Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

DNA: n metylaation poikkeamia ja microRNA (miRNA) vapauttaminen on havaittu monenlaisia ​​syöpiä. Systemaattinen tutkimus methylome ja transcriptome virtsarakon urothelial karsinooma ei ole koskaan raportoitu.

Menetelmät /Principal Havainnot

DNA: n metylaatio profiloitiin muunnellulla metylaatiospesifistä digitaalinen karyotyping (MMSDK) ja ilmaisu mRNA ja miRNA analysoitiin digitaalisen geenien ilmentyminen (DGE) sekvensointi kasvaimissa ja vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten saatu 9 virtsarakon urothelial karsinooma potilaille. Huomasimme, että joukko on täydennettävä reittejä häirinnyt virtsarakon urothelial karsinooma liittyy pääasiassa ”neurogenesis” ja ”solujen erilaistumista” integroitujen analyysi -omics tietoja. Lisäksi tunnistimme kiehtova kokoelma syöpään liittyvien geenien, jotka vapautettiin tasoilla DNA: n metylaation ja mRNA: n ilmentymisen, ja validoitu useita näistä geeneistä (HIC1, SLIT2, RASAL1, ja KRT17), jonka bisulfiittimodifiointi Sekvensointi PCR: llä ja Käänteinen transkriptio qPCR paneelissa 33 virtsarakon syöpä näytteitä.

Johtopäätökset /merkitys

ominaista profiilit välillä methylome ja transcriptome virtsarakon urothelial karsinooma, määritetty joukko merkittävästi rikastettu keskeisten polkuja, ja seulotaan neljä poikkeavasti metyloitu ja ilmaisi geenejä. Lopullisesti, meidän havainnot valottaa uusi väylä perustutkimuksen virtsarakon syövän tutkimukseen.

Citation: Zhu J, Jiang Z, Gao F, Hu X, Zhou L, Chen J, et al. (2011) järjestelmällinen analyysi DNA Metylointi ja Expression of Both mRNA ja microRNA in virtsarakon syövän. PLoS ONE 6 (11): e28223. doi: 10,1371 /journal.pone.0028223

Editor: Amr H. Sawalha, University of Oklahoma ja Oklahoma Medical Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 03 marraskuu 2011; Julkaistu: 30 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiina (863 Program, 2009AA022707 ja XZ), Promotion ohjelma Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kiina (CXB200903090055A ja CXB201005250016A sen ZC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska geneettisiä ja epigeneettiset poikkeavuuksia on havaittu kehittämisessä syöpäsolujen [1], se on teorian, että he molemmat tärkeä rooli syövän synnyssä, asiakkuutta muutoksia geenien aktiivisuuden ja kromosomi rakenne [2]. Perustutkimus paljastaa mekanismeja syövän on erittäin tärkeää diagnoosin, hoidon ja ennusteen syöpien klinikalla. Poikkeavuus DNA metylaatio syövän voi esiintyä globaali hypometylaatio tai lokuksen erityisiä hypermetylaation in CpG-saarekkeen-rikas promoottorit [3]. DNA hypometylaatio in syöpäsolu uskotaan johtavan kromosomin epävakautta ja onkogeeni aktivointi [4]. Toisaalta, poikkeava promoottori metylaatio tai hypermetylaatiota CpG-saarekkeiden liittyvien geenien liittyy vahvasti transkription hiljentämisen näiden geenien [5]. Lisäksi DNA: n metylaatio, vapautettiin miRNA syöpä voi vaikuttaa geenien ilmentymistä ja polkuja, jotka ovat osallisina syövän synnyssä koko matkan aloittamista etäpesäkkeiden. Jotkut miRNA toimivat oletetun tuumorisuppressoreilla ja muut toimivat onkogeenien [6].

Virtsarakon syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa. Vuonna 2008 arviolta 386300 uutta tapausta diagnosoitiin, ja 150200 ihmistä kuoli virtsarakon syöpään [7]. Urothelial virtsarakko-, yleisin histologinen tyyppi virtsarakon syövän, muodostaa yli 90% pahanlaatuinen tapauksissa virtsarakon syöpä [8]. DNA hypometylaatio on yleinen ilmiö virtsarakon syövän [9], [10]. Samaan aikaan, välinen suhde DNA: n metylaation ja virtsarakon syöpä on pääasiassa tutkittu osalta promoottorin hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille. Sopimaton hiljentäminen Näiden geenien promoottori hypermetylaation vaikuttaa syövän aloittamista, etenemistä, invaasio, ja etäpesäkkeiden [11], [12], [13]. Useat tutkimukset ovat tutkineet sekä pieniä että suuria paneeleja DNA: n metylaation tapahtumien virtsarakon syövän käyttäen array-pohjaiset teknologiat [9], [10], [14]. Kuitenkin genominlaajuisten tunnistus tutkimuksia saada korkean resoluution metylaatio tietojen virtsarakon syöpä ovat harvinaisia. Kasvain-vaimennin ja onkogeenisen toiminnot miRNA on havaittu virtsarakon syövän sekä [15], [16], [17]. Useat miRNA profiloinnit by mikrosiruja virtsarakon syöpä on myös tehty, mutta mitään johdonmukaista johtopäätöksiä voida aina vetää niiden tuloksista [18], [19], [20].

