Krooninen sairaus

tiivistelmä

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) kudokset ovat korvaamaton voimavara kliininen tutkimus. Kuitenkin nukleiinihapot uutetaan FFPE kudokset ovat hajanaisia ​​ja kemiallisesti muunnetut tekee niistä haastavia käyttää molekyylitutkimukset. Analysoimme 23 tuore jäädytettyjen (FF), 35 FFPE ja 38 pariksi FF /FFPE yksilöitä, jotka edustavat kuutta eri ihmiskudostyypeistä (virtsarakon, eturauhasen ja paksusuolen syöpä, maksan ja paksusuolen normaali kudos; reaktiivisia nielurisojen) tutkiakseen mahdollista käyttöä of FFPE näytteiden seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS), joka retrospektiivinen ja mahdollisille kliinisissä tutkimuksissa. Kaksi menetelmät DNA ja kolme menetelmää RNA uuttamalla FFPE kudoksista verrattiin ja havaittiin vaikuttavan nukleiinihapon määrään ja laatuun. DNA ja RNA valikoiduista FFPE ja pariksi FF /FFPE näytteitä käytettiin exome ja transcriptome analyysi. Valmisteet DNA Exome-Seq kirjastojen oli vaativampi (29,5% onnistuminen) kuin RNA-Seq kirjastoja, oletettavasti koska muutokset FFPE kudokseen johdettua DNA. Kirjastot voidaan edelleen valmistaa RNA eristettiin kahden vuosikymmenen vanhaa FFPE kudoksiin. Tiedot analysoitiin käyttämällä CLC Bio Genomics Workbench ja paljasti järjestelmällisiä eroja FF ja FFPE kudos johdettua nukleiinihappokirjastoja. Tästä huolimatta, pairwise analyysi DNA Exome-Seq tiedot osoittivat konkordanssin 70-80% varianttien FF ja FFPE näytteitä säilytettiin vähemmän kuin kolme vuotta. RNA-Seq tiedot osoittivat korkea korrelaatio ilmaisun profiileja FF /FFPE parit (Pearson korrelaatiot 0,90 +/- 0,05), riippumatta säilytysaika (enintään 244 kuukautta) ja kudoksen tyyppi. Yhteiset 1494 geenejä tunnistettiin ekspressioprofiileja jotka olivat merkittävästi erilaiset välillä pariksi FF ja FFPE näytteitä riippumatta kudostyypin. Meidän tulokset ovat lupaavia ja viittaavat siihen, että NGS voidaan tutkia FFPE yksilöitä sekä etu- ja jälkikäteen arkisto perustuvat tutkimukset, joissa FF yksilöt eivät ole käytettävissä.

Citation: Hedegaard J, Thorsen K, Lund MK, Hein A-MK, Hamilton-Dutoit SJ, Vang S, et ai. (2014) seuraavan sukupolven sekvensointi RNA ja DNA Eristetty Parilliset Makean jäädytetty ja Formaliinifiksoidusta parafinoidut näytteitä ihmisen syövän ja terveessä kudoksessa. PLoS ONE 9 (5): e98187. doi: 10,1371 /journal.pone.0098187

Editor: Zhuang Zuo, UT MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 30, 2014

Copyright: © 2014 Hedegaard et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Pääsy sekvenssi data, joka sisältää henkilön tunnistetietoja, tarvitsee allekirjoitus on kulunvalvonta muoto, ja niihin voi tutustua osoitteessa Eurooppalainen Genome-phenome Archive [25] käyttämällä tutkimuksen ID EGAS00001000737 seuraava pyyntö MOMA Data Access komitea. Expression matriisit ovat rajoituksetta kautta ArrayExpress [REF: www.ebi.ac.uk/arrayexpress] alla liittymistä: E-MTAB-2523.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Tanskan National Advanced Technology Foundation (https://hoejteknologifonden.dk/), John ja Birthe Meyer Foundation ja Tanskan Cancer Society (https://www.cancer.dk/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Anne-Mette K. Hein ja Bjarne Knudsen työskentelevät CLC bio, joka on QIAGEN yritys. Mette Katrine Lund ja Mogens Kruhøffer työskentelee AROS Applied Biotechnology. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) kudosnäytteitä tallennetaan diagnostinen patologia arkistoon edustavat korvaamaton biopankkia jälkikäteen kliininen tutkimus. Lisäksi FFPE yksilöt voivat olla hyödyllisiä tulevien tutkimusten jättämällä keräämistä tuoreen jäädytettyjen (FF) yksilöitä. Valitettavasti nukleiinihapot on vaikeampi poimittava FFPE kudoksesta koska tarve poistaa parafiinia ja torjua kovalenttisten proteiini-DNA vuorovaikutuksia, jotka johtuvat fiksaatioprosessi. Lisäksi kiinnitys viive (eli leikkaussalin iskeeminen aikaa), tallennuksesta prosessi, kudosvalmistuksen, parafiinivalu, ja arkistointiteknologioita edistävät pirstoutumista, silloittumista ja kemiallinen muutos FFPE kudoksesta johdettua nukleiinihappoja. Nämä muutokset häiritsevät monia klassisen molekyyli- analyysejä vaativat korkealaatuisia nukleiinihappoja. Ennakot seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) tekniikat mahdollistavat tutkinnan genomien, epigenomes ja transcriptomes rajoitetuin näytemateriaalin. Lisäksi tämä analyysi voidaan tehdä suhteellisen vähäisin kustannuksin, kun otetaan huomioon valtava kasvu määrän tietoa, joka voidaan saada. Voima NGS analysoida perusteellisesti suuria määriä lyhyitä sekvenssejä mahdollisesti tekee tästä ihanteellisen tekniikkaa sovelletaan yleensä hajanaisia ​​nukleiinihapot voidaan uuttaa FFPE yksilöitä. Kehittäminen luotettavien NGS perustuvia menetelmiä käytettäväksi huonolaatuisia FFPE kudos johdettua nukleiinihapot avaisi diagnostisia patologian arkistoista suuren suorituskyvyn profiloinnin, helpottaa laaja retrospektiivinen kliinisissä tutkimuksissa. Samoin kyky käyttää FFPE näytteitä molekyylitason analyysia tulevaisuudentutkimusta olisi suurta hyötyä, jota mahdollisesti vähentämällä tai jopa poistaa tarpeen ikävä keräämistä ja varastointia kylmäsäilytetyn kliinisissä näytteissä.

