Krooninen sairaus

tiivistelmä

Advanced ihmisen kilpirauhassyövän ovat tiheästi soluttautunut kasvaimeen liittyvien makrofagien (TAM) ja tämä korreloi huonoon ennusteeseen. Käytimme

BRAF

indusoimaan papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) hiiri malleja tutkia roolia TAMeja PTC etenemistä. Sen jälkeen ehdollinen aktivointi

BRAF

V600E

hiiren kilpirauhasen on lisääntynyt ilmentymä TAM kemoattraktantit

Csf-1

ja

Ccl-2

. Tätä seuraa kehitystä PTC jotka ovat tiheästi soluttautunut TAMeja jotka ilmaisevat

CSF-1R

ja

CCR2

. Targeting CCR2 ilmentävien solujen aikana BRAF-induktion vähensi TAM tiheys ja heikentynyt PTC kehitystä. Tämä strategia indusoi myös pienempiä kasvaimia, vähentynyt proliferaatio ja palauttaa kilpirauhasen follikulaarinen arkkitehtuurin perustettu PTC. Vuonna PTC hiiristä, jotka puuttuivat CSF-1 tai jotka saivat C-FMS /CSF-1R estäjä, TAM rekrytointi ja PTC eteneminen oli heikentynyt, pääpiirteittäin vaikutukset kohdistuvat CCR2 ilmentävien solujen. Tuloksemme osoittavat, että TAM ovat pro-tuumorigeenisia kehittyneiden PTC ja että ne voidaan suunnata farmakologisesti, joka voi olla hyötyä potilaille, joilla on edennyt kilpirauhassyövän.

Citation: Ryder M, Gild M, Hohl TM, Pamer E, Knauf J, Ghossein R, et al. (2013) Genetic ja farmakologiset kohdentaminen CSF-1 /CSF-1R Estää kasvaimeen liittyvien makrofagien ja Heikentää BRAF aiheuttama kilpirauhassyöpä Progression. PLoS ONE 8 (1): e54302. doi: 10,1371 /journal.pone.0054302

Editor: Marian Ludgate, Cardiff University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 26 syyskuu 2012; Hyväksytty: 10 joulukuu 2012; Julkaistu: 23 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Ryder et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke on rahoitettu, osittain K08 CA133183 ja American Kilpirauhasen Association THANC palkinto (MR), K08 AI071998 (TMH), RO1 CA50706 ja R01 CA72597 (JAF), The Lefkovsky Family Foundation ja Byrne rahasto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) on kyky estää (M1 tyyppi) tai edistää (M2 tyyppi) tumorigeneesin [1]. Havainto, että lisääntynyt tiheys TAMeja korreloi huonon kliinisen tuloksen useimmissa ihmisen syövissä viittaa TAMeja ovat pro-tuumorigeenisia [2] – [5]. Lisäksi geeni allekirjoitusta stroomaan ihmisen rinta- syöpien, jotka ovat peräisin potilaista, joilla on huono tulos ovat riippumattomia prognostisia markkereita ja sisältävät useita erittäin ilmaistaan ​​TAM liittyviä geenejä [6]. Välittömät todisteet roolin TAMeja kasvainten synnyssä havaitaan rintasyöpä hiiri malleja, joissa pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1 (CSF-1) riippuvan TAM rekrytointi vaaditaan kasvaimen aloittamiseen stimulaation kautta tuumoriangiogeneesin [7]. Tällä metastaasien, CCR2

+ tulehduksellinen makrofageja (MO) helpottaa rinta- syöpäsolujen ekstravasaatio, kylvö ja kasvu [8].

Monivaiheinen hiiren malleja tumorigeneesin sopivat ihanteellisesti tutkia toiminnallista roolia strooman soluja kasvainten aloittamisesta ja etenemiseen. Paras tunnettu näistä ovat RIP1-Tag saarekesolujen carcinoma [9] ja polyoma keskimmäinen T-antigeeni (PyMT) rintasyöpä mallit [10]. Nämä ovat antaneet arvokasta tietoa, vaikka luultavasti ne eivät ole geneettisesti tarkkoja recapitulations kuljettajien tumorigeneesin näissä solutyypeissä. Onkogeenisia mutaatiot

BRAF

ovat yleisimpiä geneettisiä tapahtumia ihosyövän [11] ja papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) [12], [13], ja niiden ajatellaan olevan osallisena alkuvaiheissa kasvaimen kehitystä, kuten ne ovat läsnä hyvänlaatuisia nevi [14] ja micropapillary kilpirauhassyövän [15], vastaavasti.