Perustuen edellä havaintojen me arveltu että systemaattinen analyysi profiilit DNA metylaatio ja geenien molempien mRNA ja microRNA virtsarakon syövän auttaisi tunnistamaan keskeiset muutokset virtsarakon syöpään. Siten toteutimme genominlaajuisia metylointianalyysi vuonna Hyväksytty kasvain ja normaali viereisten kudosten 9 virtsarakon urothelial karsinooma käyttävillä potilailla modifioitu metylaatiospesifistä digitaalinen karyotyping (MMSDK) yhdistettynä mRNA ja miRNA ilmaisun data (yhdistettynä tuloksiin edellisessä tutkimuksia mRNA [21] ja miRNA [22] virtsarakon syöpä), joka saatiin tag sekvensointi käyttämällä toisen sukupolven sekvensointi teknologia.

tulokset

katsaus methylome ja transcriptome virtsarakon urothelial carcinoma

DNA: n metylaatio, keskimäärin 4.445.972 ja 4.525.269 ainutlaatuisesti kartoitettu tunnisteita, jotka olivat 17 ja 18 nt saatiin 9 eri virtsarakon urothelial karsinoomat ja niiden vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten, vastaavasti. Geenien ilmentyminen, DGE kirjastot tuotetaan 3307536 ja 3136370 laadukkaita tageja kasvain ja normaaleissa kudoksissa, vastaavasti. Ei-koodaavat pieniä RNA (sRNAs) sekvensoinnin, yhteensä 14787388 ja 12754928 laadukkaita lukee saatiin kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, vastaavasti. Yhteensä 16236 geenien ja 543 miRNA havaittiin ilmaistaan ​​ainakin yhden kasvaimeen tai viereisistä normaaleista kudosnäytteistä.

saamiseksi yleiskuvan Erot DNA-metylaation osalta geenin ilmentymisen profiilit virtsarakon urothelial karsinoomien ja niiden vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten, log2-transformoitu, keskiarvo-kertainen muutosten välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa kolmen tyyppisiä tageja piirrettiin koko genomin (kuva 1A). Tällä kynnyksellä | log2Ratio | ≥1, havaitsimme joitakin eroja tunnisteet edustavat metylaatiostatus tiettyinä

MluI

genomista loci ja mRNA: n ilmentymisen tasoa välillä syövän kudosten ja normaalit kontrollit, Lisäksi maailmanlaajuinen ylös -regulation of miRNA virtsarakon syöpään havaittiin.

. Genome leveä DNA: n metylaatio, mRNA, ja miRNA profiileja virtsarakon syöpään kudoksista ja vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten. Log2-transformoidut keskimääräinen kertaiseksi muutoksia (kasvain /normaali) metylaation tila (punainen), mRNA ilmentymistaso (vihreä), ja miRNA ekspressiotaso (sininen) kaikista potilaista tehtiin koko genomin. Y-akseli edustaa log2 suhde, ja katkoviivat edustavat merkitys kynnys (| log2Ratio | = 1). B. jakelu metylaatiotasot erityyppisissä aiheuttavaa alueiden välillä virtsarakon syövän kudosten ja vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten. Rasia tontteja jakeluun DNA metylaatiotasoilla perustuu log2-transformoidut tag kertainen muutos (kasvain /normaali) alkaen MMSDK kaikilla potilailla tehtiin. Tyyppejä ovat CpG-rikas promoottorit, CpG-köyhä promoottorit, eksonit ja intronit.

tutkia edelleen metylaatiostatuksen eri genomialuetta, vertasimme metylaatio profiileja promoottorien kanssa tai ilman CpG-saarekkeiden ( CGI), eksonit ja intronit virtsarakon urothelial syöpä kudoksia ja vastaaviin normaaleihin viereisiin kudoksiin. Vastaava taso yleistä DNA: n metylaation tutkituissa genomialuetta jaettiin kahden kudosten (kuvio 1 B, P 0,05, Wilcoxonin-sum test).

