Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Host T-solujen vasteet liittyvät suotuisat tulosten epiteelin munasarjasyöpä (EOC), mutta on epäselvää, miten parhaiten edistämään näitä vasteita potilailla. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, arvioimme paneeli kliinisesti merkittävää sytokiinien kykyä parantaa useita T-solujen effektorifunktioita (polyfunctionality) natiivin kasvain ympäristössä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kokeet suoritettiin asuva CD8 + ja CD4 + T-solut irtotavarana askites soluvalmisteilla korkealaatuisesta vakavasta EOC potilaille. T-soluja stimuloitiin α-CD3: n läsnä ollessa 100% autologista askitesnesteen tai ilman eksogeenisen IL-2, IL-12, IL-18 tai IL-21, yksin tai yhdistelmänä. T-solujen lisääntymistä (Ki-67) ja toiminta (IFN-γ: n, TNF-α, IL-2, CCL4, ja CD107a lauseke) arvioitiin multi-parametri virtaussytometrialla. Samanaikaisesti 27 sytokiinien mitattiin viljelmän supernatanteissa. Vaikka askitesneste oli vaihtelevia vaikutuksia CD8 + ja CD4 + T-solujen lisääntymistä, se esti T-solu-toiminto useimmissa potilaan näytteissä, ja CD107a, IFN-γ, ja CCL4 osoittaa suurimman inhibition. Tähän liittyi kevyemmästä IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, ja bFGF viljelmäsupernatanteissa. T-solujen lisääntymistä tehostettiin eksogeenisen IL-2, mutta myös muut T-solujen toimintaan olivat suurelta osin vaikuttanut yhden sytokiineja. Yhdistelmä-IL-2 sytokiinien harjoittaa täydentäviä signalointireittejä, erityisesti IL-12 ja IL-18, tehostettu ilmentyminen IFN-γ: n, TNF-α, ja CCL4 kaikissa potilasnäytteissä edistämällä polyfunktionaalisia T-soluvasteita. Tästä huolimatta muut toiminnalliset parametrit pysyivät estyy.

Johtopäätökset /merkitys

EOC askites ympäristö häiritsee useita T-solujen toimintaa, ja eksogeeniset sytokiinien harjoittaa monipuolista signalointireitteihin vain osittain kääntää näitä vaikutuksia. Tuloksemme saattavat selittää rajoitettu tehoa sytokiinien hoitojen EOC tasalla. Full palauttaminen T-solujen tehtävään tarvitaan aktivointi signalointipolkujen pidemmälle kuin palkkaamat IL-2, IL-12, IL-18 ja IL-21.

Citation: Tran E, Nielsen JS, Wick DA Ng AV, Johnson LDS, Nesslinger NJ, et ai. (2010) Monifunktionaalisia T-solujen vasteet on repinyt rikki munasarjasyöpä Askitesta ympäristö- ja vain osittain palautettu kliinisesti merkittävänä Sytokiinit. PLoS ONE 5 (12): e15625. doi: 10,1371 /journal.pone.0015625

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2010; Hyväksytty: 19 marraskuu 2010; Julkaistu: 22 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Tran et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat British Columbia Cancer Foundation, United States Department of Defense, ja luonnontieteiden ja Research Council of Canada. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useat tutkimukset viime vuosikymmenellä ovat osoittaneet, että immuunijärjestelmän vaikuttaa kliiniseen tulokseen potilailla, joilla on korkea-asteen serous epiteelin munasarjasyöpä (jäljempänä EOC). Erityisesti, kun läsnä on kasvainta infiltroivien CD8 + T-solujen liittyy pitkittynyt taudista vapaan ja elinaika [1], [2]. Lisäksi kohonnut määrä CD56 + T-solujen askites osastoon korreloivat lisääntynyt platinaa herkkyyteen [3]. Viime aikoina, askitesnesteestä sisältävät kohonneet IL-17 (sytokiini pääasiallisesti tuotetaan Th17 ja muita T-soluja) [4] korreloi lisääntyneeseen eloonjäämiseen [5]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että parannetaan endogeeninen T-soluvasteen EOC voi olla kliinistä hyötyä potilaille. Kuitenkin munasarjakasvain ympäristön sisältää useita immunosuppressiivisia solutyypeissä, ja tekijät, jotka voivat vastustaa anti-kasvain T-soluvasteita. Näin ollen kohonnut määrä kasvaimeen liittyvien säätelijä-T-solujen (Tregs) ja makrofagit liittyvät huono selviytyminen EOC [1], [2]. Monet liukoinen immunosuppressiivisia tekijöitä löytyy myös askites, mukaan lukien IL-10, TGF-β, VEGF, B7-H1 /PD-L1, B7-H4, SDF-1, EBAG9 /RCAS1, Fas-ligandi, ja liukoisen IL-2-reseptori [1], [2].

