Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen altistuminen bisfenoli A (BPA) on läsnä kaikkialla. Eläinkokeissa havaittiin, että BPA edistää kehitystä eturauhassyöpää, mutta ihmisen tiedot ovat niukkoja. Meidän tutkimuksessa selvitettiin yhdistyksen välillä virtsan BPA tasoilla ja Eturauhassyöpä ja arvioidaan vaikutuksia BPA induktioon sentrosomin poikkeavuuksia kuin oleva mekanismi edistää eturauhasen syövän synnyn. Tutkimuksessa, johon 60 urologian potilasta, todettiin korkeampia virtsan BPA (kreatiniini-oikaistu) in Eturauhassyöpä potilailla (5,74 ug /g [95% CI, 2,63, 12,51]) kuin ei-Eturauhassyöpä potilailla (1,43 ug /g [95% CI: 0,70, 2,88]) (

p

= 0,012). Ero oli vielä merkittävämpi potilailla 65 vuotta vanha. Suuntaus kohti negatiivinen yhdistyksen välillä virtsan BPA ja seerumin PSA havaittiin Eturauhassyöpä potilailla, mutta ei ei-Eturauhassyöpä potilailla.

In vitro

tutkimuksissa tutkittiin centrosomal poikkeavuuksia, mikrotubulusten ydintyminen ja ankkurista riippumaton kasvu neljä eturauhasen syöpäsolulinjoissa (LNCaP, C4-2, 22Rv1, PC-3) ja kaksi kuolemattomaksi normaalissa eturauhasessa epiteelin solulinjojen (NPrEC ja RWPE-1). Altistuminen pieniä annoksia (0,01-100 nM) BPA prosenttiosuus kasvoi solujen sentrosomin vahvistus kahden kahdeksan-kertaiseksi. Annosvasteet joko terävähuippuisia tai saavuttanut tasankoja 0,1 nM BPA altistumista. Tämä pieni annos edistettiin myös mikrotubulusten ydintymis ja regrowth klo sentrosomien in RWPE-1 ja parannettu ankkurista riippumaton kasvu C4-2. Nämä havainnot viittaavat siihen, että virtsan BPA taso on itsenäinen ennustetekijöiden markkeri Eturauhassyöpä ja että BPA altistuminen voi alentaa seerumin PSA tasot Eturauhassyöpä potilailla. Lisäksi häiriöitä sentrosomimäärän päällekkäisyys syklin pienian- BPA voi myötävaikuttaa neoplastisen transformaation eturauhasen.

Citation: Tarapore P, Ying J, Ouyang B, Burke B, Bracken B, Ho SM (2014) altistuminen bisfenoli A korreloi varhain alkanut Eturauhassyöpä ja Edistää sentrosomimäärän Amplification ja riippumattomaan kasvuun

In vitro

. PLoS ONE 9 (3): e90332. doi: 10,1371 /journal.pone.0090332

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 25 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 30 tammikuu 2014; Julkaistu: 03 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Tarapore et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia National Institutes of Health (P30-ES006096, U01-ES019480, U01-ES020988), Veterans Administration kunniapalkinnon (I01-BX000675), sisäinen rahoituslähteenä yliopistosta Cincinnati SMH ja PT ja congressionally Suunnattu Medical Research Program puolustusministeriön Award (PC094619) PT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi yleisin maligniteetti miesten Pohjois-Amerikassa. Ikääntyminen on vakiintunut riskitekijä PCA [1]. Yksi kuudesta miehistä kehittyy PCa niiden elinkaaren aikana; kuitenkin, syöpä on harvoin diagnosoidaan miehillä 40 vuotias, lähes kaksi kolmasosaa tapauksista ilmoitetaan [2], [3] miehillä vuotiaana 65 Vuodesta 2006 vuoteen 2010 mediaani-ikä diagnoosin ajankohtana oli 66 vuotta mukaan tilastojen National Cancer Instituten Surveillance Epidemiology and Lopputulokset Studies (2013) [4]. Suuret ohella myös muut tekijät ikä ovat rotu ja suvussa [1], kun taas vähän tiedetään vaikutus hormonaalisten haitta on PCa.

