Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tuumorinekroositekijä alfan (TNF) pystyy tappamaan syöpäsoluja kautta reseptorivälitteisen solukuoleman vaativat Adenosiinitrifosfaatti (ATP). Kliininen käyttö TNF toistaiseksi rajoittuu lähinnä sen syvällinen maksatoksisuuteen. Äskettäin todettiin, että hiiren järjestelmän erityistä suojaa hepatosyyttien vastaan ​​TNF: n haitallisia vaikutuksia voidaan saavuttaa fruktoosi-välitteisen ATP ehtyminen siihen. Ennen käyttävät tätä varsin houkutteleva valinta periaate ensimmäisessä kliinisessä tutkimuksessa, me täällä kattavasti tutkineet keskinäinen riippuvuus ATP ehtymisen ja TNF maksatoksisuutta sekä

in vitro

ja

ex vivo

kokeiden käytön mukaan ensisijaisen potilaskudos materiaaleja.

Methods

ensisijainen ihmisen maksasoluissa, ja sekä ei-tuumori- ja tumorous potilaasta peräisin ensisijainen maksakudosta viipaleita käytettiin selvittämään fruktoosi aiheuttama ATP ehtyminen ja TNF-aiheuttamaa sytotoksisuutta.

tulokset

PHH sekä kudoksen siivuja valmistettu ei-pahanlaatuinen ihmisen maksan näyte käynnissä fruktoosi välittämä ATP ehtyminen molemmat osoitettiin suojattava TNF-solukuolema. Sen sijaan johtuen kasvainspesifisen yliekspressio heksokinaasilla II, jossa säädetään syvällinen ohitus hepatosyyttiset erityisiä fruktoosi hajoamista, tämä ei ollut ihmisen tumorous maksakudoksissa.

Johtopäätös

Normal ihmisen maksan kudoksissa voidaan suojata väliaikaisesti vastaan ​​TNF-solukuolema systeemisesti annostelluilla fruktoosia käytetään myrkyttömiä /fysiologisten pitoisuuksien. Valikoiva TNF-kohdistamista ensimmäisen ja toisen kasvain maksassa ohimenevä ja erityisten ehtyminen hepatosyyttiset ATP avaa uuden kliinisen avenue TNF perustuvaa hoitoa maksan syöpien.

Citation: Weiland T, Klein K, Zimmermann M, Speicher T, Venturelli S, Berger A, et al. (2012) Selective Protection of Human Liver Tissue TNF-kohdistaminen syöpien maksassa Ohimenevä väheneminen on Adenosiinitrifosfaatti. PLoS ONE 7 (12): e52496. doi: 10,1371 /journal.pone.0052496

Editor: Johannes Haybaeck, Medical University Graz, Itävalta

vastaanotettu: 9. elokuuta, 2012 Hyväksytty: 19 marraskuu 2012; Julkaistu: 18 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Weiland et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat ICEPHA avustuksen 2009-09, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB /TRR77), liittovaltion opetus- ja tutkimusministeriö (BMBF, # 0315755) ja Robert Bosch -säätiö, Stuttgart, Saksa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

systeeminen käyttö erittäin voimakkaita antineoplastisia sytokiinien tuumorinekroositekijä (TNF) on erittäin rajoitettu

johtuu havaintoon, että TNF: n pleiotrooppista toiminnoista aiheuttaa vakavia systeemisiä sivuvaikutuksia

, erityisesti korkealaatuista maksatoksisuutta [ ,,,0],1], [2]. Siksi systeeminen anto TNF korvattiin valituilla kasvain yksiköt onnistuneesti hoito ainoastaan ​​käyttämällä paikallisia -perfuusioiden Raajojen TNF [3], [4]. Kuitenkin tällaisia ​​strategioita jäänyt epäsel- eristetyn maksan perfuusiota (IHP), jota käytetään pahanlaatuisten kasvainten hoidossa maksan [5] – [8].

Äskettäin, TNF-indusoitu hepatosyyttiset apoptoosi tunnustettu erittäin ATP- riippuvainen prosessi hiirimallissa [9]. Lisäksi on näyttöä siitä, että fruktoosi johtaa ATP ehtyminen yksinomaan hepatosyyteissä. Toiminnallisena seurauksena hepatosyyteissä (päinvastoin kuin malign vastineet) osoittavat suojautuminen TNF-aiheuttamaa apoptoosia [9], [10]. Tämä biologinen ero hepatosyyttien ja pahanlaatuisten solujen katsottiin johtuvan muutoksen liittyvä yli-ilmentyminen heksokinaasi II (HKII) johtaa ohituksen hepatosyyttiset-spesifisten fruktoosi kataboliaa [10]. Läsnäollessa fruktoosi, kriittisen maksa-entsyymien ketohexokinase (KHK) ja aldolaasient- B (AldoB) perustaa palautuva, hepatosyyttiset-specific ATP trap [11]. Yliekspressio HKII ohittaa tämän sink

jotta

fruktoosi muuttuu ensisijaisesti fruktoosiksi-6-fosfaatti ja metaboloituvat ”lihas-tyyppinen” Glykolyysivaiheen vaikuttamatta solujen ATP-tasot (kuvattu yksityiskohtaisesti kuviossa 1).