Vaikka nukleiinihappojen eristettyjen FFPE kudokset ovat aiemmin pääasiassa tutkittu käyttäen PCR- ja mikrosirujen perustuvat menetelmät, on nyt raportoi soveltamisesta NGS kohteeseen FFPE materiaalia. Yksi ensimmäisistä tuli Schweiger

et al.

Jotka ilmoittivat NGS perustuva analyysi DNA (DNA-sekvenssi) eristettiin FFPE näytteistä [1]. Kirjoittajat löytyi hyvä korrelaatio sovitettu FF ja FFPE rintasyöpä näytteitä yhdestä potilaan analysoitaessa genominlaajuisten kopioluvun muutoksia ja variantti esiintyvyys perustuu matalan kattavuus koko-Genomikartoituksen [1]. Myöhemmin Wood

et al.

Yhdistetty yhdistäminen näytteitä ja määrän vähentämistä tulo DNA tutkia genominlaajuisten kopioluvun muutoksia FFPE näytteissä [2]. Toinen paperi Schweiger n ryhmä osoitti, että tutkimukset genomista muunnelmia perustuva sekvensointi DNA FFPE kudoksesta hyötyneet kasvoi kattavuus saadaan käyttämällä kohdennettua uudelleenjärjestely, vaikutus vähenee tallennuksesta aiheuttama melu [3]. Äskettäin Tuononen

et al.

Soveltaa kohdennettuja DNA resequencing seulontaan FFPE ei-pienisoluisen keuhkosyövän kliinisesti merkittäviä

EGFR

,

KRAS

ja

BRAF

mutaatiot ja löysi merkittävä korrelaatio tuloksiin reaaliaikaisten PCR perustuvia analyyseja suorittaa rinnakkain [4]. Spencer

et al.

Sovellettu kohdennettua resequencing 27 syöpään liittyvät geenit 16 FF /FFPE pariksi keuhko adenokarsinoomia ja totesi, että huolimatta todistettavasti vaikutuksia fiksaatioprosessi, identtiset yhden nukleotidin variantteja voitaisiin luotettavasti havaita [ ,,,0],5]. Fanelli

et al.

Ovat raportoineet suurikapasiteettisten sekvensointi menetelmä epigeneettisellä profilointi perustuu siru-seq, FFPE näytteitä hiiren leukemia malli ja rajoitettu valikoima ihmisen syövissä (yksi seminoomasta ja kuusi rintakarsinoomista) , jotka mahdollistavat analysointi histonimodifikaation ja transkriptiotekijä sitova genomin laajuisesti [6], [7]. Gu

et al.

[8], [9] osoitti, että pieni panos määrät FFPE kudos johdettua DNA voitaisiin käyttää ja vähentyneen edustus bisulfiitti sekvensointi (RRBS) sallimaan tutkimuksiin genominlaajuisten DNA: n metylaatio profiilit arkistointia kliinisistä näytteistä.

Weng

et al.

oli yksi ensimmäisistä kuvaamaan NGS perustuva analyysi RNA: n (RNA-sekvenssi) on eristetty FFPE näytteistä [10]. Nämä kirjoittajat raportoivat vertailukelpoisista ekspressiotulokset syvältä sekvensointi miRNA peräisin pariksi FF ja FFPE munuaissolukarsinooman. Lisäksi he löysivät korkea korrelaatio tulosten vertaamisen NGS, jotka on saatu rinnakkain käyttäen microarray ja RT-PCR menetelmiä. Äskettäin Meng

et al.

