Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Äskettäin Next Generation Sequencing (NGS) on alkanut syrjäyttää muita tekniikoita geenimutaation testaus että nyt tarvitaan kohdennettuja hoitoja. Kuitenkin siirto NGS teknologian kliinistä päivittäin edellyttää, validointi.

Methods

validoitu Ion Torrent AmpliSeq Colon ja Keuhkosyöpä paneeli kyselevän 1850 kuormittajat 22 geenien avulla Ion Torrent Personal Genome Machine . Ensinnäkin, käytimme kaupallisen viitestandardit joka kuljettaa mutaatiot määritellyn alleelifrekvenssi (AF). Sitten, 51 peräsuolen adenokarsinoomat (CRC) ja 39 ei-pienisoluinen keuhkosyövän (NSCLC) on takautuvasti analysoitiin.

Tulokset

Herkkyys ja tarkkuus havaitsemiseksi varianttien klo AF 4% oli 100 % kaupalliseen vertailustandardeista. Niistä 90 tapausta, 89 (98,9%) onnistuneesti sekvensoitiin. Niistä 86 näytteitä, jotka NGS ja referenssitestiin olivat molemmat informatiivinen, 83 osoitti yhtäpitävät tulokset välillä NGS ja referenssitestiin; eli

KRAS

ja

BRAF

CRC ja

EGFR

varten NSCLC, jossa 3 discordant tapauksissa kunkin ominaista AF 10%.

johtopäätökset

Kaiken AmpliSeq paksusuolen /keuhkosyöpä paneeli oli erityinen ja herkkä mutaation analyysi geenin paneelien ja voidaan sisällyttää kliinisen käytännön toiminta.

Citation: D’Haene N, Le Mercier M, De Neve N, Blanchard O, DELAUNOY M, El Housni H, et al. (2015) Clinical validointi Kohdennettu Next Generation Sequencing Colon ja keuhkosyövässä. PLoS ONE 10 (9): e0138245. doi: 10,1371 /journal.pone.0138245

Editor: Aldo Scarpa, University of Verona, Italia

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2015 Hyväksytty: 27 elokuu 2015; Julkaistu: 14 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 D’Haene et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat rahoituksella ”Fonds Yvonne Boël” (Bryssel, Belgia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset edistysaskeleet sekvensointitekniikan ansiosta kattava profiloinnin geneettisten muutosten syöpä [1]. Kehittäminen tyrosiinikinaasiestäjä hoitoja on tehnyt tärkeää testata syöpäpotilaiden kliinisesti merkittävien geenimutaatioita, jotka vaikuttavat hoidon hyöty. Tunnistaminen syöpään liittyvät mutaatiot on tullut standardi hoidon syövän hoitoon; esimerkkejä tällaisista sisältävät

RAS

mutaatioita metastasoituneen kolorektaalisyövän karsinoomien tai

EGFR

mutaatioita keuhkosyöpä. Rutiini

EGFR

somaattinen mutaatio testaus on nyt suositellaan Euroopassa ja Yhdysvalloissa ei-levy- ei pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) [2, 3]. Uudet eurooppalaiset suuntaviivat painokkaasti laaja kattavuus eksonien 18-21 [2]. Lisäksi uudet NCCN suuntaviivat NSCLC tukee voimakkaasti laajempaa molekyyli- profilointi, jonka tavoitteena on tunnistaa harvinaisten kuljettajan mutaatioita johon on olemassa tehokkaita lääkkeitä voi jo olla tai sopivasti ohjata potilasta saannille kliinisissä tutkimuksissa (NCCN ohjeet http: //www.nccn .org /ammattilaisten /physician_gls /pdf /nscl.pdf). Viime aikoihin asti, merkinnät standardi-of-care molekyylitestin peräsuolen karsinoomat mukana testaus

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta ennustajana vaste anti-kasvutekijän reseptorin (EGFR), kuten setuksimabin [4]. Nyt ohjeissa suositellaan, että ainakin, eksoni 2