BRAF

mutaatiot ovat myös erittäin yleisiä kehittyneitä muotoja kilpirauhassyövän [16], ja niihin liittyy suurempi kuolleisuus [17]. Mielenkiintoista, lisääntynyt tiheys TAMeja korreloi imusolmukemetastaaseja vuonna PTC [18] ja invasiivista sairautta ja laski eloonjäämisen huonosti eriytetty kilpirauhassyövän (PDTC) [4]. Todellakin, TAM käsittävät vähintään 50% tuumorin tilavuudesta useimmat anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC), erittäin virulenttia muodossa tauti, joka on lähes aina kuolemaan johtava [4], [19], [20].

useita hiiren geneettistä mallia

BRAF

indusoimaan syöpä on kehitetty joko aktivoituminen piilevän endogeenisen mutanttialleelit [21], [22] tai kilpirauhasen-erityinen yli-ilmentymisen [23]. Kaikki näyttää korkea penetrance kilpirauhassyövän, ja eteneminen huonosti eriytetty kasvaimia. Lisäksi ehdollinen aktivointi BRAF hiiren kilpirauhasen indusoi PTC, joka on täysin päinvastainen, kun de-induktion BRAF [24].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että aktivointi onkogeenisiä BRAF hiiren kilpirauhasen johtaa kasvaneeseen ilmaus n kemoattraktantit CSF-1 ja CCL2 ja että tämä liittyy nopeaan ja vankka rekrytointi TAMeja ilmentävien sukulais reseptoreita

CSF-1R

ja

CCR2

, vastaavasti. Valikoivasti kohdistaminen CSF-1 tai CCR2 ilmentävien solujen aikana BRAF aktivoinnin vähensi TAM tiheys ja heikentynyt PTC kehittymistä ja etenemistä. Ehtyminen TAMeja alkupuolella PTC kehitys painoi strooman laajentamista syöpään liittyvien myofibroblasteja (valuuttalisien). Vakiintuneissa PTC, kasvaimet kehittävät pitkä solu ja huonosti erilaistunut pesäkkeitä, jotka ovat histologisia piirteitä, jotka ovat ominaisia ​​edistyneitä ihmisen kilpirauhassyövän. Targeting CCR2 ilmentäviä soluja hiirissä kehittyneitä PTC pienensi TAM tiheys sekä pienempiä, eriytetymmällä kilpirauhassyövän vähemmillä pesäkkeet pitkä solujen ja huonosti eriytetty alueilla. Farmakologinen kohdentamista BRAF aiheuttama PTC selektiivisen c-FMS /CSF-1R estäjä kertasi vaikutukset kohdistuvat CCR2 ilmentävien solujen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että hoitostrategioita kohdistaminen TAM voi olla hyödyllistä tässä sairaudessa, ja ehkä parantaa tehokkuutta estäjät kohdistuvat solun autonomisen onkogeenisiä kuljettajien taudin.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiri mallit

seuraavat kaksi mallia

BRAF

indusoimaan kilpirauhassyövän käytettiin tässä tutkimuksessa:

1) Tg-rtTA /tefO-BRAF

V600E

hiiriä ilmaista onkogeeniset BRAF

V600E kilpirauhasen solujen DOX-riippuvaisella tavalla, ja pidettiin käytettäessä FVB /N tausta [24]. 2)

Tg-Braf

siirtogeenisiä hiiriä ilmaista ihmisen onkoproteiinia valvonnassa naudan tyroglobuliinin geenin promoottori [23].

CCR2-DTR

ja

CCR2-GFP

hiiret ilmentävät DTR tai vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP), vastaavasti, valvonnassa monosyytti /MO-erityisiä

CCR2

geenin promoottori ja ylläpidettiin C57 /B6 tausta [25].