Lisääntynyt ilmentyminen heksokinaasilla II (HKII) tuumorisoluissa johtaa lihas-tyyppinen metabolia fruktoosi (alaosassa kuvassa), joka ei sisällä mitään ehtyminen tai pyydystäminen ATP. Sitä vastoin hepatosyyttien (ylempi osa kuvassa) käyttää entsyymejä ketohexokinase (KHK) ja aldolaasi B (aldoB) ja siten maksan-tyyppinen aineenvaihduntaa fruktoosi. Tämän seurauksena on erittäin nopea ATP-riippuvainen muuntaminen fruktoosin kautta KHK fruktoosiksi-1-fosfaatti toimii fosfaatti pesuallas dramaattisesti alentaa solujen ATP: n.

molekyylitasolla,

tämä fruktoosi välittämää hepatosyyttispesifinen erityinen suojaava vaikutus kohti TNF

todennäköisimmin saavutetaan ADP hajoamistuotteita, jotka kertyvät muodossa adenosiini. Äskettäin

on osoitettu, että adenosiini saa aikaan autokriininen adenosiini-3 ’, 5’-syklisen monofosfaatin vaste

, negatiivisesti vaikuttavat TNF-indusoidun aktiivisuuden c-Jun-N-terminaalisen kinaasin (JNK) on proteiinikinaasi A: -riippuvaisella tavalla [12].

tutkimuksessamme selvitimme mahdollisuus siirtää tätä lähestymistapaa hiiren tietoja ihmisen järjestelmän osalta fruktoosia välittämää ohimenevä ATP ehtyminen ja siten toteuttaa sillä selektiivisen aseistariisunta TNF: n tuhoisaa hepatosyyttiset ominaisuuksia. Tätä varten käytimme (i) viljellyissä ensisijainen ihmisen hepatosyyttien (PHH) ja (ii) tarkkuus leikattu viipaleita terveen ihmisen maksan kudoksissa

verrattuna

pahanlaatuinen ihmisen maksan kudoksissa peräisin potilaiden maksan resectates on translaation e

x vivo

lähestymistapaa. Lisäksi aiemmin tehty hiiren kokeiluja, w

e oli nyt mahdollisuus kääntää saanut tietoa fruktoosi välittämän maksan suoja osaksi ihmisen fysiologiset yhteydessä luodaan perusta tuleville vaiheen I /II kliinisessä tutkimuksessa

.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen

Viljellyt, ensisijainen ihmisen hepatosyyttien (PHH) jalostetaan juuri otettu maksasta yksilö saadaan alle maksaleikkauksen. Niinpä PHH eivät muodosta solulinja; PHH ovat ensisijainen soluja. PHH eri luovuttajalta potilaat toimittivat T.S. Weiss kanssa tietoon potilaan suostumuksella suhteen ottaen näytteiden mukaan ohjeita ja hyväksynyt hyväntekeväisyyteen valtion hallinnassa Human Tissue Cell Research Foundation, HTCR (suoraan tietoa osoitteessa: https://www.htcr.de/english/supply.html), ja A. Königsrainer ja M. Schenk (Dpt. General, Sisäelinten elinsiirtokirurgiaa , University Hospital, Tübingenin Saksa), jossa tietoon potilaan suostumuksella suhteen ottamalla näytteitä hyväksymän paikallisen eettisen komitean (Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingenin /Ethic provision lääketieteellisen tiedekunnan Eberhard-Karls-yliopistossa ja yliopistollisessa sairaalassa sairaala Tübingenin). Osallistujat eivät tarjota kirjallinen lupa osallistua tähän tutkimukseen. Tuebingen eettinen komitea hyväksyi lupamenettelyssä ja Tübingenin eettinen komitea ei vastusta tätä tutkimusta. Ihmisen maksan ja maksan kasvainten resectates saatiin tietoon potilaan suostumusta Dpt. General, Sisäelinten Elinsiirtokirurgiaa, University Hospital, Tübingenin Saksa, ohjeiden mukaan paikallisen eettisen komitean. Osallistujat eivät tarjota kirjallinen lupa osallistua tähän tutkimukseen (ts lahjoitus kirurgisen näytteen että Tuebingen kasvain ja normaali kudospankille). Tämä prosessi dokumentoitiin allekirjoittamalla kunkin potilaan tiedot. Tuebingen eettinen komitea hyväksyi lupamenettelyssä ja Tübingenin eettinen komitea ei vastusta tätä tutkimusta (Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingenin /Ethic provision lääketieteellisen tiedekunnan Eberhard- Karls-yliopiston ja yliopistollisen sairaalan Tübingenin). Ei tutkimus tehtiin ulkopuolella meidän asuinmaan.