Bisfenoli A (BPA) on orgaaninen yhdiste, jonka kemiallinen kaava (CH

3)

2C (C

6 H

4OH)

2. BPA on käytetty tehdä polykarbonaatista ja epoksihartsit, jotka ovat läsnä tuhansia kulutustuotteiden [5], [6]. Yhdysvalloissa, altistuminen BPA on levinnyt laajalle, on yli 90% koko väestössä [7]. Imeytymiseen ihon kautta, hengitysteitse, ja nieleminen päässä saastuneen ruoan ja veden ovat tärkeimmät altistumisreitit [8]. Hormonitoimintaa disruptor joka jäljittelee estrogeenin ja kilpirauhashormonin BPA toimii myös aineenvaihdunnan ja immuunijärjestelmän haitta. Siten terveydelle haitallisia BPA ovat laajoja [9], [10], ja korkeampi BPA altistuminen korreloi lisääntyneeseen sydän- ja verisuonitautien, liikalihavuuden, diabeteksen, immuunijärjestelmän häiriöt, ja isäntä lisääntymis- häiriöiden [11], [ ,,,0],12], [13]. Lisäksi

in vitro

ja eläinkokeet ovat osoittaneet, että BPA altistuminen voi lisätä riskiä maitorauhasen, aivot, ja eturauhasen syöpiä [9]. Kuitenkin ihmisen tutkimukset yhdistää BPA altistuminen kohonnut syöpäriski on niukasti. Yksi tällainen tutkimus Kiinassa osoitti, että esiintyvyys meningeooma oli 1,6 kertaa suurempi aikuisilla korkeammilla pitoisuuksilla BPA virtsassa kuin niillä, joilla pienemmillä pitoisuuksilla [14]. Samanlaisia ​​tutkimuksia PCA ei ole ollut saatavilla tähän asti.

sentrosomimäärän käsittää parin sylinterimäisiä rakenteita kutsutaan

keskusjyvänen

ympäröimä pericentriolar materiaalia. Sentrosomien ovat mukana järjestämässä interphase mikrotubulusten tukirankansa, mitoosi karat, ja cilia. Sentrosomimäärän toimintahäiriö (numero ja eheys), tunnusmerkki moniin syöpiin, uskotaan aloittaa neoplastisen transformaation ja edistää taudin etenemiseen [15], [16]. Epänormaali määrä sentrosomien voi johtaa mono- tai moninapaista mitoosia, mikä lisää aneuploidia- [15], [16]. Toinen piirre centrosomal häiriöitä on poikkeavuuksia mikrotubulusten (MT) nukleaation ja ankkurointi. Tällaisia ​​poikkeavuuksia useammin havaittiin rintasyövän soluja kuin normaaleissa rinta- epiteelisolujen [15], [16]. Lisäksi merkittävä määrä geenejä, jotka liittyvät lisääntynyt PCa riski ovat johtavia reittejä sentrosomimäärän toimintahäiriö [17], [18]. Nämä havainnot ovat saaneet meidät tutkimaan, solujen perustuvia malleja, haitalliset vaikutukset BPA on sentrosomimäärän sykli mekanismina edistää eturauhasen syövän syntymistä.

Käytimme poikkileikkaus kliininen tutkimus tutkia yhdistyksen välillä BPA altistumista ja PCa. Oletimme, että BPA on merkitystä eturauhasen syövän synnyn. Huomasimme, että potilaat PCA ovat todennäköisemmin kuin ilman PCa olla korkeampi BPA virtsassa. Havaitsimme suuntaus on negatiivinen korrelaatio virtsan BPA ja seerumin PSA-tasot PCA potilailla. Suoritimme

in vitro

tutkimuksia vaikutusten arvioimiseksi BPA on sentrosomimäärän, muodostumista MT asters, ja kolonisaatio pehmytagarissa kahdessa kuolemattomaksi normaalissa eturauhasessa epiteelin solulinjoissa (RWPE-1 ja NPrEC) ja neljä PCa solulinjoja (LNCaP, C4-2, 22Rv1, PC-3). Huomasimme, että solujen prosenttiosuus, joilla sentrosomin vahvistus (CA) kasvoi vasteena pieniannoksisen BPA valotuksen ja että suhde oli ei-monotoninen useimmissa solulinjoissa. Lisäksi altistuminen pieniannoksisen BPA edistänyt MT asteri organisaatio ei-syöpä RWPE-1 ja lisäsi ankkurista riippumaton kasvu androgeenista riippumattoman C4-2 PCa solulinjassa. Kokonaisuudessaan nämä havainnot osoittavat aiemmin tuntematon suhde BPA altistumisen ja PCa ja ehdottaa mekanismia taustalla roolia BPA neoplastisen transformaation ja taudin etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja keräämiseen Virtsanäyteanalyysit

Potilaat rekrytoitiin urologic klinikan yliopiston Cincinnati Medical Center alle protokolla hyväksymä yliopiston Cincinnati Institutional Review Board. Taulukko 1 luettelee potilasryhmät ja diagnostiset tiedot. Kirjautumisen jälkeen tietoisen suostumuksen muodossa, potilailla tehtiin eturauhasen ja pyydettiin antamaan 20- 50 ml virtsanäytteen ennen ajoitettua ultraääni-ohjattu eturauhasen koepala. Kaikki menettelyt tässä tutkimuksessa oli hyväksynyt yliopiston Cincinnati Institutional Review Board. Virtsan Näytteet sentrifugoitiin, sedimentit kerättiin PCA biomarker tutkimuksessa [19], ja supernatantit säilytettiin erinä -80 ° C: ssa BPA analyysiä. Niistä 60 näytettä käytettiin tässä tutkimuksessa, 27 oli potilailta PCA (PCA) ja 33 olivat potilailta, joilla PCa (non-PCA).

