Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida biologisen toiminnan kasvaimen etenemiseen ja metastaattinen prosessi karsinoembryonista antigeeni liittyviä solun adheesiomolekyylien (CEACAM) 1, 5 ja 6 haiman (PDAC).

Experimental suunnittelu

CEACAM kaataa solut perustettiin ja arvioitiin in vitro ja in ihonalaisen ja vatsaonteloon hiiren ksenograftimallissa. Tissue ja seerumin ilmentymistä potilailla, joilla PDAC arvioitiin immunohistokemiallisesti (IHC) ja entsyymi immunosorbenttimäärityksillä.

Tulokset

Läsnäolo imusolmuke etäpesäke korreloi CEACAM 5 ja 6 lauseke (määritetty IHC) ja kasvaimen uusiutumisen yksinomaan CEACAM 6. Potilaat, joilla CEACAM 5 ja 6 ilmaus osoitti merkittävästi lyhennetty OS Kaplan-Meier selviytymisen analyysit. Kohonnut CEACAM6 seerumiarvoja osoittivat korrelaatio kaukainen etäpesäke ja. Survival-analyysi paljasti pitkittyneen OS potilaille, joilla on alhainen seerumin CEACAM 1 arvoja. In vitro proliferaatio ja migraatio kapasiteettia nostettiin CEACAM kaataa PDAC soluja kuitenkin hiiriin inokuloitiin CEACAM kaataa soluista osoitti pitkittyneen yleistä-(OS). Määrä spontaani keuhkojen etäpesäkkeiden oli lisääntynyt CEACAM tinkiä ryhmä.

Johtopäätös

vaikutukset välittyvät CEACAM ilmentyminen PDAC ovat monimutkaisia, vaikka yli-ilmentyminen korreloi paikallista alueellista aggressiivinen kasvaimen kasvua . Kuitenkin menetys CEACAM voidaan pitää osana epiteelin-mesenkymaalitransitioon ja on näin ollen melko tärkeää prosessin etäpesäkkeiden.

Citation: Gebauer F, Wicklein D, Horst J, Sundermann P, Maar H, Streichert T, et ai. (2014) Karsinoembryonaalinen antigeeni-sivujen soluadheesiomolekyylit (CEACAM) 1, 5 ja 6 biomarkkereina in Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (11): e113023. doi: 10,1371 /journal.pone.0113023

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 20 lokakuu 2014; Julkaistu: 19 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Gebauer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

viime vuosina, ennuste kärsivien potilaiden haiman adenokarsinooma (PDAC) ei ole merkittävästi parantunut [1], [2]. Useimmat potilaat läsnä on pitkälle edennyt kasvain vaiheiden tekeminen parantava hoito mahdottomaksi. Täydellinen kirurginen resektio, jota seurasi adjuvanttihoitoa on nykyään kultaa standardi terapiassa PDAC. Kuitenkin vaikka potilaalla jälkeen täydellinen kirurginen kasvaimen resektiota, yleinen eloonjääminen on edelleen heikko mediaani elinaika 20-24 kuukautta [3] – [5]. Aggressiivinen paikallista alueellista kasvaimen kasvua lisäksi aikaisin kaukainen ja vatsakalvon etäpesäke ja korkea chemoresistance tehdä PDAC yksi tappava ruoansulatuskanavan kasvaimet [6].

Nykyään ei luotettava seerumissa eikä kudoksen markkereita ennustamiseksi kliininen aikana potilaiden diagnoosin jälkeen PDAC ovat käytettävissä. Lisäksi molekyyli- vuorovaikutukset kasvaimen isännän ja paikalliset tekijät, jotka mahdollistavat PDAC näyttämään niin aggressiivinen eteneminen tunnetaan huonosti. Siksi on välttämätöntä tarvetta ymmärtää paremmin tuumoribiologiassa suhteen mekanismien paikallisen syövän leviämisen ja toistuminen.