Soluviljely

Ensisijainen ihmisen hepatosyyttien viljeltiin DMEM täydennetty 100 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä (Serva, Heidelberg, Saksa), 18,8 ug /ml hydrokortisonia (Merck, Darmstadt, Saksa) ja 1,68 mU /ml insuliinia (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Tanska). Kasvainsolulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia. Kaikki solut viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. HepG2 saatiin ATCC, Hep3B ja PLC /PRF /5 saatiin ECACC ja Huh7 saatiin riken geenipankki. Cell identiteetit testattiin DNA-tyypitys (DSMZ, Braunschweig, Saksa). Kaikki solut testattiin negatiiviseksi mykoplasmakontaminaation.

Precision-cut kudos viipalointi

viipalointi kudosnäytteiden alkoi tunnin kuluessa resektio vibratomilla VT1200S (Leica, Wetzlar, Saksa) vuonna jääkylmää happi-kyllästetty Krebs-Henseleit puskuria (KHB), joka sisälsi 25 mmol /l glukoosia (Merck, Darmstadt, Saksa), 25 mmol /l NaHCO

3 ja 10 mmol /l HEPES (Carl Roth, Karlsruhe, Saksa) jälkeen varastointi Custodiol (Franz Köhler Chemie, Alsbach, Saksa) [21]. Viipaleita inkuboitiin hapetetussa William n E alustassa, joka sisälsi 25 mmol /l glukoosia ja 50 ug /ml gentamysiiniä (Lonza Bioscience, Verviers, Belgia) käytettäessä happipitoista ilmakehässä (80% happea, 5% CO

2).

Aineet

rekombinantti ihmisen TNF-alfa ostettiin Innogenetics (Gent, Belgia). Fruktoosi ja ActinomycinD (ActD) ostettiin Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Saksa).

Solujen käsittely ja ihmiskudoksen viipaleet

Solut ja viipaleet esikäsiteltiin 50 mM fruktoosia 30 minuuttia ja 1 ug /ml ActD 15 min ennen antoa 100 ng /ml TNF. Kaspaasi-määritykset suoritettiin 8 tunnin jälkeen, LDH: n vapautuminen ja sytokeratiini 18-pilkkominen määritykset suoritettiin 24 tunnin kuluttua TNF-hoidon.

Sytotoksisuusmääritykset

prosenttiosuus laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumista määritettiin käyttäen LDH Mono-P-määritys (Analyticon, Lichtenfels, Saksa) laskettiin suhteena supernatantti /(supernatantti + lysaattia). Kudoksen viipaleita, LDH: n määrä on luovutettu supernatantti määritettiin ja normalisoitiin proteiinipitoisuuden yksittäisten viipaleiksi. Caspase aktiivisuudet määritettiin inkuboimalla 50 uM substraattia

N

asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-aminometyylikumariinia (Ac-DEVD-AMC, Biomol, Hampuri, Saksa) määrityspuskurissa (50 mM HEPES , pH 7,4, 1% sakkaroosia, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT). Alustan lohkaisu mitattiin kineettisesti mukaan spektrofluorometrialla. Kaspaasiaktiivisuus määritettiin kulmakerroin tuloksena lineaarisen taantumat ja ilmaistu mielivaltainen fluoresenssiyksiköinä per minuutti. Sytokeratiini 18-pilkkominen määritettiin supernatantissa kudosleikkeitä käyttäen M30 CytoDEATH ELISA-pakkausta (Peviva, Bromma, Ruotsi), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

ATP määritys

ATP-pitoisuus mitattiin käyttäen CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega, Mannheim, Saksa).

Quantitative real-time PCR

Korkealaatuiset kokonais-RNA (0,5 ug) käänteiskopioitiin käyttämällä Reverse Transcription Kit ja satunnainen heksameerejä (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. mRNA-ekspressio mitattiin käyttämällä TaqMan 7500 tai 7900HT Applied Biosystems käyttämällä erityisiä predeveloped määrityksissä aldolaasi B (Hs01554887_m1), heksokinaasin II (Hs00606086_m1) ja ketohexokinase (Hs00240827_m1) verrattuna standardi käyrät pCMV6-XL vektoreita, jotka sisältävät cDNA: ita vastaavien geenien (ostettu Origene, Rockville, USA). 18S RNA (4308329, Applied Biosystems) käytettiin normalisointi.