tunnistaminen erilaisten loci DNA metylaatio ja ilmennetty eri geenit

lisätutkimuksia DNA metylaatiostatus tiettyinä genomialuetta, genomisen loci jotka vastaavat

MluI

tunnustamista sivustoja liittyivät geenejä mukaan niiden suhteellinen asema ihmisen genomissa. Jopa 9034 yksittäisiä genomista lokusten 5656 ainutlaatuisia geenejä tunnistettiin perustuen UCSC Genome Browser. Havaitsimme myös 299 yksittäisiä loci, jotka vastaavat 274 geenejä, jotka osoittavat selvästi erilaisen DNA: n metylaatio tason välillä kasvainten ja hallintalaitteet (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (taulukko S1). On merkittävästi erilainen loci, 36 loci oli hypermetyloitunut ja 263 loci oli hypometyloidut kasvain kudosnäytteitä verrattuna vastaaviin normaaleihin viereisen kudosnäytteistä. BSP validointi vahvisti 16 satunnaisesti valittua

MluI

genomista loci että luonnehdittiin joilla on eri metylaatiotasoilla joiden keskimääräinen onnistumisprosentti 93,8% (kuvio 2A).

. Validointi tulokset MMSDK BSP. Vertaamaan BSP-Sangerin sekvensoinnilla data ja syvä sekvensointi MMSDK tiedot,

MluI

loci, joiden on määritelty differentiaalisesti metyloiduksi keskimäärin syvä sekvensointi validoitiin käyttäen BSP. Korkeus sarakkeiden edustaa log2-transformoitiin keskimääräinen kertainen muutos (kasvain /normaalista) metylaation tason yli 9 potilaalla. B. BSP ja RT-qPCR tulokset neljän syöpään liittyvien geenien tutkittu 33 virtsarakon syöpäpotilailla. Metylaatiotasot promoottorien neljästä valittujen geenien (SLIT2, HIC1, RASRAl1, KRT17) ja niiden ilmentymistaso arvioitiin paneeli 33 näytettä. Korkeus sarakkeet edustaa log2 keskimääräinen kertainen muutos (kasvain /normaalista) metylaatio tasolla (sininen) tai ilmentymistaso (punainen) kaikissa potilaille. Palkit edustavat keskivirheen. Näytteiden määrä (n) käytetty validointi määrityksessä osoitetaan vierekkäin keskivirheen bar.

Between virtsarakon syöpä kudoksiin ja vastaavan tavanomaista valvontaa, 2975 koodaavat geenit havaittiin kuten differentiaalisesti ilmaisi myös 1560 asti -regulated geenit ja 1415 alas geenien, ja 196 miRNA oli ilmennetty eri lukien 156 säädelty ja 40 alassäädetty miRNA (| log2Ratio | ≥1, FDR P-value≤0.05) (taulukko S2 ja taulukko S3, osa mRNA ja miRNA paketti tuli meidän aikaisemmat tutkimukset mRNA [21] ja miRNA [22] virtsarakon syöpä). Mukaan kohdistaa ennustus, 56 pois 196 ilmentyvät eri miRNA ennustettiin kohdistaa 285 eri mRNA: t (taulukko S4). Kuten taulukossa 1 on esitetty, useita liuenneen aineen kantaja-perheen jäseniä (SLC) olivat johdonmukaisesti alle ilmaistu suurin virtsarakon syövän kasvainten tarkastellaan, mukaan lukien helpottaa glukoosin kuljettajaa (SLC2A4), mitokondrio kantaja (SLC25A25), natrium /kalsium lämmönvaihdin ( SLC8A1), sinkki kuljettimen (SLC39A14), kationista aminohappojen kuljettajaa (SLC7A2), suuri neutraalin aminohappojen kuljettajan (SLC43A1), ja monokarboksyylihapon kuljettimen (SLC16A1). Lisäksi olemme huomanneet, että kaksi natrium-selektiivinen ei-jänniteherkkiin epiteelin natriumkanava- (ENaC) geenit (SCNN1B ja SCNN1G) mukana säädettäessä solujen sisäisiä natriumia homeostaasin olivat merkittävästi säädelty tutkimuksessamme [23], [24]. Hepatosyyttikasvutekijän reseptorin (HGFR-), joka tunnetaan myös MET, oli myös voimakkaasti säädelty kaikissa kasvaimet tutkittiin tutkimuksessamme samoin. Yhdenmukainen äskettäin julkaistujen tutkimusten, miR-182, miR-183, miR-10a, miR-203, ja miR-224 olivat kaikki merkitsevästi säädellään ylöspäin kasvaimia, kun taas miR-1, miR-143, miR-145 olivat merkitsevästi alassäädetty kasvainkudoksessa [25]. Lisäksi tyypillinen alas-säätely miR-133a, miR-133b ja miR-125b havaittiin tutkimuksessamme myös havaittu aiemmin [26]. Merkillistä, tuumorisuppressorit miR-1 ja miR-133a olivat molemmat merkittävästi alle ilmaistuna tutkimuksessamme, jolloin aktivointi ennustetun kohdegeenin transgelin 2 (TAGLN2), joka on tunnistettu mahdolliseksi onkogeenin. Tämä tulos on yhtäpitävä nykyisten tietoa geenien ilmentymisen muutoksia virtsarakon syöpä [16].

