Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja Tavoitteet

GLI1 on keskeinen transkriptionaalinen tekijä Hedgehog signalointireitillä haimasyövän. RegIV liittyy uudistaminen, ja solujen kasvua, selviytymistä, tarttuvuus ja kestävyys apoptoosin. Tavoitteena oli tutkia RegIV ilmentymistä haimasyövän ja sen suhdetta GLI1.

Methods

GLI1 ja RegIV ilmentymistä arvioitiin kasvainkudoksessa ja viereisten normaaleissa kudoksissa haiman syöpäpotilaiden ja 5 haimasyöpä solu riviä qRT-PCR, Western blot, ja immunohistokemia (IHC), ja niiden välinen korrelaatio. GLI1-shRNA lentivirusvektori on rakennettu ja transfektoitiin PANC-1, ja lentiviraalinen vektori, joka sisältää GLI1 ekspressiosekvenssiä on rakennettu ja transfektoitiin BxPC-3. GLI1 ja RegIV ilmaisun arvioitiin qRT-PCR ja Western blot. Lopuksi osoitimme RegIV olla kohteena GLI1 mukaan kromatiinin immunosaostuksella (chip) ja elektroforeettinen liikkuvuus shift määritykset (EMSA).

Tulokset

tulokset IHC ja qRT-PCR osoitti, että RegIV ja GLI1 ilme oli korkeampi haimasyövän kudoksissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa (p 0,001). RegIV ilmentyminen korreloi GLI1 ilmentymistä näissä kudoksissa (R = 0,795, p 0,0001). Nämä tulokset vahvistettiin proteiinin (R = 0,939, p = 0,018) ja mRNA: n ilmentymisen (R = 0,959, p = 0,011) 5 haimasyövän solulinjoissa. RegIV mRNA ja proteiinin ilmentyminen väheni (94,7 ± 0,3%, 84,1 ± 0,5%; vastaavasti) kun GLI1 pudotettiin (82,1 ± 3,2%, 76,7 ± 2,2%, vastaavasti), jonka RNAi tekniikalla. GLI1 yliekspressio mRNA ja proteiini tasolla (924,5 ± 5,3%, 362,1 ± 3,5%; vastaavasti) aiheuttama RegIV yliekspressio (729,1 ± 4,3%, 339,0 ± 3,7%; vastaavasti). Lisäksi siru ja EMSA määritykset osoittivat GLI1 sitoutuneen proteiinin RegIV promoottorin alueet (GATCATCCA) haiman syöpäsoluissa.

Johtopäätös

GLI1 edistää RegIV transkription sitoutumalla RegIV geenin promoottorin haimasyöpä.

Citation: Wang F, Xu L, Guo C, Ke A, ​​Hu G, Xu X, et al. (2011) tunnistaminen RegIV uutena GLI1 Target Gene Human Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (4): e18434. doi: 10,1371 /journal.pone.0018434

Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 lokakuu 2010; Hyväksytty: 04 maaliskuu 2011; Julkaistu: 11 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Natural Science Foundation of China (nro 81072065), Foundation for Shanghai Science and Technology komitea (nro 09JC1412200, nro 09410705400), ja jatko-Fund opetusministeriön Kiinassa (nro 20090072110022). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on neljänneksi yleisin syöpään liittyvien kuolinsyy länsimaissa [1] – [3] ja on synkkä ennuste huolimatta merkittävää edistystä hallintaan. Mediaanielossaolosta PC on alle 6 kuukautta; 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1], [2]. Yli 80% läsnä leikkaushoitoon tauti; kolmasosa on paikallinen tauti loput on etäispesäkkeitä. Tutkimus kahden viime vuosikymmenen aikana on osoittanut, että PC on geneettinen sairaus pohjimmiltaan aiheuttama perinnöllinen ituradan ja hankittu somaattiset mutaatiot syöpään liittyvien geenien. Syövän etenemistä malli PC jossa haimatiehyen epiteelin etenee normaalista lisääntyneeseen laadut haiman intraepiteliaalisten neoplasia (PanINs) ja kohdunkaulan syöpä. Useita muutoksia geenejä, jotka ovat tärkeitä PC etenemistä on tunnistettu, esimerkiksi K-ras, INK4a, p53, ja Smad4 /DPC4 [4], [5]. PC on ominaista lähes universaali mutaatiot K-ras ja usein vapautuminen ratkaiseva alkion signalointireittien, kuten Hedgehog (HH) signalointireitin [6], [7]. Parempi ymmärrys mekanismeista kehitystä PC voisi parantaa varhaisen diagnoosin ja mahdollisesti tunnistaa molekyylien hoitotavoitteet.

siili (HH) signalointireitin ensin tunnistettu alkion kehityksen Drosophila [8] ja on osoitettu olevan ratkaisevia kasvun ja kuviointi haimassa alkionkehityksen aikana. HH signalointi säätelee solujen erilaistumista ja elinten muodostumiseen alkionkehityksen aikana, ja se ilmaistaan ​​haiman epiteelisolujen [9], [10]. Konstitutiivisen aktivaation HH signalointi on havaittu monissa eri ihmisen syövissä, mukaan lukien haimasyöpä [9] – [13]. Koska sen misexpression sekä metastaattisen haimasyövän solulinjoissa ja esiasteleesioita (Panin) [14], HH signaali aktivointi voi olla mukana sekä varhainen ja myöhäinen haiman kasvaimen kehittymisen.