Csf-1

– /-

hiiriä (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) ovat puutteellisia verenkierrossa ja kudoksissa monosyyttien /MO [26], [27]. Kaikki karjanhoito ja kokeellisia toimenpiteitä oli hyväksynyt Memorial-Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

ehtyminen TAMeja in Braf aiheuttama kilpirauhassyöpä hiirimalleihin

makrofaagianalyysi ehtyminen luuytimen (BM), veri, pernassa ja vatsaontelo tutkittiin

CCR2-DTR

hiirillä hoidon jälkeen difteriatoksiini (DT) 20 ng /g (List Biologicals, Campbell, CA) vatsaonteloon (ip) päällä vuorotellen päivää 7 päivää. Kaksikymmentäneljä tuntia viimeisen annoksen jälkeen DT, hiiret tapettiin CO

2 hengitysteitse ja kudosnäytteiden saadaan virtaussytometrialla ja /tai immunohistokemia (IHC) jäljempänä kuvatulla tavalla.

vaikutusten arvioimiseksi TAM PTC kehittämiseen,

Tg-rtTA /tefO-Braf /CCR2-DTR

hiiriä ruokittiin DOX-kyllästetty chow (2500 ppm; Harlan-Teklad) 7 päivän tai ilman DT ip joka toinen päivä alkaen päivänä 0. Päivänä 7 (24 tuntia viimeisen annoksen jälkeen DT), hiiret tapettiin CO

2 hengitysteitse ja kilpirauhasen uutetaan IHC. Jotta voidaan tutkia roolia TAMeja vakiintuneissa BRAF aiheuttama kilpirauhassyövän käsittelimme

Tg-Braf /CCR2-DTR

hiirillä noin 6 ja 12 viikon iässä tai ilman DT joka toinen päivä 10 päivän ajan. Hiiret lopetettiin ja kilpirauhasen uutettu 24 tuntia viimeisen annoksen jälkeen DT virtaussytometriaa ja IHC.

FACS-analyysi

Yhdistetyt kilpirauhasen kerättiin talteen intrakardiaa- PBS perfuusion heikentävistä kiertävien leukosyyttien. Kilpirauhasen jauhettiin pieniksi paloiksi ja sen jälkeen pilkkomalla entsymaattisesti yksisolususpensioi- kollagenaasin kanssa tyypin 2 (Worthington, Lakewood, NJ) ja dispaasi (Invitrogen, Carlsbad, CA) 90 minuutin ajan ravistellen inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Sitten näytteet pestiin kolme kertaa jääkylmällä-alusta täydennettynä 10% FBS: ää ja sen jälkeen laimentamalla FACS-puskurissa (PSB /1% BSA: ta). Näytteet peitettiin hiiren Seroblock FcR (ABD Serotec, Raleigh, NC) 10 minuuttia jäillä seurasi 30 minuutin inkubaatio seuraavien fluoresoivasti konjugoidun vasta: CD45: PerCP Cy5.5, CD11: APC, Gr-1: FITC, Ly6C: FITC, Ly6G: FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA) F4 /80: FITC (ABD Serotec). Yhden solun suspensiot BM aspirates, verinäytteitä, jotka oli poistettu punasoluja ja vatsakalvon pesuja estetty ja merkitty edellä. Tiedonkeruu saatiin käyttämällä FACS kaliiperi -virtaussytometrissä läpi MKSCC Flow Core ja data-analyysi suoritettiin käyttäen Flowjo 7.2.5 ohjelmistoa.

TAM kilpirauhasen syövät

TPO-Cre /LSL-Braf

hiiriä, jotka ilmentävät endogeenistä tasoa BRAF

V600E [21], eroteltiin kanssa CD11b: APC kilpirauhasen yhden solun valmisteet kuten edellä on kuvattu.

Immunofluoresenssi /immunohistokemia (IHC) B

Immunofluoresenssitutkimuksia leikesarjojen saatiin tuore, OCT-sulautettujen kilpirauhasen ja /tai pernat. Kilpirauhasen 5 uM kohdissa vähintään 3-4 tasoilla, kukin ~150 um toisistaan, saatiin. Leikkeitä kuivattiin ilmassa, kiinnitettiin jääkylmällä asetonilla 30 minuuttia, kuivata uudelleen ja asetettiin sitten PBS: ssä. Leikkeitä blokattiin DakoCytomation seerumitonta proteiini lohkon (Dako, Carpinteria, CA) 30 minuuttia, minkä jälkeen PNB salpausreagenssissa (Perkin Elmer, Waltham, MA) ja 60 minuutin ajan. Seuraavat hiiri ensisijainen, konjugoimattoman vasta-aineita käytettiin: CD11, CD68 ja αSMA seurasi inkubointi sekundaarisia vasta-aineita joko Alexa-Fluor 488 tai Alexa-564. Leikkeet kuvatuksi pystyasennossa Zeiss Axio2Imaging mikroskoopilla MSKCC Molecular Sytologia Core Facility.