Carcioembryonic antigeeni liittyvät solun adheesiomolekyylien (CEACAMs) ovat jäseniä glykosyylifosfatidyyli (GPI ) linkatun immunoglobuliinin (Ig) superperheen [7]. On yli 17 geeniä, jotka kuuluvat tähän perheeseen, ja niiden geenituotteiden pääasiassa integroitu solukalvon. Sisällä CEACAM perheen CEACAM alatyyppejä ovat rakenteellisesti samankaltaisia ​​ja fysiologisesti ilmentyvät apikaalisella pinnalla lukuisia solutyyppejä, esim. endoteelisolujen ja hematopoieettiset solut sekä epiteelisolujen eri elimiin. Riippuen solutyypistä ja CEACAM alatyyppi, lähetetyn vaikutus sitoutumisen jälkeen tietyn kumppanin vaihtelee, kuten sääntely soluadheesion, tuumorisuppressiogeeneksi, angiogeneesi, aktivointi leukosyyttien ja muiden immunologiseen reaktiivisia soluja, ja säätely solusyklin [8] – [11]. CEACAM 5-geeni, sen tuote joka tunnetaan myös nimellä CD66e koodit carcioembryonic antigeeni (CEA) ja on tullut yksi tunnetuimmista jäsenten Ig-superperheen, koska sillä on merkittävä rooli kliinisessä rutiini kuin tuumorimarkkeri useita kasvain yhteisöt kuten ruoansulatuskanavan ja hengitysteiden syöpäsairauksia [12]. Kuitenkin, koska puuttuu herkkyys ja spesifisyys sen ennustearvo yksin on edelleen epätyydyttävä [13] – [16]. CEACAM alatyyppiä 1 ja 6 on kuvattu olevan ali- tai yli-ilmentyy useissa kasvaimen yksiköitä, kuten keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä ja melanooma [17] – [23]. Vaikka yli-ilmentyminen on laajalti havaittu joissakin tutkimuksissa jopa ilmoittaa vähentynyttä ilmentymistä tietyissä kasvaimen yhteisöihin eri kasvain vaiheissa.

Mielenkiintoista, viimeaikaisissa tutkimuksissa havaittu CEACAM 1 ja 6 ilmentymisen ensisijainen PDAC korreloivat lyhennetty yleinen elossaololuku [24 ], [25]. Biologinen periaatteet miksi CEACAM ilmaisu välittää kasvaimen etenemistä ei täysin tunneta. Siksi analysoitiin vaikutuksia CEACAM 1, 5 ja 6 in vitro ja vahvistetaan ksenografti hiirimallissa tutkia toiminnallista roolia CEACAM ilmentymisen PDAC. Sen arvioimiseksi, onko CEACAM ilme vaikuttaa kasvaimen etenemistä potilailla, yhdistimme seerumi ja immunohistokemiallista analyysiä varten CEACAM molekyylien 1, 5 ja 6 analysoida, onko korrelaatio CECACM ilmaisun kanssa kliinis-pathologcial data sairastavien potilaiden PDAC.

Materiaalit ja menetelmät

solun viiva ja CEACAM kaataa

ihmisen haiman adenokarsinoomasolulinja PaCa 5061 perustettiin ensisijaisesta kasvain. Yksityiskohtaiset ominaisuudet perustamisen ja kulttuurin solulinjan on kuvattu aiemmin [26]. Lyhyesti, solut saadaan potilaalta, jolla on PDAC joille tehtiin kirurginen resektio Department of General, sisäelinten ja Torakaaliikirurgia yliopiston Medical Center Hamburg-Eppendorf. Lopullinen kasvain mukainen luokitus UICC 7

th ed. paljasti pT3, N1, L1, V1, R0, G2 PDAC haiman pään.

CEACAM kaataa variantteja suoritti shRNA häiriöt kuten aiemmin on kuvattu [27]. Oligonukleotidit kloonattiin pSIREN-RetroQ vektoriin ja transfektoitiin FuGENE transfek- aineet (Roche Diagnostics, Hilden, Saksa) kasvainsolujen kanssa. Valinta kaataa kloonien suoritettiin ilmentämällä Puromysiinin chemoresistance (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Ranska) ja virtaus-taussytometrin lajittelu (FACS-LSR Fortessa, BD Bioscience, San Jose, USA). Vain solut knock alas 90%, määritettynä virtaussytometrialla, käytettiin in vitro ja in vivo kokeissa. Konjugoimattoman vasta-aineet CEACAM 1, 5 ja 6 ja vastaavien hiiren biotinyloitu IgM tai rotan IgM isotyyppikontrollilla (Dako, Glostrup, Tanska), havaittiin vuohen anti-hiiri-Ig-APC (BD Biosciences). Solut analysoitiin käyttäen CyFlow-sytometrillä (Partek, Münster, Saksa), jonka jälkeen lisätään AlexaFluor488-konjugoitu streptavidiini (Invitrogen) ennen värjäystä.