Kolmesta nisäkkäiden ligandien HH perhe , Sonic (SHH), Desert (DHH), ja Intian (IHH) siili [15], entinen on liittynyt sekä haiman organogeneesin ja haimasyöpä. HH-signaalit lähetetään ja muutettu kahdella transmembraaniproteiineja, paikattu (PTCH) ja tasoitetaan (SMO), ja loppupään transkriptiotekijät, jotka ovat jäseniä gliooma liittyvän onkogeenin (GLI) perhe (GLI1, 2, ja 3). GLI2 ja Gli3 on transaktivaatiota ja tukahduttavaa verkkotunnuksia, kun taas GLI1 todennäköisesti toimii vain transaktivaattorina ja transkription kohde HH reitin itse [16] – [19]. Uudistuvan geeni (Reg) perhe, joukko pieniä erittyviä proteiineja, on osallisena solujen lisääntymisen tai erilaistumisen ruuansulatuselimille [20] määrä lisääntyy useissa ruoansulatuskanavan syöpien, ja toimii ravintoketjun tai antiapoptoottisten tekijät [21] – [23] . RegIV, jäsen uudistamiseksi geenin perhe, on mukana ruoansulatuskanavan maligniteettien, mukaan lukien vatsa [24], colorectum [25], [26], ja haiman [27], [28], sekä hyvänlaatuisia sairauksia kuten kuten haavainen paksusuolen tulehdus [29]. RegIV yli-ilmentyminen kasvainsoluissa on liittynyt solujen kasvua, selviytymistä, tarttuvuus, ja kestävyys apoptoosin. Äskettäin RegIV yliekspressio oli raportoitu liittyvän aloittamiseen ja etenemisessä haimasyövän, ja ehdotettiin lupaavana tuumorimarkkeri seuloa alkuvaiheen PC ja tavoitteeksi adjuvanttihoito PC [28], [30].

toiminnot GLI1 ja RegIV näytti olevan samanlainen meidän kirjallisuuskatsaus; Näin olemme tutkineet ilmaisun ja korrelaatio GLI1 ja RegIV PC kudoksissa ja solulinjoissa. Olemme myös tutkineet mahdollinen mekanismi välillä GLI1 ja RegIV, käyttämällä siru ja EMSA määrityksissä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kudosten

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa, PANC -1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-2 ja SW1990, ostettiin Kiinan tiedeakatemia komitean Type Culture Collection solu pankki. PANC-1 viljeltiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) (Gibco BRL, USA), muiden tyyppisiä Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco BRL, USA), ja kaikki väliaineet täydennettiin 10% FBS: ää (Gibco BRL, USA), penisilliini G (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2. Kaksitoista paria PC ja vastaavat ei-syöpä haima kudokset saatiin Shanghai Tenth Kansan sairaalassa täysin kirjoitettu eettisiä suostumusta. Kukaan näistä potilaista ei ollut saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen syövän resektio. Toinen 9 pariksi kudosten siivuja saatiin patologian osastolta Shanghai kymmenes Kansan sairaalassa. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Tongji yliopiston School of Medicine ja Life Sciences.

Short Hairpin RNA (shRNA) Suunnittelu ja Vector Production

häiritsevät sekvenssit vastaavat erillisiä alueita GLI1mRNA, kuten sekä negatiivinen kontrolli ilman homologiaa ihmisen tai hiiren geenit suunnitellut Shanghai GeneChem Biotech (taulukko 1). Kolme siRNA-dupleksit seulottiin GLI1 knock-down Western blot analyysissä kotransfektio kokeissa GLI1 ilmentämisplasmidin HEK 293T-soluissa. Menestyksekkäin sekvenssi ja yksi ei-hiljentäminen Luciferase sekvenssi suunniteltiin osaksi shRNA oligonukleotidin malli koostuu mielessä, hiusneulasilmukan, antisense, ja terminaattorisekvenssit, jotka kaikki reunustavat restriktioentsyymikohdat helpottamiseksi suuntaava osa-kloonaus. Saatu koodattujen vektorien GFP transkriptionaalisen säätelyn alaiseksi ja EF1-promoottorin ja H1 promoottorin kloonaus restriktiokohtien (

Mlu

I ja

Cla

I), jotta käyttöön oligonukleotidejä, jotka koodaavat shRNAs. Joko shRNA vastaan ​​GLI1 tai nonsilencing-Luciferase shRNA oli alla H1-promoottorin (kuvio 1). Oikea insertio tiettyyn shRNA vahvistettiin edelleen suoralla DNA-sekvensoinnilla.