heterogeenisuus immunosuppressiivisten mekanismien EOC esittelee valtava haaste immunoterapiaa, koska se viittaa siihen, että useita immunosuppressiivisia mekanismeja ehkä päinvastainen palauttamaan T-solujen toimintaa. Esimerkiksi Treg ehtyminen arvioidaan parhaillaan keinona parantaa koskemattomuutta vastaan ​​useita ihmisen syövistä [6], mukaan lukien EOC [7], mutta parhaimmillaankin vain kääntää yksi mekanismi immunosuppression, jättäen muut immunologisten esteitä ennallaan. Sen sijaan yrittää poistaa nämä esteet yksi kerrallaan, käytännöllisempi kliininen lähestymistapa olisi tuottaa tekijöitä, jotka voivat pitkälti ohittaa immunosuppressiivinen esteiden kasvain ympäristössä. Siten tunnistaa signaaleja tai olosuhteet, jotka edistävät T-soluvasteita EOC ympäristö voi johtaa tehokkaampaan immunoterapeuttisia strategioita.

Tätä varten olemme aiemmin kehittäneet hiirimallissa EOC joka mahdollistaa toiminnallinen arviointi CD8 + T soluvasteita munasarjakasvain ympäristöön [8]. Erityisesti meidän suunniteltu hiiren EOC kasvainlinjaan ilmaista CD8 + T-soluepitoopin mallista antigeeni ovalbumiini. Hiirillä, joilla on kehittynyt, laajalti kasvaimet, joilla on laaja askites käsiteltiin adoptiivinen siirto CD8 + T-solujen, jotka ovat spesifisiä ovalbumiinin epitoopin. Huomattavaa on, siirrettiin adoptiivisesti CD8 + T-solujen tehtiin voimakkaasti proliferaatiota ei vain imusolmukkeisiin ja perifeerisen veren, mutta myös askites ja kasvaimen osastoja. Todellakin, huippu vastauksen, siirretään T-solut muodostivat 40% CD8 + T-solujen ääreisverenkierrossa, ja jopa 96% CD8 + T-solujen askites. Tämä syvä proliferatiivinen vaste, jota seuraa nopea ja lähes täydellinen kasvaimen regressio, että suurin osa eläimistä, jotka osoittavat, että T-solut oli funktionaalisesti aktiivinen. Tärkeää on, leviämisen ja kasvaimen aktiivisuus siirretään CD8 + T-solut oli täysin riippuvainen IL-2 /IL-15 signalointia, kuten on osoitettu geneettinen häiriö IL-2-reseptorin alfa (CD25) tai beeta (CD122) alayksiköitä [ ,,,0],8]. Siten jopa asettaminen kehittynyt munasarjojen kasvaimia, CD8 + T-solut asentaa voimakas anti-tuumorivasteita että IL-2 /IL-15 signalointireitteihin olivat ehjät.

Edellä olevat tulokset nostanut esiin kysymyksen siitä, sytokiinien, kuten IL-2 voidaan vastaavasti yli-ratsastaa immunosuppressiiviset vaikutukset askitesta ihmisen EOC. Edellinen

in vitro

tutkimukset ihmisen EOC näytteet ovat osoittaneet, että IL-2 voi osittain palauttaa lymfokiiniaktivoiduiksi tappaja (LAK-solujen) sytotoksisuutta, kun läsnä on 50% askites-nesteestä, kun taas yhdistelmä-IL-2: TCR stimulaatio [9] tai IL-12 [10], [11] täysin palauttaa LAK sytotoksisuutta. Kuitenkin käyttö 50% askitesnesteen ei yksin täysin kerrata munasarjakasvain ympäristössä, joka sisältää myös immunosuppressiivisia solutyyppejä, kuten Tregs ja MDSCs [1], [2]. Lisäksi Låks ovat pääasiassa koostuu NK-solujen, jotka voivat vaikuttaa eri tavalla Askites verrattuna T-soluihin. Lisäksi nämä ohi tutkimuksissa mitattiin sytotoksisuus bulk LAK soluvalmisteilla eivätkä siis valaista vaikutuksia sytokiinien erilaisiin T-solujen alaryhmiä. Lopuksi

in vitro

sytotoksisuus on vain yksi osa T-solujen toimintaa ja ei aina korreloi tehokas T-soluvasteita

in vivo

[12].

