Krooninen sairaus

tiivistelmä

luonnontuote Embelin on osoitettu olevan monenlaisia ​​terapeuttisia ominaisuudet, kuitenkin, mekanismeja, joilla se saa aikaan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista eivät ole vielä selvillä. Seuraamalla molekyylimuutokset liittyvät alkupuolella apoptoottiset vaiheessa olemme tunnistaneet keskeistä roolia oksidatiivisen stressin aiheuttama MAP kinaasisignaloinnin kuin hallitseva mekanismi sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista. Hoito A549 keuhkosyöpään solut Embelin johti parantamiseksi fosfo-p38 ja fosfo-JNK tasoilla jo 4h. Solujen esikäsittely erityisiä p38 (PD169316) ja JNK (SP600125) kumosi Embelin aiheuttama kaspaasi-3 aktivaation. Tutkimukset työllistää Embelin läsnä tai jos erityisiä MAP estäjät osoitti, että havaitut muutokset fosforylaation tasoja p38, JNK ja ERK 1/2 yksin johtuvat Embelin ja ei siksi cross-talk välillä MAP-kinaasien. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) on keskeinen rooli Embelin indusoidut muutokset MAP-kinaasin fosforylaatiota ja apoptoosin kuten solujen esikäsittely FeTMPyP lieventää tätä vaikutusta. Havaitut muutokset eivät johdu estävästä vaikutuksesta Embelin on XIAP soluiksi käsitelty SMAC-N7-Ant peptidi, erityinen estäjä XIAP n BIR3 verkkotunnus ei jäljittele Embelin aiheuttama apoptoottisia vaikutuksia. Havainnot Tämän tutkimuksen osoittavat selvästi ratkaisevan aseman p38 ja JNK reittejä Embelin aiheuttaman apoptoosin ja antaa meille uusia johtolankoja parantaa sen terapeuttista tehoa.

Citation: Avisetti DR, Babu KS, Kalivendi SV (2014 ) aktivointi p38 /JNK Pathway vastaa Embelin aiheutti apoptoosia Lung Cancer Cells: Siirtymäkauden rooli reaktiivisia happiradikaaleja. PLoS ONE 9 (1): e87050. doi: 10,1371 /journal.pone.0087050

Editor: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 syyskuu 2013; Hyväksytty: 17 joulukuu 2013; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Avisetti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Smile hanke CSIR, Intia. Senior Research Fellowship DRA peräisin UGC, Intia, vilpittömät kiitokset. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Embelin, aktiivinen komponentti hedelmistä

embelia ribes,

on osoitettu olevan laajakirjoinen terapeuttisia ominaisuuksia, kuten syövän vastaisia, anti-tulehdus, diabeteksen, lihavuuden vastaiset, analgeettinen, anti-hedelmällisyyttä ja anti-madon [1] – [5]. Alkuperäinen löytö Embelin estäjänä XIAP nojalla sen vuorovaikutusta BIR3 domain ja sen havaittiin selektiivisyyden syöpäsolujen verrattuna normaaleihin soluihin inspiroi pohtimaan sitä lyijy yhdiste lisätutkimuksiin syöpää vastaan ​​[6]. Koska monet syövät ilmaista kohonneet XIAP ja tulla tulenkestävät apoptoosiin, hoito Embelin tai yhdessä muiden tunnettujen syöpälääkkeiden havaittiin herkistää niitä kohti apoptoosin [6], [7]. Mekanismi perustuu tutkimukset osoittavat, että Embelin inaktivoi NF-kB estämällä ydinvoiman kuljetus p65 ja myös osoittaa estävän STST3 fosforylaatiota indusoimalla ilmaus PTEN [8], [9].

Erityisiä ponnisteluja määrittää tarkkoja molekyylitasolla tavoite Embelin johti tunnistamiseen Embelin estäjänä vastaan ​​XIAP n BIR3 verkkotunnuksen [6]. Lisäksi, Embelin osoitettiin myös olevan estäjä 5-lipoxigenase ja mikrosomaalisia prostaglandiini E2-syntaasi-1 (mPGES) -1; plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1 (PAI-1) ja P300 /CBP liittyvä tekijä (PCAF) [10] – [12]. Lisäksi Embelin on osoitettu häiritsevän oksidatiivisen fosforylaation mitokondrioiden ja voi suorittaa sekä redox ja ei-redox mekanismeilla [13], [14].

