Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kuihtuminen on heikentävä ehto ominaista yhdistelmä anoreksia, lihasten surkastuminen, laihtuminen, ja aliravitsemus. Tämä ehto vaikuttaa valtaosa potilaista haimasyöpä ja on ensisijainen syy syövän liittyvät kuolemat. Kuitenkin vähän, jos lainkaan, tehokkaita hoitoja ei ole olemassa sekä hoitoon ja ehkäisyyn tämän oireyhtymän. Jotta voitaisiin kehittää uusia terapeuttisia strategioita haimasyövän kakeksian, sopiva eläinmalleissa ovat tarpeen. Tässä tutkimuksessa kehitimme ja validoitu syngeenisellä, metastaattinen, hiirimallissa haimasyövän kuihtuminen. Käyttämällä mallia, tutkimme kyky transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β) saarto lieventää aineenvaihdunnan muutoksiin liittyy kakeksia. Huomasimme, että TGF-β esto käyttäen anti-TGF-β-vasta 1D11.16.8 merkittävästi parantunut yleistä kuolleisuutta, laihtuminen, rasvaa massa, kehon rasvattomaan massaan, luun mineraalitiheys, ja luustolihasten proteolyysin hiirillä kätkeminen kehittyneen haimasyövän. Muut immuuniterapeuttista strategiat käytimme olleet tehokkaita. Yhdessä me validoitu yksinkertaistettua mutta hyödyllinen malli haimasyövän kuihtuminen tutkimaan immunologisia hoitostrategioita. Lisäksi osoitimme, että TGF-β esto voi vähentää aineenvaihdunnan muutoksiin liittyy syövän kakeksia ja parantaa yleistä eloonjäämistä.

Citation: Greco SH, Tomkötter L, Vahle AK, Rokosh R, Avanzi A Mahmood SK, et ai. (2015) TGF-β Blockade Vähentää Kuolleisuus ja Metabolinen muutokset validoidun hiirimallissa Haimasyöpä Kuihtuminen. PLoS ONE 10 (7): e0132786. doi: 10,1371 /journal.pone.0132786

Editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 21 marraskuu 2014; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 14 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Greco et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat in-osassa avustuksilla America Maksa ja sappi haiman Association (SHG), Saksan tutkimussäätiö (LT), National Institute of Health palkinnot CA155649 (GM), ja CA168611 (GM) ja Saksan Cancer Aid (AKV).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDA) on aggressiivinen ruoansulatuskanavan syöpään, on viiden vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Suurin osa potilaista PDA läsnä kehittyneitä etäpesäkkeitä ja on eloonjäämismediaani oli ainoastaan ​​3-6 kuukautta [2, 3]. Kuolleisuus ja huono elämänlaatu näillä potilailla liittyy merkittävä metabolisen ja ravitsemukselliset derangements liittyvät syöpäkakeksialle oireyhtymä. Tämä oireyhtymä esiintyy jopa 80% PDA potilaista ja osuus jopa 22% kaikista syöpään liittyvien kuolemien [4-6].

näkyvä piirre kakeksian on kehittää tahaton laihtuminen vähintään 5% painoindeksi [7]. Samanaikainen menetys molempien lihasmassan ja rasvan massan erottaa kuihtuminen nälkään, jossa lihasmassaa aluksi säilynyt. Syöpäkakeksiassa käsittää lukuisia metabolisen derangements lukien lisääntynyt energia-aineenvaihdunnan-lukien muutokset proteiinia, rasvaa, ja glukoosiaineenvaihduntaan-ja immunosuppressio lisääntynyt vapautuminen proinflammatoristen sytokiinien ja akuuttivaiheen proteiinien [6]. Lisäksi neurokognitiivisia vaikutuksiin kuihtuminen ovat väsymys, heikentynyt muisti ja kognition, ja laski liikuntaa toissijainen lisääntynyt lepää energian kulutusta [8, 9]. Yhdessä nämä derangements vähentää elämänlaatua kakektisia potilaita ja voi jopa edistää alentunut terapeuttinen vaste kemoterapiaan [10].

Valitettavasti, on olemassa muutamia näyttöön perustuvia tehokas hoito strategioita syöpäkakeksialle. Koska tämä tauti Prosessiin kuuluu erilaisia ​​isäntä epätasapainon, tehokkaita hoitoja olisi mieluiten kohdistaa useisiin metaboliareitteihin. Kuihtuminen on käsitelty käyttämällä progestiinien kuten megestroliasetaatti ja medroksiprogesteroniasetaattia lisätä ruokahalua ja painonnousua yhdessä kortikosteroidien parantaa mielialaa ja vähentää tulehdusta [11, 12]. Kuitenkin kliinistä hyötyä näistä hoidoista ovat olleet marginaalinen [11, 13]. Muita mahdollisia terapeuttisia aineita, joita on tutkittu muun muassa syklo-oksigenaasi (COX-2) estäjiä ja tutkittavia lääkkeitä, mukaan lukien greliinin ja greliini-jäljittelijät, yhdistetty tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) ja interleukiini 6 (IL-6) inhibiittorit, samoin kuin β- adrenoseptoriagonistien ja myostatiinin inhibiittorit [6]. Kuitenkin tehokas kliininen tuloksia syöpäkakeksialle potilaat ovat olleet vaikeasti.