GLI1-shRNA vektori, kaksi yksijuosteisen DNA: t, jotka koodaavat kahta linkkereitä, kohdesekvenssien ja silmukan elementin, syntetisoitiin. Nämä hybridisoitiin kaksijuosteiseen DNA, ja ligoitiin pLVTHM seuraavat

Mlu

I ja

Cal

I-digestiolla. Lyhyt hiusneula muoto shGLI1 ilmaistaan ​​valvonnassa ihmisen H1-promoottorin. Vektori sisältää myös ihmisen EF 1 a-α-promoottorin ohjaaman GFP-merkkiainegeenin seuranta transdusoidut solut. Vektorit muodostettiin lyhytaikaisella transfektiolla ja pRSV-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G, ja shRNA koodaava pLVTHM 293T-soluihin. Lyhenteet: RRE, Rev vaste-elementin; cPPT, keskeinen polypuriinialueen; EF1-α, ihmisen elongaatiotekijä 1-α promoottori; H1, ihmisen H1-promoottori; GFP vihreä fluoresoiva proteiini; PRE, ihmisen hepatiitti -viruksen posttranskriptionaalisella säätelyelementti.

tuotannon lentivirusvektorin, HEK 293T-soluja viljeltiin 30-40% konfluenssiin, jonka seuraavana päivänä. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin DMEM: llä /10% FBS: ää ilman antibiootteja. Tämän jälkeen 20 ug shRNA plasmidi-DNA (nonsense shRNA tai GLI1 kohdistaminen shRNA; GeneChem Biotech, Shanghai, Kiina), 7,5 ug pMD2G, 10 ug pRSV-Rev, ja 15 ug pMDLg-pRRE oli sekoitettu steriiliin DDH

2O ja lopulliseen tilavuuteen 1800 ui, sekoitettiin sitten 200 ul: aan 2,5 M CaCl

2. DNA-seos hapetettu ja 2000 ui 2 x PBS: ää (pH 7,05), lisättiin pisaroittain, ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Transfektioseos lisättiin sen vastaavien levyjen ja inkuboitiin yön yli. Väliaine korvattiin 12 tunnin kuluttua DMEM: llä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. 48 tunnin kuluttua esikäsitelty väliaine sisälsi shRNA lentivirus kerättiin ja suodatettiin 0,45 um: n huokoskoon selluloosa-asetaatti suodattimet, ja säilytettiin jäissä. Virus konsentroitiin pyörittämällä 70000 G: ssa 2 tuntia ja suspendoitiin uudelleen 500 ui PBS: ää. Transduktio yksikkö (TU) tiitteri arvioitiin HEK 293T-soluihin polybreenin 8 ug /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Titterit 2-5 x 10

8 TU /ml rutiininomaisesti saavutettiin.

Yliekspressio-GLI1 Lentivirusvektori Hakemisto Rakentaminen

Ihmisen GLI1 cDNA hankittiin Open-Biosystemin (USA). Täydellinen cDNA-sekvenssi GLI1 synnytettiin PCR: llä käyttäen eteenpäin-aluketta, 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTCAACTCGATGACCCCAC-3 ’; ja reverse-aluke, 5’-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGGCACTAGAGTTGAGGA-3 ’; Sitten työnnetään PGC-FU-EGFP-3FLAG Vector (GeneChem Company, Shanghai, Kiina). Transformantit analysoitiin sekvensoimalla. Saatu 3320 bp: n fragmentti varmistettiin sekvensoimalla (kuvio S1), ja verrattuna sekvenssi GLI1 geenin ilmentymisen alueella GenBank (NM_005269.2). Tuottaa lentiviruksen varastossa, 293FT soluja viljelty 70-85% konfluenssiin seuraavana päivänä. Täydellinen elatusaine poistettiin. Sitten solut altistettiin 5 ml elatusainetta (Opti-MEM; Invitrogen) kanssa komplekseja, jotka sisältävät pakkaukset auttaja-konstruktin (GeneChem Company, Shanghai, Kiina), 20 ug ekspressioplasmidin DNA: ta (PGC-FU-EGFP-3FLAG-GLI1) tai kontrolli-plasmidi DNA (PGC-FU-EGFP-3FLAG) 100 ui Lipofectamine 2000 -reagenssia (Invitrogen, USA) läsnä ollessa polybreeniä (8 ug /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kun oli inkuboitu 24 tuntia, infektion alusta korvattiin täydellisen elatusaineeseen. Lentivirus sisältävät supernatantit kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen. Supernatantit sentrifugoidaan pelletin roskat ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Titterit 2-5 x 10