Vaikka affiniteetti Embelin vastaan ​​joitakin molekyylien tavoitteiden ja solujen viestinvälitystekniikoita on tunnistettu, ensisijaisen solunsisäinen tavoite vastuussa sen anti-syöpä kiinteistö ei ole vielä selvä, koska monet aiemmista tutkimuksista on tehty myöhempinä ajankohtina, joissa signaalin siirtoon cascade tulee mutkikkaaksi ylikuuluminen välillä useita solun viestinvälitystekniikoita [8], [15], [16], [17]. Siten esillä olevassa tutkimuksessa olemme pyrkineet tunnistamaan muutoksia signalointipolkujen vastuussa syövän vastaisen omaisuutta Embelin alkupuolella apoptoottisen vaiheessa. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin ensimmäistä kertaa keskeisen aseman MAP kinaasireitin, erityisesti p38 ja JNK, vuonna Embelin aiheuttama apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Embelin oli puhdistettu hedelmistä

embelia ribes

kuten aiemmin on kuvattu [18], [19]. Minimal essential (MEM), Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos (DPBS), penisilliiniä, streptomysiiniä, Sulphordamine B (SRB), Ac-DEVD-7-AFC, Ac-LEHD-7-AFC, PD169316 , SP600125, N-asetyyli-L-kysteiini (NAC), radioimmuunisaostuspuskurissa määrityspuskurissa (RIPA) ja proteaasiestäjäseostabletit ostettiin Sigma-Aldrich, Saksa. U0126 ja FeTMPyP hankittiin Calbiochem. SMAC-N7-Ant peptidi (AVPIAQK-P-RQIKIWFQNRRMKWKK) syntetisoitiin GenPro Biotech, Noida, Intia. Anneksiini V iinianalyysikitissä ostettiin Clontech Inc., USA. Kaikki kemikaalit puskurin valmisteet ja hienokemikaalien hankittiin Sigma-Aldrich, Saksa.

Soluviljelmä ja koeolosuhteet

Kaikki solulinjat saatiin ATCC, USA. A549, DU145, MCF-7 ja WPMY-1-soluja kasvatettiin MEM (täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 yksikköä /ml streptomysiiniä), kun taas H9c2 ja MRC-5-soluja kasvatettiin DMEM: ssä (täydennetty 10 % FBS, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 yksikköä /ml streptomysiiniä). Soluja pidettiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO 2 37 ° C: ssa. Kaksitoista tuntia ennen käsittelyä, soluviljelyaine korvattiin vastaavaan väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää, ellei toisin ole ilmoitettu. Interventioon-tutkimuksia varten solut esikäsiteltiin vastaavien MAP-kinaasin estäjien tai antioksidantteja 1 tunti ennen kuin lisättiin Embelin (15 uM). Kokeissa, joissa SMAC-N7-Ant-peptidin, soluja käsiteltiin 100 uM peptidi ajaksi 8h.

Sytotoksisuusmääritys

vaikutus Embelin solujen elinkelpoisuus määritettiin Sulphordamine B ( SRB) -määrityksellä kuten aiemmin on kuvattu [20]. SRB on aminoxanthene väri, joka sitoutuu perus aminohappotähdettä solujen (kiinteä kudosviljelmälevyillä by trikloorietikkahappo) lievästi happamissa olosuhteissa [20]. Lyhyesti, soluja (24-kuoppalevyillä, ~ 80% yhtymäkohta) käsiteltiin eri pitoisuuksilla Embelin 48 h väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Päättymisen jälkeen inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin lisäämällä 30% trikloorietikkahappoa väliaineen 4 ° C: ssa 1 tunti. Myöhemmin solut pestiin deionisoidulla vedellä ja kuivattiin ilmassa. SRB (0,04%, paino /tilavuus) lisättiin soluihin ja inkuboitiin edelleen 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi solut pestiin 1% etikkahappoa (kolme kertaa) ja kuivattiin ilmassa. SRB sitoutunut soluihin solubilisoitiin 10 mM Tris-emästä, ja absorbanssi mitattiin 565 nm: ssä käyttäen EnSpire multimode levynlukijaa (Perkin Elmer).