KRAS

mutaatiostatus tulisi määrittää ja mahdollisuuksien mukaan ei-eksoni 2

KRAS

ja

sääntelyviranomaisten

mutaatio statuts pitäisi voidaan myös määrittää (NCCN suuntaviivat https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf). Tämä korostaa, että numeron (tai laajuutta) biomarkkereiden, jota on arvioitava kliinisissä päivittäin käytännössä molekyyli patologian kasvaa nopeasti. Tämä vaatii, että käyttöön menetelmiä luotaa mutaatiostatuksesta riippumatta useiden geenien. Lisäksi tämä lisääntyminen geenien testata liittyy väheneminen näytteen kokoa. Patologi on edessään uusi haaste: optimointi käytettävissä kasvainkudoksen. Kuten määrä kliinisesti merkittäviä geneettisiä variantteja on kasvanut, kliininen testaus on kehittynyt, siirrytään yhden mutaatioista multiplex hotspot arviointeja useita syövän geenejä. Viime vuosina Next Generation Sequencing (NGS) on alkanut syrjäyttää muita tekniikoita geenimutaation testaus [5-8]. Kohdennettu, amplikoni-pohjainen NGS tarjoaa samanaikaisesti sekvensointi tuhansia lyhyitä DNA-sekvenssin massiivisesti rinnakkaisen tavalla ja voivat tarjota kustannustehokkaan lähestymistavan havaitsemiseksi useita geneettisiä muutoksia, joiden vähimmäismäärä DNA [5, 9, 10]. Lisäksi, NGS voidaan suorittaa käyttäen DNA formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosblokeista [11-16]. Kliininen soveltaminen NGS syövässä on havaitsemiseksi kliinisen toiminnan geneettinen /genomista muutoksia, jotka ovat kriittisiä syövän hoitoon [6]. Nämä muutokset voivat olla diagnostista, prognostista tai terapeuttista merkitystä. Kuitenkin siirto NGS teknologian kliinistä päivittäin edellyttää, validointi.

Tässä tutkimuksessa arvioitiin kliinistä soveltuvuutta Ion Ampliseq Colon ja Keuhkosyöpä paneeli Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM-Life Technologies) seuloa keuhko- ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. Ion Ampliseq Colon ja Keuhkosyöpä paneeli on multiplex PCR-pohjainen kirjasto valmiste menetelmä, jolla 90 amplikoneihin jotka kattavat 1825 mutaatiostatuksesta kuormittajat 22. liittyvistä geeneistä paksusuolen ja keuhkosyöpää valikoivasti monistetaan [14, 15, 17, 18].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tätä työtä on hyväksynyt eettinen komitea Erasmen yliopistollisen sairaalan (Bryssel, Belgia-viite: P2013 /174). Mukaan Belgian lain joulukuun 2008 «Loi suhteellinen à l’saamisen et à l’käyttöaste de matériel CORPOREL humain destiné à des sovelluksia MEDICALES Humaines ou à des evät de recherche scientifique», ei kirjallinen suostumus oli tarpeen. Eettinen komitea on siten luopunut tarvetta kirjallinen suostumus osallistujalta.

Näytteitä valinta

Kasvain näytettä 90 potilasta takautuvasti analysoitiin, kuten 51 peräsuolen adenokarsinoomat (CRC) ja 39 non pienet solu keuhkosyövän (NSCLC lukien 37 adenokarsinooman ja 2 squamous karsinoomia). Mutaatioiden tila

KRAS

ja

BRAF

CRC ja

EGFR

NSCLC oli arvioitu aiemmin yhteydessä päivittäisen harjoittelun. Ensisijainen näytetyypeille olivat joko kirurginen asemointia (n = 57, 44 CRC ja 13 NSCLC), koepaloja (n = 23, 7 CRC ja 16 NSCLC) tai solun lohkot (n = 10, kaikki NSCLC). Lisäksi käytimme 12 ei neoplastisten näytettä (6 keuhkot ja 6 kaksoispisteet) ja 5 kaupallisia FFPE vertailustandardeihin (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK), joka kantaa mutaatiota

sääntelyviranomaisten

,

KRAS

,

AKT

ja

EGFR

50% alleelifrekvenssi (AF) ja 1 FFPE multiplex referenssistandardin (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) kuljettaa 11 erilaista mutaatiota erilaisiin määriteltyihin AF (0,9-24,4% ).

DNA: n eristämiseksi

DNA eristettiin FFPE kasvain näytteistä käyttäen QIAamp FFPE kudoksen (Qiagen, Antwerpen, Belgia). Lyhyesti, värjäämätön 10 um parafiinia leikattiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kuivausuunissa yön yli. Parafiini poistettiin inkuboimalla liukuu 2 peräkkäiseen altaaseen ksyleeniä ja kasvainkudoksen oli käsin macrodissected, kaavittu pois levyltä veitsellä ja siirrettiin 1,5 ml putkeen. DNA uutettiin sitten mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. H 100000 ja /tai keskimääräinen perustakuuaika oli 500x katsottiin kieltäytyneen informatiivinen. Mutaatiot havaittiin käyttäen Variant Soittajan plug-in v3.6 kanssa löysissä asetukset (Life Technologies). Vuonna variantti luettelossa saatu, kukin mutaatio varmistettiin integroiva genomin katsoja (IGV) päässä Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/igv/) [19]. Vain mutaatiot raportoitu COSMIC (Sanger Institute Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer) tietokantaan (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) otettiin huomioon ja hiljainen tai introni mutaatioita ei raportoitu.