Raportoitu onnistunut soveltaminen ligaation perustuvia miRNA sekvensointi syöpään tallennettuja näytteitä jopa 9 vuoden ajan [11]. Vaikka tiedetään tutkimuksista perinteisin molekyylitekniikkaa että pienempi RNA-molekyylien kuten miRNA pystyvät kestämään formaliinin kiinnittäminen [12], on olemassa yleinen odotus, että enää RNA-molekyylit ovat todennäköisesti alttiimpia pirstoutumista ja muutoksia, mikä niitä huono malleja RNA-Seq. NGS-based study of enää RNA-molekyylien on raportoinut Sinicropi

et al.

Jotka havaitsivat, että RNA-Seq saatujen tietojen FFPE primaarisista rintasyövistä oli riittävän laadukkaita, jotta biomarkkereiden löytö [13]. Adiconis

et al.

Raportoitu vertaileva analyysi viisi menetelmiä RNA-Seq soveltaa huonolaatuisia RNA (kuten eristetyt FFPE kudosta) ja alhaisen määrän RNA [14]. Äskettäin Norton

et al.

Soveltaa RNA-Seq yhdeksän sarjaa FF ja FFPE rintasyöpäkohteisiin näytteitä säilyttää enintään neljä vuotta ja löytänyt hyvän korrelaatio pariksi FF ja FFPE ekspressioprofiileja [15].

laajentaa näiden tutkimusten kannalta määrä ja monimuotoisuus ihmisen näytteitä tutkitaan ja raportit järjestelmällisen analyysin mahdollista käyttöä NGS-pohjainen profilointi ihmisen FFPE näytteiden retrospektiivi ja mahdollisille kliinisissä tutkimuksissa. Tutkimuksemme sisältää (1) arviointi eri eristäminen strategioita nukleiinihappojen ihmisen FFPE näytteet ja vastaavat FF ja FFPE yksilöt; (2) valmistelu kohdennettujen genomin (DNA Exome-Seq) ja koko transcriptome (RNA-Seq) sekvensointi kirjastot; ja (3) perusteellinen analyysi NGS saatujen tietojen. Ensisijainen tavoitteena oli tunnistaa ja kuvata systemaattinen vaikutukset fiksaatioprosessi saaduista tuloksista sekä kriittisten parametrien työnkulun leikkauksesta analysoitu NGS tietoja. Käytettävissä louhinta sarjat arvioitiin suhteessa puhdistuksen RNA ja DNA valittujen FFPE ihmisen yksilöitä (normaali, maksan karsinooma, reaktiivinen nielurisojen, keuhkosyöpä, rintasyöpä, normaali iho rinta-, ja rakkosyöpä-; yhteensopivat FF näytteiden maksassa ja nielurisojen näytettä). Tätä seurasi arviointi RNA: n ja DNA: FFPE ihmisen yksilöt (kolorektaalikarsinooma, normaali maksan, virtsarakon syöpä, ja nielurisojen) eri rutiini arkistointiteknologioita kertaa (jopa 244 kuukautta). Lopuksi, DNA: n ja RNA uutettiin Matching FF ja FFPE ihmisen näytteet (virtsarakon, eturauhasen ja paksusuolen karsinoomat samoin kuin normaalissa paksusuolen kudosta). Uutettua DNA: ta ja RNA: ta käytettiin valmistettaessa kohdennettujen genomin (DNA Exome-Seq) ja koko transcriptome (RNA-Seq) sekvensointi kirjastot ja NGS saadut analysoitiin keskittyen löytö järjestelmällinen vaikutusten fiksaatioprosessi.

menetelmät ja materiaalit

Ethics lausuntoja

Kaikki kokeet tässä tutkimuksessa tehtiin näytteistä ihmisestä peräisin valittu jäätynyt kudos biopankkien Århusin yliopiston sairaalan, Tanskassa ja diagnostisen FFPE lohko arkisto, Institute of Pathology, Aarhus University Hospital, Denmark. Kudokset poistettiin aikana rutiini kirurgisten ja olivat ylijäämä diagnostisten vaatimuksiin. Näytteet nimettömiksi ennen käyttöä tässä tutkimuksessa. Tutkimuksen hyväksyi komitean Health Research Ethics Keski-Jyllanti ja Tanskan tietosuojavirasto.