Tilastot

Kokeet tehdään saatavuuden mukaan yksilöitä ja toistettu ainakin 5 kertaa. Kaikki tiedot kuvattu kertainen muutos valvonta, joka on 1. Virhepylväät osoittavat keskiarvo ± SEM. Tilastolliset erot määritettiin parittomalla t-testillä. Kaikki tilastot laskettiin käyttäen GraphPad Prism 4,01 (GraphPad Software Inc.) ja ap arvo 0,05 katsottiin merkittäväksi.

Tulokset ja keskustelu

ohimenevä väheneminen solujen ATP saavutettu primaaristen ihmisen hepatosyyttien käyttämällä n fysiologiset pitoisuudet fruktoosin

verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin, ATP pitoisuus PHH

havaittiin vähentynyt pitoisuudesta riippuvalla tavalla

30 min inkubaation fruktoosilla , joilla keskimääräinen vähennys on 30% valvonnan pitoisuutena 50 mM (kuvio 2A, oikeanpuoleisin datapiste, kokoaminen kuuden ihmisen luovuttajien). Kineettisesti, ATP havaittiin loppuvan 5 min (kuvio 2B), jolloin keskiarvo vähintään -40% verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Tämä ATP ehtyminen oli spontaanisti näkemänä nousu ATP sisältöä 120 min ja sen jälkeen (kuvio 2B, kooste kahdeksan ihmisen luovuttajien). Siten solujen energiavarastoja hepatosyyttien koki jatkuvaa elpymistä seuraavan parin tunnin jättää ohimenevä ehtyminen ikkuna. Tärkeää on, aikana fruktoosi välittämää ohimenevä ehtyminen solujen ATP, emme löytäneet mitään vaikutusta hepatosyyttiset elinkelpoisuuden kuten osoitetaan puuttuminen kasvoi merkittävästi LDH: n vapautuminen ennen ja aloittamisen jälkeen fruktoosin hoidon (kuvio 2C, tietojen kokoaminen neljän ihmisen luovuttajien ). Huomattavaa on, että mikä tahansa viljelyn PHHs riistäytynyt havaintoajasta 1440 min (eli 24 tuntia) on osoitettu johtavan merkittävän nousun LDH levittämisestä soluviljelysupernatantit (meidän julkaisemattomat tulokset), joka osoittaa syvällinen prosenttiosuuden hajonneen PHHs pidemmälle 24 tunnin rajan. Siksi ”pitkän aikavälin” koskevat tulokset PHH elinkelpoisuutta yli 24 tuntia eivät ole toteutettavissa tässä yhteydessä. Samalla meidän edelleen perusmäärittely PHH kulttuureissa on myös osoittanut, että ATP sisältö näiden ensiöparit vähenee hitaasti jo ensimmäisten 24 tunnin testaus. Siksi ei ole mahdollista säilyttää samat ATP-tasot (100%; alussa mitattuun /aloittamisen näissä kokeissa) koko 24 tunnin PHH viljelyn. Kuitenkin dokumentoitu elpyminen jopa 60% alkuperäisestä ATP tasolla ilman merkittävää vapautumista LDH osoittaa, että vaikutus fruktoosin ATP tasoilla on erittäin palautuvaa ja että maksasolujen pystyvät selviytymään tämän ohimenevä väheneminen solujen ATP rajatussa erilaisia ​​viljelyn ajan (eli enintään 24 tunnin aikajakson).

(A-C) PHH ihmisluovuttajia käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla fruktoosi (A) tai käsitelty kiinteä pitoisuus 50 mM fruktoosin (B); ATP-pitoisuus määritetään sen jälkeen 30 min (A) tai vaihtelemalla ajankohtina kuten (B); LDH: n vapautuminen ja PHH inkuboinnin jälkeen 50 mM fruktoosia määritettiin sen jälkeen, kun ilmoitettuina ajankohtina (C). Tiedot annetaan keskiarvoina ± SEM.

siis käyttöön maksan suoja kohti TNF eristetyissä maksan perfuusio (IHP) näyttää olevan mahdollista kliinisestä näkökulmasta. Eräässä tutkimuksessa Cortez-Pinto

et

al

., Tervettä vapaaehtoista sekä potilaita, joilla alkoholittomia rasvamaksatulehdus (NASH) olivat bolus-pistoksena fruktoosilla. Myöhemmin ATP ehtyminen tarkkailtiin jatkuvasti NMR-spektroskopialla korkeintaan 60 min. Sekä terveillä vapaaehtoisilla sekä NASH potilasta havaittu olevan nopeasti (12 min kuluttua fruktoosi injektion) ja ohimenevää laskua solujen ATP (palauttaminen maksan ATP myymälöissä havaitaan 60 minuutin post fruktoosi injektio) [13]. Siksi tämä työ Cortez-Pinto

et

al

. on olennainen seurattaessa sekä ajan myötä ja niiden laajuus ATP ehtyminen tulevaisuudessa vaiheen I /II kliinisiä tutkimuksia suoritetaan potilaalla ilmenee ensisijaisen ja toissijaisen syövät maksan.