Validoituja eläinmalleissa haimasyövän kuihtuminen ovat tarpeen kehittää tehokkaita immunoterapia-pohjainen hoitostrategioita. Kakeksia indusoivan solulinjat, kuten Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) ja peräsuolen kasvaimia on käytetty laajasti syövän eläinmalleissa kuihtuminen [4, 14]. Nämä tuumorilinjoja istutetaan ihonalaisesti koe-eläimissä, ja annetaan kasvaa kunnes oireet kuihtuminen saavutetaan. Tällaisia ​​heterotooppi- malleja on käytetty myös tutkittaessa kuihtuminen PDA [15, 16]. Kuitenkin ensisijainen rajoitus näistä malleista on niiden kyvyttömyys muodostaa etäpesäkkeitä [17]. Ksenograftimalleja ihmisen PDA jossa ihmisen PDA solulinjoja istutetaan kateenkorvattomiin tai immunosuppressoiduilla hiirillä on myös käytetty [17]. Vaikka ksenograftimalleja tehokkaasti matkivat kasvain /isäntä epigenetiikka ja voi etäispesäkkeitä, ne merkittävästi muuttavan immunologinen miljöö ja siksi estävät Opiskelukykyä immunologinen muutokset liittyvät kakeksia samoin ja kaikki immunotherapeutic strategioita [17, 18].

Mahdolliset immunologinen tavoitteet kakeksian hoitoa PDA, kuuluu Toll kaltaiset reseptorit (TLR) ja transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β). Toll-like reseptorit ovat perheen hahmontunnistuksen reseptoreiden synnynnäisen immuunijärjestelmän soluja, jotka suoraan viittaavat ympäristön ärsykkeisiin ja synnynnäinen tulehdusreaktioita [19]. TLR: t voidaan aktivoida ligoimalla ei-patogeeninen ”vaara molekyylien, tunnettu vaimentaa, mukaan lukien sivutuotteet tulehduksellisten vammojen ja solunekroosiin [20, 21]. TLR ovat sekaantuneet olevan merkittävä rooli PDA, kuten meidän lab on viime aikoina osoittanut, että TLR7 ligaatio kiihdyttää haiman syövän synnyn ja että TLR7 saarto suojattu taudin etenemiseen [22]. Lisäksi TLR9 stimulaatio on korreloivat invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin ihmisen PDA, jolloin syytetään tämän reseptorin potentiaalisia kohde on tämän sairauden hoidossa [23]. Kuitenkin, meidän tietääksemme ole TLR7 eikä TLR9 on tutkittu hoitoon haimasyövän kuihtuminen.

transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β) reitin tärkeä rooli solujen erilaistumiseen ja tulehdukseen [24]. TGF-β-reseptorin aktivointi johtaa fosforylaatioon Smad proteiinien, mukaan lukien Smad2, Smad3, ja Smad4, jotka puolestaan ​​säätelevät transkription solusyklin estäjät, mukaan lukien p21 [25]. PDA, TGF-β on paradoksaalisesti osoitettu toimia sekä tuumorisuppressorina ja kasvaimen promoottori [26]. TGF-β voi estää leviämisen, tukahduttaa muutosta, ja pienentää PDA eteneminen [27]. Kuitenkin samanaikaisesti TGF-β estäminen voi vähentää invasiivisuus PDA [28]. Kuitenkin, mutaatiot alavirran välittäjinä TGF-β signaloinnin, mukaan lukien Smad4 on osoitettu edistävän PDA etenemistä [29]. Lisäksi, vaikka TGF-β on liitetty edistää syöpäkakeksia [30, 31], meidän tietomme, TGF-β salpauksen ei ole tutkittu, koska terapeuttinen strategia hoidossa haimasyöpä kuihtuminen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää syngeeninen metastaattinen malli haimasyövän kuihtuminen ja tutkimaan immunoterapeuttiset hoitostrategioiden, kuten TLR 7/9 salpaus ja TGF-β saarto.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet, solulinjoja ja in vivo kokeissa