In vitro karakterisointi CEACAM kaataa solujen

Solujen proliferaatio arvioitiin käyttäen kolorimetristä XTT määritystä (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 3000 solua /kuoppa. 48 tunnin jälkeen, jotta solujen kiinnittyminen, soluja inkuboitiin kolorimetrisiä substraatteja. Kolorimetrinen muutokset mitattiin usean hyvin spektrofotometrillä (MR5000 monilevylukija, Dynatech, Denkendorf, Saksa).

erot solujen vaeltamiseen arvioitiin käyttäen FluoroBlok migraatiokokeessa (BD Bioscience, San Jose, USA) kanssa 24- hyvin 8 mikronin huokoskoon inserttejä. Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan RPMI1640 (Invitrogen, Darmstadt, Saksa) pitoisuutena 300,000 solua /ml. 400 ui solususpensiota lisättiin apikaaliseen kammioon, ja 800 ui RPMI1640 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Invitrogen) lisättiin alaosaan. Määritys inkuboitiin 24 tuntia standardeissa soluviljelyolosuhteissa.

poistamisen jälkeen Chemo houkutusaine pohjan kammion, visualisointi siirtynyt solujen suoritettiin lisäämällä 500 ul /kuoppa HBSS-puskurissa Calcein AM (Invitrogen) 4 ug /ml pohjaan hyvin ja inkuboitiin 1 h. Readout suoritettiin 494/517 nm (Ex /Em) on Genios alhaalta lukeminen fluoresenssilevylukijaa (Tecan, Männedorf, Swizerland).

Laminaarivirtausta kokeet tehtiin käyttämällä IBIDI microslides VI (IBIDI, Munich, Saksa) yhdistetty ruiskupumpun (malli 100-sarja, kdScientific, Holliston, MA) ja solujen liikkumisen havaittiin käännettyä mikroskooppia (Zeiss, Jena, Saksa; Axiovert 200). Kasvaimen solut suspendoitiin solujen elatusaineeseen (20 ml, 200 000 solua /ml) ja microslides päällystettiin ihmisen keuhkojen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HPMEC) (Promocell, Heidelberg, Saksa). HPMEC suspendoitiin soluviljelyalustaan, kylvetään microslides pitoisuutena 5 x 10

5 solua /ml, ja 20 ui elatusainetta solujen pipetoitiin kuhunkin virtauskanavaan. Cell kasvoi konfluentteja yli yön standardiolosuhteissa. Applied leikkausnopeuksilla vaihteli 0,05 dyn /cm

2-10,0 dyn /cm

2. Solujen liike tallennettiin ja analysoitiin suhteessa laatuun liikkeen (tarttuvuus, liikkuva ja kiinnittäminen) ja vierimisnopeus käyttäen CapImage 8,5 ohjelma (Dr. Heinrich Zeintl, Heidelberg, Saksa).

Eläinkokeet

eläinkokeet suoritettiin mukaisesti UKCCR suuntaviivoja eläinten hyvinvointia kokeellisessa neoplasia [28], paikalliset eettinen komitea eläinkokeiden (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit, Verbraucherschutz; Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz; Billstr. 80 , D-20539 Hamburg, Germany, hanke nro G58 /09) ja samoin institutionaalisten eläinten hyvinvoinnista vastaavan yliopiston Medical-Center suositellut ja hyväksyi tutkimuksen.

ihonalainen kasvain malli, miljoona PaCa 5061-kasvainsoluja injektoidaan oikean lapaluun alueelle 8-12 viikkoa vanhoja C57BL /6N pfp

– /- /rag2

– /- double-hiirten. Eläimet lopetettiin kun primaarikasvainten ylitti 2 cm

3 tai haavaumia hiiren ihon, hiiret olivat kuolettavasti narcotized ja tapetaan cardiocentesis.

arvioimiseksi vaikutuksen CEACAM ilmaisun peritoneaalidialyysia levittämiseen, perustimme intraperiteoneal tuumorin malli, kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti, miljoona kasvainsoluja ruiskutettiin vasemmassa alakulmassa vatsan neljänneksessä vatsaonteloon suspensiona tilavuuteen 200 ui. Arviointi ja ajankohtina päättymisestä koe tehtiin mukaisesti aikaisemman perustettu pisteytysjärjestelmä. Arviointi mitassa intraperitoneaalista kasvaimen kasvua tehtiin modifioidun vatsakalvon carcinomatosis indeksi (PCI) kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, vatsaonteloon on jaettu 9 Abdominoplastiikka-lantion alueilla, riippuen pidentää tuumorin kasvun, tulokset välillä 0 ja 3 pistettä annetaan (0 pistettä: ei kasvaimen läsnä; 1 piste: kasvaimen 1 mm