Myös muita ryhmiä havaittiin niin nopeassa heikentävien vaikutus ATP 30 min, kun annos on enintään 250 mg fruktoosia /painokilo sovellettiin terveillä vapaaehtoisilla. Vastaa meidän kokeellisia tuloksia, ei ole haitallista vaikutuksia maksassa (esim osalta transaminaasit ovat koholla) kuvattiin tällaisia ​​fruktoosi-lastaus menettelyjä [13] – [17].

lisääntymisen merkkejä heksokinaasilla II ja kumoamisesta maksan-tyyppinen fruktoosi aineenvaihduntaa maksassa tuumorikudoksissa

äskettäin osoitettiin maksan kasvainsolulinjoissa että prosessin aikana pahanlaatuisen muutoksen syvällinen säätelyä heksokinaasilla II (HKII) esiintyy joka voisi selittää

että fysiologinen ilmiö maksan ATP ansastusta ohitetaan tuumorisoluissa

[10]. Tutkimaan edelleen tätä mekanismia käytimme vasta resektoitiin yksilöitä ihmisen maksan kudoksissa, eli solut, jotka eivät kuulu mahdollisten liittyviä artefakteja prosessin kuolemattomaksi. Verrataan transkription tasot HKII, AldoB, ja KHK, keskimääräinen taso HKII transkription havaittiin lisätään 7,6-kertaiseksi ihmisen maksan kasvaimissa verrattuna ei-tuumori- ensisijainen ihmisen maksan kudoksissa on normalisoitu tekijä 1 (taulukko 1). Sen sijaan, AldoB ja KHK havaittiin vähentynyt Valtaosa tutkittiin kasvaimen kudosten ja kasvainsolulinjoja (tarkoittaa kertamuutoksia 1 verrattuna ei-tuumori- ensisijainen ihmisen maksan kudoksissa on normalisoitu tekijä 1) (taulukko 1). Mukaan Warburg hypoteesi hankittu muutoksia aineenvaihduntaan aikana etenemisen maligniteettien myös syövät ihmisen maksan voi mukautua ympäristön ominaista puute ravinteita ja happea kautta muuttuneeseen metabolisen laitteet, erityisesti niiden ei-oksidatiivisen eli glykolyyttisissä energia aineenvaihduntaa [18]. Siksi yliekspressio HKII ja siten muuttunut fruktoosi aineenvaihduntaa ensisijainen tai toissijainen syövät maksan voi toimia välineenä luoda valikoiva maksan suoja TNF-pohjainen tuumoriterapian avulla, joka adjunctive fruktoosin hallintoa.

TNF-sytotoksisuus on poistettu käytöstä fruktoosi välittämä ATP ehtyminen PHH

Seuraavaksi seuraukset maksan ATP ehtyminen arvioitiin tasolla sytotoksisuuden ja kaspaasin aktivoitumista ihmisen maksasoluissa. Koska korvikemarkkerilta kalvon eheyden, määrät LDH: n vapautuminen altistettaessa 100 ng /ml TNF yksin (100 ng /ml; kuvataan -fruc kuviossa 2A) tai yhdistetty fruktoosi esikäsittely (15 min; + fruktoosi kuviossa 2A ) /TNF-hoidon (50 mM fruktoosia; 100 ng /ml TNF) määritettiin ihmisen luovuttajalta peräisin PHH näytteitä. Näissä kokeissa, herkistyminen TNF-solukuolema on parannettu lisäämällä RNA-synteesin inhibiittori aktinomysiini D (ActD; 1 ug /ml), joka estää säätely ylöspäin tahansa suojaava selviytymisen geenejä [19]. Tutkimalla PHH peräisin resektoidun ihmisen maksan yksilöt (kuvio 3A), tasot keskimääräisen TNF-aiheuttamaa LDH: n vapautuminen havaittiin kaikkien heikentyvän merkittävästi aikana fruktoosi-lastaus. Tämän mukaisesti toiminnallisen havainnon, morfologiset muutokset ovat tyypillisiä TNF-induced apoptoottisen tilassa solukuoleman (esim arkkityyppistä ydin- tiivistyminen ja kalvo kupliminen) havaittiin myös merkittävästi kumottu fruktoosi esikäsittelyn (kuvio 3B). Esimerkkinä on PHH useita apoptoottinen ilmiöitä kuten (i) kondensoimalla ydinten (kuvio 3B, ylempi vasen paneeli; Hoechst värjäys) sekä (ii) kupliminen kasvaimen solukalvojen (kuvio 3B, alempi vasen paneeli; faasikontrastimikroskopiaa) selvästi olivat havaittu vastauksena TNF hoito yksinään; kuitenkin, esikäsittely fruktoosilla yksimielisesti johti lähes täydellistä kumoamista näiden TNF-aiheuttamaa ilmiöitä (kuvio 3B, ylempi ja alempi oikea paneeli). Aikaisemmissa työtä, se jo on osoitettu, että hepatosyyteissä TNF-välitteisen NF-kappa B on kumottu aikana meidän järjestelmän samanaikainen työllisyyden ActD tai CPT, jolla yleisesti estoa maksassa transkriptio [20]. Siten, hepatosyytit meneillään kombinatorinen käsittelemällä joko ActD /TNF tai CPT /TNF ei ole mitään mahdollisuutta ilmaista riittäviä määriä anti-apoptoottiset proteiinit, kuten cFLIP tai XIAP, jonka ilmentyminen voinut laukaista TNF-indusoidun NF-kappa B- -välitteistä signalointia. Näin ollen, hepatosyytit, joille fruktoosi-välitteinen väheneminen ATP: n läsnä ollessa joko ActD /TNF tai CPT /TNF eivät pysty estämään estämällä TNF-välitteisen hepatosyyttiset syöttämällä aktivoimalla pro-selviytymisen efektori reittejä, kuten NF-kappa B: signalointi [20].

