Krooninen sairaus

tiivistelmä

täällä arvioitiin mahdollisten anti-peräsuolen syöpä aktiivisuuden erastin, jänniteriippuvainen anioni kanava (VDAC) sitoutuvilla yhdistettä. Meidän

in vitro

tutkimukset osoittivat, että erastin kohdistuu voimakkaita sytotoksisia vaikutuksia vastaan ​​useita ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjat, mahdollisesti kautta indusoimaan oksidatiivisen stressin ja kaspaasi-9-riippuvaisen solun apoptoosia. Edelleen, mitokondrioiden läpäisevyys siirtyminen huokosten (MPTP) aukko havaittiin erastin käsiteltyjen syöpäsolujen, joka näkyi VDAC-1 ja syklofiliinistä-D (CYP-D) yhdistys, mitokondrioiden depolarisaation, ja sytokromi C vapautumista. Caspase-inhibiittorit, ROS scavenger MnTBAP, ja MPTP-salpaajat (sanglifehrin A, syklosporiini A ja bongkrekic happo), sekä shRNA-välitteisen knockdovvn VDAC-1, kaikki merkittävästi heikennetty erastin-indusoitua sytotoksisuutta ja apoptoosin peräsuolen syövän soluissa. Toisaalta, yli-ilmentyminen VDAC-1 lisätyn erastin-indusoidun ROS, MPTP avaaminen, ja peräsuolen syövän solujen apoptoosin.

In vivo

tutkimukset osoittivat, että vatsaonteloon erastin at hyvin siedetty annoksilla dramaattisesti esti HT-29 ksenograftissa kasvu severe combined immuunivajausta (SCID) hiiriä. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että erastin on sytotoksinen ja pro-apoptoottista ja peräsuolen syövän soluja. Erastin voidaan tutkia tarkemmin uutena anti-peräsuolen syövän agentti.

Citation: Huo H, Zhou Z, Qin J, Liu W, Wang B, Gu Y (2016) Erastin häiritsee mitokondrioiden Läpäisevyys Transition Pore (MPTP ) ja indusoi apoptoottinen kuolema peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 11 (5): e0154605. doi: 10,1371 /journal.pone.0154605

Editor: Cong Cao, Suzhoun yliopisto, Kiina

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2016; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2016; Julkaistu: toukokuu 12, 2016

Copyright: © 2016 Huo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tiedesäätiö yhdeksännen kansan sairaalan sidoksissa Shanghai Jiao tong University School of Medicine (nro 2015521, on YG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on merkittävä rahoittaja syöpään liittyvää kuolleisuutta sekä Kiinassa [1] ja ympäri maailmaa [2,3]. On arvioitu, että yli 100000 uutta tapausta ja peräsuolen syöpä diagnosoidaan vuosittain, mikä aiheuttaa yli 50000 kuolemantapausta vuosittain [4]. Kemoterapia on ollut laajalti käytetty hoitoon peräsuolen syöpä, mutta lääkeresistenssin ja /tai off-kohde myrkyllisyys rajoittaa tehokkuutta nykyinen kemoterapia-lääkkeet [5,6,7]. Niinpä ryhmämme [8,9] ja muut [10,11] ovat keskittyneet kehittämään uusia ja tehokkaampia anti-peräsuolen syövän aineita.

Mitokondrioiden läpäisevyyttä siirtyminen huokosten (MPTP) on moni- proteiini kanava kompleksi makaa mitokondrioissa, jonka päätehtävänä on säilyttää tasapaino mitokondrioiden Hengitysketjun [12]. MPTP koostuu pääasiassa kolmesta proteiineista: lukien jännitteestä riippuva anioni kanava (VDAC) kun ulos mitokondrion kalvon (OMM), adeniinia nukleotidin translocator 1 (ANT-1) sisemmässä mitokondrion kalvon (IMM) ja matriisi paikallistamiseen syklofiliinistä-D ( CYP-D) [12]. On osoitettu, että useat ärsykkeet indusoi ANT-1 ja CYP-D yhdistys ja MPTP aukko, mikä johtaa reaktiivisten happiradikaalien (ROS) tuotanto, ATP ehtyminen ja proapoptoottisiin molekyyli (

i

.