Kliiniset näytteet ja keskeisiä tavoitteita

Tutkimus työnkulkuja leikkauksesta lopullinen analyysi NGS Tulokset esitetään kuvassa S1 yhdessä keskeisiä muuttujia tutkitaan. Näytteet valittiin maksimoimiseksi määrä muuttujia (esim. Varastointi aika vuodesta keräys ja kudostyypin), joiden odotettua vaikutusta tuloksiin. Näytejoukoille on kuvattu tässä jaksossa, taulukossa 1 ja taulukossa S1. Tutkimuksessa oli mukana yhteensä 23 FF, 35 FFPE ja 38 pariksi FF /FFPE yksilöitä, jotka edustavat kuutta eri ihmiskudostyypeistä (virtsarakon, eturauhasen ja paksusuolen syöpä, maksan ja paksusuolen normaali kudos; reaktiivinen nielurisojen). Kaikkiaan 16 FF ja FFPE yksilöt eri kudoksista valittiin ensimmäinen koestus DNA- ja RNA-puhdistus (

testissä

). Tutkia vaikutus kudoksen tyypin ja säilytysajan kuluessa tallentamisesta, FFPE lohkot neljästä kudoksista (peräsuolen ja virtsarakon syöpä, ja normaali maksan ja nielurisojen) valittiin, joissa jokaisessa on neljä säilytysaika (2-3, 13-15, 60-62 ja 241-244 kuukautta). Tämä koe on merkitty

varastointiaika FFPE asetettu

. Suurin kokeilu,

pariksi FF /FFPE paksusuolen asetettu

, mukana 19 pariksi FF /FFPE peräsuolen kasvain näytteet (sekä hyvän- että pahanlaatuisia) ja 13 FF näytteitä vastaavia normaalissa paksusuolen kudosta, joka oli kerätty 2-13 vuotta aiemmin. Testaamiseksi havaita tietyn yhden nukleotidin variantteja, joukko 11 paksusuolen näytteet valitaan tunnettujen varianttien

KRAS

ja

BRAF

(

paksusuoleen KRAS /BRAF varianttien tunnistus set

). Lisäksi seitsemän pariksi FF /FFPE prostatakarsinoomassa kerätyistä näytteistä 2-11 vuotta aikaisemmin (

pariksi FF /FFPE eturauhasen set

), kahdeksan pariksi FF /FFPE rakkosyöpä- kerätyistä näytteistä 5-9 vuotta aikaisemmin (

pariksi FF /FFPE virtsarakon asetettu

) ja 10 FF rakkosyöpä- näytteet (

FF virtsarakon allekirjoitus säilyttäminen asettaa

) valittiin tutkimukseen. DNA: ta ja RNA: ta eristettiin kustakin näytteestä ja käytetään tuottamaan kirjastoja exome sekvensointi ja koko-RNA-sekvensoinnilla. Ensisijaisena tavoitteena DNA Exome-seuraavissa kokeissa oli verrata havaitsemiseen genomista vaihtelua Hyväksytty FF ja FFPE näytteet, mukaan lukien sekä erityiset muunnelmat kliinistä merkitystä sekä globaalit muunnelmia. RNA-Seq kokeet suoritettiin, jotta voidaan verrata transkription saatujen tietojen Hyväksytty FF ja FFPE näytteet, mukaan lukien (1) maailmanlaajuinen tiedot transkriptioaktiivisuutta; (2) erityiset ekspressiotasot suhteessa biologinen tila (ts vastakkaisia ​​hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset näytteiden

pariksi FF /FFPE paksusuolen asettaa

); ja (3) kuvaus ilmaus allekirjoitus virtsarakon syövän etenemiseen (in

FF virtsarakon allekirjoitus säilyttäminen set

ja

pariksi FF /FFPE virtsarakon asetettu

).

puhdistus DNA: n ja RNA: FF ja FFPE kudos

tunnistaa uuttamismenetelmiä optimaalisella nukleiinihapon laatua ja saantoa, RNA ja DNA puhdistettiin FFPE lohkot