7 TU /ml rutiininomaisesti saavutettiin.

Lentivirusvektorikonstruktit Transfektio

Solut (1 x 10

5) in kuuden kuoppalevyllä transfektoitiin jossa lentivirusvektori on infektiokertoimella (MOI) = 5 (PANC-1) tai 20 (BxPC-3), kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 72 tunnin jälkeen transfektion väliaine korvattiin 2 ml: lla täydellistä viljelyalustaa. 48 tuntia transfektion jälkeen, GLI1 ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella-PCR ja Western blot-analyysi.

virtaussytometria

Solut säädettiin 1 x 10

6 solua /100 ui ja käytetty varten virtaussytometria. Yhteensä 10000 tapahtumien analysoitiin sen määrittämiseksi, transfektion tehokkuus käyttämällä FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) Cell-Quest-ohjelmisto.

qRT-PCR

Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteisen transkription polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) analyysi suoritettiin ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA). GLI1 ja RegIV mRNA: n ilmentymisen analysoitiin qRT-PCR: llä käyttämällä SYBR Green Dye. β-aktiini käytettiin housekeeping-geeni. Kohdegeenin ilmentyminen normalisoida p-aktiini ja analysoitiin 2

-ΔΔCT

kaava. Alukesekvenssejä ovat seuraavat: GLI1, eteenpäin: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT, käänteinen: CCCTATGTGAAGCCCTATTT, RegIV, eteenpäin: CGCTGAGATGAACCCCAAG, käänteinen: TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG. β-aktiini, eteenpäin: AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA, käänteinen: CTGGAACGGTGAAGGTGACA. Kaikki reaktiot suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Western blot-analyysi

Solut huuhdottiin kahdesti PBS: ssä, sitten lyysattiin 2 tuntia RIPA-lyysipuskuria jäissä ja sentrifugoitiin 12000 rpm 10 minuuttia 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin standardin BCA-menetelmällä (BCA ™ Protein Assay Kit, Pierce, USA). 50 ug kokonais-proteiinia erotettiin SDS-PAGE käyttäen 6% tai 12% polyakryyliamidigeelillä Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, USA). GLI1 ja RegIV proteiini Geeli siirrettiin 0,45 um nitroselluloosamembraani Mini Transfer Cell ja Trans-blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad, USA) vastaavasti.

immunoreagensseja käytetään Western blot olivat kanin monoklonaalinen vasta-aine GLI1 (1:200, Santa Cruz, USA), ja vuohen polyklonaalista anti-RegIV-vasta-aine (1:100, Santa Cruz, USA). Hiiren polyklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine (1:5000, Santa Cruz, USA) käytettiin loading ohjaus. Blotit kehitettiin tavanomaisella tehostetun kemiluminesenssin (ECL) menetelmällä (Pierce, USA). Kaikki kokeet toistettiin useita kertoja, ja saatiin samanlaisia ​​tuloksia.

immunohistokemia

Kasvaimen osat poistettiin parafiini, vedettömät, ja käsiteltiin 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 95 ° C: ssa hakea antigeenejä. Sammutuksen jälkeen endogeeninen Peroksidaasiaktiivisuuden H

2O

2 ja estää 10% normaalia hevosen seerumia, leikkeitä inkuboitiin peräkkäin ensisijaisen vasta vuohen anti-RegIV (1:100, Santa Cruz, Kalifornia, USA), kanin anti-GLI1 (1:200, Santa Cruz, Kalifornia, USA), biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita ja ABC-reagenssia (Gene Tech, Shanghai, Kiina). Immunovärjäyksen visualisoitiin 3,3-diaminobentsidiinillä (Gene Tech, Shanghai, Kiina). Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiiviset kontrollit tehtiin kussakin tapauksessa korvaamalla ensisijaisen vasta-PBS: llä.

Kromatiini immunosaostuksella (CHIP) B

Muokkasimme aiemmin raportoitu protokollaa [31] varten kromatiinin immunosaostuksella (chip). Lyhyesti, PANC-1-soluja (3 x 10