Tilastolliset analyysit

epäparametrinen Mann-Whitney ja Kruskal-Wallisin testiä käytettiin vertaamaan kahta tai useita erillisiä ryhmiä numerotietoja, vastaavasti. Jos Kruskal-Wallisin testi oli merkittävä, post-hoc testit levitettiin käyttäen joko standardia Dunn menettelyn verrata kaikkia ryhmän pareittain tai sen mukauttaminen vertailla kunkin koetilalle kontrolliin, välttäen monivertailu vaikutuksia (kuten esitetään yksityiskohtaisesti Zar [20] ).

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, USA) ja p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

NGS paneeli validointi

Suorituskyky AmpliSeq Colon ja keuhkosyövän paneeli ensin arvioitiin käyttämällä 12 ei neoplastisten kudosten (6 keuhkot ja 6 kaksoispisteet) ja 6 kaupallinen FFPE vertailustandardeihin (5 vertailustandardit yksi mutaatio 50% alleelifrekvenssi ja yksi kanavanippu referenssistandardin kuljettaa 11 erilaista mutaatiota erilaisiin määriteltyihin Alleelifrekvenssien vaihdellen 0,9-24,4%).

Ei mutaatio havaittiin 12 ei neoplastisia kudoksia. 5 mutaatiot läsnä 5 viitestandardit 50% alleelifrekvenssi olivat kaikki oikein havainnut NGS kanssa AmpliSeq Colon ja keuhkosyövän paneeli (taulukko 1). Niistä 11 mutaatiot läsnä multiplex standardiliuoksena kaikki mutaatiot AF 3% oli oikein havainnut NGS lukuun ottamatta

KIT

mutaatio koska tämä geeni ei sisälly 22 geeneissä paneelin . Jotta 3 mutaatiota AF 3%, vain yksi (

EGFR

poisto eksonissa 19, AF = 2,0%) havaittiin Variant Caller taas kahden muun (

EGFR

p .L858R ja p.T790M AF = 2,7% ja 0,9% vastaavasti) eivät olleet. Vuoteen IGV tarkastus, huomasimme, että nämä variantit olivat mukana, mutta pieni AF (25/1633 lukee (1,5%) ja 7/1613 lukee (0,4%), vastaavasti). Muita mutaatioita

CTNNB1

,

BRAF

,

PIK3CA

ja

EGFR

havaittiin Variant soittajan vertailustandardeista (taulukko 1).

KRAS

ja

sääntelyviranomaisten

standardit syntyvät SW48 solulinjasta joka raportoidaan kuljettamaan

CTNNB1

p.S33Y ja

EGFR

p.G719S mutaatiot COSMIC tietokannassa (https://www.sanger.ac.uk/cosmic);

EGFR

standardit syntyvät RKO solulinjasta joka raportoidaan kuljettamaan

BRAF

p.V600E ja

PIK3CA

p.H1047R mutaatioita. Lopuksi multiplex referenssistandardia generoidaan RKO, SW48 ja HCT16 solulinjoissa, mikä selittää havaitseminen

CTNNB1

p.S33Y mutaatio tätä valvontaa.

tarkkuus (uusittavuus ja toistettavuus) arvioitiin myös käyttäen 2 FFPE kasvain näytteet ja multiplex referenssistandardia. Näytteet analysoitiin 5 kertaa (5 kirjaston tuotantoa alkaen saman DNA-uutetta) kolmessa eri kokeessa (taulukko 2). Kaikki mutaatiot jossa AF 4% oli johdonmukaisesti havaittu. Kuitenkin, mutaatiot jossa AF 3% oli havainnut Variant Caller yhdessä tai useammassa, mutta eivät kaikki, viiden toistojen. Vuoteen IGV tarkastus, TP53 mutaatiot epäjohdonmukaisesti havaitsema Variant soittajan olivat läsnä vain rinnakkaisten jolle mutaatio havaittiin, että Variant soittajan, mutta ei muiden näytteitä (S1 taulukko). Sillä standardiliuoksena 3 EGFR variantteja havaittiin IGV tarkastus (mutta variantti kattavuus 30x useimpien rinnakkaisnäytteiden), vaikka nämä olivat epäjohdonmukaisesti havainnut Variant Caller (S1 taulukko).