mittaus BPA virtsanäytteistä

BPA tasot näytteissä määritettiin laboratorio Organic Analyyttisen kemian Wadsworth Center, New York State Department of Health, (Albany, NY). Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) yhdistettynä sähkösumutus triple-kvadrupoli massaspektrometrialla (ESI-MS /MS) käytettiin määrittämään BPA, tekniikka on samanlainen kuin aiemmin on kuvattu, muutamin muutoksin [20], [21]. Lyhyesti, 500 ui kutakin virtsanäytettä sekoitettiin 1 ml glukuronidaasin (2 ul /ml) ruoansulatusta ja uuttamalla. Laadunvalvontaan, 5 ng

13C

12-BPA lisättiin kuhunkin seokseen. Uutteet sovellettiin Agilent 1100 sarjan HPLC rajapinta Applied Biosystems API 2000 sähkösumutus MS /MS (Applied Biosystems, Foster City, CA) kvantitatiivista BPA. Tiedot hankittiin käyttäen usean reaktion seuranta siirtymät 227 212 BPA, ja 239 224

13C

12-BPA. Pienin havaitsemisraja (MDL) BPA tämän protokollan oli 0,05 ng /ml. Pitoisuuksille alle MDL arvo yhtä suuri kuin MDL jaettuna neliöjuuri 2 käytettiin tilastollisten analyysien [22]. Raportoitu pitoisuudet korjattiin saantojen korvike standardin (-isotoopin laimennus menetelmä). BPA standardi terästetty valittujen näytematriiseja ja läpi kaikki analyysin vaiheet tuotti talteenotto 88% ± 8% (keskiarvo ± SD). Ulkoisen Kalibrointikäyrä valmistettiin injektoimalla 10 ui 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50, ja 100 ng /ml standardeja, ja regressiokerroin oli 0,99.

Normalisointi virtsan BPA

virtsan kreatiniinipitoisuus käytettiin säätää vaihtelu laimennus ja määrittää pätevyyttä paikka virtsanäytettä arvioimiseksi kemiallisen altistuksen [23]. Kreatiniini- (virtsan) iinianalyysikitissä Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan mitata virtsan kreatiniinipitoisuus. Kreatiniinitasot käytettiin säätämään virtsan pitoisuuksien BPA mitattiin HPLC-ESI-MS /MS saada ”kreatiniini-oikaistu” BPA tasot (BPA tasoilla) mikrog /g.

Cells

PCa solulinjat PC-3, LNCaP, C4-2, ja 22Rv1 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin normaaleissa, suositellaan, olosuhteissa. Kuvaus alkuperästä kuolemattomaksi normaalin eturauhasen epiteelisolujen NPrEC solulinja on julkaistu [24]; muut kuolemattomaksi normaalin eturauhasen epiteelisolujen linja, RWPE-1, hankittiin ATCC (Manassas, VA) ja kasvatettiin Määritellään keratinosyyttispesifisestä SFM-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), jossa kasvua edistäviä täydentää. Soluviljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa, jossa on 5% CO

2-ilmakehässä.

BPA hoitoja

Soluja kustakin solulinjasta ympättiin kuuden kuoppalevyille lasipeitinlevyihin 25000 solua /kuoppa. 24 tunnin kuluttua väliaine vaihdettiin fenolipunaista media 10% hiilellä erotettua seerumia vielä 24 tuntia, jona aikana BPA lisättiin saavuttamiseksi lopulliseen konsentraatioon 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM tai 100 nM. Koe toistettiin viisi kertaa tuottaa yhteensä viisi näytettä kohti solulinjan per BPA pitoisuus.

epäsuoralla immunofluoresenssilla

immunovärjäystä sentrosomien, solut kiinnitettiin metanolilla 5 minuutin ajan -20 ° C: ° C: ssa ja sitten käsitellään γ-tubuliinin (klooni GTU88 vasta-aine, Sigma Immunochemicals), α-tubuliinin (klooni DM1A, Sigma Immunochemicals), ja sentriinin (sc-50452, Santacruz Biotechnology) värjäämällä kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, soluja uutettiin 1% NP-40 PBS: ssä 10 minuutin ajan. Solut testattiin primaarisilla vasta-aineilla, ja vasta-aine-antigeeni-kompleksit tunnistettiin Alexa fluor 488- tai 594-konjugoiduilla vasta-aineilla (Molecular Probes). Solut värjättiin myös DNA: 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Invitrogen). Immunovärjättiin solut tutkittiin fluoresenssimikroskopialla.