Me tehdään integroitu analyysi valittujen geenien välillä DNA metylaatio ja geenien ilmentymisen. Kaikkiaan 4772 geenejä sekä DNA: n metylaation datan ja geenien ilmentyminen tietojen tunnistettiin. Kuten on esitetty täydentävien taulukossa S5 tunnistimme 82 samanaikaisesti differentiaalisesti metyloidut ja ilmaisi geenien täyttävät seuraavat ehdot: | log2Ratio | ≥1 oikaistuna P-value≤0.05, sekä DNA: n metylaation ja geenien ilmentyminen tietoja. Useat tunnetut syöpään liittyvien geenien (mukaan lukien ADAMTS9, CCND1, HIC1, jne.) Osoittivat johdonmukaisesti häiritsi metylaation ja ilmaisun tilat useimmissa virtsarakon uroteelin syövän näytteitä.

Gene ontologian (GO) ja Kegg reitin rikastamiseen analyysi

Jos haluat luoda käsityksen näkymä reitin häiriön taustalla virtsarakon syöpä, suoritimme GO ja Kegg polku analyysi geenien sarjoista, jotka eri tavoin metyloituja sivustoja, ilmentyvät eri geenit tunnistettiin mRNA jaksotuksesta ja kohdegeenien vapautetuilla miRNA.

kaikista geenit sisältävän poikkeavia DNA: n metylaatio loci, GO analyysi ”biologinen käsittely” ja ”molekyyli toiminto” osoitti merkittävää rikastumista 19 ja 13 GO termejä, tässä järjestyksessä, käyttäen FDR P-arvo cutoff 0,05. Merkittävin rikastettua GO termejä ”biologinen prosessi” olivat ”hermosolu kehittämistä”, mikä viittaa siihen, kriittinen rooli ero metylaatio neurogenesis. Vastaavasti vain ”aksoniohjauksen” koulutusjakso on merkittävästi rikastettu (FDR P-arvo: 3.29E-13) kautta Kegg reitin analyysi, joka heijastaa yhteensopivuutta GO analyysitulos. Tämä tulos viittaa tärkeä mekanismi epigeneettiset poikkeavuudesta hermosolu geenien rooli virtsarakon syöpä, kuten syöpään liittyvien axonogenesis ja neurogenesis on havaittu eturauhassyöpä [27]. Loput rikastettu GO termejä ”molekyyli toiminnon” analyysi liittyivät ensisijaisesti eri kuljettimen toimintaan (taulukko S6).

ilmentyvät eri geenejä, 226 GO termejä luokkaan ”biologinen prosessi” ja 8 GO termejä kategoriassa ”molekyyli toiminto” merkittävästi rikastettu vähintään FDR kynnyksellä P-value≤0.05 (taulukko S7). Valitse ”biologinen käsittely” analyysi, esiintyvyyden negatiivinen sääntelyn geenien havaittiin tyypillinen alas geenien. Samalla olemme myös huomanneet merkittävän esiintyy usein geenien säätelyyn osallistuvan solusyklin ja mitoosin keskuudessa ylös geenien. Rikastettu GO ehdot ”molekyyli toiminto” liittyivät ensisijaisesti ”proteiinikinaasi aktiivisuutta”. Kegg polku analyysi osoitti myös, että useita tunnettuja syöpään liittyvän reittejä merkittävästi häiriintynyt (FDR P-value≤0.05), esim. ECM-reseptori vuorovaikutus, solusykliä, p53 signalointi, ja kalsium signalointireitille. Erilaiset metaboliareitit (esimerkiksi osallistuvien aminohappo aineenvaihduntaan) havaittiin myös rikastettu vapailla geenit tunnistetaan tutkimuksessamme (FDR P-value≤0.05).