7) olivat silloitettu 1% formaldehydiä. Tallennuksesta Reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 ml glysiini (0,125 M), sitten kromatiinin kerättiin 1 ml: lla IP-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoria cocktailit. Chromatin leikattiin käyttäen sonikaattorilla 4 mm kärki anturi 3 kertaa 10 sekunnin pulsseja (60 W, 80 W ja 100 W, vastaavasti, 90 s välein) jää- ruutuun. Silloitusta päinvastaiseksi lisäämällä 20 ui 5 M NaCl: a yli yön 65 ° C: ssa. DNA uutettiin käyttäen fenoli /kloroformilla määrityksessä. 20 ui DNA: ta ajettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelillä, ja loput säilytettiin -20 ° C: ssa INPUT DNA. Liukoinen kromatiinin immunosaostettiin 2 ug anti-GLI1 kanin monoklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz, California, USA). 2 ug hiiren IgG: tä (Santa Cruz, California, USA) lisättiin satunnainen ohjaus, RNA-polymeraasi II positiivisena kontrollina, ja β-aktiini-vasta-ainetta negatiivisena kontrollina. DNA-proteiini-immuunikompleksien eluoitiin ja kääntää silloitettu, ja DNA uutettiin fenoli /kloroformilla ja saostetaan. Läsnäolo RegIV promoottorin domeenin, joka sisältää GLI1 motiiveja Immunopresipitoidun-DNA tunnistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: RegIV-A päällä 1 (118 bp), eteenpäin: 5′-5-TGGTCCCTTCCAGACTTA-3-3 ’, käänteinen: 5 ”- TCCAGTATAGATGGCAAA -3 ’. RegIV-B sivuston 2 (131 emäsparia), eteenpäin: 5’-CTAACCCTTTGCCATCTA -3 ’, käänteinen: 5′-GACCTGGACACTGAACCTTG-3’. RegIV-C site 3 (70 emäsparia), eteenpäin: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ’, käänteinen: 5′-GTGTTACATAACGGGTTT-3’. RegIV-D site4 (70 emäsparia), eteenpäin: 5′-TGTAACACACTCTGTTGATGTAAGC-3 ’, käänteinen: 5’CTATTTGAGCTTCTCCCGCAG-3’. RegIV-E sivustojen 3 ja 4 (226 emäsparia), eteenpäin: 5′-CTCGGAAGGTTTCTAATC-3 ’, käänteinen: 5’TTCAACATGCGTGAGTTT-3’. RegIV-F sivustojen 3 ja 4 (481 emäsparia), eteenpäin: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ’, käänteinen: 5′-AGACGGCTTCAGAATGTA-3’. RegIV-G sivuston 5 (315 emäsparia), eteenpäin: 5′-TTCCTGAGGCAAGAAGAT-3 ’, käänteinen: 5′-CCAAGATTTAACCCAACA-3’. PCR-olosuhteet RegIV promoottorialueen olivat: denaturointi 30 sekuntia 94 ° C: ssa, alukkeiden 30 s, venymä 1 minuutti 72 ° C: ssa. Hehkutus lämpötilat RegIV-A-G olivat 55 ° C, 56 ° C, 56 ° C, 47 ° C, 56 ° C, 56 ° C: ssa, ja 52 ° C, vastaavasti. Monistamiseen RegIV promoottorialueen analysoitiin sen jälkeen, kun 35 sykliä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Analyysit (EMSA) B

Nuclear uutteet valmistettiin NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Pierce, Rockford, USA). EMSA ja supermuutoksena EMSA digoksiinin-leimatuilla koettimilla suoritettiin käyttämällä DIG-Gel shift kit mukaan valmistajan ohjeiden (Roche, Basel, Sveitsi). Sekvenssit käytettyjen oligonukleotidien olivat 5′-AGAACATGGATGATCATGTCA-3 ’(sitova motiivi on alleviivattu). Mutant käytetyt oligonukleotidit olivat 5’-AGAACAAAAAATTTTATGTCA-3 ’. Vuonna supermuutoksena tutkimuksessa, 5 ug kanin monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​GLI1 inkuboitiin 5 ug tumauutetta jäällä 30 minuuttia ennen kuin lisättiin leimatun koettimen, ja edelleen inkuboitiin jäissä 30 minuuttia. Koko 20 ui sitova reaktio erotettiin 7% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin positiivisesti varatulle nailonkalvolle (Bio-Rad, USA) 0,5 x Tris boraatti-EDTA-puskuriin.

Tilastollinen analyysi

määrälliset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Reaaliaikainen PCR analysoitiin mukaan erot kohdegeenin ilmentymisen pariksi t-testiä ja olivat 2

-ΔΔCT

muuttaneet ennen analyysiä. Suhde GLI1 ja RegIV ilmentyminen analysoitiin käyttämällä Spearman. IHC analysoitiin käyttämällä Chi-neliö testi. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GLI1 ja RegIV ilmentymisen haimasyövän kudoksissa