kasvaa arvostusta tärkeydestä polyfunktionaalisen T-soluja (eli T-soluja, jotka voivat samanaikaisesti suorittaa useita toimintoja) tehokkaan immuunivastetta [13]. Erityisesti polyfunktionaalisia T-solujen vasteet liittyvät suojaavan immuniteetin rokotuksen jälkeen isorokkoa vastaan ​​(vacciniavirus) [14], keltakuume [15], tuberkuloosi [16], [17], ja leishmaniaasin [18]. Kohonnut määrä polyfunktionaalisen T-solut ovat myös korreloivat suotuisan tulokset erilaisissa sairauden asetuksia, kuten HIV /AIDS [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] , [26], [27], [28], [29], hepatiitti C [30], ja lymfosyyttinen koriomeningiitti [31]. Asettamisessa syövän, useat tutkimukset ovat osoittaneet, tehostettu määrä kasvainspesifisten polyfunktionaalisia T-solut potilailla, vastaa myönteisesti eri immunoterapian, mukaan lukien otto- T-soluterapia, α-CTLA-4-vasta-aine-hoidon ja kasvaimen rokotteet [32] [33], [34], [35], [36].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme arvioitiin ensimmäistä kertaa vaikutukset ihmisen EOC askites ympäristön T-solujen polyfunctionality. Arvioitiin myös kyky IL-2 ja kolme muuta kliinisesti merkityksellisiä sytokiinien (IL-12, IL-18 ja IL-21) palauttaa laajan T-solujen toimintoja. Olemme havainneet, että askites inhiboi polyfunktionaalisen vastaukset sekä CD4 + ja CD8 + T-solujen, joidenkin toimintojen osoittaa suurempaa inhibitiota kuin toiset. Lisäksi vain osa T-solujen toimintoja palautettiin eksogeenisten sytokiinien toimitetaan yksin tai yhdistelmänä. Niinpä täydellistä palauttamista T-solujen funktion EOC edellyttää aktivointia signalointipolkujen pidemmälle kuin palkkaamat IL-2, IL-12, IL-18 ja IL-21.

Tulokset

EOC askites häiritsee useita T-solujen toimintaan

Ensisijainen askites näytteet kerättiin potilailta, joilla on korkea-asteen vakavien EOC (taulukko 1). Mallintaa natiivi askites kasvain ympäristössä mahdollisimman tarkasti

in vitro

, olemme analysoineet bulk askites solupelletit, jotka lisäksi CD8 + ja CD4 + T-solut, jotka sisältyvät asukas kasvainsoluja, Tregs, B-solut, NK-solut, ja CD14 + soluja (taulukko 2). Lisäksi, soluja viljeltiin 100% autologinen askitesnesteestä sisältää liukoiset tekijät, kuten TGF-β, IL-10, ja VEGF: n (taulukko 2), jotka voivat vaikuttaa T-solujen toimintaa. Koska vähäisyys hyvin määritelty T-solujen antigeenien munasarjasyövän, me stimuloidaan viljelmiä α-CD3-vasta-aineen, joka tulisi stimuloida sekä efek- ja sääntelyn osajoukot. Näin ollen, kunkin potilaan T-solut analysoitiin läsnä ollessa täysi luonnossa esiintyvät kasvainsolujen, immunosuppressiiviset soluja, ja liukoiset tekijät.

Olemme äskettäin osoitettu hiirimallissa EOC, että askites ympäristö voi olla erittäin salliva T-solujen proliferaatiota [8]. Onko tämä oli myös totta ihmisen EOC näytteissä testasimme vaikutus askitesnesteen T-solujen lisääntymistä. Kuten nähdään Fig. 1A, askitesneste oli erittäin vaihteleva vaikutus CD8 + T-solujen lisääntymistä (mitattuna Ki-67 lauseke), jotka vaihtelevat voimakas esto (1/5 potilasta) lisääntyneistä leviämisen (2/5 potilasta). Yleisesti samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin CD4 + T-soluja (tuloksia ei ole esitetty). Siten ehdottivat meidän hiiren tutkimukset [8], ihmisen EOC Askites ympäristö ei ole yleisesti tukahduttava ja joissakin tapauksissa voi parantaa T-solujen lisääntymistä.

Bulk askites soluja stimuloitiin levyyn sitoutunut α-CD3 in media tai 100% autologista askitesnesteestä 48 tuntia. (A) leviämisen ja toiminta CD8 + T-solujen läsnä ollessa median tai autologisen askitesnesteestä (yläpaneeli) arvioitiin mittaamalla ilmentyminen Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ: n, TNF-α, ja IL-2: virtaussytometrialla. (B) Vaikutus IL-2 (toinen paneeli), IL-12 (kolmas paneeli), ja IL-21 (neljäs paneeli) on CD8 + T-solujen proliferaation ja eri toimintoja, kun läsnä on autologisia askites-nesteestä. Tiedot on normalisoitu a-CD3-stimuloiduissa soluissa median (eli media-arvot vähennettiin kustakin stimulaatio kunnossa). * Oli merkittävä vaikutus sytokiinin tehostamiseksi ilmoittanut toiminto verrattuna soluihin stimuloidaan media (Wilcoxonin pareittain t-testi, p 0,05).