testijärjestelyä

(Taulukko 1 ja Taulukko S1) käyttäen kaupallisesti saatavia kittejä, kuten alla on kuvattu. Jopa kuusi 10 um: n leikkeitä leikattiin kustakin kasvainblokki ja asetetaan steriiliin 1,5 ml: n sentrifugiputkia valmis uuttamalla. Putket, jotka sisältävät leikata FFPE osiot RNA puhdistukseen säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. DNA: n ja RNA: n puhdistukset sekä vastaavan FF maksassa ja nielurisojen näytteet tehtiin käyttäen QiaSymphony robotin yhdessä QIAsymphony DSP DNA Mini Kit ja QIAsymphony RNA Mini Kit (molemmat QIAGEN). DNA puhdistettiin FFPE näytteitä käyttämällä QIAamp DNA FFPE Tissue (QIAGEN) ja NucleoSpin FFPE DNA (Machery-Nagel) sarjat; RNA puhdistettiin FFPE näytteitä miRNeasy FFPE (QIAGEN), NucleoSpin FFPE RNA (Machery-Nagel) ja ExpressArt FFPE RNAready (Amp Tec) sarjat. Jotta voidaan testata rinnakkain puhdistus RNA: n ja DNA: n samasta FFPE osaan, NucleoSpin FFPE RNA /DNA-Kit (Machery-Nagel) ja RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit FFPE (Ambion) otettiin mukaan. Lopuksi, jotta testi automatisoituja puhdistusmenettelyt, DNA ja RNA puhdistettiin QiaSymphony robotin käyttäen erikoistunut FFPE ohjelmia ja QIAsymphony DSP DNA Mini Kit ja QIAsymphony RNA Mini Kit (QIAGEN), tässä järjestyksessä. Kaikki otot suoritettiin kolmena rinnakkaisena, kumpikin kolme FFPE osaan. Koska rajoittava määrä materiaalia, uuttamalla rintojen näytteistä Recover Kaikki tehtiin kaksoiskappaleet vain. Puhdistukset suoritettiin seuraavien valmistajien protokollat ​​seuraavin muutoksin: Deparaffinisation ennen DNA: n ja RNA: n uutto käyttäen QIAamp FFPE DNA ja ExpressArt FFPE RNAready kit, vastaavasti, tehtiin käyttäen QIAGEN n Deparaffinisation ratkaisu sen sijaan, ksyleeni sisältyvät sarjat. Kaikki DNA-näytteet RNaasia käsiteltiin ja RNA-näytteet DNaasia käsiteltiin puhdistuksen aikana. Puhdistuksen jälkeen kaikki näytteet pestään UF suodatinlevyt ja eluoitiin Qiagen n Eluutiopuskuri (EB, [10 mM Tris-HCl, pH 8,5]). Pirstoutuminen profiilit puhdistetun RNA ja DNA arvioitiin sirulla elektroforeesi 1 ui näyte Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Koska vain kaksijuosteinen (ds) DNA on aktiivinen TruSeq kirjaston muodostumista, sekä yhteensä absorbanssi 260 nM (NanoDropND-1000 spektrofotometri) sekä dsDNA-spesifisessä määrityksessä se (Qubit dsDNA BR Assay Kit /Qubit 2,0-fluorometri, Invitrogen) oli kvantifioimiseksi käytetään DNA pitoisuus. RNA-konsentraatio määritettiin käyttäen vain yhteensä absorbanssi 260 nM.

Tämä alustava puhdistus seurasi DNA: n ja RNA: n uutto FFPE kudoksissa, jotka oli rutiininomaisesti tallennettu patologian arkistoon eripituisia aikoja sen jälkeen, kun kiinnityksen. Tämä säilytysaika Tutkimukseen osallistui neljä kudokset: nielurisojen (normaali reaktiivinen), maksa (normaali ei-neoplastisia), virtsarakon (karsinooma) ja paksusuolen (karsinooma). Kukin kudos edusti neljä FFPE lohkojen varastoidaan 2-3, 13-15, 60-61 ja 241-244 kuukautta, vastaavasti (taulukko 1 ja taulukko S1). Vain kaksi lupaavimmista reagenssipakkaukset käytettiin: DNA Puhdistukset suoritettiin käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue ja Ambion RECOVERALL- sarjat. RNA Puhdistukset suoritettiin käyttäen miRNeasy FFPE ja AmpTec ExpressArt sarjat. Kaikki uutot suoritettiin kahtena kappaleena käyttämällä kolmea kudosleikkeiden.

varastointiaika Tutkimus seurasi puhdistus DNA: n ja RNA: n pariksi FF /FFPE näytteet paksusuolen (19 näytettä), virtsarakon (8 näytettä) ja eturauhasen ( 7 näytettä) karsinoomat (taulukko 1 ja taulukko S1). Lisäksi 12 FFPE paksusuolikarsinooma näytteitä, joiden tiedetään mutaatiot KRAS ja BRAF sisällytettiin (

paksusuoleen KRAS /BRAF varianttien tunnistus asettaa

, taulukko 1 ja taulukko S1). Kaikki uutteita FF materiaalista suoritettiin käyttäen QiaSymphony kuten edellä on kuvattu. RNA uutettiin manuaalisesti FFPE lausetta AmpTec ExpressArt sarjat ja DNA uutettiin puoliautomaattisesti alkaen FFPE lohkoja QiaSymphony. RNA uutettiin kahteen rinnakkaiseen reaktioita; yksi käsiteltiin DNaasi I: llä ja toinen on lisäksi käsitelty Exonulcease I, joka katalysoi poistaminen nukleotidin yksijuosteista (ss) DNA: ta.