IHC, kilpirauhasen kiinnitettiin yön yli 4 ° C: ssa tuoretta 4% paraformaldehydillä käyttäen jatkuva kierto. Kudokset pestiin 2 sykliä 30 min PBS inkuboinnit ja asetettiin sitten 70% etanolilla. Kudokset jalostetaan parafinoidut lohkojen seuraa mikrotomiamenetelmiä. Jälkeen deparaffinization, H 20000-kertainen

Csf-1

ja

c-fms /CSF-1R

mRNA, vastaavasti (Fig. 2). Valtava kasvu

CSF-1R

ilmaisu todennäköisesti heijastaa runsas TAM rekrytointi, koska me osoitamme, että BRAF aiheuttama hiiren PTC-solut eivät ilmennä tätä reseptoria (Fig. S1). Expression of

CCL2

ja sen reseptorin

CCR2

lisättiin myös, mutta vähemmässä määrin (~ 4-kertainen) (Fig. 2). Lisääntynyt ilmentyminen kaksi kemokiinien lisättiin ei-TAM solupopulaatio, joka koostuu pääasiassa kilpirauhasen follikulaarinen soluissa (kuvio. S1). Tämä vastaa aiempien tutkimusten osoittavat, että BRAF indusoi ilmentymistä Mo kemoattraktantit vuonna PCCL3 soluissa, rotan kilpirauhasen follikulaarinen solulinjassa [30]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että seuraava BRAF aktivointia, thyrocytes express CSF-1 ja CCL2, joka liittyy rekrytointi TAMeja ilmentävät niiden reseptoreita.

kvantitatiivinen RT-PCR: llä osoitti kemoattraktantit ja niiden reseptorien kilpirauhasissa otteita T

g-rtTA /tefO-BRAF

V600E

hiiriä ilman (ei DOX) tai 7 päivän kuluttua DOX. Ekspressiotasot normalisoitiin

β-aktiini

. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD peräisin kilpirauhasen mitään DOX (n = 4) ja 7-päivän DOX-indusoidun (n = 7) hiirillä. *** P 0,001.

valikoiva köyhtyminen TAMeja vuonna PTC Tg-rtTA /tefO-BRAF

V600E hiiret heikentää PTC aloittamista ja hidastaa strooman laajentaminen valuuttalisiin

jotta tutkia toiminnallista roolia TAMeja PTC kehittämiseen, ylitimme

Tg-rtTA /tefO-BRAF

V600E

kanssa

CCR2-DTR

hiiriä, jotka ilmentävät difteriatoksiinin reseptoriin (DTR) valvonnassa

CCR2

geenin promoottori [31]. Luuytimestä peräisin monosyytti (BMDM) esiasteita vaatia CCR2 signalointi poistua luuytimen [31]. Perifeerinen Mo eivät ilmaise CCR2, paitsi aikana erilliset tulehdustilat [32], [33]. Kuten on esitetty kuviossa. S2A-B, BM ja veri

CCR2-DTR

hiiriä hoidettiin DT viikon ollut väheneminen Ly6C + monosyytti esiasteita (kuvio. S2A) sekä CD11

+ ja F4 /80

+ kiertävä monosyyteissä (Fig. S2B). Resident vatsakalvon ja pernan MO (Fig. S2C, G) oli myös täydellinen ja /tai osittainen alentaminen MO: ssä tiheys (Fig. S2E, H), tässä järjestyksessä. Tähän liittyi siirtymä Gr-1 + myelomonocytes lähtöainelähetysten BM (Fig. S2A) ja setelien (Fig. S2B) perifeeriseen sivustoja (Kuva. S2F).