kaspaasi 3 ja 9 Pitoisuus

päättymisen jälkeen inkuboinnin, solun kaspaasi-3 ja -9- aktiivisuudet mitattiin käyttämällä AFC konjugoidun tetrapeptidi substraatteja, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, solut pestiin jääkylmällä DPBS ja hajotettiin jääkylmässä lyysipuskuria (50 mM HEPES, pH 7,4, 5 mM CHAPS ja 5 mM DTT) [22]. Lysaatit pelletoitiin alas 12000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantit kerättiin. Jotta lysaatit yhtä suuret tilavuudet määrityspuskurissa (40 mM HEPES, pH 7,4, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT: tä, 4 mM EDTA: ta), joka sisälsi joko kaspaasi-3-alustaan ​​(Ac-DEVD-7- AFC, 40 uM) tai kaspaasi-9 substraattia (Ac-LEHD-7-AFC, 40 uM) lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Lisäys Fluoresenssilukemia johtuen vapauttaa AFC seurattiin 5 minuutin välein tiheästi Aex 400 nm ja Aem 505 nm: ssa 1 tunti käyttäen EnSpire multimode levynlukijaa (Perkin Elmer). Proteiini arviointi suoritettiin Bradfordin menetelmällä ja fluoresenssiyksiköinä normalisoituivat kokonaisproteiinista inkubaatioseokseen.

anneksiini V /FITC Analyysi Apoptosis

A549-soluja kasvatettiin coverslip in 6- kuoppalevyille käsiteltiin Embelin 4 h. Käsittelyn jälkeen peitelasit pestiin kaksi kertaa PBS: llä, jota seuraa 1 x sitomispuskurissa. Sitten solut värjättiin anneksiini-V /FITC-vasta-inkuboimalla pimeässä 30 minuutin ajan ja pestiin 1X sitoutumispuskuria poistaa sitoutumattoman vasta-aineen kohti valmistajan protokollaa (Clontech Inc., USA). Formaldehydi (2%) lisättiin solujen kiinnittämiseksi lopussa inkuboinnin. Fluoresenssia seurattiin käyttäen Olympus-IX71inverted mikroskooppi on varustettu FITC ja rodamiini asetukset.

geeniekspressioprofilointi käyttäen Microarray

A549-soluja käsiteltiin Embelin 4 h. Seuraavat käsittelyt, RNA eristettiin käyttäen Qiagen n kit kohti valmistajan ohjeiden mukaan. Pitoisuus ja puhtaus RNA uutettiin arvioitiin käyttäen Nanodrop Spektrofotometri (Thermo Scientific). Eheyden uutettu RNA analysoitiin Bioanalyzer (Agilent). RNA pidettiin hyvälaatuista perustuu 260/280 arvoihin, rRNA 28S /18S suhteet ja RNA eheyden numero (RIN). Näytteet leimattiin käyttäen Agilent pika Amp Kit. 500 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä oligo-dT-aluketta merkitty T7-promoottorin sekvenssin. cDNA Näin saatu muutettiin kaksisäikeiseksi cDNA samassa reaktiossa. Lisäksi cDNA muutettiin cRNA

in vitro

transkription vaihe käyttäen T7 RNA-polymeraasia entsyymin ja Cy3-väriaine lisättiin reaktioseokseen. cRNA saatu puhdistettu käyttämällä RNeasy saraketta (Qiagen Inc) ja pitoisuus ja väriaineen määrä sisällyttää määritettiin käyttäen Nanodrop. Spesifinen aktiivisuus on kaikkien näytteiden yli 8 pmol väriaine /ug cRNA katsottiin ihanteellinen hybridisaatioon. Leimattua cRNA (600 ng) hybridisoitiin array (Custom Whole Genome Human 8 × 60k suunnitellut Genotyyppistä Technology Private Limited AMADID: 027114) käyttämällä Gene Expression hybridisaatiokitissä Sure hybridisaatio Chambers (Agilent) 65 ° C: ssa 16 tuntia. Hybridisoitiin levyjä pestiin käyttäen Gene Expression pestä puskureita. Hybridisoituihin, pestään mikrosiru jälkeen objektilasit skannattiin microarray skannerin (G2505C, Agilent Technologies). Tiedon saamiseksi kuvien tehtiin käyttämällä Feature Extraction ohjelmisto ja kuvat kvantifioitiin (versio 10.7 Agilent). Ominaisuus uutettu raaka analysoitiin käyttäen GeneSpring GX versio 11.5 ohjelmiston Agilent. Normalisoituminen tietojen tehtiin GeneSpring GX käyttämällä 75

persentiilin shift. Merkittävät geenit ylös ja alas säädellään osoittaa kahtalaiset ja yläpuolella sisällä näytteiden suhteen ohjaamaan näytteenotto- tunnistettiin. Tilastollinen

t

-testi p-arvo laskettiin Studentin

t

-testi algoritmi. Geenejä luokiteltu perustuen toiminnallisen luokan ja väyliä käyttäen GeneSpring GX ja Genotyyppistä Biointerpreter-Biological Analysis Software. Microarray data on toimitettu GEO tietokantaan hakunumerolla GSE50545.