valmistaminen ja DNA: n sekvensointi Exome-Seq kirjastojen

genomi-DNA-kirjastot valmistettiin FF- ja FFPE johdettu DNA: lla käyttäen TruSeq DNA-kirjasto valmistelu sarjat (Illumina jälkeen geeli-free-protokolla) ja sen jälkeen exome rikastukseen TruSeq exome sarjat (Illumina). gDNA kirjasto valmistelu tehtiin mukaan valmistajan käsikirjan seuraavin muutoksin. (1), jotta voidaan välttää puskurin vaikutusten, 1,2 ug dsDNA käsiteltiin käyttäen QIAGEN UF suodatinlevy, pestiin kahdesti puskuri EB ([10 mM Tris-Cl, pH 8,5], QIAGEN) ja suspendoitiin uudelleen 50 ui Buffer EB ennen kuin niitä käytetään syötteenä TruSeq gDNA kirjaston valmistelua. (2) PCR-syklien lukumäärän, joita käytetään monistamiseksi FFPE johdettujen kirjastojen nostettiin 10: stä 11: (3) Sen jälkeen, kun lopullinen helmi-puhdistusvaiheen monistetun gDNA kirjastot, 10 ui puskuri EB lisättiin kirjastot, jolloin lopputilavuus 40 ui. Koko jakauma gDNA kirjastojen arvioitiin sirulla elektroforeesi (DNA 1000 DNA-siru) on 1 ui näyte Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). DNA: n konsentraatio kirjastojen arvioitiin käyttäen KAPA Kirjasto kvantifiointi Kit (Kapa Biosystems). Lyhyesti, kvantifiointi suoritettiin käyttäen 10 ui reaktiota teoksesta sisältäen 6 ui KAPA reagenssi /nalliseoksesta ja 4 ui 1.000.000-kertaisesti laimennettu näyte seuraavaa suositeltua menettelyä ja toimitettu standardeja. Kvantifiointi suoritettiin kolme itsenäistä laimennuksia kustakin näytteestä. Exome kohdistaminen suoritettiin altaissa jopa kuusi gDNA kirjastoja käyttäen 500 ng kutakin gDNA kirjaston mukaan valmistajan suositusten. gDNA kirjastot valmistetaan FF ja FFPE näytteitä ei yhdistetä. Sen jälkeen, kun lopullinen helmi-puhdistusvaiheen exome kiinni ja monistettiin gDNA kirjastot, 30 ui puskuri EB lisättiin kirjastot, jolloin lopullinen tilavuus 60 ui. Kokojakaumiin on kaapattu kirjastojen arvioitiin sirulla elektroforeesi (Suuri herkkyys DNA-siru) on 1 ui näyte Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). DNA-pitoisuus kirjastojen arvioitiin käyttäen KAPA Library kvantifiointi Kit kuten edellä on kuvattu. Exome jää gDNA kirjastoista yhdistettiin 2 nM yhdistettiin varastoja, denaturoitiin ja laimennettiin kaksikymmentäkaksi ennalta jäähdytetty hybridisaatio- puskuria ja ladattiin TruSeq PE v3 flowcells koskevasta Illumina CBOT seuraa indeksoitu pariksi loppuun sekvensointi (101 + 7 + 101 bp ) on Illumina HiSeq 2000 käyttäen TruSeq SBS Kit v3 kemia (Illumina).

Mutaatiotutkimukset tilaansa BRAF ja KRAS

KRAS

ja

BRAF

mutaatio analyysi 11 näytteiden

paksusuoleen KRAS /BRAF varianttien tunnistus joukko

tehtiin kuvatulla [16]. Lyhyesti,

KRAS

kodoni 12, 13 ja 61 ja

BRAF

V600E ja kodonien 442-474 tutkittiin käyttäen Lightscanner (Idaho Technology). Näytteet, joilla on poikkeavat Sulamiskäyrät vielä vahvistanut Sangerin sekvensoinnilla on 3130x Genetic Analyzer (Applied Biosystems) B