Seuraava käsitelty

Tg -rtTA /tefO-BRAF

V600E /CCR2-DTR

hiiriä DOX 7 päivää ja DT: n kanssa IP injektio päivinä 0, 3 ja 6. Kuten kuviossa 3A, tämä johti lähes täydellinen ehtyminen of TAMeja kasvaimen strooman. Histologisesti, tämä oli mukana väheneminen kasvaimen massan kanssa ainakin osittain palauttamalla kilpirauhasen follikulaarinen arkkitehtuuri (Fig. 3B). Solulisääntyminen mitattuna Ki67 värjäys väheni merkittävästi, mikä oli selvimmin peri-kasvaimen ja peri-follikulaarinen strooman osastoja (Fig. 3C). Koska valuuttalisiin ja TAM ovat tärkeimmät solutyypit sisällä strooman oletamme, että vähennys leviämisen ensisijaisesti vastaa vaikutusta TAMeja ja /tai valuuttalisien. Kuten kuviossa 3D ja E, ilman TAM, havaitsimme dramaattinen väheneminen αSMA positiivista värjäytymistä kasvain kapseli sekä sisällä kilpirauhasen välillä pesiä follikulaarinen soluja. Hoito DT ei vaikuttanut BRAF aiheuttama MAPK aktivointi, määritettynä IHC kanssa fosfo-ERK (Fig. S3). Me toisti nämä tutkimukset käyttäen toista mallia ehdollisen TAM ehtymisen (

CD11-DTR

). Havaitsimme väheneminen TAM ja αSMA

+ valuuttalisiin käsittelyn jälkeen

Tg-rtTA /tefO-BRAF

V600E /CD11-DTR

hiiret, joilla Dox ja 7 päivää + DT, kuten edellä on kuvattu ( dataa ei esitetty). Siksi MO ehtyminen aikana BRAF aiheuttama kasvain aloittaminen johtaa syvällinen remontin kasvain strooman, tunnettu ehtyminen valuuttalisiin.

edustaja osastoja T

g-rtTA /tefO-BRAF

V600E /CCR2-DTR

hiiriä hoidettiin DOX 7 päivää tai ilman vatsaonteloon DT joka toinen päivä: A) IHC anti-Mac-2 esitetään tiivis ruskea värjäystä sisällä strooman ympäröivän kilpirauhassyövän follikulaarinen solujen ohjaus PTC (

vasen

), joka on merkittävästi heikennetty DT-käsiteltyjen hiirten (

oikea

). B) PTC DT-käsiteltyjen hiirten ovat pienempiä ja niillä on enemmän säilynyt follikulaarinen arkkitehtuuria. C) IHC kanssa Ki67 osoittaa alentunut solujen lisääntymistä, ensisijaisesti stroomaan, on PTC DT-käsitellyistä hiiristä. D, E) IHC kanssa αSMA osoitti alentunut positiivisuuden kasvain kapseli ja intertumoral strooman. E) Korkeampi suurennos (40 x) osoittaa selvästi ohenemista kasvain kapseli ja ehtyminen αSMA positiivisten solujen välisessä kasvaimen tilat DT-käsiteltyjen hiirten. F) pylväsdiagrammi, joka esittää muutoksia Mac-2, αSMA ja Ki67 valvonta (n = 5) vs DT-käsiteltyjen (n = 6) hiirillä. *** P 0,001, * p 0,01.

PTC Tg-Braf hiiret voimakkaasti tunkeutunut tulehduksellinen, M2 polarisoitunut TAMeja

vieressä kääntyi hiirimallissa perustettu PTC, tutkia roolia TAMeja kasvaimen ylläpitoon ja etenemiseen.

Tg

–

Braf

hiirimallissa tiiviisti ssä toistetaan kehittyneen ihmisen BRAF mutantti PTC, että kasvaimen soluilla ominainen pitkä solun ominaisuuksia [23], ja edetä PDTC [23], [34 ]. Kuten on esitetty kuviossa. S4, CD68

+ (Fig. S4A), F4 /80

+ (Fig. S4b) ja CD11

+ (Fig. S4C) TAM surround ja raskaasti tunkeutua PTC 6-12 viikkoa vanha

T

g-

Braf

hiirillä. Sen määrittämiseksi, ovatko CCR2

+ TAMeja edistää tämän solupopulaatio, me syntyy

Tg-Braf /CCR2-GFP

hiirillä. Villityypin

CCR2-GFP

hiiret, on olemassa muutamia CCR2-GFP

+ asukas MO (Fig. S4d), kun taas

Tg-Braf /CCR2-GFP

eläimiä, noin 20% koko solupopulaation koostuu CCR2-GFP

+ TAMeja että co-express CD45

+ (Fig. S4 E, F).