Microtubule (MT) asteri muodostuminen määrityksessä

Vaikutus BPA on mikrotubulusdynamiikan määritettiin määrityksellä MT aster muodostumisen kuvattu aiemmin [25]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin nokodatsoli (1,5 ug /ml) 40 minuutin ajan jäissä depolymeroida interphase MT, pestiin PBS: llä poistamiseksi nokodatsoli, ja inkuboitiin tuoreessa, lämpimässä väliaineessa 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, jotta MT uusiutumista .

Mittaukset

määrä sentrosomien solua kohti teki fluoresenssimikroskopialla. Vähintään 150-soluja tutkittiin käsittelyä kohden, ja niiden solujen prosentuaalinen määrä, joissa on epänormaali määrä sentrosomien laskettu kokonaismäärä soluja tutkittiin käytettiin tulosten mittana analyysin. Merkittävä poikkeavuus CA määriteltiin solu on enemmän kuin kaksi sentrosomien.

Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä

Solut analysoitiin kiinnittymisestä riippumatonta kasvua mittaamalla tehokkuus pesäkkeenmuodostusta puolikiinteässä keskipitkän kuten on kuvattu [26]. Lyhyesti, soluja viljellään olosuhteissa, jotka on kuvattu edellä, läsnä ollessa tai poissa ollessa 0,1 nM BPA, ja -10 kohtia. Valitsimme 0,1 nM koska tämä pitoisuus aiheuttama prosentuaalisesti eniten solujen CA useimpien solulinjojen (katso tulokset). Noin 2500 solua /35 mm hyvin upotettiin pehmytagar. Solut syötettiin kahdesti viikossa tuoreella alustalla ja ilman BPA. Jälkeen 2-3 viikkoa, pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti. Pesäkkeitä muodostavien hyötysuhde on pesäkkeiden lukumäärä saadaan jakamalla kokonaismäärä solujen päällystetty kerrottuna 100.

Tilastollinen

Ensisijainen toimenpide kliinisen analyysi oli jatkuvana muuttujana virtsasta BPA taso jälkeen normalisointi tai oikaistu virtsan kreatiniinipitoisuus. Alkutarkastus jakelu osoitti, että tämä muuttuja oli erittäin vinossa oikealle. Siksi sen log-transformoituja muuttuja (LnBPA) käytettiin riippuva muuttuja tilastollisia malleja. Pääasiallinen tilastollinen malli oli kiinteän vaikutuksen mallia arvioimaan assosiaatio LnBPA ja PCa tila (1 = yes; 0 = ei). Käytimme sekä korjaamattomissakin säädettiin menetelmiä meidän kiinteän vaikutuksen mallia. Oikaisemattomaan menetelmässä PCA tila oli ainoa itsenäinen muuttuja. Oikaistun menetelmässä, olemme mukana ikä (ositettu ikä ≥65 vs. 65 vuotta) ja seerumin PSA tasot ohjaamalla kovariantteja. Suoritimme

post hoc

vertailuja keinoin PCa ja ei-PCa potilaiden ja samanlainen vertailujen potilasryhmissä ositettu iän. Wilcoxonin summa testejä käytettiin validoida havainnot kiinteän vaikutuksen mallia, jotta kaikki löydökset olivat vankka (tuloksia ei ole esitetty). Virtsan BPA ja muita numeerisia riippumattomien muuttujien kuten seerumin PSA-arvot, suhteet arvioitiin lineaarisella regressiomallit ja /tai korrelaatiokertoimet.

in vitro

analysoi kunkin solulinjan, käytimme kiinteä efektimalli arvioida yhdistyksen prosenttiosuuden solujen CA että BPA keskittymän käytetään hoitamaan solujen ja

jälkikäteen

analyysit oikaistu monimuuttujille käyttäen Bonferronin testi. Ankkurointi riippumattoman kasvun määrityksessä tulokset analysoitiin kahden otoksen

t

-testaukset. Kaikki tilastolliset testit suoritettiin SAS 9.3 ohjelmisto (SAS, Cary, NC) paketti.

P

-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Virtsa BPA taso liittyy PCa ja saattaa olla ennusteen arvioinnissa

tutkittu 60 urologian potilasta, 27 PCA ja 33 ilman PCa. Keskimääräinen ikä (± keskihajonta [SD]) Eturauhassyövän potilaista oli 69,7 ± 10,3 v (min, 56 v, max. 87 vuotta); he olivat vanhempia kuin ei-PCa potilasta, jotka olivat 62,8 ± 7,15 v (min. 46 v, maks. 77 v;

p

= 0,003). Seerumin PSA-pitoisuudet Eturauhassyövän ja ei-PCa potilaat eivät eronneet. Gleason pisteet 71% PCA potilaiden oli 6, ja 7. muut. Lähtöpainosta ominaisuudet on koottu taulukkoon 1.