Lisäksi, jotkut mutaatiot varmistettiin ddPCR (taulukko 2). P.H1047Q PIK3CA mutaatio, johdonmukaisesti havaitaan NGS, joiden keskimääräinen AF 10,8%, havaittiin myös ddPCR kanssa AF 9,1%. Sen sijaan p.R181C ja p.H168Y TP53 mutaatiot ristiriitaisesti havaita NGS ei havaittu ddPCR. Koska tosiasiat, että mutaatiot havaitaan AF 3% ei vahvistanut ddPCR (for TP53 mutaatiot) tai epäjohdonmukaisesti havaittu (EGFR mutaatioita referenssistandardia), ja että KRAS-mutaatio, jonka odotettu AF 5% johdonmukaisesti havaittu AF vaihtelee 4,6-5,9%, me valinnut 4% AF kynnys mutaation raportointiin. Tämä kynnys on sopusoinnussa tietojen raportoitu kirjallisuudessa tähän NGS foorumin [9, 16, 21].

Yhdistelmät esityksiä

Joukko 90 FFPE näytteiden, kuten 51 CRC ja 39 NSCLC , sekvensoitiin NGS. Sekvensointi suorituskyky arvioitiin lukumäärästä ja jakelusta lukee poikki kohdealueilla. Niistä 90 sekvensoitu tapauksissa 89 (98,9%) oli onnistunut (lukumäärä kartoitettiin lukee 100000 keskimäärin perustakuuaika 500X). Unsuccesfull tapaus pidettiin ei informatiivinen, koska useat lukee 100 000 (40,072 lukee) ja keskimääräinen perustakuuaika 500x (1,2-kertainen). Niistä 89 onnistuneesti sekvensoitiin tapauksissa yksi tapaus pidettiin optimaalinen (lukumäärä lukee: 69,564 ja keskimääräinen perustakuuaika: 676x), mutta laatu sekvensointi pidettiin riittävän hyvä tarkempaa analysointia varten. Kaikissa muissa tapauksissa (n = 88, 97,8%) oli useita lukee 100,000 ja keskimääräinen perustakuuaika antaneet perusteita harkita variantti autenttisena (ks materiaali ja menetelmät) emme voineet vahvistaa tätä variantti.

Kaiken välistä yhdenmukaisuutta kahden menetelmän

EGFR

mutaatioiden havaitseminen oli 33/34 (97%).

Lisäksi mutaatiot muissa geeneissä havaittiin NGS: mutaatiot

KRAS

varten 15/38 näytettä (39,5%), mutaatiot

TP53

for 15/38 potilaalla (39,5%), mutaatiot

STK11

for 3/38 potilaalla (7,9%), mutaatio

BRAF

varten yksi näyte (2,6%), mutaatio

PIK3CA

yhden potilaan (2,6%), mutaatio

CTNNB1

varten yksi näyte (2,6%). Mutaatioiden NSCLC oli koottu kuvioon 1 ja S2 taulukossa. Kaiken 29/38 näytteet tunnettu ainakin yksi mutaatio (76,3%).

Mutaatiot eri geenit (rivit) on merkitty kullekin NSCLC näytteen (sarakkeet). Harmaa neliö osoittaa, että mutaatio (raportoitu COSMIC tietokannassa (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), pois lukien polymorfismi) havaittiin kanssa Ampliseq Colon ja Lung paneeli geenissä, kun taas tyhjä neliö ilmaisee että mitään asiaa mutaatio löydettiin geenin.

2 KRAS mutaatiot tunnistetaan AF 6% (yksi p.G12S jossa AF 4%, yksi p.G12D jossa AF 5%) varmistettiin ddPCR. 2 mutaatiot havaittiin ddPCR kanssa AF 1,1 ja 5,7%, vastaavasti (S2 taulukko).

CRC.

Yhdistelmät ja PCR onnistuivat kaikilla näytteillä.