3 , 2 pistettä: kasvain 1 ja 3 mm

3, 3 pistettä: kasvain 3 mm

3), jotka johtavat PCI pisteet 0 27.

kvantifiointi keuhkojen etäpesäke, levitettävä kasvainsoluja (DTC) ja CTC by Alu-PCR

vasemmassa keuhkot homogenoitiin näytteessä haitta (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Saksa) ja altistetaan DNA-eristys (QIAamp DNA Mini kit, Qiagen). Luuytimen kerättiin huuhtelemalla vasen reisiluu 1 ml NaCl 0,9%. 200 ui verta ja luuytimen suspensioita alistettiin DNA- eristäminen käyttäen QIAamp DNA veren Mini Kit.

DNA pitoisuudet kaikki näytteet kvantifioitiin käyttäen NanoDrop spektrofotometrillä (Peqlab, Erlangen, Saksa). Koska pitoisuus havaittavissa Alu-sekvenssit seuraavat qPCR olisi vaikuttanut yksinkertaisesti muuttamalla DNA-pitoisuuksia, kaikki lung- ja luuytimen-DNA-näytteet normalisoitiin 30 ng /ul käyttäen AE-puskuria (Qiagen). Pitoisuudet veren DNA olivat melko samanlaisia ​​kaikissa näytteissä (n. 10 ng /ul), minkä vuoksi ei normalisoitu. qPCR suoritettiin vakiintuneiden ihmisspesifiset Alu-alukkeita [31]. 2 ui kokonais-DNA: ta (eli 60 ng keuhko /luuytimen-DNA: ta; 20 ng veri-DNA: ta) käytettiin kunkin qPCR. Numeeriset tiedot määritettiin standardikäyrää vastaan, kuten on kuvattu [32]. Toteamisraja erityinen ihmisen Alu-sekvenssin signaalit määritettiin kullekin kudostyypin testaamalla DNA viidestä terve (ei pistetään) pfp

– /- /rag2

– /- hiirten samankaltainen sukupuolen ja iän mukaan. Kunkin näytteen, analyysit suoritettiin kaksinkertaisina ja itsenäisinä kokeissa vähintään kaksi kertaa.

Potilaille ja kirurgisten

Vuosien 1992 ja 2009, kaikki potilaat, joille tehtiin suuri resectional Haimaleikkauksen laitoksella yleinen, Viskeraalinen ja Torakaaliikirurgia yliopiston Medical Centre Hamburg-Eppendorf sisällytettiin prospektiivisessa, haiman tietokantaan. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Chamber of Physicians Hampuri, Saksa. Kirjallinen lupa käyttää näytteiden tutkimustarkoituksiin saatiin kaikille potilaille ennen leikkausta tai veren piirustuksen.

Potilaat, joilla PDAC haiman pään alueen rutiininomaisesti tehtiin joko osittainen pankreatikoduodenektomia (PD) tai mahaportin säilyttävää duodenopancreatectomy (PPDP ) ja urut säilyttävää resektio menetelmiä tapauksissa krooninen haimatulehdus (CP). Vain potilaita, makroskooppisten täydellinen kasvaimen resektiota sisällytettiin lopulliseen analyysiin. Sairaalakuolleisuus määriteltiin kuolema milloin tahansa koko ajan sairaalahoitoa. Seurantatiedot saatiin toimielimemme poliklinikalla, sopivista yleislääkäreiden vastaanotoilla tai alueellisesta syövän rekisteriä. Kun kuolinpäivä ei ole kirjattu, potilaat sensuroitiin viimeksi tallennetun yhteystietoja.

Tissue mikro array rakentaminen ja immounohistochemistry

Tissue ytimiä saatiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosblokeista potilaista, joilla patologisesti todistettu PDAC. Edustavalla kasvaimen valittiin perustuen värjäys hematoksyliini-eosiinilla.

TMA rakentaminen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [33] – [35]. Lyhyesti, 252 kudossylintereitä, jonka halkaisija on 0,6 mm lävistettiin alkaen ”luovuttajan” kudosblokeista käyttäen mittatilaustyönä puoliautomaattinen robotti tarkkuuslaite ja sijoitetaan yhteen parafiiniblokkiin joka sisälsi 252 yksittäisten näytteiden. Näiden näytteiden oli 142 PDACs, 40 neuroendokriinisiä haiman kasvaimet (NET), 33 intraduktaalisissa papillaarinen mucinous kasvain (IPMN), ja 37 näytettä terveen kudoksen negatiivisena kontrollina. Tuloksena TMA lohkoja käytettiin tuottamaan 4-um: n leikkeitä, jotka siirrettiin liima-pinnoitettu dia järjestelmä (Instrumedics Inc., Hackensack, New Jersey, USA).

immunohistokemiallisella värjäyksellä pöytäkirjat optimoitu eri hyvänlaatuinen ja pahanlaatuinen kudosten laajan monivaiheisessa menettelyssä että modifioitu värjäytyminen protokollan kunnes haluttu selektiivinen värjäys saatiin aikaan mahdollisimman taustan signaali (mukaan [36]).