Solunsisäinen ROS Measurement

reaktiivisen hapen sukupolvi soluissa määritettiin karboksi-H2-DCFDA (Molecular Probes) kuten aiemmin on kuvattu [23]. Päättymisen jälkeen hoitoja, imettiin pois ja solut 12-kuoppalevyillä pestiin kahdesti DPBS: llä. Seerumittomassa elatusaineessa, joka sisälsi 10 uM karboksi-H2-DCFDA lisättiin soluihin ja inkuboitiin edelleen 37 ° C: ssa 20 min. Lopuksi solut pestiin kaksi kertaa DPBS: llä, ennen kuin lisättiin viljelyalustaan. Solunsisäistä fluoresenssia seurattiin käyttäen Olympus-IX71inverted mikroskooppi on varustettu FITC suodattimen asetus.

Western blot -analyysi

jälkeen hoitoja, solut pestiin DPBS: llä, raaputettiin hellävaraisesti ja kerättiin sentrifugoimalla lyhyen aikaa (300 g 3 min) ja suspendoidaan uudelleen 100 ul: aan RIPA sisältävät proteaasiestäjäseostabletit ja natrium-orto-vanadaattia, 10 mM (Sigma). Saatu solususpensio läpi 26 gaugen neulan 10 kertaa, joka takaa täydellisen tuhoutumisen. Lysaattia sentrifugoitiin 12000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja kirkas supernatantit kerättiin erillisiin putkiin. Koska kaikki käytetyt vasta-aineet ovat monoklonaalisia, sen sijaan, strippaus ja reprobing immunoblot täydellistä ja fosfo-spesifiset proteiinit, olemme suorittaneet immunoblottauksella erikseen, jotta vältetään tausta signaaleja. Proteiinin arvio Bradfordin menetelmällä, proteiineja (25 ug) erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja blotattiin nitroselluloosakalvolle. Blotit monoklonaalisella vasta-aineiden varalta koko ja fosfo spesifisiä vasta-aineita ERK 1/2, p38, JNK (Cell Signaling Technology); ja tubuliinia (Sigma-Aldrich). Anti-kani-Ig-G konjugoitu HRP (GE Life Sciences) ja anti-hiiri-IgG: llä konjugoituna alkaliseen fosfataasiin (Sigma-Aldrich) käytettiin sekundäärisenä vasta-aineiden MAP-kinaasin ja tubuliinin vasta-aineiden osalta. Bändit kehitettiin käyttämällä ECL Prime Western blotting reagenssia (GE, Life Sciences) tai BCIP /NBT reagenssi tubuliinin (Sigma-Aldrich) ja kaistaintensiteettejä laskettiin GeneTools ohjelmistoa (Syngene- geeli dokumentaatiojärjestelmän).

Statistical analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin

t

-testi Sigmaplot ohjelmistoa.

Tulokset

Embelin Näytteillä Tehostettu Sytotoksisuus syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin

antiproliferatiivista toimintaa Embelin verrattiin SRB määritys valittu syöpä ja normaali solulinjoissa (Fig. 1). Solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia Embelin (2,5, 5, 10 ja 25 uM) 48 tunnin ajan. Niistä syöpäsoluja, Embelin havaittiin olevan myrkyllisiä A549-solujen IC

50-arvo 4,4 uM, jota seuraa DU145 ja MCF7 kanssa 6,31 ja 10,66 uM. Kuitenkin havaittiin IC

50-arvot olivat suhteellisesti vähemmän kuin normaali solulinjat nimittäin., MRC5, WPMY-1 ja H9c2, jotka osoittivat IC

50-arvo oli 24,4, 10,9 ja 23,4 uM. Ero havaitun IC

50-arvot keuhkosyövän ja normaalien solujen (4,44 ± 0,76 ja 24,44 ± 5,32 uM) näytti olevan merkittävä. Koska A549-solut osoittivat parannettu herkkyyttä Embelin, kaikki lisätutkimuksia on tehty käyttäen tätä solulinjaa ymmärtämiseksi vaikutustapa Embelin saada uusia oivalluksia valikoivasti tavoite keuhkosyövän soluja verrattuna niiden normaalin solun vastine. Näin ollen, jotta voidaan tunnistaa varhaisessa apoptoottiset vaiheessa, olemme analysoineet ajasta riippuva vaikutus Embelin solu- kaspaasi-3 aktiivisuutta A549-solut (Fig. 2A). Embelin (15 uM) indusoi lähes 2-kertainen nousu kaspaasi-3-aktiivisuus jo 4h ajan, mikä lisäisi Jopa 6-kertaisesti 8h (Fig. 2A). Anneksiini-V /FITC solujen värjäys käsiteltiin Embelin (4h) osoittaa selvästi varhaisessa apoptoottisten vaiheessa soluja kuin ne värjättiin ainoastaan ​​anneksiini-V, mutta ei propidiumjodidilla (Fig. 2B). Kuitenkin myöhempinä ajankohtina eli, 18 ja 24, kaspaasi-3 toimintaa laski lähes 4 ja 2-kertaiseksi osoittaa, että apoptoottisten solujen voi olla täysin kuollut loppuun mennessä 18 tai 24 tai siinä voi myös olla mahdollisuus useiden solukuoleman mekanismeja johtuen ylikuulumista eri signalointimekanismeja.