Viljellyt PHH kuuden eri luovuttajilta käsiteltiin 400 ng /ml ActD yksinään tai yhdessä 100 ng /ml TNF: n ja 50 mM fruktoosia ilmoitettu. Sytotoksisuus määritettiin 24 tunnin kuluttua LDH vapautumisen määrityksellä kuvattu keskimääräinen kertainen muutos käsittelemätön kontrolli, on asetettu 1 (*: p 0,05, pariton t-testi). (B) Kuvia PHH otettiin 12 tunnin kuluttua hoidon ja esittävät TNF-induced apoptoottiset tiivistyminen ytimet riippuen fruktoosi-lastaus (+/- fruktoosi) (ylempi paneeli: Hoechst värjäytyminen) ja kalvo kupliminen (alempi paneeli: faasikontrastimikroskopiaa ). Valkoinen palkki osoittaa 10pM.

kumoaminen TNF-solukuolema alle ATP heikentävien olosuhteissa ihmisen maksan kudoksissa

Jotta lähestyä kysymykseemme potilaskohtaisessa asettaa itse pidemmälle eristetty , viljellyt solut ja solulinjat,

ex vivo

tarkkuus leikattu kudos viipale teknologia mukautettiin meidän koetilannetta [21]. Ihmisen maksan kudoksen viipaleita, joiden halkaisija on 0,8 cm ja paksuus 200-300 nm, joka koostuu 10-15 solukerrosten, joka satama -10

6 maksasoluissa keskimäärin, valmistettiin tuoreeltaan toistoleikattiin maksan kasvaimet ja vastaavat ei- pahanlaatuinen maksakudosta, inkuboitiin 24-kuoppaisilla levyillä (kuvio 4B). Näytteitä ei-tuumori- ihmisen maksan kudoksissa ja ihmisen kasvaimen kudokset olivat eri alkuperää (ks taulukkomuodossa kuviossa 4A), mukaan lukien maksasolusyövän (HCC), kolorektaalisyövän (CRC), haiman karsinooma (PC), ja kolangiokarsinooma (CC). Kuten elinkelpoisuuden ohjaus, tarkkuus-cut viipaletta ihmisen maksakudosta (A; vasen sarake) ja ihmisen kasvainkudoksessa (A; oikea sarake) infektoitiin oletusarvoisesti GFP markkerigeeni koodaavat adenovirusvektori (AdV-GFP, MOI 1) tunti sen jälkeen, kun kudoksen leikkaaminen määrittää elinvoimaisuutta kudosleikkeitä viljeltiin 24-kuoppaisilla levyillä. Vain elävät solut, joilla suuria alueita ovat positiivisia GFP maker geeniekspression sekä tumorous ja ei-tuumori- ensisijainen ihmisen maksan kudoksissa tarjoavat mahdollisuuden infektion ja myöhemmän ilmentymistä viruksen koodaamia markkerigeeni (huom kudos viipaleet edustavat monen solun kerroksen kappaletta kirurgisesti resektoitiin kudosten (at valitun leikkeen paksuus on 200-300 mikrometriä laskemme noin 10-15 solukerroksissa), joten se ei ole teknisesti mahdollista tuoda kaikkiin osiin kunkin viipaleita polttopisteeseen (kuva 4B)).

tyypit kudosnäytteiden käytetään tuottaa tietoja Kuva 4: hepatosellulaarinen karsinooma (HCC), kolorektaalisyövän (CRC), haimakarsinooman (PC), ja kolangiokarsinooma (CC) (A). Esimerkkeinä, tarkkuus-cut viipaletta ihmisen maksakudosta (B, vasen sarake) ja ihmisen kasvainkudoksessa (B, oikea palsta) infektoitiin GFP markkerigeeni koodaavat adenovirusvektori (AdV-GFP, MOI 1) yhden tunnin kuluttua kudoksen leikkaaminen määrittää elinvoimaisuutta kudosleikkeitä viljeltiin 24-kuoppaisilla levyillä. Kuvat otettiin 24 tuntia infektion määrittämiseksi viruksen GFP ilmaisu, joka vain voidaan saada elintärkeitä alueilla kudosnäytteet (2,5 x /488 nm suodattimet, valkoiset pylväät rinnastaa 1000 uM).