e

. sytokromi c) vapautuminen [12,13]. Sen jälkeen kaspaaseiksi (lähinnä kaspaasi-9) ja solujen apoptoosin aktivoituu [12,13].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet ensimmäinen luokkansa VDAC sitovan pieni molekyyli, nimittäin erastin [14,15] . On osoitettu, että erastin on selektiivisesti sytotoksinen tiettyjen syöpäsolulinjoissa [14,15,16,17]. Esimerkiksi, Yagoda et al., Osoittivat, että erastin sitoutuu VDAC, jolloin tappava hapettumista syöpäsoluja [18]. Mahdollinen rooli erastin kolorektaalisyövässä soluissa, ja taustalla signalointi mekanismeja ei ole tutkittu. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että erastin oli sytotoksinen ja proapoptoottisiin peräsuolen syövän soluja, mahdollisesti kautta häiritsevät MPTP.

Materiaalit ja menetelmät

2.1. Soluviljely

Kuten [8,9], peräsuolen syöpä solulinjoja, kuten HT-29, DLD-1 ja Caco-2, ostettiin solusta pankin Kiinan tiedeakatemian (CAS) Shanghai Biologiset Institute (Shanghai, Kiina). Soluja ylläpidettiin FBS sisältävässä RPMI /DMEM. Ihmisen NCM460 paksusuolen epiteelisolujen linja tarjosi Fudanin IBS Cell keskus (Shanghai, Kiina). Soluja viljeltiin Hamin F12 ravintoalustassa (Gibco) [19].

2,2. Reagenssit ja kemikaalit

Erastin ostettiin Selleck (Shanghai, Kiina). MPTP-salpaajat kuten sanglifehrin A, syklosporiini A ja bongkrekic happo hankittiin Sigmalta (Shanghai, Kiina). Antioksidantti MnTBAP oli myös yhtiöltä Sigma. Kaspaasi-3-spesifinen inhibiittori z-DEVD-fmk ja kaspaasi-9-spesifinen estäjä z-LEHD-fmk hankittiin Calbiochem (Darmstadt, Saksa). Kaikki vasta-aineet soveltaa tässä tutkimuksessa saatiin Santa Cruz Biotech (Shanghai, Kiina).

2.3. MTT solunelinkykyisyysmääritys

Solujen eloonjääminen mitattiin 3- [4,5-dimethylthylthiazol-2-yyli] -2,5 difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma) määritys [9]. Eri kylvö tiheydet optimoitu alussa kokeiden.

2.4. Trypaanisinisellä värjäys määritys

trypaanisinistä määritys kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [9]. Lyhyesti, kun sovellettu erastin hoidon, kuolleiden (trypansininen positiiviset solut) laskettiin. Kuolema suhde (%) laskettiin numero trypaanisinisellä värjätään solut jaettuna solujen lukumäärä.

2,5. Pesäkemuodostusta

jälkeen erastin hoidon soluja (2 x 10

3) alun perin suspendoitiin elatusaineeseen 0,25% agaria (Sigma). Solususpensio sitten planked päälle ennalta vahvisti 0,25% agaria päälle 100 mm: n viljelymaljalle. Elatusaine vaihdettiin joka toinen päivä. Kun 10 päivän inkuboinnin selviytymisen pesäkkeet värjättiin ja ne laskettiin manuaalisesti.

2.6. BrdU

Solut (3 x 10

3 per kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille, kun käytetään käsittelyä, proliferaatiota arvioitiin kautta BrdU ELISA kolorimetristä määritystä (Roche, Indianapolis, IN ) valmistajan protokollaa. ELISA OD-arvo hoitoryhmän normalisoitiin kuin käsittelemättömän kontrolliryhmän.

2.7. -Solujen apoptoosin analyysissä anneksiini V-värjäys

hoidon jälkeen, apoptoosia havaittiin, että anneksiini V FACS-analyysilla, kuten aiemmin on raportoitu [9]. Määrä anneksiini V värjäytyneiden solujen kirjattiin.

2.8. Kvantifiointi apoptoosin entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

Kuten on kuvattu [8,9], Cell Apoptosis ELISA Detection Kit Plus (Roche, Palo Alto, CA) käytettiin määrittämään solujen apoptoosin mukaan valmistajan protokollan.