Male C57BL /6 (H-2k

b) ja Toll-like-reseptori 9 knockout (TLR9 ​​

– /-) hiiret hankittiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Pdx1

Cre; Kras

LSL-G12D; Tp53

R172H (KPC) hiiret olivat lahja Mark Philips (New York University) [32]. Eläimet kasvatettiin talossa ja ikä-haun 6-8 viikkoa vanhoja hiiriä käytettiin kaikissa kokeissa. Pan02 hiiren PDA-solulinja (lahja Daniel Meruelo, New York University), joka on syngeeninen C57BL /6, kasvatettiin täydellisessä RPMI elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. FC1242 PDA kasvainsoluja, jotka ovat peräisin KPC hiiret olivat lahja David Tuveson (Cold Spring Harbor Laboratory). -Hiiriin ruiskutettiin i.p. joko 10 miljoonaa Pan02 eli 5 miljoonaa FC1242 solujen aiheuttaa syöpää kuihtuminen oireyhtymä. Valitut kohortit lisäksi annettiin 2,6 mg /kg Toll-kaltainen reseptori 7 ja 9 (TLR7 /9) estäjä IRS 954 (Dynavax, Berkeley, CA), kolmesti viikossa tai 200 ug transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β) estäjä (klooni 1D11.16.8, estää TGF β

1, β

2, ja β

3) (Bioxcell, West Lebanon, NH) kahdesti viikossa, joka alkaa heti istuttamisen jälkeen Pan02 ja jatkuu kokeen kesto. Eläimiä seurattiin kahdesti päivässä. Hiiret tapettiin käyttämällä CO2 narkoosi seurasi niskanmurrolla lopussa 60 päivän tutkimusjakson aikana, tai aikaisemmin, jos ne näyttivät kuolemaisillaan tai näytteille yli 20% painon. Indusoimaan ihonalainen kasvaimen kasvua, hiiriin injektoitiin oikeaan kylkeen 10000000 Pan02 soluja. Kasvaimen kasvu mitattiin käyttäen paksuus kahdesti viikossa. Sytokiinitasot seerumissa määritettiin käyttäen sytometrinen helmi array (BD Biosciences). New York University School of Medicine IACUC hyväksyi kaikki menettelyt.

mittaus painon ja kehon koostumuksen

paino ja kehon koostumus kuten: rasva massa, vähärasvaisen massa% rasvaa, luun mineraalipitoisuus, ja luun mineraalitiheys mitattiin viikoittain käyttäen dual-energy x-ray (DEXA) kanssa Lunar PIXImus (PIXImus, Fitchburg, WI) laite pieniä eläimiä. Kaikki hiiret nukutettiin ennen DEXA tiedonkeruun käyttäen 0,1 mg /g ketamiinia ja 0,01 mg /g ksylatsiinia i.p. injektio. Aineisto analysoitiin Lunar PIXImus ohjelmistoversio 1.45. Arm ympärysmitta laskettiin 3,14 kertaa olkavarren halkaisija, mitattuna käyttämällä jarrusatula tarkkuudella ± 0,1 mm. Subscapular skinfold paksuus mitattiin myös käyttäen paksuus.

Western blotting ja immunohistokemia

Western blotting, kokonaisproteiinin eristettiin hiiren reisilihakseen tai rasvakudoksen homogenisoimalla RIPA-puskurissa täydellinen proteaasiestäjäseostabletit ja fosfataasinestäjällä cocktail (Roche, Pleasanton, CA) [33]. Proteiini kvantitointi määritettiin Bradfordin proteiinimäärityksellä, ja näytteet yhtä ladattiin 10% polyakryyliamidigeeleillä (NuPage, Grand Island, NY), elektroforeesi 200V, sähköllä PVDF-kalvoille ja tutkittiin vasta-aineiden kanssa Atrogin-1 (1: 500 ; ECM Biosciences, Versailles, KY), myostatiinin (1: 200; Abcam, Cambridge, MA), MuRF1, ZAG (1: 500; molemmat Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), p21 (1: 200; Santa Cruz), β-aktiini, Smad2, p-Smad2 /3 (1: 1000; kaikki Cell Signaling, Danvers, MA), TGF-β (1: 1000, Abcam), ja Erzin (1: 1000; BD Transduction Laboratories, San Jose, CA). Kvantifiointi suoritettiin mittaamalla integroitu tiheys ja normalisoida lastausta valvontaa. Immunohistokemiallista analyysia varten, parafiiniin upotettujen kudosleikkeiden värjättiin käyttäen polyklonaalista anti-TGF-β (1: 100; Abcam, Cambridge, MA), anti-p21 (1: 100, Santa Cruz), tai anti-p-Smad 2/3 (01:50, Santa Cruz), ja vastaava isotyyppikontrolleja [33].