Seuraava määritetään onko muita T-solujen toimintaan valmistettiin samalla vaikuttaa munasarjojen askites. Virtaussytometria-analyysiä käytettiin arvioimaan viisi yleisesti käytetty merkkiaineina T-solu-toiminto: IFN-γ: n, TNF-α, IL-2, CCL4, ja CD107a [13], [14], [19], [20], [ ,,,0],21]. Ensimmäiset neljä markkereita ovat sytokiinit osallistuvat T-solujen lisääntymisen tai efektorifunktion, kun taas CD107a ilmentyy T-solujen pinnalla olevien solujen jyvästen häviämisen ja toimii siten markkeri sytotoksisuuden [13]. In 4/5 potilaan näytteissä, askitesnesteestä aiheutti dramaattisen inhibition CD107a ekspression CD8 + T-solujen (Fig. 1A), joka oli liitetty alhaisempia grantsyymi B viljelmäsupernatanteissa (Supp. Fig. S1A), joka osoittaa askites ympäristön yleensä estää T-solujen jyvästen häviämisen. CCL4 ja IFN-γ ilmentymisen myös inhiboi askites useimmissa potilaan näytettä (Fig. 1A). T-solut ilmentävät IL-2 ja TNF-α olivat suhteellisen harvinaisia, ja oli minimaalisesti vaikutti askitesneste useimmiten (Fig. 1A). Vastaavia tuloksia saatiin, jossa CD4 + T-soluja (tuloksia ei ole esitetty). Kiehtovan vaikutukset askites T-solujen lisääntymistä ja muut T-solujen toimintaan olivat suurelta osin kytketty irti. Esimerkiksi potilaan näytteitä IROC008 ja IROC036, askitesnesteestä tehostunutta sekä CD8 + ja CD4 + T-solujen proliferaatiota, mutta esti ilmentymisen CD107a, CCL4, ja IFN-γ (Fig. 1A, ja dataa ei näytetty). Siten askitesneste on laajasti vaihtelevia vaikutuksia T-solujen toimintaan välillä potilaan näytteitä, sopusoinnussa epäyhtenäisyys EOC.

edelleen karakterisoimiseksi vaikutukset askitesnesteen immuunitoimintaan, viljelmäsupematanteista edellä olevissa arvioitiin multiplex bead määrityksiä ilmentymisen laajaa paneelia sytokiinien liittyy immunologisia ja tulehduksia. 27 sytokiinejä testattiin yhdeksän (IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, ja bFGF) inhiboi askitesnesteestä verrattuna media kaikkiaan 5 potilasnäytteistä (Supp. Fig. S1B). Askitesneste oli vaihtelevia vaikutuksia jäljellä sytokiinien (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka multiplex helmi määritykset eivät anna tietoa matkapuhelinverkon lähde (t) sytokiinien, tulokset kuitenkin korostavat laajan vaikutusten askitesnesteen on sytokiini miljöö EOC.

Vaikka järjestelmällinen arviointi lukemattomista immunosuppressiivisen tekijät in EOC [1], [2] oli kuulu tämän tutkimuksen, teimme tutkia mahdollisia vaikutuksia Tregs, TGF-β, IL-10, ja VEGF. Prosenttiosuus Tregs vaihteli 2,5% ja 6,8% kokonais-soluissa, mutta ei osoittanut mitään merkittävää korrelaatiota asteen inhibitio T-solujen proliferaatiota tai CD107a, CCL4, IFN-γ: n, TNF-α, ja IL-2: n ilmentymisen; Samoin, tasot TGF-β, IL-10, ja VEGF askiittinesteessä ei merkittävästi korreloi määrin T-solun eston (taulukko 2; Pearson korrelaatio p 0,05 vertailut). Nämä havainnot korostavat monimutkainen Immunobiologian munasarjakasvain ympäristön että aste immunosuppression eivät korreloineet näiden yhteisten immunosuppressiivisia tekijöitä.

Eksogeeninen sytokiinien vain osittain palauttaa T-solujen funktion EOC askites ympäristön

meidän hiirimallissa EOC, IL-2 /IL-15 signalointi on kriittinen CD8 + T-solujen proliferaatiota ja toimintaa vesivatsanes- [8]. Kuitenkin, edellisen kokeet paljastivat, että suurin osa T-solujen EOC askites ei näihin havaittavia määriä IL-2. Tämä johti meidät spekuloida, että lisäämällä IL-2: n viljelmät voi palauttaa T-soluproliferaation ja toiminto. Tämän testaamiseksi bulk askites soluja stimuloitiin α-CD3 läsnä ollessa 100% askitesnesteen tai ilman eksogeenisen IL-2, ja T-solujen lisääntymistä ja toiminto mitattiin 48 tuntia myöhemmin. In 4/5 potilaan näytteissä, IL-2 täysin päinvastainen vaikutuksia askites T-soluproliferaation, ja todellakin indusoi vasteita oli suurempi kuin täyteen kasvatusliuokseen (Fig. 1 B). Sitä vastoin, IL-2 oli vain vähän vaikutusta ilmentymistä CD107a, CCL4, IFN-γ: n tai IL-2 useimpien potilaiden näytteitä, vaikka se aiheutti heikko mutta tilastollisesti merkittävää parannusta TNF-α ilmentymistä (Fig. 1 B). Siten IL-2 alone parannettu T-solujen lisääntymistä, mutta yleensä, oli vähäinen vaikutus muihin toimintoihin.