kohdegeenien kaikkien vapautettu miRNA, 149 GO ehtoja rikastetaan ”biologinen käsittely” analyysi käyttäen samanlaisia ​​kynnystä. Yleensä soluprosessi, biologiset ja aineenvaihduntaa ehdot todettiin rikastaa joukossa miRNA-kohdegeenien joka vapautui tutkimuksessamme. ”Molekyyli toiminto” analyysi paljasti 11 GO termejä, jotka olivat merkittävästi rikastaa FDR kynnyksen P-value≤0.05. Kaikkein merkittävästi rikastettu GO termi oli ”proteiinikinaasi aktiivisuutta”, viitaten rooliin kinaasiaktiivisuuden sääntelyä. Lisäksi polun analyysi tavoitteiden vapailla miRNA osoitti myös merkittävää häiriön solusyklin, aksoniohjauksen ja MAPK signalointireitteihin (oikaistu P-value≤0.05) (taulukko S8).

edelleen valvoa yhteys joukossa kolme luokkaa -omics, GO sisältämien molekyylien toimintojen ja biologisiin prosesseihin, sekä Kegg polkuja, jotka olivat rikastuneet useamman kuin yhden luokan analysoitiin edelleen. GO ja KO ehdot rikastunut useampaan kuin yhteen luokkaan on esitetty taulukossa S9. Peräti 106 rikastettu GO termejä ja Kegg reittejä rikastuneet Tutkimuksessamme joista suurin osa oli tiiviisti liittyy syövän. Merkillistä päällekkäisyydellä merkittävästi rikastettu GO termejä ja Kegg polkuja keskuudessa kolmeen ryhmään -omics toteutettiin myöhemmin, kuten keskeinen hermoston kehittymistä polku nimeltään ”aksoniohjauksen”. Lisäksi 7 rikastettu ”biologinen prosessi” GO termejä ja single ”molekyyli toiminnon” GO termi liittyivät ensisijaisesti ”neurogenesis” ja ”solujen erilaistumista”, mikä viittaa siihen yhdistetty sääntelyä keskeisten prosessien ja toimintojen differentiaalisella metylaation ja mRNA: t ja miRNA ilmaisun sääntelyä.

syöpään liittyvien geenien merkittävästi vapautettiin virtsarakon syövän

kautta GO termi rikastamiseen ja Kegg koulutusjakson analyysi valituista säädellään eri tavalla geenit, havaitsimme, että tietyt geenit olivat molemmat differentiaalisesti metyloidut ja ilmaisi jotka olivat mukana merkittävissä häiritseekin polkuja, ja nämä reitit olivat läheisessä yhteydessä eri kasvaimien syntyyn prosesseihin. Esimerkiksi SLIT2 oli mukana Axon ohjausta koulutusjakson, ja CCND1 oli mukana solusyklin ja p53 signalointireitille. Lisäksi olemme tunnistaneet useita kanonisia syöpään liittyvien geenien, joita ei ole rikastettu merkittävästi häiriintynyt reittejä, kuten ADAMTS9, HIC1, RASAL1, sekä metylaation tiloja ja ilmentymistä (taulukko 2).

koska DNA: n metylaatio erehdykseltä geenipromoottorit on ilmoitettu vaikuttavan niiden ekspressiotasot, ne metylaatiokohtia sijaitseva promoottori alueilla analysoitiin yksityiskohtaisesti. Hypermetyloitunut syöpä 1 (HIC1) ja viilto homologin 2 (SLIT2) on tunnistettu olevan differentiaalisesti säädelty metylaatiostatuksen niiden promoottorialueiden ja dramaattisesti alassäädetty ilmentymisen tasolla kaikilla virtsarakon urothelial karsinooma kudosnäytteitä. Lisäksi huomasimme, että RAS proteiini aktivaattori kuten 1 (RASAL1) ja keratiini 17 (KRT17) oli selvästi hypometyloidut promoottorialueella ja yli-ilmentyy kasvain näytteissä verrattuna kontrolleihin. Nämä neljä geenit on tunnistettu potentiaalisia tuumorisuppressorigeeneille tai onkogeenien tutkimuksissa muissa elimissä [28], [29], [30], [31], mutta ei ole ollut osallisena virtsarakon syöpään.