vieressä määritelty fenotyyppi TAMs saatujen vakiintuneiden hiiren PTC (8-15 viikkoa ikäisiä) vertaamalla mRNA tasoja M1- vs M2 liittyviä geenejä verrattuna hiiren BMDM (Fig. S4G). Rikastaminen TAMeja lajitellaan PTC yksisolususpensioi- vahvistettiin korkea ilmentyminen

Csf-1R

, joka oli verrattavissa BMDMs. Expression of M2 liittyvien geenien

CCR2

,

arginase1

,

Ccl22 ja IL-10

oli suurempi TAM verrattuna BMDMs. Sen sijaan M1-spesifisten

IL-12

ja

ROS

eivät olleet merkittävästi erilaiset näiden solupopulaatioiden (kuvio. S4G).

valikoivasti heikentävien TAMeja aikana pitkälle edennyt PTC indusoi kasvaimen regressio: Tuloksemme osoittavat, että hiiren PTC ovat soluttautuneet M2 polarisoitunut TAMeja

seuraava luotu

Tg-Braf /CCR2-DTR

hiiret tutkia TAMeja tarvitaan kasvaimen huoltoa . Hiirten käsittely DT 10 päivä aiheutti 4-8-kertainen väheneminen TAM (Fig. 4A, B, C, D, E, F). Oli pieni samanaikainen lisäys Gr1

+, Ly6G

+ soluja, sopusoinnussa kasvaimeen infiltroivien neutrofiilien (verotunnisteissa) (Fig. 4D, E, F). TAM ehtyminen liittyi -50% vähennys kasvaimen painoa (18 +/- 3 vs. 33 +/- 7 mg DT vs. kontrolli, p = 0,0002, Fig. 5A, B). Tähän liittyi 30%: n lasku Ki67 värjäytymistä (0,54% /mm

2 vs. 0,77% /mm

2 DT vs. kontrolli; p = 0,04) (kuvio. 5C, F), ja 4 kertainen lisääntyminen TUNEL + soluissa (Kuva. 5 D, F), ensisijaisesti alueilla soluttautuvat TAMeja. Vaikka koko verisuonen tiheys oli alhaisempi TAM-köyhdytettyä PTC verrattuna ohjata PTC (Fig. 5E), tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä korjattuna kasvaimen alueelle. Pitkälle PTC hallinnassa hiirillä oli näkyvästi papillaarisen rakenteita lukuisia pesäkkeitä korkeita soluja (Kuva. S5a) ja PDTC pesäkkeet (Fig. S5B). Hoito on 6-12 viikkoa vanha Tg-

Braf Twitter /

CCR2-DTR

hiiriä DT: n kanssa 10 vuorokauden ajan aiheutti kilpirauhasen kanssa hallitseva follikulaarinen arkkitehtuuri koostuu kolloidin sisältävien munarakkuloiden, jossa on vähemmän pitkä solut ja PDTC kasvaimen pesiä (Kuva. S5c, D).

edustaja IHC kanssa Iba-1 in PTC valvonnan (A) ja DT-käsitelty (B) hiirillä. C) kvantifiointi Iba-1 positiivisesti värjäämällä solut kilpirauhasen osien ohjaus ja DT-hoidettujen hiirten avulla Metamorph ohjelmistoa. D, E), FACS-analyysi anti-CD11b ja anti-Gr-1-solujen suspensioita eristetty kilpirauhasen valvonta (D) ja DT-käsitellyillä hiirillä. Koska DT (D) on runsaasti CD11 + Gr1- TAM (ylhäällä vasemmalla neljänneksessä). Sen jälkeen viikon DT (E), TAM ovat syvästi köyhtynyt pientä lisäystä CD11 + Gr1 + neutrofiilejä. F) edustaja analyysi FACS tiedot ilmoitetaan merkkiaineiden TAMeja ja neutrofiilien ennen ja jälkeen DT hoidon.