Koska korvike merkkiaineita solutoksisuudesta, (i) määrä kudosta vapautuu LDH per mg proteiinia, (ii) ELISA-pohjainen määritys sytokeratiinia 18-pilkkominen korreloi kaspaasiaktiivisuus ja, (iii) kaspaasi aiheuttama DEVD katkaisuaktiivisuuden per mg kudosproteiiniin arvioitiin.

saadut tulokset kudoksesta viipaleet osoittivat luonteeltaan valikoiva fruktoosi-välitteisen suojautuminen TNF myös potilaasta peräisin ensisijainen maksan ja maksan kasvainten kudoksissa. Primaarisissa ei-pahanlaatuinen ihmisen maksakudosta viipaleita, vaikutus TNF-indusoidun maksatoksisuuden (i) LDH: n vapautuminen (kuvio 5A), (ii) sytokeratiini 18-katkaisun (kuvio 5B), ja (iii) DEVD pilkkominen (kuvio 5C) vastaavasti oli merkittävästi vähentynyt läsnäollessa fruktoosia lähes kaikkia näytteitä. Sen sijaan ensisijaisesti ihmisen maksan kasvainten kudosleikkeitä, kun samanlainen Esikäsittelymenettely fruktoosilla, useimmissa potilasnäytteistä ei suojaa TNF sytotoksisuutta ei havaittu, jos ei edes herkistymistä kohti TNF-indusoitu solukuolema, kuten osoittaa tasot (i) LDH: n vapautuminen (kuvio 5D), (ii) sytokeratiini- 18-pilkkominen (kuvio 5E), ja (iii) DEVD pilkkominen (Kuva 5F), tässä järjestyksessä. Tulokset on johdettu ihmisen kudoksesta sopii hyvin saadut tulokset hyödyntämällä eristetty ensisijainen hiiren hepatosyyttien

in vitro

ja hiirimallissa TNF aiheuttaman maksavaurion

in vivo

by Latta

et

al

. [9]. TNF saa syvällinen maksan apoptoosin ja maksavaurioita kvantifioidaan DEVD pilkkomalla sekä LDH ja plasman ALAT julkaisu, vastaavasti. Kuitenkin akuutti TNF-aiheuttamaa maksatoksisuutta ja maksavaurioita primaarisen eristetyn hiiren hepatosyyttien ja hiirillä, vastaavasti, oli täysin inhiboi ATP ehtyminen 50 mM fruktoosin [9].

Tissue siivuja peräisin ihmisen maksa (A- C) tai maksan tuumorikudoksissa (D-F), vastaavasti, käsiteltiin 1 ug /ml ActD yhdessä 100 ng /ml TNF: n ja 50 mM fruktoosin kuten on osoitettu. Sytotoksisuus määritettiin LDH vapautumisen määrityksellä (A /C) ja sytokeratiinia 18-pilkkominen (B /D) 24 tunnin kuluttua ja DEVD pilkkomalla kahdeksan tunnin kuluttua (C /F). Tiedot kuvataan tarkoittaa kertamuutoksia käsittelemättömään, on asetettu 1 (*: p 0,05, pariton t-testi).

Näin ollen me täällä näyttää ensimmäistä kertaa

ex vivo

, heitto- soluviljelmissä esineitä ja jyrsijä epiphenomena, että lisälääkkeenä anto fruktoosin selektiivisesti suojelee ensisijainen ihmisen maksan kudoksissa

ex vivo

. Sen sijaan ensisijainen ihmisen tuumorikudoksista johdettu maksametastaaseista ei juurikaan suojattu

ex vivo

. Kuitenkin yksittäisiä tasoja, joillakin kasvain potilaasta johdettujen kudosnäytteet, fruktoosi-lastaus ei pystytty suojelemaan hepatosyyttien. On pidettävä mielessä, että endogeeninen patologisten tilojen ja häiriöiden maksan voi muuttaa fruktoosin aineenvaihduntaa ja herkkyyttä TNF. Lisäksi kudosten luovuttajia saaneet neo-adjuvantti hoitoja voisi johtaa muutoksiin kasvaimen vastaus ennen oletetun ilmenee mikä tahansa TNF-pohjainen hoito-ohjelman.