Opiskella GLI1 ja RegIV ilmaisun PC, qRT -PCR ja IHC käytettiin 12 pariksi koepala kudoksiin. GLI1 ilme oli korkeampi 9 tapauksessa (9/12) verrattuna viereiseen normaaliin haiman kudoksista (p = 0,011; kuva 2); RegIV ekspressio oli korkeampi 9 tapauksessa (9/12) (p = 0,011, kuvio 2). Oli positiivinen korrelaatio GLI1 ja RegIV PC kudoksissa (R = 0,795, p 0,0001; kuva 2). On IHC, löysimme RegIV voidaan ilmaista vain beetasolujen normaalin hormonitoimintaa haiman kudoksista, mikä vahvisti Oue raportissa [37]. On IHC, GLI1 ja RegIV ilmentyminen oli korkeampi useimmissa PC verrattuna normaaleissa kudoksissa (15/21 vs. 4/21, p = 0,001; 14/21 vs. 5/21, p = 0,005, vastaavasti, kuvio 3). 15 21 PC tapauksissa oli korkea ekspressio GLI1 proteiinia, joista 11 tapauksia ilmaistuna korkea RegIV proteiinia (p = 0,001, kuvio 3).

ilmentyminen GLI1 RegIV mRNA 12 paria PC kudosten ja viereiset normaalit kudokset (A-B). DNA kerättiin kirurgisen biopsiat, ja suhteellinen GLI1 ja RegIV mRNA: n ilmentymisen havaittiin qRT-PCR: llä. Tilastollinen korrelaatio ilmentymisen GLI1 ja RegIV mRNA 12 paria PC kudosten ja viereiset normaalit kudokset analysoitiin Spearmanin testi (C). Kaikki tulokset normalisoitiin p-aktiinin mRNA ilmaisun. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD ja se on laskettu parillista t-testiä. Merkitsevää eroa kahden ryhmän: * p 0,05. ** P 0,01. NS: ei ole merkittävä.

Kaikki näytteet kerättiin, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut, ja havaitaan IHC. Edustavia kuvia näytetään. Positiivinen värjäytyminen GLI1 ei havaittu PDAC solun tumassa (A); kuitenkin vierekkäiset normaaleissa kudoksissa ei esiintynyt tai heikko värjäytymistä GLI1 (B). Viereisissä normaalin haiman kudoksista, vain saarekesolujen osoittivat positiivista värjäytymistä of RegIV (D), kun taas positiivinen värjäys RegIV havaittiin sekä pikari kaltainen sytoplasmaan rakeet PC kudoksissa (C). Kaikki mikrovalokuvia hankittu × 200 suurennus. Mittaviivat 100 pm.

Korrelaatio GLI1 ja RegIV

Testasimme GLI1 ja RegIV ilmaisun 5 PC solulinjoissa qPCR ja Western blot. Oli positiivinen korrelaatio tason GLI1 ja RegIV mRNA ja proteiini (R = 0,958, p = 0,011 ja R = 0,939, p = 0,018, vastaavasti, kuvio 4). GLI1 ja RegIV oli yli-ilmentynyt PC ja normaalissa haiman soluja.

Expression of GLI1 ja RegIV proteiinien 5 haimasyövän solulinjoissa havaittiin Western blot-analyysi solu-uutteet, käyttäen anti-GLI1 ja anti-RegIV vasta-aineita ( A). β-aktiini käytettiin latauskontrollina kaikissa kokeissa. Tulokset kvantitoitiin määrittämällä intensiteetit nauhojen verrattiin β-aktiini (B). Tilastollinen korrelaatio ilmentymisen GLI1 ja RegIV proteiinin 5 PC solulinjoissa analysoitiin Pearson testillä (C). Suhteellinen GLI1 ja RegIV mRNA: n ilmentymisen tutkittiin qRT-PCR: llä (D). Ilmaus GLI1 ja RegIV mRNA normalisoitiin p-aktiinin mRNA: n ilmentymisen. Tilastollinen korrelaatio ilmentymisen GLI1 ja RegIV mRNA: n 5 PC solulinjoissa analysoitiin Pearson testillä (E). Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

RegIV ilmentyminen muuttunut GLI1 ekspression PANC-1 ja BxPC-3

varmistamiseksi edelleen suhdetta GLI1 ja RegIV PC-soluissa, olemme suunniteltu ja rakennettu shRNA-GLI1 lentivirusvektori, ja transfektoitiin se PANC-1, PC-solulinja, jolla on korkein ekspression GLI1 (kuvio 4). 48 tuntia transfektion jälkeen, transfektion tehokkuus osoitettiin virtaussytometrialla (FCM) on yli 95% (kuva S2); vakaa fluoresenssi voidaan vielä havaita, vaikka 20 kohdat (kuva S3).