2.9. Kaspaasiaktiivisuus määritys

Hoidon jälkeen sytosolin proteiinit uutettiin puskuriin kuvattu [8,9]. Kaksikymmentä ug sytosolin otteita per näyte lisättiin kaspaasi määrityspuskuria substraattien kanssa kaspaasi-3 /-8 /-9 (Roche, Shanghai, Kiina). Vapautuminen 7-amido-4- (trifluorimetyyli) kumariini (AFC) kvantifioitiin kautta Fluoroskan järjestelmä asetettu herätteen arvo 355 nm [8,9]. Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisina fluoresenssiyksikköinä /ug proteiinia.

2,10. Western blotting

Lyhyesti, alikvootteja 30 ug hajotettiin kunkin näytteen proteiinit erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore, Bedford, MA). Blokkauksen jälkeen kalvoja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin sekundäärisellä vasta-aineella yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pultti visualisoitiin ECL (tehostettu kemiluminesenssi) kone. Kukin kaista kvantifioitiin kautta ImageJ ohjelmisto, ja arvo oli normalisoitu kullekin latauskontrollina bändi.

2.11. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) havaitseminen

Solunsisäinen ROS mitattiin virtaussytometrialla kautta dichlorofluorescin (DCF) hapetus määrityksessä. DCFH-DA siirtyy passiivisesti soluihin, ja lohkaistaan ​​epäspesifinen solujen esteraasit ja hapetetaan kun läsnä on ROS. Käsittelyn jälkeen soluja (3 x 10

5 per näyte) inkuboitiin DCFH-DA (5 uM) yhden tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut pestiin PBS: llä ja pidettiin 1 ml: aan PBS: ää, ROS fluoresenssi analysoitiin käyttäen yllä Fluoroskan järjestelmän.

2,12. Detection mitokondrion potentiaali vähennys (ΔΨ

m) B

Kuten [20] ΔΨ

m mitattiin JC-10 fluoresenssiväriä. Kun mitokondrion potentiaali pienenee, monomeerinen JC-10 muodostavat sytosoliin, jossa esiintyy vihreä fluoresenssi [20]. Lyhyesti, kun käytetään erastin hoidon, solut värjättiin 5 ug /ml JC-10 (Invitrogen) 10 minuutin ajan, ja havaitaan heti sen jälkeen Fluoroskan-järjestelmästä asetetaan heräte-arvo 485 nm: n [20].

2.13. Mitokondrioiden immunosaostus (mito-IP) B

Solut trypsinoitiin, ja mitokondrioiden fraktiot valmistettiin kautta Mitochondria /sytosoliin fraktiointi Kit (BioVision, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Kaksisataa ug solulysaateista mitokondrion fraktiot esipuhdistettiin 20 ui proteiini-A /G Plus-agaroosia (Santa Cruz) 1 tunnin ajan. Supernatantti pyöritettiin sitten yön yli 0,25 ug anti-ANT-1 (Santa Cruz Biotech). Seuraavaksi lysaatit sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa mikro-sentrifugissa poistamaan epäspesifisen aggregaatteja. Proteiini A /G Plus-agaroosia (35 ui) lisättiin sitten supernatantit 4 tuntia 4 ° C: ssa. Pelletit pestiin kuusi kertaa PBS: llä, suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin, ja sitten analysoitiin Western blottauksella [20].

2,14. Vakaa knockdovvn VDAC-1 lentiviraalinen shRNA

kahdet lentivirusta pakattujen VDAC-1 lyhyt hiusneula-RNA: t (shRNA-1 ja shRNA-2, ei-päällekkäisiä sekvenssejä) suunniteltiin, syntetisoitiin ja varmistettiin Genechem (Shanghai, Kiina). Kymmenen ui /ml lentivirus- partikkeleita lisättiin HT-29-solut 12 tuntia. Sen jälkeen, lentivirus sisältävä väliaine korvattiin täydellistä alustaa, ja soluja viljeltiin vielä 24 tuntia. Sen jälkeen, puromysiini (5,0 ug /ml, Sigma) lisättiin ja valitse resistenttejä stabiilisti pesäkkeitä varten 2-3 viikkoa. Expression of VDAC-1 detektoitiin Western-blottauksella. Kontrollisoluja käsiteltiin sekoituskoodin ei-sense shRNA lentivirus- partikkeleita (Santa Cruz Biotech).