Kaikissa aineet (PCA ja ei-PCA), tasot virtsan BPA ei liittynyt ikään ja seerumin PSA ja ei korreloinut Gleason pisteet syöpä ja syöpä -aiheiset ominaisuudet PCA koehenkilöillä (taulukko 2). Kuitenkin potilaat PCA oli korkeampi virtsan BPA (kreatiini oikaistu), joiden geometrinen keskiarvo 5,74 [95% CI; 2,63, 12.51] ug /g (keskiarvo ± SD LnBPA 1,75 ± 1,97), kun taas virtsan BPA tasoa non-PCa potilailla oli geometrinen keskiarvo 1,43 [95% CI; 0,70, 2,88] ug /g (keskiarvo ± SD LnBPA 0,35 ± 2,14;

p

= 0,012, Fig. 1A 1D). Kerrostunut analyysit osoittivat, että positiivinen yhteys oli merkitsevä vain yksi 30 urologic potilaat alle 65 (keskiarvo ja mediaani-ikä = 58 v, alaikäraja = 46 v). Vuonna nuoremmilla potilailla (alle 65 v), geometrinen keskiarvo virtsan BPA tasot PCa potilailla oli 8,08 [95% CI; 2,40, 27,15] ug /g (keskiarvo ± SD LnBPA 2,09 ± 1,71) verrattuna geometrinen keskiarvo 0,90 [95% CI; 0,36, 2,25] ug /g (keskiarvo ± SD LnBPA ja -0,11 ± 2,09) kesken ei-PCa potilailla (

p

= 0,006; Fig. 1B 1D). Lisäksi lineaarinen regressioanalyysisarjoissa Tässä nuoremmassa paljasti suuntaus on negatiivinen yhdistyksen välillä virtsan BPA tasojen ja seerumin PSA pitoisuudet PCA potilailla (n = 10, r = -0,52,

p

= 0,10), mutta ei tällaiset suuntaus kuin PCa potilailla (Fig. 1 C). Korrelaatio ei saavuttanut merkitsevyyttä 5% tasolla, koska pienen otoskoon.

Virtsa BPA arvot liittyvät PCa. Log-transformoituja BPA kutsutaan LnBPA. Arvot kaavio ovat keskiarvoja ± SD LnBPA. (A) Virtsan BPA tasot ovat korkeampia PCA potilaille kuin ei-PCa potilaille. Keinot LnBPA = 1,75 ± 1,97 PCA (sininen, n = 27) vs. 0,35 ± 2,14 ulkopuolisissa PCa (punainen, n = 33),

p

= 0.012. (B) LnBPA PCA vs. LnBPA ei-PCa, ositettu iän = 65 Virtsa BPA pitoisuudet ovat huomattavasti korkeammat nuorilla PCa potilailla kuin vastaavana kuin PCa potilasta vain ikäryhmässä 65 vuotta vanha;

p

= 0,006. (C) Lineaarinen regressioanalyysisarjoissa Seerumin PSA vs. LnBPA potilailla 65 vuotias ainoastaan ​​(n = 30). Blue kiinteät neliöt edustavat PCa potilaita; red käänteinen-ympyrät edustavat ei-PCa potilaille. Sininen ja punainen kiinteät viivat edustavat niiden regressiolinjoja, vastaavasti. (D) vertailu geometrisen keskiarvon BPA PCA ja ei-PCa ryhmiä. Geometrinen keskiarvo (Geo) määritellään eksponentiaalinen ja keskiarvon LnBPA. Arvot ovat geometriset keskiarvot (95% CI) BPA yksikössä ug /g kreatiniinia.

Pienillä BPA edistetään sentrosomimäärän vahvistus (CA) B

CA on yleisesti havaittu ihmisen kasvaimissa ja on merkittävä tekijä kromosomiin epävakautta [15], [27]. Riippuen siitä, onko solu on G1 tai S /G2 /M-vaiheen solusyklin, normaalien solujen yksi tai kaksi sentrosomien, vastaavasti. Me määrittää, onko käsittelemällä soluja BPA muutti määrä sentrosomien, käsittelemällä soluviljelmissä kasvavien pitoisuuksien kanssa BPA (0,01-100 nM) (kuviot. 2 ja 3). Käsittelemättömät solut, jotka toimivat kontrolleina osoitti odotettavissa normaali sentrosomin profiili, jossa suurin osa soluista ( 90%) sisälsi joko yksi tai kaksi sentrosomien (Fig. 3-I, paneelit A, C, E, G, I, K ). Käsittelemättömän NPrEC oli vähiten solujen centrosomal poikkeamia (1,7%), jota seurasi C4-2 (2,9%), LNCaP (3,5%), 22Rv1 (4,9%), RWPE-1 (7,3%), ja PC-3 ( 10,4%) (kuvio 2). Sen sijaan kaikki solulinjat käsiteltiin BPA kasvoi (kaksi- kahdeksan-kertainen, taulukko 3), solujen lukumäärä, joissa on kolme tai useampia sentrosomien (Fig. 2, Fig. 3-I-paneelit B, D, F, H, J, L). Annos-vaste-käyrät kahden ei-syöpä solulinjoja, NPrEC ja RWPE-1, ja kaksi PCa solulinjat, LNCaP ja 22Rv1, paljastaa ei-monotoninen (kaksivaiheinen) vastesuhde, jossa maksimaalinen vaste 0,1 nM BPA ( kuva 2). Toisaalta, kaksi muuta PCa riviä, C4-2 ja PC-3, näytetään yhä annos-vaste-käyrä, joka plateaus samalla alhainen pitoisuus BPA (0,1 nM) (Fig. 2). Immortalisoidut ei-syöpä eturauhasen epiteelisolujen linja NPrEC-1, osoitti korkeinta kertainen muutos (keskiarvo ± SD, 8,1 ± 2,4) sentrosomimäärän profiili (taulukko 3), mikä viittaa siihen, että sen sentrosomimäärän päällekkäisyyttä sykli voi olla herkin vaikutukset matalan -dose BPA edistämisestä CA.