(A) rakenne Embelin (B) Soluja käsiteltiin Embelin 48 tuntia ja lopettamisen jälkeen inkuboinnin solujen elinkelpoisuus mitattiin Sulphordamine B määritys ja IC

50-arvot laskettiin kuten edellä kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. * Osoittaa p 0.01as verrattuna kontrolleihin.

(A) A549-soluja käsiteltiin 15 uM Embelin eri aikavälein. Päättymisen jälkeen hoitoja, kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. (B) A549-soluja käsiteltiin 15 uM Embelin: ssa 4 tuntia ja värjättiin anneksiini-V /FITC ja propidiumjodidilla, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” osiossa. Fluoresenssi kuvat otettiin käyttäen Olympus-IX71 käänteinen fluoresenssimikroskooppiin varustettu FITC ja rodamiini asetukset. Kuvat ovat kolmesta eri näkökenttää näkyvät. (C) Soluja käsiteltiin XIAP estäjä, SMAC-N7-Ant-peptidi (100 uM) ja 8h. Myöhemmin, kaspaasi-3 ja -9- toiminta mitattiin käyttäen tetra-peptidisubstraateilla kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Sekä (A) ja (C) esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. ** Osoittaa p 0,01 ja * osoittaa p 0,05 verrattuna kontrolleihin.

Kuten Embelin tiedetään estävän XIAP sitoutumalla BIR3 domain samanlainen kuin SMAC, tutkimme seuraavaksi, onko Havaittu vaikutus vuoden Embelin solu- apoptoosin voi osoittaa solun läpäisevä SMAC-N7-Ant peptidi (koostuu kypsän SMAC: n aminopään 7 aminohapon peptidi – AVPIAQK sitoutuneena Ant peptidi -RQIKIWFQNRRMKWKK, solujen läpäisevyys jonka proliini linkkeri), joka on tiedetään spesifisesti vuorovaikutuksessa BIR3 domeenin XIAP [24], [25]. Tulokset osoittavat, että hoito A549-solujen SMAC-N7-Ant-peptidi (100 uM 8h) lisääntynyt solun kaspaasi-9 -aktiivisuuden lähes kaksinkertaiseksi suhteen käsittelemätön kontrolli, mutta ei merkittävästi kasva kaspaasi-3-aktiivisuus havaittiin ( kuva 2C). Vaikka havaitut vaikutukset SMAC-N7-Ant peptidi ovat sopusoinnussa aiemman raportin [24], ettei kaspaasi-3 aktivaatio SMAC-N7-Ant peptidi, mutta ei Embelin, sai meidät tutkimaan vastuussa polkuja välittävien Embelin aiheuttama apoptoosin saamassa uusia oivalluksia sen vaikutusmekanismi.

muutos geeniekspressioprofiili tekijänä Embelin

jotta voitaisiin tunnistaa polkuja vastuussa Embelin aiheuttaman apoptoosin, olemme analysoineet muuttuneen geeniekspressioprofiili A549-soluissa käsitelty Embelin (15 uM 4 h). Kaikkiaan 215 voimistunut ja 80 vaimentua geenejä tunnistettiin joka osoitti vähintään kaksinkertaiseksi ero yli säätimet merkitys p 0,05.

luokittelu näiden geenien perustuvan toiminnallisen luokan ja väyliä käyttäen GeneSpring GX ja Genotyyppistä Biointerpreter-Biologinen analyysi ohjelmisto osoitti, että voimistunut geenit aikuinen kuuluvat viiteen eri reittejä (vähintään 4 muuttunut geenejä kussakin reitti) ja joukko geenejä muuttunut ovat luokkaa Wnt (4 geenit) Focal tartunta (5 geenit ) p53 (8 geenit) sytokiini-sytokiinin reseptoreiden (11-geenien) MAP-kinaasireitin (16 geenit) (Fig. 3 A-C). Joukossa vaimentua geenejä ainakin kolme geeniä jokaiseen koulutusjakson jolla 2-kertainen muutos joiden merkitys p 0,05 kuului sytokiini-sytokiinireseptorille ja MAP kinaasireitin (Fig. 3A ja B).