jotta voitaisiin edelleen tutkia metylaation ja ilmaisun korjauksilla HIC1, SLIT2, RASAL1, ja KRT17, massiivinen bisulfiitti sekvensointi PCR ja käänteistranskriptio qPCR tehtiin pareittain syövän ja normaalin viereisen kudoksia ylimääräisiä ~ 33 virtsarakon urothelial karsinooma potilaille (katso menetelmät lisätietoja ). Kuten on esitetty kuviossa 2B, aberraatio alueellisten promoottorin metylaation on tiukasti liittyy muuttunutta geeniekspressiota näissä neljässä geenien virtsarakon syöpä. Ihmisen virtsarakon uroteelin karsinooma tutkitut näytteet, lisääntynyt HIC1 promoottorin metylaation havaittiin 100% (30/30) näytteistä ja vähentää ilmentymistä havaittiin 70,0%: n 30 kasvainnäytteet. Hypermetylaatiota SLIT2 promoottorin todettiin 58,6% (17/29) tapauksissa ja merkittävä väheneminen ilmentymistä havaittiin nopeudella 86,2% (25/29). Vähentynyt metylointi taajuus RASAL1 oli 96,7% (29/30), ja KRT17 oli taajuudella 93,9% (31/33). Vastaava lisääntynyt geeniekspression hinnat RASAL1 ja KRT17 oli 63,3% (19/30) ja 78,8% (26/33), tässä järjestyksessä. Kaikkiaan lisääntynyt HIC1 ja SLIT2 promoottorin metylaation ja vähentynyttä ilmentymistä havaittiin 70,0% ja 51,7% tuumorin näytteiden, vastaavasti. Samaan hypometylaatio on RASAL1 ja KRT17 promoottoreita ja alas-säätely niiden ilmentymisen havaittiin nopeuksilla 63,3% ja 75,8%, tässä järjestyksessä.

Keskustelu

MMSDK teknologia tarjoaa tehokkaan ja kustannus- tehokas tapa analysoida genomin laajuinen DNA: n metylaatio profiileja, joilla on suhteellisen suuri herkkyys [32]. Metylointi taso havaitaan MMSDK korreloi hyvin ne vahvistustulokset bisulfiitin sekvensointi PCR satunnaisesti valitun

MluI

loci tutkimuksessamme. DGE sekvensointi on myös hyödyllinen ja herkkä väline, joka mahdollistaa tarkka havaitseminen monenlaisia ​​ekspressiotasoja sekä mRNA: iden ja miRNA ja siten mahdollistaa ero ilmentymisen analyysiä enemmän erilaisia ​​selostukset [33] [34]. Nämä kaksi teknologiaa sekä pari tag sukupolven kautta entsyymidigestiota seuraavan sukupolven syvä sekvensointi ja mahdollistaa herkän vertaileva analyysi DNA: n metylaation ja geenien ilmentymisen.

yleensä samanlainen genominlaajuisten metylaatiokuvion välillä havaittiin virtsarakon kasvain ja normaali viereisiin kudoksiin. Metylaatiotasoilla at CpG rikkaiden ja köyhien promoottorit, eksonit ja intronit olivat myös samankaltaisia ​​kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, mikä tukee edellä toteamukset samanlainen maailmanlaajuinen metylaation. Geenien tasolla, se on hyvin tiedossa, että inaktivointi kasvaimeen synnyssä paikkaspesifisellä hypermetylaation myötävaikuttaa taudin alkamisen ja etenemisen ihmisen maligniteettien [2], [35]. Hypermetylaatiota HIC1 ja siihen liittyvä lasku HIC1 ilme on yleinen piirre useissa syövissä, kuten ihmisen rintasyövän [28], akuutti myelooinen leukemia [36], ja eturauhassyövän [37]. Virtsarakon syöpä, vastaavaa tutkimusta on tehty myös, että määrälliset metylaatiospesifistä PCR tehtiin 17-geenin promoottorit kuten HIC1 96 pahanlaatuinen ja 30 normaalia urothelial näytteitä [38]. todettiin, että metylaatio taajuudet HIC1 promoottorin pahanlaatuisia ja normaaleja uroteeli olivat 21,9% ja 16,7%, vastaavasti. Ne eivät osoittaneet merkitsevää eroa pahanlaatuisten ja normaalin urothelial kudosta. Tässä raportoimme hypermetylaatiota HIC1 ja johtuvilla vähentynyt ilmentyminen HIC1 mRNA: virtsarakon syöpä. Ero tutkimuksessamme ja Yates DR: n tutkimus saattaa selittää eri resoluutiolla teknologioiden, kuten me sovellettu korkean resoluution syvä sekvensointitekniikan taas Yates DR ryhmä sovellettu suhteellisen matalan ratkaisuteknologia määrällisten MSP, tai eri näytteenottostrategiaa, koska me kerätään täsmälleen sovitettu pari kasvainkudosnäytteet ja viereisistä normaaleista kudoksista peräisin samoista potilaista, kun taas suurin osa kasvaimen kudosten Yates DR: n keräsi ei ole sovitettu normaaleissa kudoksissa. HIC1 on ehdokas tuumorisuppressori sijaitsee 17p13.3, alueella usein olevan hypermetyloitunut tai poistaa monenlaisia ​​yleisiä ihmisen kasvaimissa [39]. Koko HIC1 geenialueen on käsitti sisällä tiheä CpG saari, joka on normaalisti metyloimaton. HIC1 (hypermetyloitunut syöpä 1) on osoitettu olevan mukana monimutkainen signalointireitin, joka heikentää p53-välitteinen apoptoottista DNA-vaurioita vaste prosessi kasvaimen [40], [41]. Epigeneettisellä inaktivointi HIC1 voisi aiheuttaa deasetyloinnilla p53, häiritsevät sen toimintaa, ja mikä vähentää apoptoottisten vasteena DNA-vauriolle, mikä johtaa kasvaimien syntyyn ja edistää kasvaimen etenemiseen [35], [41], [42]. Siksi tutkimuksemme osoitti, että promoottori-CpG-saarekkeen hypermetylaation aiheutti HIC1 transkription inaktivointi ja häiritä monimutkainen HIC1-p53 signalointireitin virtsarakon syöpään.