solulinjat NPrEC, RWPE1, LNCaP, C4-2, 22Rv1, ja PC3 hoidettiin sisälsi 10% CSS plus 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM ja 100 nM BPA 72 tuntia. Solut kiinnitettiin 100% kylmällä metanolilla ja immunovärjättiin sentrosomien ja ytimiä. Määrä sentrosomien solua kohti teki fluoresenssimikroskopialla. Tulokset on esitetty keskiarvona määritettiin viisi erillistä koetta. Sirontakuvaajaan kertyi prosenttiosuuden solujen epänormaali määrä sentrosomien vastauksena BPA. Analyysit suoritettiin käyttäen kiinteää vaikutus malli kustakin solulinjasta.

Post hoc

vertailuja keinoja säädettiin käyttäen Bonferronin testeissä. Taitos muutos on prosentuaalinen solujen epänormaalia sentrosomien 0,1 nM BPA /prosenttiosuus solujen epänormaalia sentrosomien 0 nM BPA.

(I) lisääntyminen sentrosomimäärän numeroita. Solulinjat NPrEC, RWPE1, LNCaP, C4-2, 22Rv1 ja PC3 käsiteltiin alustassa, joka sisälsi 10% CSS ja 0 tai 0,1 nM BPA: ssa 72 tuntia. Solut kiinnitettiin 100% kylmällä metanolilla ja immunovärjättiin sentrosomien (anti-γ-tubuliinin, punainen) ja tuma (DAPI, sininen). Solut tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. Nuolet kantoja sentrosomien, ja paneelit oikealla osoittavat suurennettu kuvia merkityillä alueilla. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (II) sentrosomin vahvistus läsnä ollessa BPA ei johdu keskusjyvänen erottaminen. RWPE-1-soluja käsiteltiin 0,1 nM BPA 3 päivää. Solut kiinnitettiin ja immunovärjättiin sentrosomien (anti-γ-tubuliinin, punainen), keskusjyvänen (anti-sentriinin, vihreä), ja tuma (DAPI, sininen). Nuolet kantoja sentrosomien. Paneelit oikealla osoittavat suurennettu kuvia merkityillä alueilla. Asteikko bar, 10 um.

matala-annos BPA ei vaikuttanut keskusjyvänen jakoa

Rakenteellisesti sentrosomin koostuu parista lieriömäisiä rakenteita, kutsutaan keskusjyvänen että toimii päällekkäisiä yksiköitä. Voit tarkistaa eheyden sentrosomien, me immunovärjättiin soluja sentriinin, merkittävä ainesosa keskusjyvänen sylinterin, joka mahdollistaa visualisoinnin keskusjyvänen parin sisällä sentrosomimäärän. Kuva. 3 esitetään edustavat kuvia RWPE-1-soluissa. Jokainen piste havaitaan vasta-aineen y-tubuliinia (Fig. 3-II, paneelit A ja D), päätettiin pari pistettä (edustaa keskusjyvänen pari) paljasti vasta sentriinin suurennettuna (Fig. 3-II; paneelit B ja E, paneelit a, a ’, d’, d ’). Nämä tiedot siis osoittavat, että sentrosomien ovat ehjät, joka sisältää pari keskusjyvänen. Sentrosomin profiilit määritettiin laskemalla sentriinin signaalin olivat samanlaiset kuin määritetty laskemalla γ-tubuliinin signaalin (Fig. 2). Tulokset LNCaP, C4-2, 22Rv1, ja NPrEC solut olivat samanlaisia. Siksi BPA ei vaikuttanut sentrosomimäärän erottamista tai keskusjyvänen halkaisu.