Osiot poistettiin parafiini ja kuivattiin yön yli 37 ° C: ssa . Antigeeni haku suoritettiin mikroaaltouunissa hoitoon sitraattipuskurissa (pH 6,0) 1 minuutin ajan, jälkeen leikkeet niihin lisätään Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS; 0,05 M Tris-HCl, pH 7,6 ja 0,15 M NaCl) ja blokattiin kanin AB-seerumia (Biotest Diagnostics, Dreirach, Saksa) laimennettuna 1:10 TBS 60 minuuttia. CEACAM värjäys suoritettiin käyttämällä erityistä CEACAM monoklonaalinen vasta-aine (CEACAM1 klooni 4D1 /C2 IgG2a, in-house-kloonin (kuvattu aiemmin [37]) laimennoksena 1:200, CEACAM5 klooni # 2383 IgG1 laimennoksella 1:50 (Cell Signaling, Beverly, USA); CEACAM6 klooni IgG1 (9A6), laimennoksena 1:40 [Sigma Aldrich, Hampuri, Saksa]) yön yli 4 ° C: ssa. Biotinyloidun sekundaarisen kanin polyklonaalista anti-hiiri-vasta-aineita (Dako, Hampuri, Saksa) käytettiin sitomaan CEACAM primaarista vasta-ainetta. Epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä transistion (EMT) merkkiaineet olivat tutkimukset immunohistokemiallisesti samoin. ZEB 1 (IgG laimennussuhteella 1:100, polyklonaalista kanin anti-humaani, Atlas Antibodies, Tukholma, Ruotsi), ZEB 2 (IgG laimennussuhteella 1:100, polyklonaalista kanin anti-humaani, Atlas Antibodies, Tukholma, Ruotsi ), E-kadheriini (), Pan-sytokeratiinivasta ().

sitoutumiskohtia havaittiin käyttäen ABC-AP-Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA). Alkalisen fosfataasin aktiivisuus biotiini-streptavidiini-alkalinen fosfataasi-kompleksi visualisoitiin käyttäen naftoli-AS bisfosfaatin substraattina ja hexatozised New Fuchsin käytettiin samanaikaista kytkentää. Leikkeet vastavärjättiin Mayerin hemalum (Merck, Darmstadt, Saksa).

värjäytymisen intensiteetti (0, 1+, 2+, 3+) ja osa positiivisia kasvainsoluja pisteytettiin kunkin kudoksen paikka kuin äskettäin julkaistussa [34]. Täplät ilman värjäystä ja joiden värjäytymisen intensiteetti 1+ in 70% ja 2+ 30% kasvainsoluista pisteytettiin CEACAM alhainen, keskitason pisteitä annettiin varten värjäytymisen intensiteetti 1+ vuonna ≥70%, 2+ ≥30% tai 3+ 30% kasvainsoluista ja huippupisteet annettiin varten värjäytymisen intensiteetti 2+ ≥70% tai 3+ ≥30% tuumorisolujen. Immunohistokemiallinen analyysi kohdat tehtiin ilman tietoa potilaiden henkilöllisyyden tai kliininen tila. Immunohistokemiallista analyysiä ja pisteytys suoritettiin kaksi riippumatonta tutkijat eivät olleet tietoisia potilaan tulokseen tai muita kliinisiä löydöksiä. 95% näytteistä, arvioinnit kahden tarkkailijaa olivat identtisiä, loput diat arvioitiin uudelleen, ja konsensus päätökset tehtiin.

värjäytyminen protokollaa sekä käytettiin hiiriä kasvatettiin kasvaimia ja osoitti vastaavia herkkyys ja spesifisyys verrattuna TMA värjäystä.