viiltämällä geeniperheen (SLIT1, SLIT2, ja SLIT3) on viime aikoina ominaista perhe eritettyjen aineita käytetään aksoniohjauksen ja hermosolujen muuttoliike kehittämisen aikana keskushermostoon [43], [44]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että SLIT2 on epigeneettiseltä vaiennetaan hypermetylaatiota promoottorialueen laaja kirjo muita kasvaimia, kuten keuhko-, rinta-, gliooma, paksusuoli-, ja kohdunkaulan syövät, mikä inaktivaatio SLIT2 ilmaisun [29], [ ,,,0],45], [46], [47]. Esikäsitelty väliaine SLIT2-transfektoiduista soluista vähentää solujen kasvua ja indusoi apoptoosia kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat, syytetään että SLIT2 on kasvain-vaimennin toimintaa [45]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että SLIT2 kasvaimen kasvu estyy ja etäpesäkkeiden mekanismilla, joka liittyy asetuksen kasvaimen muuttoliikkeen, invaasio, apoptoosin, ja kasvu rintasyövän, fibrosarkooma, ja okasolusyöpä [48], [49]. Hypermetylaation at promoottorit geenien (SLIT1, SLIT2, SLIT3, ROBO1, ja ROBO3) mukana viiltämällä-Robo polku johtaa alassäädetty geenin ilmentymistä oli myös tunnistettavissa vuonna invasiivisen kohdunkaulan syövän [46]. Tämä työ havainnut, että tuumorisuppressorigeenin, SLIT2, joka inhiboi kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden, todettiin tehottomaksi promoottorin hypermetylaatio virtsarakon uroteelin karsinooma samoin.

Aikaisemmat tutkimukset tunnistettu hypermethyled promoottorialueet joissakin yleisesti metyloitu geenejä (RASSF1A , p16, MLH1, MGMT, HOXA9) eri syöpiä. Yritimme vahvistaa nämä tulokset virtsarakon urothelial karsinooma samoin. Valitettavasti ei ollut

MluI

entsyymidigestiota sivustoja löytyy promoottorit näiden geenien, joten emme voineet asianmukaisesti huomioon metylaatiotasoilla promoottorit näissä yleisesti metyloituja geenit teknisten rajoitusten takia. Olemme kuitenkin havainneet, että MLH1 ja HOXA9, mutta ei muita näitä yleisesti metyloitu geenit olivat merkitsevästi alle ilmaistuna virtsarakon syöpä, joiden tulokset olivat yhteneviä aiempien tutkimusten kanssa, [10], [50].

toisin hypermetylaation, DNA hypometylaatio myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn aktivoimalla esikasvaintekijät [5], joka edistää syövän kehittymisen ja etenemisen [51]. Kuten mainittiin tulokset massiivinen BSP ja RT-qPCR testejä, RASAL1 metylaatiotasoilla olivat merkitsevästi alassäädetty ja ekspressiotasot dramaattisesti lisääntynyt virtsarakon syövän solujen 66,7% ja 53,3%, tässä järjestyksessä, ja virtsarakon syöpä tutkitaan. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia osoittaa, että RASAL1 hiljennettiin läpi promoottori CpG-metylaation useita kasvaimia [52] ja että vähentäminen RASAL1 ilmaus voisi edistää syövän synnyn ja liittyi taudin etenemiseen [30], [53] on julkaistu. RASAL1 on RAS-GTPaasia aktivoivan proteiinin, joka sammuttaa RAS toimintaa muuntamalla GTPaasi sen aktiivinen, GTP-sitoutunut muoto sen aktiivinen, GDP-sitoutunut muoto [54]. RAS-geeniperhe on tunnettu yksi yleisimmin käytössä onkogeeneistä ihmisen syövissä [55]. Yllättäen RASAL1, RAS signaalia terminaattori, oli hyvin yli-ilmentynyt ja hypometylaatio promoottorin havaittiin myös useimmissa tutkituissa virtsarakon syöpä kudoksiin tutkimuksemme. Lisätutkimuksia tarvitaan käsitellä mekanismeihin, jotka ovat RASAL1 yli-ilmentyminen ja epigeneettiset poikkeavuus virtsarakon syöpään.