vieressä kysytään palkkaamalla muuta signalointipolkujen ehkä parempi parantaa T-solujen toimintaa. Ottaa huomioon, että IL-2 aktivoi ensisijaisesti Stat5: n reitti, siihen liittyvä sytokiini IL-12 aktivoi STAT4 reitti, joka on osoitettu lisäävän T-solun funktion erilaisten fysiologisten asetukset [37]. Kun lisätään EOC viljelmiä, IL-12 yksin oli vain vähäisiä vaikutuksia proliferaation tai toimin- CD8 + T-solujen kaikkein potilaan näytettä (Fig. 1 B). Me seuraavaksi arvioidaan IL-21, joka pääasiassa aktivoi STAT1 ja STAT3 polkuja [38]. Samanlainen kuin IL-12, IL-21 oli vain vähäinen vaikutus T-solujen proliferaatiota tai toimintaa (Fig. 1 B). Yleisesti samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin, jossa CD4 + T-soluja (tuloksia ei ole esitetty).

päättely, että laajempi määrin funktionaalisia lisälaite voidaan saavuttaa aktivoimalla samanaikaisesti useita STAT reittejä, arvioimme kahden yhdistelmiä sytokiinien: a) IL-2 + IL-12, ja b) IL-2 + IL-12 + IL-21. Tärkeää on, että viimeksi mainittu yhdistelmä olisi teoreettisesti aktivoida kaikki STAT väyliä, jotka liittyvät CD8 + T-soluvasteiden (ts STAT1, STAT3, STAT4, ja Stat5: n). Yleisesti ottaen sekä sytokiinien yhdistelmien indusoi T-solujen lisääntymistä samanlainen kuin IL-2 (vertaa Fig. 2 Fig. 1 B). Erityisesti kuitenkin, CD8 + T-solut IROC028, joka ei lisääntyä vasteena yksittäisen sytokiinin (Fig. 1 B), lisääntyneet vasteena sekä sytokiinien yhdistelmien (Fig. 2). Lisäksi sekä sytokiinien yhdistelmien olivat vaatimattomasti tehokkaampia kuin yksittäiset sytokiineja tehostamaan IFN-γ ja TNF-α tuotanto (Fig. 2). Tästä huolimatta, ei ole sytokiinien yhdistelmä parantaa ilmentymistä CD107a tai IL-2 (Fig. 2). Vastaavia tuloksia saatiin, jossa CD4 + T-solujen, vaikka vaikutukset sytokiinien olivat yleensä heikompi (tuloksia ei ole esitetty). Yhteenvetona lisäämällä sytokiinien yhdistelmien harjoittaa monenlaisia ​​STAT signalointireittien epäonnistui täysin korjaamaan T-solu-toiminto EOC askites ympäristöön.

Bulk askites soluja stimuloitiin levyyn sitoutunut α-CD3 media- tai 100% autologinen askitesnesteestä 48 tuntia. Leviämisen ja toiminta CD8 + T-solujen läsnä ollessa media, autologisen askitesneste (yläpaneeli), tai askitesnesteestä, kun läsnä on IL-2 + IL-12 (keskimmäinen paneeli), tai IL-2 + IL-12 + IL -21 (alapaneeli) arvioitiin mittaamalla ilmentyminen Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ: n, TNF-α, ja IL-2 virtaussytometrialla. Tiedot on normalisoitu a-CD3-stimuloiduissa soluissa median (eli media-arvot vähennettiin kustakin stimulaatio kunnossa). * Oli merkittävä vaikutus sytokiinien yhdistelmä parantamiseksi ilmoittanut toiminto verrattuna soluihin stimuloidaan media (Wilcoxonin pareittain t-testi, p 0,05).

Lopuksi arvioi aktivointi ei -STAT signalointireitteihin voisi entisestään tehostaa T-solujen toimintaa. Tätä varten, arvioimme sytokiini IL-18, joka kuuluu IL-1-sytokiiniperheen, aktivoi MyD88 /NFKB reitin, ja voi suoraan lisätä CD8 + T-solu-vasteita eri ympäristöissä [39], [40] , [41]. IL-18 yksin oli heikko vaikutuksia T-solujen lisääntymistä ja toiminta (Fig. 3A). Kuitenkin, kun se yhdistetään IL-2 + IL-12, IL-18 merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen IFN-γ ja, vähemmässä määrin, TNF-α (Fig. 3A). Lisäksi, yhdistelmä-IL-2 + IL-12 + IL-18 lisäsi merkittävästi määrä IFN-γ tuotetaan solua kohti, mikä näkyy lisääntynyt fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) (Fig. 3B, C). Tästä huolimatta yhdistelmä-IL-2 + IL-12 + IL-18 ei pystynyt merkittävästi parantaa ekspressiota CD107a tai IL-2 (Fig. 3A) ja vain hieman parantaa grantsyymi B vapautumista (Supp. Fig. S2A). Samoin, tämä yhdistelmä ei palauttaa IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB tai bFGF viljelmäsupernatanteissa (Supp. Kuvio . S2B). Tämä yhdistelmä ei kuitenkaan heikosti korottaa IL-5 ja IL-10 viljelmäsupernatanteissa (Supp. Fig. S2C). Näin ollen, yhdistelmä IL-2 + IL-12 + IL-18 vain osittain palauttaa T-solujen toimintoja EOC ympäristössä.