NGS, mutaatiot

KRAS

havaittiin 30/51 tapauksessa (58,8%), kun taas

KRAS

analyysi PCR-menetelmällä havaittiin vain 23 tapausta mutaatioita

KRAS

geeni (45,1%). Viisi 7 ristiriitainen tapausta leimasi mutaatiot kodoneissa 59, 61 ja 146 (eksonit 3 ja 4), jotka eivät kuuluneet PCR-testiä. Mutaatiot kodoneissa 61 ja 146 testattiin ja validoitu ddPCR (S3 taulukko) varten 2 Muissa tapauksissa ei havaittu PCR,

KRAS

p.G12V mutaatio havaittiin NGS kanssa AF 8 ja 9%, vastaavasti. Nämä mutaatiot on myös havaittu ddPCR kanssa AF 12,5 ja 9%, vastaavasti. Vuonna 23 yhdenmukaisia ​​tapauksissa AF on

KRAS

mutaatiot olivat suuremmat kuin 20% 21 tapausta; vain kaksi asiaa ominaista AF 9 ja 10%, vastaavasti.

mutaatiostatuksesta tila

BRAF

PCR arvioitiin 49 tapausta (2 tapausta ei ollut tarpeeksi DNA) .

BRAF

p.V600E mutaatio havaittiin 5 potilaalla (10,2%) käyttäen NGS tai PCR. Lisäksi

BRAF

p.E586K mutaatio havaittiin käyttäen NGS.

Lisäksi mutaatiot muissa geeneissä havaittiin NGS: mutaatiot

sääntelyviranomaisten

for 2/51 potilaille (3,9%), mutaatiot

TP53

varten 32/51 potilaalla (62,7%), mutaatiot

PIK3CA

varten 10/51 potilaalla (19,6%) ja mutaatioita

FBXW7

for 5/51 näytettä (9,8%). 2 sääntelyviranomaisten mutaatiot ja p.E545K, p.H1047 PIK3CA mutaatiot kaikki validoitu ddPCR (S3 taulukko).

Mutaatioiden CRC oli koottu kuvioon 2 ja S3 Taulukko. Kaiken 45/51 näytteet tunnettu ainakin yksi mutaatio (88,2%).

Mutaatiot eri geenit (rivit) on kullekin CRC näytteen (sarakkeet). Harmaa neliö osoittaa, että mutaatio (raportoitu COSMIC tietokannassa (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), pois lukien polymorfismi) havaittiin kanssa Ampliseq Colon ja Lung paneeli geenissä, kun taas tyhjä neliö ilmaisee että mitään asiaa mutaatio löydettiin geenin.

keskustelu

Suurin hyöty NGS perinteisiin mutaatio tunnistusmenetelmiä on sen kyky seuloa useita mutaatioita useita geenejä samanaikaisesti ilman tarvetta suorittamaan useita peräkkäisiä testejä. Useat tutkimukset ovat jo validoitu käyttöön NGS ja sen paremmuus aikavälillä herkkyyden, nopeutta ja kustannuksia verrattuna perinteisiin menetelmiin. [18, 23, 24] oman kokemuksemme, kokeisiin mukaan lukien enemmän kuin kaksi tai kolme erilaista kuormittajat, NGS on halvempaa, nopeampaa ja vaatii vähemmän DNA kuin tarvittaisiin perinteisiä menetelmiä. Tämä on erityisen tärkeää sytologisella näytteitä ja pieni-kudosbiopsioista jolle useat molekyylien muutoksia täytyy seuloa, kuten NSCLC näytteitä esim [9, 18]. Todellakin, NGS vaatii vain 10 ng koko paksusuolen ja keuhkosyövän paneeli kun taas perinteiset menetelmät voivat vaatia jopa 10 ng DNA: ta kunkin mutaation testattu.

tarkkuus (toistettavuus ja toistettavuus) analyysi käyttäen vertailustandardeja kanssa tunnettu AF pystyimme osoittamaan, että kaikki mutaatiot, joiden AF 5% oli johdonmukaisesti havaittu. Kuitenkin, mutaatiot jossa AF 3% havaittiin vaihtelevasti. Lisäksi kun kliiniset näytteet analysoitiin 5 kertaa 3 eri kokeissa Variant soittajan vastaisesti havaittu mutaatioita, joiden AF 3%, joita ei havaita ddPCR, mikä viittaa siihen, että nämä mutaatiot vastaavat sekvensointi esineitä, kuten usein havaittu DNA uutettu FFPE näytteistä [25-27]. 4% kynnys siten valittu mutaatiota raportoinnin tasapaino maksimoi herkkyyden ja minimoida väärät positiiviset tulokset johtuvat teknisistä artefakti. Tämä kynnys on yhdenmukainen muiden herkkyys ja spesifisyys tiedot kirjallisuudessa raportoitu tähän NGS foorumin [16, 21]. Käyttämällä tätä kynnystä, yksi tapaus NSCLC kanssa p.L858R EGFR-mutaatio oli jäänyt. Tämän näytteen Variant Caller havaittu mutaatio AF 1,9%. Ottaen kuitenkin huomioon meidän kriteerit, joiden perusteella muunnelmaa kuin aito (AF 4% ja variantti kattavuus 30x), emme voineet vahvistaa tätä variantti. Äskettäin ehdotti, että tunnettuja kliinisesti merkittäviä geenivarianttien, kuten