A) paino kilpirauhasen valvonta- ja DT-käsitelty

Tg-Braf /Ccr2- DTR

hiirissä 10 päivää hoidon vatsaonteloon DT joka toinen päivä. * P 0,01. B-C) edustaja kohdat osoitetuilla tahroja. F) kvantifiointi Ki67 ja TUNEL positiivista värjäytymistä käyttäen Metamorph tietojen analysointi. Ki67 p 0,04; TUNEL p 0,01.

CSF-1 /CSF-1R signalointi tarvitaan TAM rekrytointia ja voidaan farmakologisesti kohdentaa heikentää PTC aloittamista

tutkimme seuraavaksi CSF-1 on tarvitaan TAM rekrytointia tuottamalla

Tg-Braf /Csf-1

– /-

hiirillä.

Csf-1

– /-

hiirissä on kuvattu aiemmin (36, 37) ja on normaali kilpirauhanen histologia. PTC alkaen

Tg-Braf /Csf-1

– /+

hiiret tiheään soluttautunut TAM (Fig. 6B, vasen paneeli). Neljä 5

Tg-Braf /Csf-1

– /-

hiiret osoittivat merkittävästi heikkeni TAM on PTC (Fig. 6B oikea paneeli), joka liittyi vähenemiseen kasvaimen paino (Fig. 6A), ja siihen liittyi yleisen säilyttäminen follikulaarinen arkkitehtuurin (Fig. 6C, oikea paneeli). TAM tiheys eivät vähene, kilpirauhasen yhden

Tg-Braf /CSF-1:

– /-

hiiri, jolla oli kasvain paino (Fig. 6A) ja histologinen fenotyyppi verrattavissa valvonta PTC (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat merkittävää roolia CSF-1 signalointi TAM rekrytointi tässä mallissa, vaikka muutamissa tapauksissa vaihtoehtoisten signaalit voivat ohittaa CSF-1 vaatimus TAM rekrytointia.

A) Kilpirauhasen paino

Tg-Braf /Csf-1

+/-

(ohjaus) ja

Tg-Braf /Csf-1

– /-

(

Csf-1

null) hiirillä 6-12 viikkoa iässä. B, C) edustaja kohdat on värjätty anti-Mac-2 (B) ja H /E (C) esittävät TAM ehtyminen ja säilyttäminen follikulaarinen arkkitehtuurin PTC on

Csf-1

nollahiiriä.

Voit selvittää rekrytoinnin ja /tai aktivaatio TAMeja voitaisiin estää farmakologisesti, me syötetään DOX aiheuttama

Tg-rtTA /tefO-Braf

hiiriä kyllästetyt chow sisältävien GW2580, c-FMS /CSF-1 R-tyrosiinikinaasi-inhibiittorilla (38) 7 päivää. Dox aiheuttama GW2580 hoidetuilla hiirillä oli PTC kanssa ~62% vähennys TAM (Fig. 7B, F), joka liittyy merkittävä väheneminen kilpirauhasen painon (0,0163 +/- 0,0014 ajoneuvon vs. 0,0126 +/- 0,0026 GW2580, p = 0.029; Fig. 7A) ja erilaiset kilpirauhasen follikulaarinen arkkitehtuuri (Fig. 7A). Strooman valuuttalisiin, mitattuna αSMA, vähenivät ~77% in GW2580-käsitellyillä hiirillä verrattuna kontrolleihin (Kuva. 7C, F). Kasvaimen leviämisen väheni 31% GW2580 saaneista PTC ja tämä vähennys oli ilmeisintä sisällä strooman osaston (Fig. 7B, F). Nämä havainnot kertasi vaikutukset geneettisesti heikentävien TAM (Fig. 3), vahvistamalla todisteita siitä, että TAM helpottaa kilpirauhassyöpä etenemistä ja että TAM ovat voimassa kohde potilailla, joilla on edenneen taudin.

A-D) edustaja kilpirauhasen kohdat osoitetulle tahrat 7 päivää DOX-induced

Tg-rtTA /tefO-Braf

hiirillä, joita hoidettiin joko vehikkeliä (n = 4) tai GW2580 kyllästetyn chow (n = 4): A) H /E; B) Iba-1; C) αSMA; D) Ki67. E) Kilpirauhasen painot DOX-indusoidun, ajoneuvon vs. GW2580-käsiteltyihin hiiriin (* p = 0,02). F) kvantifiointi varten ilmoitettu tahroja; * P 0,001, ** p 0,01.