qPCR ja soluproliferaatiota Pitoisuus

PCR-analyysi, kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD) ja cDNA valmistettiin käyttäen High Capacity Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Grand Island, NY). RT-PCR suoritettiin Stratagene Mx3005P QPCR System (Agilent Technologies) käyttäen ennalta suunniteltu alukkeita hiiren MuRF1 ja Atrogin-1 (molemmat Qiagen, Germantown, MD) [34]. In vitro kasvainsoluproliferaation arvioitiin käyttäen XTT II mukainen määritys valmistajan menetelmän (Cell Proliferation Kit II, Roche, Pleasanton, CA) ja ilmaistiin% leviämisen kontrolliin verrattuna (100%).

neurokognitiivisissa Analyysit

Rotarod koe, eläimet asetettiin päälle tangon (halkaisija 3,6 cm) laitteen arvioimaan eroja motoriikkaa ja tasapainoa mittaamalla etujalan ja takaraajan motoriikkaa ja tasapainoa (Rotarod 7650 kiihtyvä malli, Ugo Basile, Varese , Italia), kuten me olemme aiemmin kuvattu [35]. Kukin eläin testattiin kolme istuntoa, jossa kunkin istunnon erotetaan 15 minuuttia, ja toimenpiteet otettiin pyörätanko nopeutta kun eläimet putosi ylhäältä pyörivän tynnyrin.

Spontaani kohteentunnistus testi (ORT) oli suoritettiin neliön muotoinen avoin kenttä laatikko, nostetaan 50 cm lattiasta, kuten olemme aiemmin kuvattu [35]. Kaksi novel esineet asetettiin lävistäjä kulmiin avoimeen kenttään ja eläimen annettiin tutkia 15 minuuttia. Mille tahansa tutkimuksessa, esineitä pari oli 10 cm korkea ja koostuu samasta materiaalista niin, että niitä ei helposti erottaa hajutavaramerkistä vihjeitä. Vietetty aika tutkia jokainen esine tallennettiin seurantajärjestelmä (San Diego Instruments, San Diego, CA), ja lopussa koulutuksen vaihe hiiri poistettiin laatikosta ajaksi säilyttämistä viive (3 h). Aikana retentiotestit, eläimet laitettiin takaisin samaan laatikkoon, jossa yksi edellisen tuttuja esineitä käyttää harjoituksen aikana korvattiin uuden kohteen, ja annettiin tutkia vapaasti 6 min. Eri esine pari käytettiin kussakin kokeessa tietylle eläin, ja järjestystä altistumisen vastustaa paria sekä nimetyt näytteen ja uusia esineitä jokaisen parin olivat vastapainotrukki sisällä ja eri ryhmien. Aika vietettyyn uusia ja tuttuja esineitä kirjattiin 6 min. Esine tunnustamista Koeindeksi laskettiin suhteena käytetyn ajan tutkia uuden kohteen kuluneen ajan tutustuen sekä uutta ja tutun esineen.

Tilastot

Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe . Survival mitattiin Kaplan-Meier-menetelmällä. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin

t

testi ja log-rank-testiä käyttäen GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

kehittäminen syngeeninen malli kehittyneen haimasyövän

Hiiret annostella Pan02 PDA soluja ip injektiona kehitetty avoin vatsakalvon carcinomatosis (kuvio 1A) implantit peritoneaalidialyysia pintojen ohutsuolen suoliliepeen sekä mikroskooppisia maksametastaaseista (kuvio 1 B) kolmen viikon hoidon jälkeen. Nämä havainnot korreloivat kehittyneen PDA ihmisellä, joka on liitetty maksan ja /tai vatsakalvon etäpesäkkeitä lähes kaikissa tapauksissa [36]. Noin 75% Pan02 saaneista eläimet kuolivat 45 päivän kuluttua hoidon (kuvio 1 C). Edelleen, mikä on yhdenmukaista PDA kakeksian oireyhtymä, Pan02-käsitellyistä hiiristä osoittivat progressiivisen laihtuminen alkaa noin 2 viikkoa sen jälkeen, kun kasvaimen haaste (kuvio 1 D).

(A) Hiirille annetaan Pan02 näytteillä brutto ja (B) mikroskooppiset todisteita vatsakalvon carcinomatosis sekä mikroskooppisen maksan implantit. Kuvat ovat ja yhteenveto tiedot esitetään. (C) Kaplan-Meier-analyysi selviytymisen tehtiin PBS: ään ja Pan02 hoidetuista eläimistä (n = 20 /ryhmä, p 0,05). (D) keskimääräinen ruumiinpainon hiiren ikäluokat käsitelty PBS tai Pan02 laskettiin eri ajankohtina kuten oli kokonaispainon muutoksen aikana tutkimuksen (n = 20; * p 0,05, *** p 0,001) .