Jälkeenpäin qRT-PCR ja Western blot käytettiin havaitsemaan RegIV ilmentymisen GLI1-shRNA-PANC-1-soluissa. Soluja ilman transfektiota käytettiin kontrolleina, kun taas solut, jotka on transfektoitu sekoituskoodin shRNA käytettiin negatiivisina kontrolleina. RegIV mRNA väheni 94,7 ± 0,3%, kun GLI1 mRNA laski 82,1 ± 3,2%. RegIV proteiinin väheni 84,1 ± 0,5%, kun GLI1 proteiinia laski 76,7 ± 2,2% (kuvio 5). Tämä viittasi siihen, että RegIV ilmentyminen vähenee, kun GLI1 oli vaiennetaan RNAi.

PANC-1-solut transfektoitiin GLI1-shRNA tai GFP-shRNA, BxPC-3-solut transfektoitiin LV-GLI1-eGFP tai LV-eGFP sitten ilmentyminen GLI1 mRNA suhteessa kuin β-aktiini-mRNA: n arvioitiin qRT-PCR: llä (A, D). Transfektion jälkeen, ilmentäminen GLI1 proteiinien analysoitiin Western blot (C, F). Insertti osoittaa huomattavaa laskua RegIV ilmentyminen reaaliaikaisella RT-PCT (B, E) ja Western blot-analyysi (C, F). Tulokset normalisoitiin että β-aktiinin ilmentymistä. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

edelleen suunniteltu ja rakennettu lentiviruksesta vektori, joka ilmaistaan ​​GLI1, ja transfektoitiin se BxPC-3, jolla on pienin GLI1 ilmentymistä 5 solulinjoja (kuva 4), onko RegIV ilme muuttunut matkan GLI1. 48 tuntia transfektion jälkeen, qRT-PCR ja Western blot käytettiin havaitsemaan RegIV LV-GLI1-BxPC-3-soluissa. Soluja ilman transfektiota käytettiin kontrolleina, kun taas solut, jotka oli transfektoitu tyhjä lentivirus vector käytettiin negatiivisina kontrolleina. RegIV mRNA lisääntyi 729,1 ± 4,3%, kun GLI1 mRNA lisääntyi 924,5 ± 5,3%. RegIV proteiinin kasvoi 339,0 ± 3,7%, kun GLI1 proteiinia kasvoi 362,1 ± 3,5% (kuvio 5). Tämä merkitsee sitä, että RegIV ilmentyminen lisääntyi, kun GLI1 oli yli-ilmentynyt. Näiden tulosten perusteella, olemme tulleet siihen tulokseen, että GLI1, transkriptiotekijä, saattaa säädellä RegIV geeniekspressiota.

tunnistaminen ehdokas Gli1 sitoutumiskohdat RegIV promoottori

positiivinen korrelaatio GLI1 ja RegIV vuonna sekä PC kudosten ja solulinjojen sai meidät etsimään RegIV promoottorin mahdollisten GLI1 sitoutumiskohtia DNA-konsensussekvenssi 5′-GACCACCCA-3 ’[42]. Tietokanta analyysi paljasti neljä mahdollista sivustoja sijaitsee ylävirtaan transkription aloituskohdasta (kuva 6). Homologiaa kunkin GLI1 sitoutumiskohdan ensisijaiseen konsensussekvenssi vaihteli 67% (auttaakseen 1, 2, 3, ja 5), ​​78% (site 4), joka ehdotti, että RegIV geenin promoottori voi sitoutua GLI1.

(A) Sijainti mahdollisten GLI1 sitoutumiskohtia (numerot 1-5), jotka liittyvät rakenteeseen geenin. P edustaa transkription aloituspaikan. Harmaa runko edustaa muuttuja liitoksen päällä. Kaarikorosteet edustaa eksonit. (B) kanta sitoutumiskohdat promoottorin suhteen P transkription aloituskohdan ja sekvenssihomologiaa GLI1 konsensus sitovan sekvenssin, GACCACCCA.

Vahvistus GLI1 sitoutuneen proteiinin promoottorialueen RegIV geenin Chip

sonikoitua chromatin liuosmäärityksen osoitti, että koko DNA-fragmentti ilmestyi sotkee ​​että 100 bp 1 kb vaihteluväli 80 W ryhmässä (kuva S4). Tuloksena DNA-elektroforeesilla osoitti, että ennustettu DNA bändi INPUT, GLI1-Ab ja postive kontrolliryhmiin käyttäen ihmisen RegIV aluketta-D-F, eikä IgG ja negatiivisen kontrollin ryhmät (kuvio 7). Vain INPUT ja positiivinen kontrolli osoitti ennustettu kaistalla käyttäen ihmisen RegIV aluketta-A-C, G, mutta ei GLI-Ab, IgG, ja negatiivinen ryhmät (tuloksia ei ole esitetty). Tulokset sekvenssin analyysi osoitti, että sekvenssit olivat samat kuin on RegIV-geenin promoottori-sivuston 4 (kuvio S5, S6, S7). Kaikki tiedot osoittivat, että GLI1 sitoutui RegIV geenin promoottori sivuston 4 (GATCATCCA), ja säännellään RegIV PC kautta HH signalointireitille.