Entsyymi immunologinen määritys (ELISA) B

kvantifiointiin CEACAM alatyyppejä ääreisverenkierrossa, seeruminäytteistä 46 valkoihoinen potilaalla on PDAC ja 47 valkoihoinen potilaiden CP , jotka olivat tarkoitettu kirurginen hoito, analysoitiin entsyymi-immunomääritys (ELISA). Kaikki verinäytteet saatiin suoraan ennen leikkausta. Kuten terveillä verrokeilla, 50 valkoihoinen veri-pankki luovuttajien, saatu instituutin verensiirtoja (University Medical Centre Hamburg-Eppendorf), otettiin mukaan tutkimukseen. Valmistaminen seeruminäytteet tehtiin standardoitua protokollaa [38]. Mediaani-ikä oli 62,4 vuotta klo diagnoosin (vaihteluväli 36,3-90,4 vuosi, 24 male [52,2%], 21 naispuolinen [47,8%]). Seerumin arvot 47 potilasta, joille tehtiin leikkaus johtuu krooninen haimatulehdus (mediaani ikä diagnoosin aikana 47,0 vuotta, vaihteluväli 31,1-76,1 vuotta) ja 50 näytettä terveiden verenluovuttajien käytettiin verrokkeina (25 male [50%], 25 naispuolinen [ ,,,0],50%]).

havaitsemista CEACAM 1 ja CEACAM 5 seerumissa, 96-kuoppaisille joustava mikrotiitterilevyille (Costar 9019, USA) päällystettiin 50 pl kuoppaa kohden 2 ug /ml monoklonaalista hiiren capture-vasta-aine (klooni 283324 ja 843130, hiiren IgG1, R CEACAM 5-lammas lgG, klooni 843131Goat IgG, R fraktio V, puhtaus 98%, Sigma Aldrich) PBS /T (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, pH 7,3, joka sisälsi 0,05% v /v Tween) 45 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen inkuboitiin 1 h: n havaitsemiseen vasta-aineen anti-CEACAM 6 (hiiren lgG1, klooni 843158, R 5% verrattuna CEACAM ekspression valvontaa soluissa (kuvio 1A). Lisääntymistä ja muuttoliike kasvoi CEACAM kaataa soluja kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 1 B ja C), mutta CEACAM knockdown ei vaikuttanut kiinnittymisen stimuloituun endoteeliin (HPMEC) (kuvio 1 D ja E).

( A). Basal CEACAM ilme vaihteli riippuen CEACAM alatyyppi, korkeimmat tasot havaittiin CEACAM 1, välituote CEACAM 6 ja alimman tason CEACAM 5. Kuten nähdään leviämisen (B) ja muuttoliike määritykset (C), CEACAM kaataa soluista osoitti korkeampaa proliferatiiviset ja migrative mahdollisia kontrollisoluihin verrattuna. Erot tarttuvuus stimuloidaan (TNFa) endoteelisolujen eivät olleet havaittavissa välillä CEACAM kd ja ohjaus soluja. Kumpikaan keskimäärin (D) eikä keskimääräinen tarttuvuus aika endoteelisolujen oli erilainen (E). Hiiren ksenograftikasvaimissa olivat erittäin positiivisia CEACAM 1, 5 ja 6. immunohistokemiallinen värjäys hallinnassa solut osoittivat täydellinen puuttuminen CEACAM ilmaisun immunohistokemia kaataa soluissa (F).

valvonta läsnäolosta CEACAM kaataa sisään hiiren kasvanut kasvaimia, IHC värjäys CEACAM 1, 5 ja 6 tehtiin ja, kuten kuviossa 1F, knock alaspäin pysyivät vakaina ja edelleen läsnä kasvaimia kasvanut hiirillä.

ksenograftimallia funktionaalista analyysia varten CEACAMs vuonna PDAC

Voit vastata kysymykseen, onko CEACAM perheenjäsenet ole toiminnallista vaikutusta kasvaimen muodostumiseen, kasvua ja etäpesäkkeiden, joka on -tuumoriksenografti koe ihmisen PDAC soluja (ja ilman CEACAM knockdown ) in pfp

– /rag2

– hiirillä suoritettiin. Ihon alle tuumorisoluinjektion hiiret inokuloitiin CEACAM kaataa solut osoittivat merkitsevästi pidentynyt eloonjäämiseen saapumiseen asti päättymisen kriteereitä (mediaanielinajassa 144 d) verrattuna PaCa 5061 ohjaus (mediaanielinajassa 104 d; P = 0,014) ja villin tyypin PACA 5061 (keskimääräinen eloonjäämisaika 79 d; P = 0,01) (kuvio 2A). Kasvaimen koon ja painon kuolin- ei eronnut merkittävästi ryhmien välillä (tuloksia ei ole esitetty).

vatsaonteloon, ei eroja vatsakalvon carcinomatosis indeksi (PCI) havaittiin ajankohtana maanmuokkauskohteisiin (80 päivän kuluttua injektio). CEACAM kaataa osoitti enemmän DNA: sta ihmisen DNA: n vasen keuhko (P = 0,021) (C), joka korreloi korkeamman metastaasilastista keuhkoissa, ei kuitenkaan eroa havaittiin verenkierrossa olevia kasvainsoluja veressä (D) .