Todisteet muuttuneen kehon koostumuksen

Kliininen haimasyöpä kuihtuminen liittyy paitsi laihtuminen, mutta myös rasvakudoksen, lihaksen ja luun sisältö [6, 37] . Näin ollen olemme havainneet, että Pan02-käsiteltyjen hiirten menetti lähes 1 g rasvaa massan 24 päivää (kuvio 2A), ja se oli merkittävästi vähentää prosenttia rasvaa verrattuna kontrollihiiriin (kuvio 2B). Kasvainta kantavien hiirten myös näytteillä pienempi lihasmassaa (kuvio 2C), ja vähensi nousuja sekä luun mineraalisisältöä (kuvio 2D) ja luun mineraalitiheys verrattuna kontrollihiiriin (kuvio 2E). Edelleen määrällisesti kehon koostumuksen muutoksia, mittasimme olkavarsi ympärysmitta (kuvio 2F) ja subscapular skinfold paksuus (kuvio 2G), ja löysivät olevan merkittävästi pienentynyt Pan02 hoidetuissa hiirissä. Yhdessä nämä havainnot korreloivat aineenvaihdunnan muutoksiin liittynyt kliinisiä haimasyöpä kuihtuminen oireyhtymä.

(A) Keskimääräinen rasvamäärän B) ja keskimääräinen rasvaprosentista hiiren ikäluokat käsitelty PBS tai Pan02 laskettiin eri ajankohtina kohdat sekä kokonaismuutos aikana tutkimuksen. (C) Muutokset laihaa massan, (D) luun mineraalisisältöä, (E) luun mineraalitiheys, (F) olkavarren ympärysmitta, ja (G) skinfold paksuus laskettiin myös (n = 20; * p 0,05, ** p 0,001).

Näyttö lihasten surkastumista ja tulehduksellinen muutos

Koska proteolyysiä ja lihasten surkastumista ovat tunnusmerkkejä ihmisen haimasyövän kuihtuminen [38], me mitataan merkkiaineiden lihasten surkastumista sekä Pan02 hoidetuilla hiirillä ja ohjaus hiirillä. Sekä atrogin-1 ja Murf-1 ovat E3 ubikitiinipromoottori ligaasit ilmaistuna luurankolihaksessa, jotka kohdistuvat proteiinien proteolyysi [39, 40] Meillä löytyi lisääntynyt lihakseen tasot atrogin-1 (kuvio 3A) ja Murf-1 (kuvio 3B), että kasvain hiirten qPCR. Western blotting vahvistivat nämä tulokset ja lisäksi osoittivat kohonnut lihasten ilmentyminen myostatiinin hoidetuissa eläimissä (kuvio 3C), viittaavia lihakseen proteolyysin [41]. Samoin sinkki alfa glykoproteiini (ZAG), merkkiaine lipolyysiä, myös merkittävästi koholla rasvakudoksesta Pan02 käsiteltyjen hiirten (kuvio 3D). Sopusoinnussa proteolyyttisen tilaan, reisilihakseen paino oli pienempi kasvaimen kantavien hiirten (kuvio 3E). Potilailla, joilla on pitkälle edennyt haimasyöpä-kuihtuminen, esiintyy yleisesti kohonnut pro-inflammatoristen sytokiinien, jotka ovat yhteydessä huonoon säilymiseen [42, 43]. Näin ollen tasojen MCP-1 ja IL-6 kohosivat seerumissa kasvain isännät (kuvio 3F).

(A) mRNA: n tasot Atrogin-1 ja (B) MuRF1 in reisilihakseen lihakset hiiriä hoidettiin PBS tai Pan02 laskettiin qPCR. (C) Vastaavasti tasot Atrogin-1, myostatiinin, MuRF1, ja β-aktiini in nelipäiseen lihakseen laskettiin Western-blottauksella. (D) ZAG ilmentymistä testattiin sisäelinten rasvakudos päässä kohortin hiirten käsiteltiin joko PBS: ää tai Pan02. (E) paino nelipäinen lihasten hiiren ikäluokat käsitelty PBS tai Pan02 laskettiin. (F) Seerumin MCP-1 ja IL-6 verrattiin PBS: llä ja Pan02-käsiteltyihin hiiriin (n = 5, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Yhdistetty TLR7 /9 esto ei lieventää haimasyöpä kuihtuminen