valmistelu ja sekvensointi RNA-Seq kirjastojen

Jotta perusteellinen analyysi RNA-Seq data, me tarvitaan menetelmä valmistukseen käytetty RNA-Seq kirjastojen tarjota lohkon erityisiä (directional) ja pariksi-end tiedot sekä helpottaa multiplex sekvensointi. Koska odotettavissa hajoamisen RNA FFPE kudoksista, kirjasto valmistusmenetelmä ei saisi perustua valintaan poly (A) + koska tämä heikentää kirjaston valmistelua tai ainakin johtaa 3 ’bias. Hankkiminen koko-RNA-Seq data olisi lisäksi helpottaa täydellisempää näkymä transcriptome. Kun tutkimus aloitettiin vuonna 2011, ainoa kaupallistettu kit, jotka täyttävät kaikki vaatimukset oli Ribo-Zero tekniikka (Epicentre, joka on Illumina yritys) varten ehtymisen rRNA seuraa kirjaston valmistelu käyttämällä ScriptSeq tekniikkaa (Epicentre, joka on Illumina yritys). Soluliman ja mitokondrioiden rRNA poistettiin kokonais-RNA käyttäen Ribo-Zero Magnetic Gold Kit (Human /hiiri /rotta, Epicentre, joka on Illumina yhtiö) seuraten valmistajan ohjeita. Lyhyesti, rRNA poistaminen Ratkaisu lisättiin 500 ng kokonais-RNA: ta ja inkuboitiin 10 min 68 ° C: ssa, sitten 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Koettimien hybridisoituun rRNA poistettiin lisäämällä RNA-koetin seos pestiin Magnetic Beads minkä jälkeen inkuboitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, sekoittamalla vorteksoimalla, inkubointi 5 minuutin ajan 50 ° C: ssa, magnetoinnin ja siirto supernatanttia RNaasi- koeputkessa. RRNA köyhdytettyä RNA puhdistettiin käyttämällä Agencourt RNAClean XP Kit (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA). Lyhyesti, 1.8x tilavuus AMPure RNAClean XP Helmet lisättiin rRNA köyhdytettyä RNA minkä jälkeen inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, kaksi 80% etanolia pesua ja eluointia osaksi 30 ui RNaasi-vapaa vesi. Laatu rRNA köyhdytettyä RNA arvioitiin sirulla elektroforeesi (Picochip) on 1 ui näyte Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Savant Speed-vac (Thermo Fischer Scientific) käytettiin vähentämään jäljellä näytteen tilavuus on 9,5 ui seuraa synteesi suuntaava, pariksi lopussa ja indeksoitu RNA-Seq kirjastoja käyttäen ScriptSeq v2 kit (Epicentre, joka on Illumina yhtiö) sen jälkeen, kun suositeltu menettelyä. Lyhyesti, rRNA köyhdytettyä RNA oli kemiallisesti hajanainen (ellei vakavasti huonontunut RNA FFPE kudoksesta käytettiin jolloin edelleen pirstoutumista oli jätetty pois), noudattamalla kuvattu liitteessä on ScriptSeq oppaat ja cDNA syntetisoitiin merkityn satunnaisen hexamer. CDNA oli pääte tagged käyttäen 3’-pää tukossa ja tagged oligo seurasi MiniElute (QIAGEN) puhdistus. Di-koodattu jälkeen cDNA käytettiin templaattina PCR (10 sykliä FF näytteitä, 13 sykliä FFPE näytettä) käyttäen Failsafe PCR Enzyme (Epicentre, joka on Illumina yhtiö), joka on eteenpäin-aluketta ja indeksoitu /viivakoodilla käänteisaluketta. Monistettu kirjastot puhdistettiin käyttämällä Agencourt XP Kit (Beckman Coulter). Lyhyesti, 1,0 x tilavuus AMPure XP Helmet (Beckman Coulter), lisättiin kuhunkin PCR-reaktio minkä jälkeen inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, kaksi 80% etanolia pesua ja eluointia otetaan 20 ui RNaasi-vapaa vesi. Ominaisuuksia RNA-Seq kirjastot arvioitiin sirulla elektroforeesi (Suuri herkkyys DNA-siru) on 1 ui näyte Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). DNA: n konsentraatio kirjastojen arvioitiin käyttäen KAPA Kirjasto kvantifiointi Kit (Kapa Biosystems) seuraten suositellut menettelyä ja toimitettu standardeja. RNA-sekvenssi kirjastoista yhdistettiin 2 nM yhdistettiin varastoja, denaturoitiin ja laimennettiin kaksikymmentäkaksi ennalta jäähdytetty hybridisaatio- puskuria ja ladattiin TruSeq PE v3 flowcells koskevasta Illumina CBOT seuraa indeksoitu pariksi loppuun sekvensointi (101 + 7 + 101 bp ) on Illumina HiSeq 2000 käyttäen TruSeq SBS Kit v3 kemia (Illumina).

Sekvenssianalyysissa

analyyttinen työnkulku on kuvattu tässä osiossa ja graafisesti esitetty kuvassa S2. Parilliset Demultipleksoitu fastq tiedostot luotiin käyttäen CASAVA ohjelmistoa (Illumina) ja alustava laadunvalvonta suoritettiin käyttäen FastQC [17] tai CASAVA.

pariksi Demultipleksoitu fastq tiedostoja DNA-exome kirjastot tuotu CLC Genomics Workbench (CLC Bio, versio 6.0.1) käynnissä CLC Genomics Server (CLC Bio, versio 5.0.1). Adaptor sekvenssit ja emäkset heikkolaatuinen karsittiin ja lukee kartoitettiin sen HG19.

poistaa päällekkäisiä kartoitettu lukee

työkalua käytetään poistamaan pariksi lukee, joilla on sama alku ja loppu koordinaatit ja ovat siten todennäköisesti PCR kaksoiskappaleet. Vaihtoehdot havaittiin exome datan CLC Bio Todennäköisyyspohjainen Variant Soittaja käyttäen seuraavia parametreja: Pienin kattavuus = 10; Variant todennäköisyys = 90,0; Suurin odotettu variantteja = 4; Vaatimus lukee molempiin suuntiin tukensa vaatimuksille.