EGFR

mutaatioiden NSCLC, olisi ilmoitettava riippumatta AF [28]. Meidän nykyisessä kliinisessä käytännössä, kun vietämme tunnettuja kliinisesti merkittäviä geenivariantin, mutta jossa on AF kynnyksen alapuolella, raportoimme että geenivariantin epäillään mutta ei vahvistettu, ja että olisi mielenkiintoista testata toinen näyte potilaasta, jos käytettävissä .

Erot NGS ja perinteisten menetelmien havaittiin 2 CRC tapauksissa KRAS G12V mutaatioita, molemmissa on alleelifrekvenssi 10%. Tämä alhainen AF voi selittää eroavaisuuksia, koska kynnys perinteisen menetelmän vaihtelee 3-20% mutanttien DNA KRAS testaus. Näistä 2 tapauksissa

KRAS

p.G12V mutaatioita todensi ddPCR.

Yksi haasteista käyttää NGS on tulkita havaitut mutaatiot sisällä biologinen yhteydessä. Kuten on jo kuvattu [28], variantit voidaan ryhmitellä kolmeen luokkaan: i) ne, jotka voivat olla suora vaikutus potilaan hoidon ja pidetään käytännöllisiä; (Ii) ne, joilla voi olla biologista merkitystä, mutta eivät ole selkeästi käytännöllisiä; ja (iii), jotka ovat tuntemattomia merkitys. Esillä olevassa tutkimuksessa, NGS analyysi havaittu mutaatioita (muu kuin

EGFR

mutaatioiden NSCLC ja kuin

KRAS

ja

sääntelyviranomaisten

CRC) mahdollisia kliinisiä vaikutuksia 4 potilailla, joilla on NSCLC (yksi

PIK3CA

mutaatio ja 3

STK11

mutaatioita) ja 14 potilaalla on CRC (10

PIK3CA

mutaatioita, 5

BRAF

mutaatioita-one potilaan kätkeminen

PIK3CA

ja

BRAF

mutaatioita). Prekliinisiä tiedot tukevat väitettä, että NSCLC solulinjoissa

PIK3CA

tai

STK11

ja

KRAS

mutaatio näyttää lisääntynyt herkkyys di pIK3 estäjiä tai MAPK ja mTOR signaloinnin esto, vastaavasti [29] – [30]. Lisäksi vaiheen annoksensuurentamistutkimuksessa Kliinisessä tutkimuksessa yleiseurooppalaisen luokan I PI3K estäjää potilailla, joilla on pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia-ensisijaisesti peräsuolen syöpä, rintasyöpä, ja keuhko-osoittivat alustavat antituumorivaikutus [31]. Samalla tavoin, ilmenee kasvaimen vastainen vaikutus havaittiin potilailla, joilla

BRAF

mutatoitu CRC käsiteltiin selektiivinen mutantti BRAF estäjä [32].

Johtopäätöksenä on, että esillä olevassa tutkimuksessa vahvistettu kliinisessä sovellettavuus Ion Ampliseq Colon ja keuhkosyöpä paneeli Ion Torrent Personal Genome Machine seulontaan keuhko- ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. Kaiken AmpliSeq paksusuolen /keuhkosyöpä paneeli oli erityinen ja herkkä riittävän mutaation analyysi geenin paneelien ja voidaan sisällyttää kliinisen käytännön toiminta.

tukeminen Information

S1 File. Täydentävillä menetelmillä: havaitseminen KRAS, BRAF ja EGFR mutaatioita ja pisara digitaalisen PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138245.s001

(DOCX) B S1 Taulukko. Kattavuusanalyysi variantteja ei johdonmukaisesti havaittu tarkkuuden analyysissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138245.s002

(DOC)

S2 Taulukko. Sekven- NSCLC.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138245.s003

(DOCX)

S3 Taulukko. Sekven- CRC.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138245.s004

(DOCX) B