aiemmin raportoitu, että Toll-kaltainen reseptori (TLR) ligaatiolla kiihdyttää haimasyöpä etenemisen taas saarto valitse TLR signalointipolkujen voi olla suojaava [ ,,,0],22, 44]. Siksi me olettaisi, että TLR esto voi olla suojaava vastaan ​​haimasyöpä kuihtuminen. Tämän testaamiseksi hiiriä hoidettiin IRS 954, yhdistelmä TLR7 /9 oligonucliotide estäjän [45]. Kuten odotettua, valitun seerumin sytokiinien olivat alhaisempia IRS 954 käsitellyissä hiirissä (kuvio 4A). Kuitenkin eläimillä, joita hoidettiin Pan02 + IRS 954 oli samanlainen eloonjäämiseen verrattuna hiirillä, joita hoidettiin Pan02 yksinään (kuvio 4B). Lisäksi ei ollut merkittäviä eroja kumulatiivinen laihtuminen (kuvio 4C), muutokset kehon rasvattomaan massaan (kuvio 4D), rasvan massa (kuvio 4E), arm ympärysmitta ja skinfold paksuus (kuvio 4F), tai luun mineraalitiheys (kuvio 4G ) välillä käsiteltyjen ja kontrolliryhmiin. Kuitenkin, IRS 954-kasvaimen kantavien hiirten ei ole suurempi luun mineraalisisältöä kuin käsittelemättömän kasvaimen kantavien hiirten (kuvio 4H). Geneettinen poisto TLR9 oli samalla tehoton lievitetään haimasyövän kakeksian Pan02-challanged eläimiä (S1 Kuva). Yhdessä kokeissa käytetään valikoivaa tai yhdistettynä TLR esto ei aineellisesti parantaa kokeellisen haimasyöpä kuihtuminen.

(A) Hiiriä käsiteltiin Pan02 tai Pan02 + IRS 954 ja testattiin seerumin sytokiinien (n = 20; * p 0,05) ja (B) selviytymisen käyttäen Kaplan-Meier-menetelmällä (n = 20; p = ns). (C) Vastaavasti hiiriä käsiteltiin PBS: lla, IRS 954, Pan02 tai Pan02 + IRS 954 ja testattiin kokonaispainoa muutos, ja muutokset (D) vähärasvaisen massa, (E) rasvan massa, (F) olkavarren ympärysmitta ja skinfold paksuus, (G) luun mineraalitiheys, (H) ja luun mineraalisisältöä (n = 20 /ryhmä; * p 0,05).

hoito TGF-β-estäjä suojaa haimasyöpä kuihtuminen

TGF-β-superperheen on tärkeä rooli tuumorin immuunivastetta [46]. TGF β on myös liitetty kakeksian stimuloimalla lihasten rappeutuminen ja proteolyysi [47]. Kuitenkin kohdistaminen TGF-β haimasyövän kuihtuminen ei ole testattu. Siksi ensimmäinen määritetty, jos TGF-β saarto oli merkitystä meidän haimasyövän kakeksiamalliin. TGF-β ja loppupään transcriptions tekijä p21 ja p-Smad 2/3 olivat erittäin ilmaistaan ​​Pan02 kasvaimet sekä endogeeninen malleja hiiren edenneisiin haimasyövän (S2 Kuva). Olemme vahvisti, että hiiret kätkeminen Pan02 käsitellyt kasvaimet neutraloivan TGF-β-mAb (1D11.16.8) oli pienempi seerumin TGF-β (kuvio 5A), sekä alhaisempi TGF-β ja alavirran signalointia merkki p-Smad2 /3 luustolihaksessa (kuvio 5B). Edelleen hoito Pan02 kasvainsolujen 1D11.16.8 ei muuttanut niiden solujen lisääntymistä in vitro (kuvio 5C) tai ihon alle kasvaimen kasvua in vivo (kuvio 5D). Lopuksi, huomasimme, että hiirten käsittely 1D11.16.8 yksin kuin kasvain isännät ei muuttanut painon muutos, kehon rasvattomaan massaan, rasvan massa, käsivarsi kehän tai luun mineraalitiheys (S3 kuvassa).

(A) Seerumin TGF-β mitattiin hiirillä, joille Pan02, Pan02 + 1D11.16.8, tai PBS: ää + ID11.16.8 (n = 10 /ryhmä; * p 0,05). (B) Lihakseen tasot Smad2, p-Smad2 /3, TGF-β, ja Erzin (latauskontrollina) laskettiin Western-blottauksella. Tiheys analyysi tehtiin perustuu kolmena rinnakkaisena (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). (C) Pan02 solujen lisääntyminen mitattiin hoidon jälkeen kasvavia annoksia 1D11.16.8. (D) 10

7 Pan02 soluja istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen käsiteltyjen hiirten joko PBS: ää tai 1D11.16.8. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa paksuus ja irrotetut kasvaimia verrattiin kasvaimen koko (n = 5 /ryhmä).