Pariksi Demultipleksoitu fastq tiedostoja RNA-Seq kirjastot karsittiin varten osuuksilla sovittimen sekvenssit, yhdistetään yhdeksi lukea mahdollisuuksien seurasi laatu leikkaamalla käyttämällä komentoja CLC Assembly Cell (CLC Bio, versio 4.012.84829). Tämä johti kolmeen eri fastq tiedostoa: pariksi-end data, single-end data liityttyään pariksi lukee, ja yhden end data hävittämisen jälkeen yksi parittaiset lukee johtuu esimerkiksi heikkolaatuinen. Kaikki kolme fastq tiedostoja sen jälkeen toi erissä osaksi CLC Genomics Workbench (CLC Bio, versio 6.0.1) käynnissä CLC Genomics Server (CLC Bio, versio 5.0.1) avulla CLC Server komentorivityökaluilla (CLC Bio, versio 1.7.1). Tuodut korkealaatuinen lukee suhteutettu geenialueisiin ja selostukset selityksin Human NCBI REFSEQ 30 lokakuu 2012 kahdessa ajossa RNA-Seq Analysointityökalu CLC Genomics Workbench. RNA-seq työkalu ajettiin

Käytä viite lappuja

vaihtoehto. Tämä vaihtoehto lukee kartoitetaan vastaan ​​sekvenssit vastaavat selityksin geenin ja transkriptio sekvenssit. Ensimmäisessä aikavälillä ainoastaan ​​ottelut eteenpäinjuoste geenien hyväksyttiin (käyttäen säie-erityinen eteenpäin vaihtoehto); Toisessa aikavälillä lukee joita ei kartoitettu ensimmäisen ajon kartoitettiin sallii vain ottelut käänteisjuoste geenien (käyttäen säie-erityinen-taaksepäin vaihtoehto). Arvioida saastumisen rRNA, lukee että ei karttaa ihmisen transcriptome määrittelemiä RefSeq, kartoitettiin juostespesifisen eteenpäin kohti ihmisen rRNA (HSU13369, HSU13369, HSU13369 ja NC_012920) ja un-kartoitettu lukee sitten kartoitettiin juostespesifisen taaksepäin kohti ihmisen rRNA.

Mapping Raportit

ja

Yksityiskohtainen kartoitus Raportit

kertyi kustakin RNA-Seq analyysi kullekin näytteelle, viedyt CLC Genomics Workbench Microsoft Excel-muodossa, tallentaa yksittäiset sarkaineroteltuna tekstitiedostoja, ja erityisiä tietoja sittemmin uutetaan ja tutkittu. Kutakin koetta varten geeni-viisasta kartoitus matriisit sekä eteen- ja taaksepäin RNA-Seq analysoi vastaan ​​ihmisen transcriptome vietiin CLC Genomics Workbench sarkaineroteltuna tekstitiedostoja etsintä ja tilastollinen analyysi R tietojenkäsittely-ympäristössä (versio 3.0.1 Windows [18]). Nämä geeni-viisasta kartoitus matriisit yhteenveto kartoituksen tulokset sarakkeiden RPKM arvojen ja laskee lukee kartoituksen eri alueisiin, kuten geeni, eksoni, eksoni-eksoni ja eksoni-introni. Matriiseja ”koko eksoni lukee” laskee valittiin geeni-viisasta kartoitus matriisit ja analysoidaan R paketti

empiirinen analyysi Digital Gene Expression data R

(särmäysautomaatin, versio 3.2.3 [19] – [ ,,,0],23]) käyttäen moniulotteista skaalausta (MDS) työkalu eksploratiivinen analyysi ja eri käytettävissä tilastollisia työkaluja tunnistamista eri tavoin vaikuttaa geenien. R paketti Hexbin käytettiin piirtämistä RNA-Seq pohjainen ekspressioprofiileja (tukikohdan RPKM arvot) mukaan kuusikulmainen jäteastioita. Strand spesifisyys arvioitiin osa koko geenin lukee kartoitus eteenpäin suhteessa kokonaismäärään lukee kartoituksen molempiin suuntiin. Geenit, joilla on vähemmän kuin 10 lukee kartoitus eteenpäin jätettiin pois. Arvioida osa monistaa sekvenssit RNA-Seq data post kartoitus (eteenpäin), BAM tiedostot vietiin CLC Genomics Workbench ja analysoitiin käyttämällä MarkDuplicates työkalua Picard työkalut (Picard-työkalut-1,47, [24]).

liittymisestä tietojen

Kaikki tiedot taustalla esitettyjen päätelmien käsikirjoituksen ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Pääsy sekvenssi data, joka sisältää henkilön tunnistetietoja, tarvitsee allekirjoitus on kulunvalvonta muoto, ja niihin voi tutustua osoitteessa Eurooppalainen Genome-phenome Archive [25] käyttämällä tutkimuksen ID EGAS00001000737 seuraava pyyntö MOMA Data Access komitea. Expression matriisit ovat rajoituksetta kautta ArrayExpress [26] nojalla liittymisen E-MTAB-2523.

Tulokset

Tutkimme mahdollinen käyttö FFPE näytteiden NGS-pohjainen retrospektiivinen ja mahdollisten kliinisten tutkimusten keskittynyt havaitsemiseen järjestelmällistä vaikutusten tallennuksesta prosessin variantti puheluita DNA-Seq ja ilmaisun profiileja RNA-Seq.