Keratiini 17, joka tunnetaan myös nimellä sytokeratiini- 17, on mukana muodostumista ja ylläpito eri ihon lisäkkeiden, erityisesti määritettäessä muoto ja suunta hiukset. Ilmentyminen KRT17 on todettu olevan säädellään ylöspäin syöpäkudokset kohdunkaulan [56], kieli [57], suullinen [58], ja ruokatorven levyepiteelikarsinoomien [59]. Lisääntynyt ilmentyminen keratiini 17 endoteelisolujen voi edistää angiogeneesiä [60], ja se voi edistää epiteelin proliferaatiota ja kasvaimen kasvua [31]. Keratiini 17 on myös raportoitu olevan mahdollinen diagnostinen markkeri suun okasolusyöpä [58], ja se voi olla yhteydessä kliinisen etenemisen ja erilaistumista kohdunkaulan karsinooman [61], [62]. On kuitenkin olemassa muutamia raportteja epigeneettiset sääntelyn ja ilmaisun keratiinin 17 virtsarakon syöpään. Tässä tutkimuksessa olemme määritelleet kasvua KRT17 ilmentymisen virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna niiden normaaliin kollegansa. Havaitsimme myös hypometylaatio että KRT17 promoottorin virtsarakon urothelial karsinooma. KRT17 voisi olla otaksuttu onkogeeni, joka aktivoituu läpi hypometylaatio klo promoottori.

Tutkimuksessa korostetaan tutkii toiminnallisten roolien mRNA ja miRNA että kasvainten synnyssä virtsarakon urothelial karsinooma. Met proto-onkogeenin (MET), hepatosyyttikasvutekijän reseptorin (HGFR), joka on ehdotettu olevan tärkeä rooli kehityksen eri epiteelin ja nonepithelial kasvaimia, havaittiin olevan huomattavasti-ilmaistuna tutkimuksessamme virtsarakon syövän, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien virtsarakon syöpiin [63], hematopoeettiset maligniteetit [64], ja munuaiskarsinoomia [65]. MET on konstitutiivisesti aktivoitunut sen proto-onkogeenisen reseptori tyrosiinikinaasin, joka edistää invaasion ja muuttoliike aktivoimalla erilaisia ​​signaalitransduktioreaktioteiden lukuisia erityyppisiä syöpäkasvainten [66]. Mielenkiintoista, alas-säätely miR-1, joka kohdistuu MET, havaittiin Tutkimuksessamme edellisiin tutkimuksiin keuhkosyövässä ja ihmisen Rabdomyosarkooma [67], [68]. MiR-1 ajatellaan estävän solun proliferaatio ja migraatio negatiivisesti säätelemällä c-Met signalointireitin. Siksi luonnehdinta onkogeenien kohteena miRNA olisi erittäin arvokasta parantanut ymmärrystämme patogeenisen mekanismeista virtsarakon syöpään.

On yleisesti tunnustettu, että häirinnyt reittejä, eikä vain purettu yksittäisiä geenejä, ajaa tuumorigeneesiä prosessi . Meidän etsiä toiminnallinen merkitys muuttuneen metylaatiotasoilla ja geenin ilmentymisen, huomasimme, että Kegg ”aksoniohjauksen” koulutusjakso on merkittävästi rikastettu ilmentyvät eri geenit (mRNA: t ja miRNA), ja että oli limittyy polkuja rikastettiin asiaa geenien kanssa differentiaalisesti metyloitu loci. Aksoniohjauksen on keskeinen vaihe, jonka aikana axons ulottuvat oikeisiin tavoitteisiin muodostumisen aikana hermoverkostoja ja liittyvien molekyylien arveltiin olevan laajalti ilmaistaan ​​ja mukana kasvainten kehittymiseen, angiogeneesi ja metastaasi [69]. Havaitsimme myös tällaiset päällekkäisyydet merkittävästi rikastettu GO termejä, joka ensisijaisesti liittyy ”neurogenesis” ja ”solujen erilaistumiseen” (esim hermosolu erilaistuminen, neurogenesis positiivinen säätely solujen erilaistumisen) keskuudessa kolmenlaisia ​​omiikka tietoja.