2,15 Yli-ilmentäminen VDAC-1 ja stabiilisti solujen valinta

täysimittaista ihmisen VDAC-1 cDNA, ostettu Genechem (Shanghai, Kiina), oli kloonattiin pSuper-puro-lippu (lahja tri Bi Lab) [21]. Tyhjän vektorin (pSuper-puro-lippu) tai VDAC-1 ilmentävien Konstrukti transfektoitiin HT-29-soluihin Lipofectamine 2000-protokollan (Invitrogen). Stabiilisti kloonit valittiin kautta puromysiiniä (5 ug /ml). Sen jälkeen, kun 12-14 päivä valinta, stabiilisti solut altistettiin Western-blottaus määritystä VDAC-1 ilmentymisen.

2,16.

In vivo

antituumorivaikutuksen tehosta arviointi

Kasvaimen kasvu tutkimuksista tehtiin vaikea sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) hiiriä ksenograftimallissa. Kaikki hiiret hankittiin Animal Facility Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Shanghai, Kiina). Lyhyesti, 2 x 10

6 elinkelpoinen HT-29-solua 100 ul: aan elatusainetta (per hiiri) inokuloitiin subkutaanisesti, ja hiiret, jotka kantavat ~ 100 mm

3 kasvaimia jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään, joissa oli 10 hiirtä per ryhmä . Hiiriä käsiteltiin päivittäin 10 tai 30 mg /kg kehon painoa erastin (vatsaonteloon, ja 4 viikkoa), tai ajoneuvon hallinnan (suolaliuos). Kasvaintilavuudet laskettiin muutettu ellipsoidin kaavalla: (π /6) x AB

2, jossa A on pisin ja B on lyhin kohtisuorassa akselin tuumorimassan [22,23]. Hiiret kehon painot tallennettiin myös viikoittain. Humane päätepisteet olivat aina käytetty minimoimaan hiirille kärsimystä. Eläimiä tarkkailtiin päivittäin pohjalta. Merkit kuten merkittäviä vähennetty liikkumiskyky, vaikea ripuli, vaikea piloerektiota tai äkillinen laihtuminen ( 20%) kirjattiin. Jos eläimet saavuttanut näitä vaikutuksia ne tapettiin exsanguination alle 2,2,2-tribromietanoli anestesian (4 mg /10 g kehon painoa, Sigma). Kaikki injektiot suoritettiin 2,2,2-tribromietanoli anestesian menetelmällä. Eläinkokeissa on hyväksynyt Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja eettinen komitea (Yhteyshenkilö: Dr. kesäkuu Wang, 2014126).

2.17. Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot normalisoitiin kontrolliarvoihin kunkin testin ja esitettiin keskiarvona ± standardipoikkeama (SD). Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Scheffen f-testiä käyttämällä SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL). Merkitys valittiin p 0.05.

Tulokset

3.1. Erastin kohdistaa sytotoksinen, mutta ei sytostaattiset vaikutukset viljeltyihin peräsuolen syövän solut

testaamiseksi erastin n aktiivisuus peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä, HT-29-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla erastin (0,1-30 uM). MTT-analyysi suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 1A, erastin voimakkaasti esti HT-29-solujen eloonjäämistä, mikä oli osoituksena MTT OD vähentämiseen. Erastin osoitti annoksesta riippuva vaikutus (kuvio 1A), ja 30 uM erastin näytetään dramaattisin vaikutus (kuvio 1A). Erastin kesti vähintään 48 tuntia käyttämään huomattavaa sytotoksista vaikutusta HT-29-soluja (kuvio 1A). Sytotoksinen vaikutus erastin osoitettiin myös, että trypaanisininen-värjäyksen määrityksessä (kuvio 1 B) ja pesäkemuodostusta (kuvio 1C). Erastin (1-30 uM) hoito lisäsi merkittävästi määrää trypaanisinisen positiivinen ( ”kuollut”) HT-29-solut (kuvio 1 B), whiling vähentämällä selviytyminen HT-29 pesäkettä (kuvio 1 C).

peräsuolen syöpä solut (HT-29, DLD-1 ja Caco-2-linjat) tai NCM460 paksusuolen epiteelisolut käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO: ta, ”Ctrl”) tai osoitetut pitoisuudet erastin soveltavaan ajan, solujen eloonjäämistä testattiin MTT-määrityksellä (A ja E) ja pesäkemuodostusta (C); Prosenttiosuus trypaanisinisen positiivinen ( ”kuollut” solut) nauhoitettiin (B); Solujen lisääntyminen testattiin BrdU (D ja F). Kutakin määritystä varten, n = 5. Tulokset esitetään olivat keskiarvo ± SD. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin saatu. * P 0,05 vs. ryhmä ”Ctrl”.