Seuraavaksi tutkimme, farmakologinen salpaus TGF-β voisi lieventää haimasyöpä kakeksia. Hiiret käsiteltiin Pan02 + 1D11.16.8 näytteillä parantunut eloonjääminen (kuvio 6A) ja huomattavasti vähemmän laihtuminen (kuvio 6B) verrattuna kontrollihiiriin. Kasvainta kantavien hiirten hoidettu 1D11.16.8 oli myös korkeampi rasvan massa (kuvio 6C), skinfold paksuus (kuvio 6D), ja luun mineraalitiheys (kuvio 6E) verrattuna kontrolleihin. Edelleen olemme huomanneet, merkittävästi vähentynyt todisteita proteolyysin käsiteltyjen hiirien 1D11.16.8, mikä näkyy huomattava ero kehon ääriviivat verrattuna kontrollihiiriin (kuvio 6F). Näin ollen oli selvästi heikennetyn väheneminen lihasmassan hoidetuilla hiirillä 1D11.16.8 (kuvio 6G). Lisäksi meillä on myös vahvistanut, että 1D11.16.8 tehokkaasti vaimentaa haimasyöpä kuihtuminen käyttäen KPC-johdettuja FC1242 soluissa. Tarkemmin, huomasimme, että FC1242 hiiriä hoidettiin 1D11.16.8 myös oli parantunut kokonaiselinaika, laski rasvan massa menetys, korkeampi luun mineraalitiheys, ja vähentynyt menetys kehon rasvaprosentti verrattuna kontrollihiiriin (S4 kuvio).

(A) Hiiriä käsiteltiin Pan02 tai Pan02 + 11D1.16.8 ja testattiin eloonjäämisen käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi. (B) Kohortit hiiriä testattiin myös painon muutos, ja muutokset (C) rasvan massa, (D) skinfold paksuus, tai (E) luun mineraalitiheys (n = 10 /ryhmä; * p 0,05, ** p * p 0,05).

Kuihtuminen voi liittyä moottori ja kognitiiviset häiriöt [48]. On motorista vajaatoiminta totesimme parannettu funktio kasvain kantavien hiirten käsitelty TGF-β estäjä mitattuna korkeampi pyörätanko ajonopeuden verrattuna hiiriin annettiin Pan02 yksin. Sitä vastoin lievä parantuminen esineen tunnustamista testin Pan02 kantavia hiiriä hoidettiin 1D11.16.8 ei ollut tilastollisesti merkitsevä (S5 kuvio). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että kohdistaminen TGF-β on houkutteleva strategia kohdistaminen haimasyövän kuihtuminen.

Keskustelu

validoitu syngeenisellä hiirimallissa metastaattisen PDA kuihtuminen kautta vatsakalvon injektion Pan02 solun linja. Hiirille kehittyi todisteita vatsakalvon etäpesäkkeiden ja maksan implantit, joka vastaa kliinisen PDA [1]. Lisäksi onnistumisprosentti tämän mallin on lähes 100% lähes kaikkien Pan02 käsiteltyjen hiirten kehittämisessä syöpäkakeksialle oireyhtymä on osoituksena huomattava laihtuminen, laski rasvaa ja kehon rasvattomaan massaan, proteolyysiä, ja lipolyysiä.

nykyisessä tutkimuksessa, osoitamme, että kumpikaan geneettinen deleetio TLR9 eikä saarto TLR7 /9 käyttäen IRS 954 muuttivat merkittävästi aineenvaihdunnan muutoksiin liittyy haimasyöpä kuihtuminen. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus erityisesti tehokkuuden tutkimiseksi TLR salpauksen kakeksian hoitoa PDA, vaikka me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että TLR: ien on tärkeä rooli patogeneesissä haimasyövän [49]. Esimerkiksi, Schwartz et ai. osoittivat, että TLR3 on konstitutiivisesti ihmisen haimasyövän solulinjoissa, ja TLR salpauksesta phenylmethimazole inhiboi haiman syövän kasvaimen kasvua in vivo [26]. Lisäksi LPS aktivointi TLR4 /MyD88 signalointi on osoitettu olevan tärkeä rooli haimasyövän kasvaimen kasvua ja muuttoliike, ja saarto tämän reitin vähentää kasvainsolujen invasiivisia kyky [29]. Edelleen, meidän lab on aiemmin osoittanut, että aktivointi TLR4 ja TLR7 kiihdyttää haiman syövän synnyn [22, 50]. Muut ovat osoittaneet, että TLR9 korreloi invasiivisen ja metastaattisen potentiaalin ihmisen haimasyövän solulinjoissa [23].