A549 soluja käsiteltiin Embelin (15 uM) 4 h. Microarray-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Geenit, jotka osoittivat ero sääntelyä vähintään 2-kertaisesti p 0,05 luokiteltiin perustuen toiminnallisen luokan ja väyliä käyttäen GeneSpring GX ja Genotyyppistä Biointerpreter-Biological Analysis Software. Polkuja, jotka pääasiassa osoitti ero ilmentyminen oli (A) MAP-kinaasin reitti, (B) Sytokiini-sytokiini- reseptorin vuorovaikutus ja (C) p53-reitin. Tiedot on toimitettu GEO tietokantaan hakunumerolla GSE50545.

Yhdellä silmäyksellä, saadut tulokset osoittavat, että joukossa muuttuneen polkuja, MAP-kinaasi-signalointireitin näyttää olevan hallitseva ja vaikutti merkittävästi lähes 16 muuttunut geenejä ja monet geenit ovat joko ylävirtaan tai alavirtaan p38 /JNK /ERK-reitin kuten p53 tai sääntelyviranomaisille näiden reitin (Fig. 3A). Vuodesta toiminnallinen näkökulmasta, fosforylaatiota tila tunnistetuista proteiineista (kuten DUSPs, GADD45A /B, p53 jne), mutta ei pelkästään niiden transkriptipitoisuuksissa sanella solujen kohtalon. Kuitenkin saadut tulokset osoittivat merkittävä rooli MAP kinaasisignaloinnin ja inspiroi meitä keskittymään osallistumista MAP-kinaasin väylän Embelin aiheuttamaa apoptoosia.

Embelin aiheuttama aktivointi p38 ja JNK Pathway

perustuu alkuperäiseen vihjeitä saatu mikrosirun tutkimuksia mahdollista roolia MAP-kinaasin väylän Embelin aiheuttaman apoptoosin, pyrimme tutkimaan edelleen osallistumisesta MAPK signalointi ja seurataan Embelin indusoidut muutokset fosforylaation tilan ERK, p38 ja JNK proteiineja ( kuva 4). Tulokset, kuten on esitetty kuviossa-3 osoittavat, että Embelin (15 uM) indusoitua fosforylaatiota p38 lähes 2,5 ja 3-kertaisesti 4 ja 8h vastaavasti. Fosfo-JNK 1/2 tasot lisääntyivät myös 1,2 ja 1,9 kertaiseksi vuoteen 8h. Kuitenkin samoissa käsittelyolosuhteissa oli merkittävä väheneminen fosforylaatiota aseman ERK 1/2 (p42 ja p44), ja arvot todettiin olevan 0,3 ja 0,2 kertaa vähemmän kuin valvonta (Fig. 4A ja B). Jotta ymmärtäisimme, onko muutoksia fosforylaatiotilaa näiden MAP kinaasiproteiinien on mitään merkitystä havaittu apoptoosin, olemme esikäsitellään solujen 1h yksilöllisesti erityisiä estäjiä p38 (PD169316), JNK (SP600125) ja MEK (U0126) at 5 uM seurasi Embelin (15 uM) 4 h. Embelin aiheuttama kaspaasi-3-aktiivisuus estyi merkittävästi sekä p38 ja JNK: n estäjät lähes kontrolliarvoihin (Fig. 4C). Kuitenkin samoissa koeolosuhteissa MEK-estäjä (U0126) eivät osoittaneet mitään suojaava vaikutus Embelin indusoitua apoptoosia ja mitään merkittävää kasvua kaspaasi-3-aktiivisuus havaittiin soluissa, joita käsiteltiin inhibiittoreilla yksin (Fig. 4C). Havaitut muutokset osoittavat selvästi, että muutokset fosforylaation tilan sekä p38 ja JNK näyttää olevan ratkaiseva Embelin aiheuttamaa apoptoosia.

(A) A549-soluja käsiteltiin 15 uM Embelin 4 ja 8h. Yhteensä sekä fosforyloitu ERK 1/2, p38, JNK 1/2 ja tubuliinia (latauskontrollina) tasot mitattiin Western blot kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. (B) Normalized arvot juovien voimakkuudet saadaan densitometrinen analyysi tietojen (A). (C) kaspaasi-3: n aktiivisuuden soluissa esikäsitellyt kanssa tai ilman U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 uM) 1 tunti ja sen jälkeen Embelin (15 uM) 4 h. Ohjaus arvot normalisoidaan 1 ja tulokset osoittivat, ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. * Osoittaa p 0,05 verrattuna ohjaus ja # ilmaisee p 0,05 verrattuna Embelin käsiteltyihin soluihin.