Mielenkiintoista, erastin (1-30 uM) näytti tehoton estämään HT-29 solujen lisääntymistä, ja BrdU ei muuttunut HT-29-solujen jälkeen sytotoksiset erastin (1-30 uM) jälkeen (kuvio 1 D). Siksi sytotoksinen vaikutus erastin on epätodennäköistä johtuen leviämisen estäminen. MTT-tulokset kuviossa 1E osoitti, että erastin (1-30 uM) oli myös solumyrkyllinen kaksi muuta kolorektaalisyöpä solulinjoissa: DLD-1 ja Caco2. Kuitenkin sama erastin hoito oli yleensä turvallista ei-syöpä NCM460 paksusuolen epiteelisoluissa (kuvio 1 E). Jälleen kerran, BrdU, merkkivalo solujen jakautumisen, ei vaikuttanut erastin (10gM) in DLD-1 ja Caco2 soluja, eikä NCM460 epiteelisoluissa (kuvio 1 F). Näiden tulosten perusteella, osoitamme, että erastin kiinnostavuus sytotoksinen, mutta ei sytostaattinen aktiivisuus viljeltyihin peräsuolen syövän soluja.

3.2. Erastin indusoi ROS tuotanto ja kaspaasiriippuvaisen apoptoosia viljellyissä peräsuolen syövän solut

Seuraavaksi arvioimme mahdolliset aktiivisuutta erastin solujen apoptoosin. Kuten kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [8,9], erilaiset apoptoosin määritykset suoritettiin. Kaspaasi-määrityksen tulokset osoittivat, että kaspaasi-3 ja caspae-9 lisääntyi merkitsevästi HT-29-soluissa, sen jälkeen sytotoksinen erastin (1-30 uM) jälkeen (kuvio 2A), mikä osoittaa mitokondrion apoptoosireittiä aktivointi [24]. Sitä vastoin kaspaasi-8, indikaattori ulkoinen apoptoottisen reitin aktivointi [25,26], oli ennallaan erastin saaneilla HT-29-soluissa (kuvio 2A). Apoptoosia aktivaatio erastin vahvistettiin myös, että anneksiini V FACS määrityksessä (kuvio 2B) ja histoni DNA apoptoosin ELISA-määritystä (kuvio 2C). Erastin annoksesta riippuvalla kasvoi anneksiini V prosenttiyksikköä ja histoni DNA ELISA OD HT-29-soluissa (kuvio 2B ja 2C).

peräsuolen syöpäsolujen (HT-29, DLD-1 ja Caco-2 riviä) tai NCM460 paksusuolen epiteelisolut käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO: ta, ”Ctrl”) tai osoitetut pitoisuudet erastin soveltavaan ajan, apoptoosia tutkittiin luetellut määritykset (AC, G ja H); ROS tuotanto tutkittiin myös (D ja I). HT-29-soluja esikäsiteltiin z-DEVD-fmk ( ”zDEVD”, 50 uM), z-LEHD-fmk ( ”zLEHD”, 50 uM) tai MnTBAP (10 uM) 1 tunti ennen sovellettu erastin stimulaation , solujen eloonjäämistä ja solukuoleman testattiin MTT-määrityksellä (E) ja trypaanisininen määritys (F), vastaavasti. Kutakin määritystä varten, n = 5. Tulokset esitetään olivat keskiarvo ± SD. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin saatu. * P 0,05 vs. ryhmä ”Ctrl”.