Vaikka ihonalaisen ksenograftimallia osoitti pitkittyneen OS hiiriä CEACAM knockdown, vaikutuksesta CEACAM kaataa että vatsaonteloon ksenograftimallia ei ollut läsnä. Vatsakalvon carcinomatosis indeksi eivät eronneet ryhmien välillä, mikä oli myös edustettuna puuttuvat eroja levitystä ei ollut eroja CEACAM kaataa ja kontrolliryhmän kiertävien tuumorisolujen ääreisveren (kuvio 2B ja D). Kuitenkin CEACAM kaataa ryhmä, löysimme suurempia määriä ihmisen DNA (tarkoittaa merkittävästi enemmän PDAC solut) keuhkoissa verrattuna verrokkiryhmään (kuvio 2C). PDAC solut osoittivat mitään affiniteettia levittämistä luuytimeen, ihmisen kasvainsolujen DNA ei havaittu missään ryhmässä. Merkkiaineita EMT ei osoittanut mitään merkittäviä eroja villityypin ja CEACAM kaataa kasvainten määritettynä immunohistokemiallisesti (kuvio S1).

immunohistokemiallinen CEACAM 1, 5 ja 6 ilmaus potilaiden näytteistä

Poissa 142 kasvain paikkoja, 5 (3,5%) yksilö ei pystytä arvioimaan sen TMA puuttuvien tai ne eivät edusta kasvainkudoksen. Tissue yksilöitä 137 potilaista oli lopulta arvioitavissa ja korreloi klinikan-patologinen data. Potilaat olivat iältään +33,1-85,0vuotta (mediaani 63,5 vuotta). Oli 82 miehillä (59,9%) ja 55 naisia ​​(40,1%).

CEACAM 1 ekspressio havaittiin 62,8% kaikista Tuumorinäytteet (n = 86), CEACAM 5 87 potilaalla (63,5%) , CEACAM 6 ilmentymistä havaittiin 99 potilaalla (72,3%). Suurin osa kasvaimista oli homogeeninen värjäys kunkin näytteen, vaikka vähemmistö kasvain yksilöitä, havaitsimme epähomogeeninen IHC värjäyskuvion sisällä kasvaimen alueella. Ekspressiokuviota kaikkien kolmen CEACAMs oli kalvomainen ja sytoplasmiset sekä (kuva 3). Expression of CEACAM 5 liittyi läsnäolo CEACAM 6 lausekkeen (P 0,001). Välinen korrelaatio CEACAM 1 ja CEACAM 5 lauseke (P = 0,113) tai CEACAM 6 ei havaittu (p = 0,09).

korrelaatio kliinis-patologisten tiedot eivät osoittaneet merkittävää yhteyttä minkään parametrin CEACAM 1 paitsi korrelaatio etäpesäkkeiden (P = 0,008). CEACAM 5 ja 6 ekspressio korreloi positiivisesti imusolmuke tila (P = 0,017 ja P = 0,046, vastaavasti) ja etäpesäkkeiden (P 0,001) (taulukko 1).

Kaplan-Meier- selviytyminen analyysi ei osoittanut korrelaatiota CEACAM 1 ilme ja yleinen (OS) tai tautivapaan elinajan (DFS), tässä järjestyksessä. Potilaat, joilla on positiivinen CEACAM 5 ja /tai 6 ilmentymisen oli lyhennetty OS ja DFS (P = 0,025 ja P = 0,007, P = 0,010 ja P = 0,030, vastaavasti) (kuvio 4A-C, taulukko 2). Potilailla, joilla on positiivinen ilmaisu kaikille kolmelle CEACAM proteiineja ei ole merkittäviä eroja DFS tai OS verrattuna potilailla, jotka olivat negatiivisia kaikissa CEACAM alatyyppejä (P = 0,144 ja P = 0,742, tuloksia ei ole esitetty), ei havaittu.