Sen määrittämiseksi, onko havaittu muutoksia MAPK fosforylaatiota ovat takia Embelin hoito yksinään tai johtuen sääntelyn vaikutus yhden MAP-kinaasin yli muiden MAPK: n, olemme käsitelty solut yksitellen Embelin (15 uM) läsnä ollessa ja puuttuessa MEK estäjän (U0126, 5 uM) tai p38-estäjän (PD169316, 5 uM) tai JNK estäjä (SP600125, 5 uM) 4h ja analysoitiin fosforylaation tasoja kaikkien kolmen MAP-kinaasien (Fig. 5). MEK estäjä U0126 estää sen loppupään tavoite ERK. p38-estäjän, PD169316 ja JNK-inhibiittori, SP600125 estävät spesifisesti p38 ja JNK: n aktiivisuutta vastaavasti kilpailukykyisesti sitoutumalla ATP: n sitoutuminen taskut estää proteiinien fosforylaatio alavirtaan, mutta ei sinänsä aiheuta vähentynyt fosforylaatio tasot joko p38 tai JNK [26 ], [27]. Tulokset osoittavat, että solujen käsittely MEK estäjän (U0126) esti fosfo-ERK 1/2, mutta ei muuttanut tasoa Embelin aiheuttama fosfo-p38 ja fosfo-JNK tasolle. Vastaavasti solujen käsittely p38-estäjän (PD169316) ei vaikuttanut tasoa fosfo-JNK ja fosfo-ERK aiheuttama Embelin. Lisäksi solujen käsittely JNK-inhibiittori (SP600125) ei vaikuttanut tasoa fosfo-p38 ja fosfo-ERK: n läsnä tai poissa ollessa Embelin (Fig. 5). Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että havaitut muutokset fosforylaation tasoja p38, JNK: n ja ERK näyttää suoraan välittämä Embelin hoitoon, mutta ei johdu välistä ylikuulumista MAP-kinaasien.

A549-soluja esi hoidetun tai ilman U0126 (5 uM), PD169316 (5 uM), SP600125 (5 uM) 1 h sen jälkeen Embelin (15 uM) 4 h. Yhteensä ja fosforyloituu tasoja ERK 1/2, p38, JNK 1/2 ja tubuliinia (latauskontrollina) havaittiin Western blottauksella, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa.

ROS välittää MAP Kinase asetuksen Embelin

MAPK proteiinien tiedetään säätelevän oksidatiivisen stressin [28]. Lisäksi bentsokinoni rakenne Embelin on osoitettu muodostaa semikinonin radikaalin redox mekanismi, joka lopulta johtaa reaktiivisten happiradikaalien sukupolven [13], [29]. Nämä havainnot viittaavat siihen merkittävä rooli ROS Embelin aiheuttamaa apoptoosia. Arvioida pro-hapetin ominaisuudet Embelin, tutkittiin sen vaikutuksia sukupolven oksidatiivista stressiä A549-soluja. Solunsisäinen ROS syntyy Embelin havaittiin parannus solunsisäisessä fluoresenssi DCF (Fig. 6). Embelin (15 uM) indusoi ROS sukupolven ajan riippuvaisella tavalla lähes 5 ja 10-kertainen kasvu yli käsittelemättömiin kontrolleihin loppuun 2 ja 4 h vastaavasti (Fig. 6). Solujen esikäsittely antioksidantin, FeTMPyP (10 uM) tai N-asetyyli-L-kysteiini (NAC) (10 mM) esti merkittävästi Embelin aiheuttama DCF värjäys kuin valvonta-arvot (Fig. 6).

(A) A549-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman FeTMPyP (10 uM) tai NAC (10 mM) 1 h ja sen jälkeen Embelin (15 uM) 4 h ja ROS: n syntyminen havaittiin DCF-värjäyksellä, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” osiossa. Cellular fluoresenssi oli kaapattu käyttäen Olympus-IX71 käänteinen fluoresenssimikroskooppiin varustettu FITC asetukset. (B) keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti kolmesta näkökenttien eroihin saatiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa. * Osoittaa p 0,05 verrattuna ohjaus ja # ilmaisee p 0,05 verrattuna Embelin käsiteltyihin soluihin.

arvioitava tarkemmin vaikutusta Embelin aiheuttamaa ROS on MAPK signalointi läsnä ja poissa ollessa antioksidantti, FeTMPyP (Fig. 7). Tulokset osoittavat, että Embelin indusoitu ROS on vastuussa havaitusta muutoksia fosfo-proteiinin tasoja p38, JNK: n ja ERK 1/2 kuten solujen esikäsittely FeTMPyP poistetuiksi, tämä vaikutus (Fig. 7A). Mukaisesti edellä olevista tuloksista, solujen esikäsittely FeTMPyP (10 uM) esti myös apoptoottisen vaikutusten Embelin osoittaa, että muutetut MAP-kinaasin signaloinnin vuoksi parannettu ROS: lla on keskeinen rooli Embelin indusoiman apoptoosin (Fig. 7B).