perusteella edellä mainitut tiedot sekä se, että TLR: ien ovat keskeisiä välittäjiä pro-inflammatoristen sytokiinien tuotantoa, mukaan lukien TNF -α ja IL-6, joka on tärkeä rooli patogeneesissä syöpäkakeksia [43, 51], me arveltu, että TLR estäminen voi olla terapeuttista haimasyövän kuihtuminen. Sytokiinit jälkeen julkaistut TLR aktivaatio voi teoriassa edistää syöpäkakeksialle oireyhtymään indusoimalla proteolyysin, lipolyysiä, ja muut aineenvaihdunnan muutoksia kautta NF-κβ transkriptio [52]. Pitkälle haimasyöpä, pro-inflammatoristen sytokiinien tuotetaan syöpäsoluja itseään, sekä maksan osana akuutin vaiheen vasteen. Mielenkiintoista, lisääntynyt sytokiinien tasot uskotaan olevan huono ennustettaessa kuihtuminen, kuten tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-6 polymorfismien ja kohonneet IL-6 liittyy lisääntynyt kakeksia ja laski eloonjääntiä haimasyövän potilaille [53]. Mallimme haimasyövän kuihtuminen liittyi merkittävää nousua seerumin IL-6. Kuitenkin IL-6 pysyi koholla jälkeen TLR7 /9 saarto. Vielä tärkeämpää on, ei TLR7 /9 saarto eikä geneettinen poisto TLR9 parantaa yleistä kuolleisuutta tai metabolisen muutoksia haiman kuihtuminen meidän validoitu hiirimallissa. Nämä negatiiviset löydökset voidaan ehdottaa, että myöhemmässä kohdentamista Toll-like-reseptori reittejä, kuten NF-κβ signalointi, vaaditaan muuttamaan vaikutuksia kuihtuminen.

Useimmat kriittisesti, huomasimme, että hiiret, joita käsiteltiin TGF-β estäjä oli parantunut eloonjäämiseen ja suojattu syöpäkakeksialle mitattuna laihtuminen, kehon rasvattomaan massaan, rasvan massa, skinfold paksuus, ja luun mineraalitiheys. Osoitimme myös, että hoito 1D11.16.8 vähentynyt proteolyysiä ja indusoi vähäistä paranemista kognitiivisiin heikentynyt meidän Pan02 hiirimallissa, mistä on osoituksena vähentynyt rasvattoman kudoksen ja parannettu arvosanat pyörätanko ajonopeuden. Itse kognitiivisiin arvonalentumiset on hyvin kuvattu kakektisia potilaita [48, 54, 55]. Lisäksi osoitimme, että vaikutuksia TGF-β-eston vaikutuksen kuihtuminen eivät liity erityisesti Pan02 kasvainisäntiin, koska me validoitu hakutuloksemme KPC johdettu PDA eläinmallissa.

TGF-β-superperheen, mukaan lukien TGF- -β

1, TGF-β

2, ja TGF-β

3, on mukana erilaisissa solun prosesseissa kuten solun kasvua ja erilaistumista, angiogeneesi, immunosuppressio, apoptoosin, ja solujen homeostaasin [25]. Lisäksi TGF-β on tärkeä rooli tuumorin suppression kautta solujen kasvun esto indusoimalla solusyklin estäjä, p21 [56]. Smad proteiinit, ovat tärkeimmät perheen transkriptiotekijöiden etenevien TGF-β signalointi. Smad perhe on t-Smad: ien, Smad 2 ja Smad 3 joka fosforylaation jälkeen, liittävät Co-Smad, Smad 4, ja menevän tuman transkription aktivoimiseksi [26]. Mielenkiintoista, osoitimme, että sekä p21 ja Smad 2/3 olivat erittäin yläreguloituja sekä meidän Pan02 ja KPC siirtogeenisen hiiren mallia haimasyövän. Olemme kuitenkin havainneet, että TGF-β-inhibition kakeksia ei liittynyt kasvaimen kasvun inhibition, mistä on osoituksena eroa in vitro Pan02 soluproliferaatioon tai ihon alle kasvaimen kasvua.

tutkimuksen lisää runsaasti tutkimuksen joka tutkii rooli TGF-β PDA. Koska sen vaikutus moniin solun prosesseja, muutokset TGF-β signalointi on osallisena on tärkeä rooli patogeneesissä, ja etenemisen moniin syöpiin [26, 57, 58]. On yleisesti hyväksytty, kuitenkin, että TGF-β on rooleja sekä tuumorisuppressorina ja kasvaimen promoottori PDA riippuen kasvaimen vaiheen ja solujen miljöö [24, 59]. Esimerkiksi lähes 100% haiman kasvaimista on mutaatio ainakin yhdessä TGF-β-reitin geenit, ja yli 50%: lla on geenin deleetio Smad4 (DPC4) [26]. Kuitenkin samaan aikaan, korkea seerumin TGF-β

1 on liitetty suurentunut riski PDA kehitystä, ja PDA potilaalla on matala tumavärjäystä TGF-βR2 ja korkean TGF-β

1 tasot voi olla pienempi kokonaiselinaika [58, 60]. Lisäksi Smad4 näyttää avainasemassa etenemisessä PDA tuumorigeneesissä kautta vaikutuksia kasvaimen microenvironment.