Bulk askites-soluja stimuloitiin levyyn sitoutuneen α-CD3 media- tai 100% autologisten askitesneste 48 tuntia. Leviämisen ja toiminta CD8 + T-solujen läsnä ollessa median tai autologisen askitesnesteestä (yläpaneeli) arvioitiin mittaamalla ilmentyminen Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ: n, TNF-α, ja IL-2 virtaussytometrialla. (A) vaikutus IL-18 (keskimmäinen paneeli) ja IL-2 + IL-12 + IL-18 (alapaneeli) on CD8 + T-solujen lisääntymisen ja erilaisten toimintojen läsnä ollessa askites-nesteestä. Tiedot on normalisoitu a-CD3-stimuloiduissa soluissa median (eli media-arvot vähennettiin kustakin stimulaatio kunnossa). * Oli merkittävä vaikutus IL-2 + IL-12 + IL-18 parantaa osoitettua toimintaa verrattuna soluihin stimuloidaan media (Wilcoxonin pareittain t-testi, p 0,05). (B) Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) IFN-γ positiivisia CD8 + T-solujen määritettiin solunsisäisen IFN-γ värjäystä. * Vaikutus IL-2 + IL-12 + IL-18 oli merkittävästi suurempi kuin kahden muun sytokiinin yhdistelmät (Wilcoxonin pareittain t-testi, p 0,05). (C) edustaja virtaussytometria tontteja osoittavat vaikutusta sytokiinien yhdistelmien IFN-γ tuotanto on solua kohti. Näkyy ovat keskiarvo fluoresenssi-intensiteetti (Y-akseli) IFN-γ tuotantoa ja CD8 + solut, jotka ilmentävät IFN-γ (numerot). Kaikki tiedot eroteltiin CD8 +.

Eksogeeninen sytokiinien indusoimaan uuden polyfunktionaalisia T-solujen profiilit

Teoriassa tehostettu toiminta sytokiinien yhdistelmien verrattuna yhden sytokiinien voisi heijastaa joko (a ) eri sytokiinien stimuloiva erilliset alapopulaatiot T-solujen, tai (b) sytokiinit toimivat synergistisesti indusoida yhden T-solujen suorittaa useita toimintoja (ts induktio polyfunktionaalisen T-solujen). Tutkimaan asian, käytimme Boolen portti analyysi tutkia erilaisia ​​toiminnallisia permutations näyttää CD8 + ja CD4 + T-solujen eri stimulaatiota olosuhteissa. Kuten nähdään yläpaneelin kuvion. 4, kun suurin askites soluja stimuloitiin täyteen kasvatusliuokseen, vain viisi hallitseva toiminnallisia muunnelmia nähtiin joukossa CD8 + T-solut: (a) ei-funktionaalisia (eli nolla-toiminto) T-soluja (tuloksia ei ole esitetty); (B) mono-funktionaalisia T-soluja, jotka ilmentävät CCL4 tai CD107a (permutaatioiden 2 ja 5), ​​(c) kaksitoimisen T-soluja, jotka ilmentävät sekä CD107a ja CCL4 (permutaatio 13), ja (d) tri-funktionaalisia T-soluja, jotka ilmentävät CD107a, CCL4 ja IFN-γ (permutaatio 24). Kun läsnä on 100% askites-nesteestä, määrä ei-toiminnallisia T-solujen lisääntynyt, kun taas muut toiminnalliset permutaatiot vähennettiin lukuun ottamatta mono-toiminnallisia T-soluja, jotka ilmentävät CCL4 (Fig. 4, toinen paneeli). Yleensä lisäksi yhden sytokiinien ei merkittävästi muuta toiminnallista permutaatiot nähnyt askites yksinään, vaikka IL-2 oli heikko vaikutus useita permutaatioista (Supp. Fig. S3). Sen sijaan lisäämällä sytokiinien yhdistelmien (joko IL-2 + IL-12 + IL-21 tai IL-2 + IL-12 + IL-18) merkittävästi vähensi nolla ja monofunktionaalisten T-solut ja se tuotti kolme uutta polyfunktionaalista permutaatioiden: a) CCL4 ja IFN-γ (permutaatio 10); b) CCL4, IFN-γ, ja TNF-α (permutaatio 17); ja c) CCL4, IFN-γ: n, TNF-α, ja CD107a (permutaatio 28) (Fig. 4, kolmas ja neljäs paneeli). Samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin CD4 + T-solujen, vaikka vaikutukset olivat yleensä heikompi (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen nämä yhdistelmät sytokiinien näyttävät vaikuttavan synergistisesti aiheuttaa polyfunktionaalisen vasteita yksittäisten T-solujen eikä stimuloi useita alaryhmien mono-funktionaalisen T-soluja.