Pieniannoksinen BPA parannettu MT asterkuva muodostumista

ankkuroiminen MTS ja niiden myöhempi venymä muodostaa radial MT paneelit (asters) ovat kriittisten tapahtumien aikana interphase ja myös johtaa muodostumista sukkularihmaston liittyy normaali sentrosomimäärän toiminta [28]. RWPE-1 eturauhasen soluja testattiin MT aster muodostumiseen (Fig. 4). Solut käsiteltiin ensin nokodatsoli jäällä täysin depolymeroida interphase MT; nokodatsoli poistettiin sitten, ja soluja inkuboitiin tuoreessa lämpimässä väliaineessa MT uusiutumista. Kyky sentrosomien nukleoitumaan, ankkuri, ja pitkänomainen MT määritettiin yhteistyössä immuunivärjäys sentrosomien (anti-γ-tubuliinin) ja MT (anti-α-tubuliinin). MT aster muodostava aktiivisuus sentrosomien arvioitiin mukaisesti aiemmin vahvistetun protokollan [25]. Käsittelemätön RWPE-1-solut osoittivat merkityksetöntä aster muodostumista. Akuutin 2-h käsitellään 0,1 nM BPA, lyhyt asters havaittiin 56%: ssa soluista. Kolme päivää hoidon jälkeen BPA (krooninen altistuminen), ~37% soluista osoitti asters (Fig. 4A, 4B paneelit g-i). Tuloksemme siis viittaavat siihen, että BPA parantaa MT aster muodostumista.

mikroputkijärjestelmä asteri muodostumisen määritys suoritettiin 2-immunovärjättiin sentrosomien (anti-γ-tubuliinin, punainen) ja MT (anti-α-tubuliinin, vihreä). Centrosomal aster muodostus arvioitiin positiiviseksi, jos sentrosomien ollut MT asteri yli 15 MT. Tulokset on esitetty (A) ovat keskimääräisiä ± keskivirhe (SE) kolmen kokeen. Kutakin koetta varten, ja gt; 200 solua tutkittiin. Merkittävyys laskettiin käyttäen Studentin t-testiä vs. kaksikymmentäneljä. *

p

≤0.00002.

Krooninen BPA altistuminen edistää ankkurista riippumaton kasvu C4-2 soluissa

Kyky krooninen BPA altistumisesta muuttaa tai edistää pahanlaatuinen kasvu NPrEC, RWPE-1, LNCaP ja C4-2-solut määritettiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumista määrityksessä. Soluja kasvatettiin alustassa kanssa tai ilman 0,1 nM BPA 10-14 kohdat, ennen kuin ne ympättiin pehmeässä agarissa. Colony muodostumaan NPrEC, RWPE-1, ja LNCaP oli 2%, ja altistuminen 0,1 nM BPA ei muuttanut tehokkuutta pesäkemuodostuksen. Kuitenkin BPA-alttiina C4-2 solut tuottivat merkittävästi enemmän, suurempia, nopeampia kasvavat pehmeässä agarissa pesäkkeiden (taulukko 4, kuva. 5). Prosentuaalinen tehokkuus pesäkkeiden muodostumisen (keskiarvo ± SD) nousi 19,25 ± 7,05% BPA hoitoon verrattuna 2,03 ± 0,40% Altistumattomilla valvonta (

p

0,001). Siirtomaa halkaisija oli 50-400 mikrometriä kontrolleissa vs. 100-1,200 mikrometriä BPA-käsiteltyjen C4-2 soluissa.

edustaja kuvia pesäkkeiden 2 viikon kuluttua inkuboinnin agar. C4-2-soluja, kun läsnä oli 0,1 nM BPA muodostetaan suurempia pesäkkeitä (B, B ’, 100-1200 um halkaisijaltaan) verrattuna kasvatetaan ilman BPA (A, A’, 50-400 um halkaisijaltaan).

keskustelu

Evidence että BPA altistuminen myötävaikuttaa PCa oli eläinkokeista saatuihin [29], [30], [31], [32] tai solu-pohjainen [33 ], [34], [35], [36] mallia. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, joka tarjoaa alustavaa näyttöä yhdistys BPA altistumista PCA kliinisessä ympäristössä. Meidän havainnot 60 urologic potilailla osoittavat, että virtsan BPA taso on itsenäinen ennustetekijöiden biomarkkereiden Eturauhassyövän, koska korkeammat virtsan BPA tasot havaittiin 27 PCa potilasta (geometrinen keskiarvo, 5,74 [95% luottamusväli, 2,63, 12,51] ug /g kreatiniinia) kuin niitä on 33 ei-PCa potilailla (geometrinen keskiarvo, 1,43 [95% CI: 0,70, 2,88] ug /g kreatiniinia) (

p

= 0,012). Toteamisraja tässä tutkimuksessa oli 0,05 ng /ml. Useat väestötutkimukset ovat nyt perustettu BPA kuin arjen ympäristön epäpuhtauksien virtsaan useimpien yksilöiden Yhdysvalloissa populaatioissa. Ensimmäisessä laajamittainen poikkileikkauksen tutkimuksessa Yhdysvalloissa liittyy 2517 osallistujat 2003-2004 National Health and Nutrition Examination Survey (nhanes) [7], BPA havaittiin 93% väestöstä on geometrinen keskiarvo ja 95