# p 0,05 vs. ryhmä erastin vain (E ja F).

Koska erastin on VDAC sitova yhdiste, joka voi häiritä mitokondrion Hengitysketjun ja aiheuttaa ROS tuotanto [18]. Seuraavaksi testasimme oksidatiivisen stressin taso erastin saaneilla HT-29-soluja. Tulokset kuvassa 2D osoitti selvästi, että erastin lisääntynyt taso ROS HT-29-soluja. Tutkia rooli apoptoosin ja ROS tuotanto erastin aiheuttama sytotoksisuuden erilaisia ​​farmakologisia inhibiittorit sovellettiin. Kuten kuviossa 2E ja 2F, kaspaasi-3-spesifinen estäjä z-DEVD-fmk, kaspaasi-9 spesifinen estäjä z-LEHD-fmk, tai superoksidin scavenger MnTBAP [27] kaikki lievittää erastin aiheuttamaa sytotoksisuutta HT-29 soluissa (kuvio 2E ja 2F). Kahdessa muussa kolorektaalisyövän solulinjat, erastin (10 uM) indusoi myös kaspaasi-9 (kuvio 2G), ja apoptoosia (kuvio 2H) aktivointi sekä ROS tuotanto (kuvio 2I). Tällaisia ​​vaikutuksia erastin jälleen ei nähty paksusuolen epiteelin NCM460 soluja (kuvio 2G-2I). Siksi erastin indusoi ROS tuotanto ja kaspaasiriippuvaisen apoptoosin peräsuolen syövän soluissa.

3.3. Erastin indusoi MPTP aukko viljellyissä peräsuolen syövän solut

Koska erastin on VDAC sitova yhdiste [18], tilan MPTP in erastin saaneilla peräsuolen syövän solut arvioitiin sitten. Ensimmäinen, mitokondrioiden immunosaostus (Mito-IP) määritys [28,29], osoittivat, että ANT-1 ja CYP-D muodostivat kompleksin erastin saaneilla HT-29-soluissa (kuvio 3A), joka tunnetaan ensimmäinen askel MPTP aukon [12,13]. Toinen taso sytosoliin sytokromi C oli myös lisääntynyt HT-29-soluissa, sen jälkeen erastin jälkeen (kuvio 3B), joka on tunnettu tapahtuma seuraavat MPTP aukon [12,13]. Lisäksi kasvua JC-10 vihreän fluoresenssin intensiteetti osoitti mitokondrion potentiaalin (ΔΨm) (kuvio 3C). Kaikki nämä tulokset osoittivat selvästi, että MPTP aukko seuraavat erastin hoidon HT-29-soluja. Huomaa, että samanlaisia ​​tuloksia erastin saatiin myös kaksi muuta paksusuolen syövän solulinjat (tietoja ei esitetty).

HT-29-soluja käsiteltiin soveltavan erastin varten osoitetun ajan, MPTP aukko oli osoituksena mitokondrioiden VDAC-1 -ANT-1 yhdistys (A), sytokromi C ( ”Cyto-C”) release (B) ja JC-10 intensiteetin kasvu (C). HT-29-soluja esikäsiteltiin sanglifehrin A (SFA, 2,5 uM), syklosporiini A (CsA, 0,5 uM) tai bongkrekic happoa (BA, 5 uM) ennen erastin (10 uM) hoitoon, solujen eloonjääminen (D) ja apoptoosin (E) analysoitiin jälkikäteen. Vakaasti HT-29-solut, jotka ilmentävät VDAC-1 shRNA-1 /-2 tai sekoituskoodin ohjaus shRNA ( ”SCR shRNA”) käsiteltiin erastin (10 uM), VDAC-1 ilmentymisen (F), solujen eloonjääminen (G) ja apoptoosin ( H) testattiin. ANT-1-assocaited CYP-D (A), sytosolissa sytokromi C lauseke (B) ja VDAC-1 ilmentymisen (F) kvantitoitiin. Kutakin määritystä varten, n = 4. esitetyt tiedot olivat keskiarvoja ± SD. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin saatu. * P 0,05 vs. ryhmä ”Ctrl”.