Keskustelu

Makrofageilla ovat erittäin monipuolisia ja on kyky erilaistua Kupfferin soluihin, osteoklastien ja /tai penumosyy- Kotimaisissa kudosten tai osaksi tulehduksellinen Mo alatyyppejä mikrobi-infektioiden (M1 tyyppi) tai sen jälkeen kudosvaurion (M2 tyyppi). TAM välittävät isäntä vastauksena kasvaimia prosessi, ja voi aiheuttaa kasvaimen vastaisen immuniteetin (M1 tyyppi TAM) tai paradoksaalisesti parantaa kasvaimen kehittymisen (M2 tyyppi TAM) [35]. Useimmat Vastaavaa tietoa ihmisen syövistä mukaan TAM ovat protumorigenic, myös kilpirauhassyöpä [2] – [5]. Vuonna PyMT aiheuttama rintasyöpiä, TAM helpottaa kasvaimen angiogeneesiä ja keuhkoetäpesäkkeet mutta ei ole vaikutusta primaarikasvaimen kasvun [28]. In RIP1-Tag aiheuttama haiman neuroendokriinisiä kasvaimet (PNET), CSF-1 riippuvainen TAMeja helpottamaan siirtymistä hyperplastista angiogeenisten saarekkeiden PNET, mutta ei ole vaikutusta myöhemmin kasvain fenotyyppi [29]. Vuonna mutantti APC suoliston polypoosin malleja, CSF-1-riippuvaisia ​​TAMeja edistää polyyppi kasvua. Kuitenkin niiden merkitys pahanlaatuisiksi ei voitu arvioida tässä mallissa hyvänlaatuisen taudin [36]. Nämä tutkimukset sotkea TAMeja kasvainten promoottorit, vakavasti epämuodostumapiirteitä fenotyypin

Csf-1

knock hiiri käytetään näissä tutkimuksissa, ja se, että tämä malli ei salli TAMeja loppuvan aikana määritetyt vaiheet kasvaimen kehitystä rajoita johtopäätöksiä, jotka voidaan johtaa näistä kokeista. Lisäksi koska onkogeenien voi aiheuttaa erillisiä tulehduksellinen signaaleja, jotka eri tavoin vaikuttaa fenotyypin TAM, syövän mallien aiheuttama onkoproteiineja tiedetään olevan osallisena taudin synnyssä saattavat enemmän uskollisesti kerrata funktio TAMeja ihmisen syövässä.

onkogeeninen

BRAF

indusoimaan kilpirauhassyövän soveltuvat erinomaisesti opiskeluun biologian TAMeja syövän etenemisessä, koska 1) ihmisen kilpirauhassyöpä eteneminen PDTCs ja ATC liittyy lisääntynyt soluttautuminen TAMeja joka käsittää lähes -50% kasvaimen tilavuuden in ATC [4], [19]; 2)

BRAF

edistää etenemistä ihmisen WDPTCs jotta PDTCs ja ATC [16] ja 3) aktivointi BRAF-MAPK-reitin in vitro kilpirauhassoluja indusoi ilmentymisen TAM kemoattraktantit [30]. Tässä tutkimuksessa käytimme hiiren malleja BRAF aiheuttama PTC /PDTCs tutkia roolia TAMeja kilpirauhassyövän hoitoon etenemiseen. Ehdollinen aktivointi BRAF hiiren kilpirauhasen liittyy merkittävä kasvu suurten TAM kemoattraktantit,

Csf-1

ja

CCL2

. Tähän liittyy tiheä infiltraatio TAMeja ja kehittämistä PTC /PDTCs lyhyt latenssi [24]. Sen tutkimiseksi, onko syy-yhteyttä TAM soluttautuminen ja PTC kehitystä, olemme ehdollisesti köyhdytettyä CCR2 riippuva TAMeja aikana BRAF induktion avulla

CCR2-DTR

lähestymistapaa. Salakuljetusta monosyyteissä luuytimestä verenkiertoon ja kudosten vaatii signalointi kautta CCL2 /CCR2 reitin ja monosyytit puuttuu CCR2 ilmaisun juuttua BM [31]. Kun verenkierrossa ja /tai kudosten, CCR2 ilme monosyyteissä /mo säätyy alas aikana lepää valtioiden vaan pysyy ylösajettu tulehduksen [31].