käytettiin kotransfektoitiin miR-338-3p jäljittelee tai ohjaus jäljittelee osaksi HEK293T-soluissa, sen jälkeen lusiferaasireportterigeenin määritys. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus pMIR /SSX2IP-3’UTR

paino, mutta ei pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut, merkittävästi tukahdutti miR-338-3p (**

P

0,01) verrattuna kontrolliryhmän jäljittelee (Fig. 7B), mikä osoittaa, että miR-338-3p sitoutuu suoraan 3’UTR SSX2IP toimimaan vaimennin.

(A) Kaavamainen diagrammi oletetun sitoutumiskohtien Mir-338-3p suunnattu 3’UTR SSX2IP. (B) miR-338-3p matkii vaimentua lusiferaasiaktiivisuudet ohjataan villityypin 3’UTR SSX2IP (**

P

0,01), mutta ei vaikuttanut lusiferaasiaktiivisuutta ohjataan mutantti 3’UTR SSX2IP. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. (C) SSX2IP, kaspaasi-3, ja Pro-casepase-3 havaittiin Western blot 48 h transfektion jälkeen, jossa miR-338-3p ja ohjaus jäljittelee. (D) SSX2IP mRNA SGC-7901-soluissa analysoitiin qPCR 48 h transfektion kanssa miR-338-3p ja ohjaus jäljittelee.

vieressä tutki vaikutusta miR-338-3p päälle ilmaus SSX2IP, mittaamalla mRNA: ta ja proteiinia tasot SSX2IP jälkeen transfektoidaan SGC-7901-solujen miR-338-3p tai ohjaus jäljittelee. Kuten on esitetty kuviossa. 7C-D, miR-338-3p ollut vaikutusta

SSX2IP

mRNA-tasolla mitattuna qPCR, mutta aiheutti merkittäviä vähentäminen SSX2IP proteiinin taso verrattuna kontrolli-transfektoitujen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-338-3p: n ekspressiota vähentävän SSX2IP post-transkriptionaalisella tasolla, todennäköisesti sitoutumisen kautta 3’UTR SSX2IP. Erityisesti olemme myös havainneet, että capase-3 ja procasepase-3, kaksi tärkeää apoptoosin geenejä, pieneni vastaavasti (Kuva. 7C).

8. Expression of miR-338-3p korreloi käänteisesti Expression taso SSX2IP Protein mahasyövän

miR-338-3p on säädeltiin mahasyövän ja SSX2IP on tuettu kohdegeenin Mir-338 -3p edisti voimme spekuloida, että SSX2IP saattaa olla yli-ilmentymisen mahasyövässä kudoksissa ja suhteessa sovitettu ei-tuumorikudoksissa.

immunohistokemiallinen analyysi SSX2IP antigeenin paljasti tilannetta värjäytymisen SSX2IP proteiinin kasvain kudosten ja Hyväksytty ei-kasvain kudosten 66 mahasyövässä samples.65% (43/66) mahasyövän kudosten oli kohonnut immuostaining varten SSX2IP proteiinia verrattuna sovitetun kuin tuumorikudoksia. Erityisesti 84% (31/37) mahasyövän kudosten oli kohonnut immunovärjääminen GC näytteitä miR-338-3p alhaisen ilmentymisen ryhmässä, kun data on 41% (12/29) on miR-338-3p korkean ilmentymisen ryhmässä. Siten analyysi ilmentymisen miR-338-3p ja SSX2IP mahasyövän kudoksissa varmistunut, että käänteinen korrelaatio ilmentymisen miR-338-3p ja sen kohdegeenin SSX2IP (Person Chi-square test:

P

0,001, Spearman korrelaatio: r = -0,442,

P

0,001, Fig. 8).

(A) immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että lisääntynyt ilmentyminen SSX2IP oli havaitaan usein mahasyövän kudoksissa miR-338-3p alhaisen ilmentymisen ryhmässä ja päinvastoin. Kasvaimen Non-kasvain (SSX2IP) tarkoittaa yliekspressio SSX2IP GC kasvainkudoksessa verrattuna täsmäsi ei-kasvainkudoksessa, ja päinvastoin. (B) edustaja valokuvia immunohistokemiallinen analyysi SSX2IP pariksi GC kasvain /ei-tuumorikudoksia (suurennos, 200 x).

9. Kohdunulkoinen ilmentäminen SSX2IP pelastaa Fenotyypit aiheuttaman Over tuottavat miR-338-3p GC Solut

Jos SSX2IP on tärkein tavoite tukahdutti miR-338-3p GC, ektooppinen ilmentyminen SSX2IP pitäisi pelastaa fenotyypit aiheuttama miR-338-3p yli tuotantoa GC soluissa. Voit testata tätä ajatusta, ja SSX2IP ekspressiovektori tai tyhjän vektorin erikseen transfektoitiin SGC-7901, jonka jälkeen Sytologisten määrityksiä solujen proliferaation mittaamiseen, muuttoliike, invaasio ja apoptoosin. Kuten odotettua, yliekspressio SSX2IP osittain tai kokonaan kääntää inhiboiva vaikutus miR-338-3p GC-soluissa kunkin näkökohdan tarkastelimme (Fig. 9 A-D). Toisaalta, SSX2IP ei vaikuta ilmaus miR-338-3p (Fig. S5 File S1). Niinpä pääteltiin, että syöpää estävien toiminta miR-338-3p in GC on ainakin osittain kautta tukahduttaa sen kohdegeenin SSX2IP.

(A) SGC-7901-solujen lisääntymistä suoritti WST määrityksessä. WST-määritys suoritettiin 24 tunnin välein 4 päivän ajan.

Tukevaa tietoa lukuja. Kuva S1. Kuva S2. Kuva S3. Kuva S4. Kuva S5.