Bulk askites-soluja stimuloitiin levyyn sitoutuneen α-CD3 media tai 100% autologista askitesnesteestä 48 h: n läsnä tai poissa ollessa osoitetun sytokiinin yhdistelmä. Looginen portti analyysi suoritettiin määrällisesti useita T-soluja, jotka ilmentävät jokaisen 31 mahdollisen funktionaalisen muunnelmia. On esitetty saadut tulokset ovat CD8 + T-solujen stimuloitu mediassa, askitesnesteestä, tai askitesnesteestä täydennetty sytokiini yhdistelmät IL-2 + IL-12 + IL-21 tai IL-2 + IL-12 + IL-18. Taajuus T-soluja, jotka ilmentävät tiettyä permutaatio ilmaistaan ​​prosentteina kaikista CD8 + T-soluja. * Jos ilmoitettu permutaatio, vaikutus sytokiinin yhdistelmä oli merkittävästi suurempi kuin mitä havaittiin media (Wilcoxonin pareittain t-testi, p 0,05).

Keskustelu

Osoitamme täällä että askites ympäristöön ihmisen EOC on vaihtelevia vaikutuksia CD8 + ja CD4 + T-solujen lisääntymistä ja todellakin voi jopa parantaa lisääntymistä joissakin tapauksissa. Sitä vastoin, askites yleensä estää ilmentymisen IFN-γ: n, TNF-α, CCL4, ja CD107a T-solut, mikä johtaa voittopuolisesti nolla tai monofunktionaalista T-soluja. Lisäksi askites ympäristöön yleensä inhiboi IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, ja bFGF viljelmän supernatanteissa. Vaikka IL-2 voisi palauttaa T-solujen lisääntymistä, se on yleensä tehotonta parantamaan muiden T-solujen toimintaa, kuten myös muu yksittäinen aine sytokiinien (IL-12, IL-18 ja IL-21). Yhdistelmät sytokiineja, jotka aktivoivat täydentäviä signalointireittejä (erityisesti IL-2 + IL-12 + IL-18), kykenivät ilmentymisen tehostamiseksi IFN-γ: n, TNF-α, ja CCL4 mutta oli vähäinen vaikutus muihin T-solujen toimintaan. Siten eksogeeninen sytokiinit voivat osittain palauttaa T-solujen toimintaa ihmisen EOC ympäristöä; kuitenkin, vaihtoehtoiset strategiat vaaditaan täysin palauttaa T-solujen toimintaa.

Yksi rajoitus tämän tutkimuksen on suhteellisen pieni otoskoko, joka oli välttämätön, koska suuri osa sytokiinien ja toiminnalliset read-out mukana. Huolimatta pieni otoskoko, oli merkittävä samankaltaisuus yleistä toiminnallista profiilit kaikkien viiden potilaan näytteet, sekä lähtötilanteessa ja sytokiinien stimulaation. Tämä viittaa siihen, että erilaiset immunosuppressiiviset mekanismeja läsnä munasarjasyövän saattaa lopulta lähenevät kohti yhteistä T-solujen toiminnallista valtiossa, konservoituneen säätelyperiaatteet signaaleja.

vapautuminen sytotoksisten rakeiden on merkittävä mekanismi, jolla T-solut tappaa virus-tartunnan ja transformoitujen solujen [42]. Huomasimme, että askitesneste esti voimakkaasti T-solujen degranulation, ja tämä vain osittain palautettiin eksogeeninen sytokiinien (osoituksena vaatimaton lisääminen grantsyymi B release). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistelmä-IL-2: TCR stimulaation [9] tai IL-12 [10], [11] voisi täysin palauttaa LAK sytotoksisuutta, kun läsnä on 50% askites-nesteestä. Tämä ero meidän tulokset voivat heijastaa vaativampia viljelyolosuhteet käytimme, että T-solut analysoitiin, kun läsnä oli 100% vatsaonteloneste ja täysi muiden kasvaimeen liittyvien solutyyppejä.