sijainnit RegIV pohjamaali-AG promoottorialueen RegIV geenistä . Numerot kaavamaisen RegIV geenin (numerot 1-5) vastaavat mahdolliset GLI1 sitoutumiskohtia. P edustaa transkription aloituspaikan. Lysaatit PANC-1-solut altistettiin kromatiini immunosaostus anti-GLI1 vasta-aine. Ihmisen RegIV aluke-A-G käytettiin monistamaan RegIV promoottorialueen, joka sisältää otaksutun GLI1-sitoutumiskohdan. Sonikoitiin chromatin käytettiin hyväksi DNA-ohjaus. IgG, RNA-polymeraasi II, ja β-aktiini Ab käytettiin satunnaisvalvontaa, positiiviset kontrollit ja negatiiviset kontrollit. (B) vain INPUT, positiivinen kontrolli ja GLI1-Ab osoitti ennustettu nauhan etidiumbromidilla värjätty agaroosigeeleillä käyttäen Chip-PCR-tuotteet, jotka monistettiin RegIV aluke-D (i), RegIV aluke-E (ii), ja RegIV primer-F (iii). Ei havaittavaa transkripti havaittiin monistettiin mallin, IgG- tai negatiivinen kontrolli ja positiivinen kontrolli kaista vahvisti odotetun fragmentti. Molekyylipainostandardeja (Marker) käytettiin koon arvioimiseksi monistetun bändejä.

Vahvistus GLI1 sidottu RegIV promoottorin EMSA

Kuten edellä on kuvattu, GLI1 sitoutumiskohta että promoottorialueen RegIV geenin varmistettiin ChIP-PCR: llä. Sitten käytettiin EMSA määrityksissä mahdollisuus ratkaista, onko GLI1 sitoo RegIV

in vivo

. Me syntetisoitiin oligonukleotidit sisältävä GLI1 elementti läsnä RegIV promoottorin EMSA kokeissa ydin- otteita PANC-1 solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa 8, inkubointi PANC-1-solujen poimii kanssa biotiini-leimattu GLI1-RegIV, joka on tuotettu DNA-proteiini-band shift. Nämä DNA-proteiini-kompleksit olivat ominaisia ​​GLI1 sivuston onnistunut kompetitiomäärityksin eri taittuu ylimääräisen leimaamatonta GLI1-RegIV ja mutantti merkitty GLI1-RegIV oligonukleotidejä. Vahvistaa sitoutuminen GLI1 on GLI1-RegIV sekvenssin, näitä EMSA reaktioita inkuboitiin edelleen anti-GLI1 vasta-aine. Kuten kuviossa 8 on esitetty, lisäksi tämän vasta-aineen johti supershifted kompleksin lisäksi DNA-proteiini-band. Nämä tiedot osoittivat, että läsnä on GLI1 ydinvoiman proteiini-kompleksin, joka sitoutuu GLI1 sitovan kohdan RegIV promoottorin (-528~-520).

EMSA suoritettiin ydin- otteita PANC-1-soluissa (kaistat 2 7) tai ilman tumauutteita (kaista 1). RegIV koetin muodostettiin annealing yksijuosteisia ja leimattiin päästään sisältävät oligonukleotidit RegIV promoottorialue (nukleotidit -528~-520). Kilpailu kokeet suoritettiin käyttäen 1-kertainen (kaistat 3), 10-kertainen (kaistat 4), ja 100-kertainen (kaistat 5) ylimäärä leimaamatonta oligonukleotideja, vastaavasti (kaistat 3-5) tai 100-kertainen mutantti leimattujen oligonukleotidien (kaista 6). Super-shift, anti-GLI1 vasta-ainetta (kaista 7) inkuboitiin tumaekstrakteilla ennen lisättiin reaktioon.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet GLI1 ja RegIV olivat yli-ilmennetään PC kudos- ja solulinjoista, vahvistunut muissa raporteissa [12], [20], [32]. Olemme myös osoittaneet merkittävästi positiivinen korrelaatio ilmaus GLI1 ja RegIV. RNA-interferenssi ja yliekspressio osoittivat, että RegIV ilme muuttui GLI1 ilmentymistä PC solulinjoissa; Tämä vahvistettiin siru ja EMSA. Tämä on ensimmäinen raportti, joka GLI1 voivat moduloida RegIV ilmentymisen sitoutumalla RegIV geenin promoottorin, ja että GLI1 on RegIV transkriptiotekijä.

HH signalointireitin, mukaan lukien transkriptiotekijä GLI1, on mukana kehittämässä monenlaisia ​​syöpiä, mukaan lukien PC [12], [13], [32] – [35]; kuitenkin, mekanismi ei ole täysin selvitetty.