# p 0,05 vs. ryhmä erastin vain (D ja E) tai ”scr shRNA” ryhmä (G ja H). ”Trans” tarkoittaa transfektiota ohjaus (FH).

roolin tutkimiseksi MPTP in erastin aiheuttamia sytotoksisuus, haimme useita tunnettuja farmakologisia MPTP salpaajat, kuten sanglifehrin A (SFA) [30], syklosporiini A (CsA) [31] ja bongkrekic happo (BA) [28,32]. Kuten on osoitettu, esikäsittely näiden MPTP-salpaajien vaimensi merkittävästi erastin aiheuttama HT-29-solujen kuolemaa (kuvio 3D) ja apoptoosia (kuvio 3E). Edelleen tukemaan hypoteesia, shRNA strategiaa sovellettiin selektiivisesti ja stabiilisti pudotus VDAC-1, keskeinen osa MPTP ja sitovan proteiinin erastin [12]. Kaksi vakaasti HT-29 linjat ilmentävät erillisiä VDAC-1 shRNAs (-1 /-2) perustettiin (kuvio 3F). Tärkeää on, erastin aiheuttama sytotoksisuuden (kuvio 3G) ja apoptoosia (kuvio 3H) olivat merkittävästi estyy VDAC-1-vaimennettu HT-29-soluja. Nämä farmakologiset ja geneettiset todisteet viittaavat siihen, että erastin aiheuttama sytotoksisuutta paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja vaatii VDAC-1 sitovaa ja myöhemmät MPTP aukko.

3.4. VDAC-1 yli-ilmentyminen voimistaa erastin n sytotoksisuus

tukemiseksi edelleen keskeinen rooli VDAC-1 in erastin aiheuttaman sytotoksisuuden, me eksogeenisesti ilmaistu VDAC-1 HT-29-soluja. Western blotting-tulokset kuviossa 4A vahvisti VDAC-1 yli-ilmentymisen pysyvästi HT-29-solujen VDAC-1-rakenne. Tämän seurauksena, erastin aiheuttama elinkelpoisuuden väheneminen (kuvio 4B) ja apoptoosia (kuvio 4C) on täydennetty. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen VDAC-1 helpottaa erastin-indusoidun ROS tuotanto (kuvio 4D), ja JC-10 OD lisäys (indikaattori MPTP aukon, kuvio 4E). Mielenkiintoista, osoitimme että NCM460 paksusuolen epiteelisolut ilmaistuna alhainen VDAC-1 (kuvio 4F). Silti, kun yli-ilmentynyt VDAC-1 NCM460 soluissa (kuvio 4F), nämä solut tulivat alttiiksi erastin (kuvio 4G). Näin ollen, nämä tulokset vahvistavat edelleen, että VDAC-1 on keskeinen tekijä erastin toimintaa.

Vakaasti HT-29-solujen tai NCM460 paksusuolen epiteelisolut ilmentävät tyhjän vektorin (pSuper-puro, ”Vec”) tai VDAC-1 cDNA: ta ( ”VDAC-1”), käsiteltiin suunniteltu erastin soveltavaan aikaa, VDAC-1 ilmentymisen, solujen selviytymisen ja apoptoosia testattiin Western-blottauksella määritystä (A ja F), MTT-määrityksellä (B ja G) ja histoni DNA ELISA-määritys (C), vastaavasti; ROS tuotanto (D) ja JC-10 voimakkuus (E) analysoitiin myös. Kutakin määritystä varten, n = 4. esitetyt tiedot olivat keskiarvoja ± SD. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin saatu. VDAC-1-ekspressio kvantitoitiin (F). * P 0,05 vs. Ctrl ryhmä ”Vec” soluja (B-E).

# p 0,05 vs. erastin ryhmä ”Vec” soluja (B-E). ”Trans” tarkoittaa transfektiota ohjaus (D ja E).

3.5. Erastin hallinto estää HT-29 ksenograftissa kasvua SCID-hiirissä

in vivo

aktiivisuuden erastin testattiin myös. SCID hiirillä HT-29 ksenograftimallissa sovellettiin. Viikoittainen kasvaimen kasvukäyrä-tulokset kuviossa 5A osoitti, että erastin vatsaonteloon dramaattisesti esti HT-29 ksenograftissa kasvua SCID-hiirissä. Erastin n

in vivo

aktiivisuus oli jälleen pitoisuudesta riippuvainen. Erastin 30 mg /kg oli selvästi tehokkaampi kuin 10 mg /kg tukahduttamaan HT-29-ksenografteissa (kuvio 5A). On huomattava, että hiiret kehon paino ei ollut merkittävää eroa kunkin ryhmän (kuvio 5B). Myöskään me esiintyy jotakin ilmeistä toksisuutta näissä hiirissä. Nämä tulokset osoittivat, että näitä eläimiä oli hyvin siedetty kuin erastin hoito täällä. Edelleen, kasvaimen päivittäin kasvu, laskettuna mm

3 /vrk, aleni kanssa erastin annon (kuvio 5C). Lopussa kokeiden, painot erastin-ylläpitäjä ksenografteissa olivat myös paljon pienemmät kuin vehikkelikontrollihiiret (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittivat, että erastin anto estää HT-29-kasvaimen kasvun

in vivo

.