A549-soluja esikäsiteltiin tai ilman antioksidanttia FeTMPyP (10 uM) 1 tunti ja sen jälkeen Embelin (15 uM) hoito 4h. (A) Cellular veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun ERK 1/2, p38, JNK 1/2 ja tubuliinin havaittiin Western blot seurasi kemiluminesenssidetektiolla kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. (B) Samanlaisissa koeolosuhteissa kuin (A), solu kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. * Osoittaa p 0,01 verrattuna kontrolliin ja # osoittaa p 0,05 verrattuna Embelin käsiteltyihin soluihin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa raportoimme että oksidatiivisen stressin aiheuttama MAPK signaloinnin tärkeä rooli Embelin aiheuttamaa apoptoosia. Analyysi geeniekspressioprofilointi microarray tutkimukset osoittivat mahdollista osallistumista MAP kinaasireitin A549-soluissa käsitelty Embelin 4 h. Solujen esikäsittely spesifisiä inhibiittoreita joko p38 tai JNK esti merkittävästi Embelin indusoiman kaspaasi-3-aktivaation sekä poistetuiksi Embelin-indusoidut muutokset fosforylaation tasoja p38, JNK: n ja ERK 1/2 MAP-kinaasien. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) näyttää keskeinen rooli välillä Embelin ja MAP-kinaasin kautta. Kaikki havaitut vaikutukset Embelin eivät johdu inhibitiosta XIAP, koska solujen käsittely solun läpäisevä SMAC-N7-Ant-peptidi, joka sitoutuu BIR3 verkkotunnuksen XIAP ei vaikuttanut solujen kaspaasi-3-aktivaation.

luonnollinen tuote, Embelin, on kiinnitetty enemmän huomiota viime aikoina sen syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Vielä tärkeämpää on, että on osoitettu, on enemmän selektiivisyyttä syöpäsolujen verrattuna normaaleihin soluihin (6). Jopa Tässä työssä havaitsimme samanlaista suuntausta ja huomattava ero IC

50-arvot Embelin näkyi välillä keuhkosyövän ja normaali solulinjoissa (Fig. 1). Vaikka Embelin tunnistettiin alun perin olevan estäjä XIAP avulla sen vuorovaikutus BIR3 domain, sen jälkeen tehdyt tutkimukset osoittivat suoraa

in vitro

vaikutuksia Embelin on oksidatiivisen fosforylaation mitokondrioita, estämällä 5-lipoksigenaasin (5 -Lo) ja mikrosomaalinen prostaglandiini E2-syntaasi-1 (mPGES) -1 ja inaktivaation plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1 (PAI-1) [10], [11]. Kuitenkin tunnistaminen ensisijainen solunsisäisen tavoite, joka on vastuussa syövän vastaisen omaisuutta Embelin voisi lopulta auttaa rakenteellisen tarkentaminen Embelin parantaa sen tehokkuuden ja selektiivisyyden.

Viime aikoina useat tutkimukset ovat tehty ymmärtää toimintatapa Embelin, ja se on osoitettu olevan rooli inaktivoimiseksi NF-kB, inhibitio STAT3 signaloinnin kautta proteiinityrosiinifosfataasi PTEN, lysosomaalisen epävakautta ja AKT ja mTOR polkuja [8], [9], [15] , [30], [31]. Kuitenkin onko kaikki havaitut vaikutukset ovat riippuvaisia ​​vai riippumattomia toisistaan ​​ei ole vielä selvä, koska monet kokeissa tehtiin kiinteällä kesto joko 24 tai 48 h [8], [10], [16], [17 ].

tiedot mikrosirun tutkimusten aikana alkuvaiheissa Embelin aiheuttaman apoptoosin ohjasivat muutoksia asetukseen transkriptiotekijöiden alavirtaan MAPK proteiineja (Fig. 3). Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet näkyvä rooli MAP kinaasireitin, (kohonnut fosfo-p38 ja fosfo-JNK) in Embelin aiheuttama apoptoosin.