persentiilin konsentraatio 2,6 ug /g ja 11,2 ng /g, vastaavasti; toteamisraja oli 0,4 ng /ml vs. 0,05 ng /ml tutkimuksessamme. Myöhemmin tutkimus 2747 aikuisten osallistujien 2003-2006 nhanes [37] ilmoitetaan geometrinen keskiarvo 2,05 ng /g kreatiniinia (25

persentiili: 01:18, 75

persentiili: 3,33); alempi havaitsemisraja oli 0,36 ng /ml. Siten geometrinen keskiarvo virtsan BPA tasojen PCA potilaille tässä tutkimuksessa oli ~2-2.5 kertaa suurempi kuin geometrinen keinot kuin Yhdysvaltain suuret poikkileikkauksen tutkimuksissa. Sen sijaan, geometrinen keskiarvo ei-PCa tutkimuspotilaat oli -50% pienempi kuin geometrinen keinot näiden kahden väestötutkimusten.

vahvuus Tässä tutkimuksessa käytämme menetelmän suosittelemaa Centers for Disease Control and Prevention, joihin kiinteän faasin uuttaminen yhdistettynä isotooppia laimennus-HPLC-MS /MS mittaa koko virtsan BPA referenssilaboratoriossa. Lisäksi me korjataan aiheuttamien vaihtelujen vaikuttavia tekijöitä virtsan laimennus ilmaisemalla tietoja suhteessa virtsan kreatiniinin pitoisuuksia. Lopuksi, kaikilla potilailla oli biopsialla vahvisti, pikemmin kuin itse ilmoitettu PCA. Mahdollinen rajoitus Tutkimuksemme oli, että koko virtsan BPA potilaidemme mitattiin vain kerran. Kuitenkin mukaan kirjallisuudessa, yhteensä virtsan BPA pitoisuudet (vapaa plus konjugoitu) spot näytteistä (kertaluonteinen mittaus) on luotettava menetelmä arvioitaessa lähtötilanteessa altistuminen kaikista lähteistä ympäri kun otos on riittävän suuri [38]. Vaikka toksikokineettisiä tutkimukset ovat osoittaneet, että BPA ja sen päämetaboliitti, BPA-glukuronidi, on melko lyhyt puoliintumisaika (~2.5 h) verenkierrossa ja että ne erittyvät nopeasti virtsaan [39], [40], poikkileikkauksen väestöstä tutkimukset ovat osoittaneet huomattavasti pidemmät puoliintumisajat johtuvat muut kuin elintarvikkeiden altistumista, kertyvät kudoksiin kuten rasvan, ja maksan toiminta, erityisesti ne, jotka liittyvät glukuronisoituvat BPA [12], [39]. Läsnäolo korkea BPA pitoisuuksia virtsassa voi ehdottaa, että elämäntapa tottumukset näillä potilailla voi ylläpitää korkeampaa altistumista. Tässä suhteessa yhdessä kliinisessä tutkimuksessa, BPA tasot virtsanäytteistä kerätyt samana päivänä miehen ja naisen kumppanit korreloivat [41], joka tukee oletuksesta, että samanlaisia ​​elämäntapavalintoja voi määrittää tason BPA altistumista. Lisäksi tuore tutkimus osoitti korkeammalla persoonan vaihtelun (yli 1-3 vuotta) vuonna BPA tasoilla verrattuna koko vaihtelulle 80 naiset [42]. Yhdessä nämä tutkimukset korostavat merkitystä meidän havainto, että kertaluonteinen näytteenotto virtsan BPA korreloi PCa.

Stratifioitu analyysit osoittivat, että yhdistyksen välillä virtsan BPA tasojen ja PCa on erittäin merkittävä (

p

= 0,006) kesken 30 potilasta 65 vuotias (keskiarvo ja mediaani-ikä = 58, alaikäraja = 46), mutta että tämä yhdistys ei pääse merkitystä joukossa puolet potilaista 65 vuotta (Fig. 1). Nämä havainnot ovat kiehtovia, mutta hämmentävä. Otettu nimellisarvo, ne viittaavat siihen, että suurempi BPA altistus liittyy aikaisempaan alkamiseen PCa. Kuitenkin pohjalta teorian kehittävän uudelleenohjelmointi syöpäriskin [43], havaintomme esiin mahdollisuuden varhaisiin uudelleenohjelmointi Eturauhassyövän ihmisillä. Rotilla tehdyt tutkimukset, vastasyntyneille syötetään ympäristön kannalta merkityksellisiä BPA oli suurentunut riski sairastua eturauhasen kasvaimien [29], [44].