analogisesti joukko ihmisen maksan kasvainsolujen – HepG2 ; Hep3B; Huh7 ja PCL /PRF /5- ole ATP heikentäviä vaikutuksia indusoitiin esikäsittelemällä fruktoosia (kuvio 6A) eikä fruktoosi-välitteisen suojautuminen TNF: n indusoiman apoptoosin voitaisiin saavuttaa (kuvio 6B). Vaikka herkkyyttä TNF määritettiin LDH: n vapautuminen määrityksessä oli vaihteleva joukossa hyödynnetään kasvainsolulinjojen HepG2; HepB3; Huh7 ja PLC /PRF 5, ei lieventäminen LDH: n vapautuminen läsnäollessa 50 mM fruktoosin tuotti.

Maksan kasvainsolulinjat HepG2, Hep3B, Huh7 ja PLC /PRF /5 käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla fruktoosi (A). ATP-pitoisuus määritetään sen jälkeen 30 min (A) tai vaihtelemalla ajankohtina kuten on osoitettu. Data on esitetty keskiarvona ± SEM (n = 15). Maksan tuumorisolulinjat käsiteltiin 1 ug /ml ActD yhdessä 100 ng /ml TNF: n ja 50 mM fruktoosia ilmoitettu. Sytotoksisuus määritettiin LDH vapautumisen määrityksellä 24 tunnin kuluttua (n = 15) (B). Data on esitetty keskiarvona taittaa muutoksia käsittelemätön kontrolli, on asetettu 1.

verrataan transkription tasot glykolyyttisten entsyymien HKII, AldoB, ja KHK, keskimääräinen taso HKII transkription havaittiin lisääntynyt keskimäärin 34-kertainen ihmisen maksan tuumorisolulinjoja HepG2, Hep3B, Huh7 ja PLC /PRF /5 verrattuna ei-tuumori- ensisijainen ihmisen maksan kudoksissa on normalisoitu tekijä 1. sen sijaan, entsyymit AldoB ja KHK todettiin olevan vakio tai väheni tutki tuumorisolulinjoja (keskiarvo kertamuutoksia 1 verrattuna ei-tuumori- ensisijainen ihmisen maksan kudoksissa on normalisoitu tekijä 1) kuten on kuvattu taulukossa 1. entsymaattinen laitteet kasvainsolujen on erittäin ohjeellisesti HKII ohitus kiertämisen ATP uppoavat aktiivinen maksasoluissa. Tämän vuoksi ei ATP ehtyminen näkyi läsnäollessa enintään 50 mM fruktoosia. Mielenkiintoista mistä mekanistinen näkökulmasta aikaisemmissa työssä se jo on osoitettu, että vaikutukset fruktoosin ATP ehtyminen ja TNF-induced kasvainsolun kuolema voi olla ”keinotekoisesti” käänteinen kun ensisijainen hiiren maksasoluissa, että ”luonnostaan” puutteellinen for HKII kuten PHH, oli geeni täydennetty kantava vektori hiiren HKII geenin [10]. Tutkimuksessa Speicher

et

al

. todettiin, että fysiologinen fruktoosi /ATP trap on ohitettu (kuten maksan kasvainsoluja); seurauksena, suojelu valtion ”alun perin” saavutettu maksasoluissa alle fruktoosia lastaus nyt menetettiin, toteuttamalla karkeasti herkempiä /myrkyllisyyttä maksasoluissa kohti TNF-aiheuttamaa apoptoosia [10].

Johtopäätökset

TNF muodostaa erittäin voimakas antineoplastinen lääke, joka kuitenkin toistaiseksi voida soveltaa potilaalla on ensisijainen ja toissijainen kasvaimia maksan johtuen syvän maksatoksisuuteen. Voittaa tämän esteen, kombinatorinen käyttö fruktoosi

, jota voidaan käyttää hyväksi metabolisen erot muodostavat selektiivisen suojauksen terveiden maksasolujen kohti TNF

näyttää olevan mielenkiintoinen terapeuttinen vaihtoehto. Tutkimustulosten perusteella käyttävät ainoastaan ​​ihmisen maksasoluissa ja tarkkuus leikattu viipaleita terveen ihmisen maksan kudoksissa

verrattuna

pahanlaatuinen ihmisen maksan kudoksissa, se vaikuttaa mahdolliselta, että fruktoosi aiheuttama ehtyminen ATP edustaa yleinen tapa suojella ihmisen maksan toivottuja energiariippuvainen solukuoleman aiheuttama TNF IHP-pohjainen paikallinen syövän hoidossa, jolloin herkkyys maksakasvaimien kohti sytotoksisten hoitojen säilyy.

Kiitokset

kirjoittajat ovat kiitollisia Christine Geisler, Igor Liebermann, Andrea Schenk ja Irina Smirnow erinomaisen teknistä tukea.