(A-C). CEACAM 1 positiivinen potilailla esiintyi mediaani oli 17,0 kk (+14,0-20,1kuukautta), CEACAM 1 negatiivinen 23,0 kuukautta (9,5-36,5 kuukautta, P = 0,279). OS CEACAM 5 positiivisten potilaiden oli 16,0 kuukautta (+12,8-+19,2kuukausi) vs. 22,0 kuukautta (+4,1-+47,9kuukautta) (p = 0,025). CEACAM 6 positiiviset potilaat osoittivat OS 14,0 kk (7,9-20,0) vs. 22,0 kuukautta (+5,6-38,4kuukautta, P = 0,010). Eloonjäämiskäyriä korrelaatiota yleiseen-selviytymisen ja CEACAM seerumin lauseke (D-F). CEACAM 1 positiiviset potilaat osoittivat OS 11,8 kk (2,4-25,2) vs. 18,3 kuukautta (+10,0-+26,2kuukausi, P = 0,022). Mediaani potilaille positiivisia CEACAM 5 oli 15,7 kk (+2,4-+32,3kuukautta) vs. 18,6 kuukautta (8,7-28,6 kuukautta, P = 0,651), ja mediaani potilaille, joilla CEACAM 6 positiivisuus oli 18,8 kk (+9,5-+28,1kuukautta ) vs. 12,8 kuukautta (+3,3-+22,3kuukausi, P = 0,187). Boxplots for CEACAM 1 seerumin lauseke (G), CEACAM 5 (H) ja CEACAM 6 (I) verrattuna haiman adenokarsinooma (PDAC), krooninen haiman (CP) ja terveitä verenluovuttajia (BD). Vastaanotin toiminta käyrä (ROC) varten CEACAM seerumin lauseke (J).

CEACAM 1, 5 ja 6 seerumista

CEACAM 1 arvot PDAC ei koholla verrattiin potilaille, joilla on CP, mutta olivat korkeammat kuin BD (PDAC mediaani 33,0 ug /l, alue 3,3-+136,7 ug /l; CP mediaani 23,1 ug /l, alue 1,8-+110,1; BD mediaani 16,1 ug /l, alue 7,8-36,5 ug /l; P = 0,059 ja P 0,001, vastaavasti). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin CEACAM 5: seerumin arvot olivat korkeammat PDAC ryhmässä verrattuna BD, mutta ei CP (PDAC mediaani 8,5 g /l, alue 0,7-75,2 ng /ml; CP mediaani 4,8 g /l, alue 0.7- 24,0; BD mediaani 1,9 g /l, alueella 0,2-9,2 ug /l; P = 0,122 ja P = 0,002, vastaavasti). Potilaat, joilla PDAC osoitti koholla CEACAM 6 seerumia ilmaisu verrattuna sekä CP ja BD (PDAC mediaani 2,90 ug /l, alue 1,34-5,46 mikrog /l; CP mediaani 2,25 ug /l, alue ,77-+5,15; BD mediaani 2,34 ug /l , alue 1,25-6,99 ug /l; P = 0,06 ja P = 0,029, vastaavasti). Yhdessäkään suoritettu analyysien merkittävä ero CP ja BD oli havaittavissa (kuvio 2G-I).

Receiver operating ominaiskäyrät käytettiin luomaan herkkyyttä-spesifisyys suhde CEACAM 1, 5 ja 6. optimaalinen raja-arvot määritettiin Youdens-indeksi laskeminen. Area under the curve (AUC) CEACAM 1 oli 0,711 (cut-off-arvo 184,1 g /l), sillä CEACAM 5 0,689 (cut-off-arvo 1,95 g /l) ja CEACAM 6 0,664 (cut-off arvo 3,58 ug /l) (kuvio 2J) herkkyys CEACAM 1 havaitsemisessa PDAC oli 53,5% vastaavaan spesifisyyden 54,7%. Sillä CEACAM 5, herkkyys on 79,1% ja spesifisyys 44,2%. Herkkyys CEACAM 6 oli 47,0% ja spesifisyys 82,6%. AUC yhdistelmänä kaikkien kolmen CEACAMs ei osoittanut parannusta verrattuna määrittämiseksi kunkin CEACAMs yksinään (AUC 0,680, tuloksia ei ole esitetty).

korrelaatiota CEACAM seerumin arvot kliinis-patologisten tiedot, seerumin arvot jaettiin alhaisella tasolla (alle 75

persentiili) ja korkean tason ryhmä (≥75

persentiili). Korkea CEACAM 6 arvojen läsnäolo etäpesäkkeiden (P = 0,009) ja luokittelu (P = 0,019) (taulukko 1).