HT-29-kasvain, joissa SCID-hiiriin intraperitoneaalisesti hallinnoitava erastin (10/30 mg /kg kehon painoa tai ” bw ”, päivässä, 4 viikkoa) tai vehikkeliä (suolaliuosta) ohjaus, kasvainten (A) ja hiirillä painon (B) tallennettiin viikoittain viiden viikon ajan; Päivittäinen kasvaimen kasvua laskettiin myös (C). Päättyessä kokeissa kaikki ksenografteissa eristettiin ja painotetut (D). Kutakin määritystä varten, n = 10. Tulokset esitetään olivat keskiarvo ± SD. Kokeet toistettiin kahdesti saatu samanlaisia ​​tuloksia. * P 0,05 vs. ryhmä ”Vehicle”.

# p 0,05 vs. ryhmä erastin 10 mg /kg kehon painoa.

Keskustelu

Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että erastin kohdistuu voimakas sytotoksinen vaikutus useita ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja mahdollisesti kautta asiakkuutta oksidatiivista stressiä ja kaspaasi-9 riippuvaista apoptoosia. MPTP aukko havaittiin erastin käsiteltyjen syöpäsolujen, joka näkyi VDAC-1 ja CYP-D yhdistys, mitokondrioiden Depolarisaatio ja sytokromi C vapautumista. Caspase-inhibiittorit, ROS scavenger MnTBAP, ja MPTP-salpaajat (sanglifehrin A, syklosporiini A ja bongkrekic happo), sekä shRNA-välitteisen knockdovvn VDAC-1, kaikki merkittävästi heikennetty erastin-indusoitua sytotoksisuutta ja apoptoosin peräsuolen syövän soluissa. Toisaalta, yli-ilmentyminen VDAC1 voimistua erastin: n sytotoksisuutta. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että erastin sitoutuu VDAC1 häiritä normaalia mitokondrioiden toimintaa, aiheuttaen MPTP aukko, ja joka lopulta johtaa kaspaasi-9-riippuvaista apoptoosia aktivaation peräsuolen syövän soluissa.

On huomattava, että erastin oli ei-sytotoksisia NCM460 paksusuolen epiteelisoluihin. Meidän ei myöskään havaita mitään merkittävää kaspaasi-9 aktivointi eikä MPTP toimintahäiriöitä erastin saaneilla NCM460 soluissa. Yksi mahdollinen syy voi olla se, että nämä ei-syöpä epiteelisolujen ilmaista hyvin alhainen VDAC (-1), siis soluja ei kohdistettu erastin (katso kuva 4). Koska itse asiassa, kun ulkoisesti yli-ilmentynyt VDAC-1 NCM460-soluissa, nämä solut, kuten syöpäsolut, tuli alttiita erastin (katso kuvio 4). Toinen mahdollisuus on, että syöpäsolut ovat kaikki nopeita solujen kasvuun jotka mahdollisesti vaativat korkeaa mitokondrioiden Hengitysketjun tuottaa ATP. Nämä solut voivat olla herkempiä VDAC tai MPTP häiriöitä. Se seikka, että erastin kohdistuu vain syöpäsoluja osoittaa, että se voisi olla ihanteellinen ehdokas syövän hoitoon.

Vaikka useat tutkimukset ovat tutkineet mahdollisuuksia syövän vastainen vaikutus, jonka erastin

in vitro

[ ,,,0],14,16,33],

in vivo

todisteet puuttuvat edelleen. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että vatsaonteloon erastin on hyvin siedetty annoksilla (10 tai 30 mg /kg, päivittäin) estivät dramaatti- sesti HT-29-ksenografti kasvua SCID-hiirissä. Tärkeää on, että

in vivo

erastin hoito ei vaikuttanut hiirten painoja, eikä se aiheuttaa merkittävää toksisuutta koe-eläimille. Nämä prekliinisissä tulokset viittaavat siihen, että erastin voisi olla lupaava anti-peräsuolen syövän agentti.

Johtopäätökset

Yhteenvetona erastin häiritsee MPTP ja indusoi apoptoottisen kuoleman paksusuolisyövän soluja. Erastin voidaan tutkia tarkemmin uutena anti-peräsuolen syövän agentti.