puute IL-2-tuotannon sekä CD8 + ja CD4 + T-solut näissä kokeissa on sopusoinnussa myös heikentynyt kasvaimen vastainen vaste. Meidän hiirimallissa munasarjasyöpä [8], kasvaimen regressio oli täysin riippuvainen IL-2 /IL-15 signalointia. Samoin Gattinoni ja kollegat osoittivat, että efektori CD8 + T-soluja, jotka kykenevät voimakas

in vitro

kasvaimen vastaisen sytotoksisuuden ja IFN-γ tuotantoa, mutta ei IL-2: n tuotantoa, olisi rajoitettu antituumorivaikutuksen

in vivo

, kun taas T-solut, jotka oli matala

in vitro

sytotoksisuuden, mutta korkea IL-2: n tuotantoa, välittämä ylivoimainen anti-tuumorivasteita [12]. CD8 + T-solut yleensä menettävät kykynsä tuottaa IL-2: ta erilaistumisen, epäonnistuminen sytokiinien parantaa IL-2-tuotannon viittaa siihen, että suurin osa kasvaimeen liittyvän T-solut voivat olla terminaalisesti erilaistuneita efektorien [13]. Jos näin on, pyrkiä vastaisuudessa suunnataan eristämisen ja laajentamalla vähemmän eriytetty alaryhmiä T-solujen suuremman pluripotenttisuuden.

Lisäksi epäonnistuneet IL-2: n tuotantoa, huomasimme, että askitesneste esti ilmaus lukuisten muiden sytokiinien ( IL-1β, IL-1 ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-bB, ja bFGF) viljelysupernatanteista. Vaikka multiplex -sytokiinianalyysin käytimme voi syrjiä mikä solutyyppi (t) on estetty tuottavat näitä sytokiineja, monet näistä sytokiinien dokumentoidut rooleja T-soluvasteiden ja siten niiden kevyemmästä odotetaan vaikuttavan T-solujen toimintaa. Erityisesti IL-17 on tuotettu Th17 osajoukko CD4 + T-soluja tulehdustiloja ja on korreloitu parannettu yleistä eloonjäämistä EOC [5]. Kun otetaan huomioon, että yhdistelmän IL-2 + IL-12 + IL-18 ei ole parantaa IL-17 tuotantoa, vaihtoehtoisia strategioita tarvitaan edistämään tämän efektori reitin sisällä kasvain ympäristössä. Esimerkiksi, IL-1β, IL-6, TGF-β, IL-23, ja ICOS kaikilla on osoitettu vaikuttavan erilaistumista, laajentamista tai toimintaa Th17 soluihin [4], [43], ja näin ollen voitaisiin mahdollisesti manipuloida edistämään IL-17-tuotannon

in vivo

.

toisin kuin nämä muut sytokiini vikoja, yhdistelmä IL-2 + IL-12 + IL-18 voimakkaasti parantaa IFN-γ tuotannon CD8 + T-solut (Fig. 3B, C). IFN-γ on keskeinen rooli kasvaimen vastaisen immuniteetin estämällä kasvaimen leviämisen ja angiogeneesissä, ja gisia kasvain antigeenin esittelyä. Endogeeninen IFN-γ suojaa kasvaimen kehittymisen, ja useita kasvainmuodosta, on kriittinen kasvaimen vastaisen immuniteetin [44]. Lisäksi, IFN-γ: n ja IFN-γ-reseptorin ilmentymisen, sekä useiden geenien alavirtaan IFN-γ, liittyy lisääntynyt selviytyminen ihmisen EOC [1]. Näin saattaa IL-2, IL-12 ja IL-18-operatiivisesti parantaa IFN-γ tuotantoa? Ensinnäkin nämä sytokiinit rakenteellisesti ylössäätävät ilmentävät niiden reseptorien, mikä parantaa herkkyyttä T-solujen kaikkien kolmen sytokiinit [45], [46], [47], [48]. Toiseksi, nämä sytokiinit voivat välittää synergistinen ja täydentävä signalointi tapahtumia [37], [49], [50]. Esimerkiksi, IL-2 ja IL-12 synergistisesti aktivoida p38 MAPK-reitin parantaa IFN-γ ilmaisun [51]. Samoin, IL-12 ja IL-18 aktivoivat transkriptiotekijöiden STAT4 ja AP-1, vastaavasti, jotka voivat synergistisesti tehostaa IFN-γ-promoottorin aktiivisuus [52]. Näin ollen koordinoitu aktivoituminen sekä STAT ja ei-STAT signalointireittien näkyy tärkeitä maksimaalisen ekspression IFN-γ. On huomionarvoista kuitenkin, että nämä signaalit eivät olleet riittäviä palauttamaan ilmentymisen monia muita sytokiineja. Tämä viittaa siihen, että tulevaisuudessa, sytokiinien muut kuin IFN-γ pitäisi käyttää lukea-out, jos haluaa optimoida kaikkia T-solujen toimintoja syövän immunoterapiassa.

Yhdistelmä IL-2 + IL -12+ IL-18 indusoi myös merkittäviä muutoksia polyfunktionaalisia T-solujen yhdistelmää.