Krooninen sairaus

tiivistelmä

arvioidusta 565650 ihmistä Yhdysvalloissa joka kuolee syöpään vuonna 2008 lähes kaikki tulee on etäpesäke. Rinta-, eturauhas-, munuais-, kilpirauhas- ja keuhkojen syövät etäispesäkkeitä luuhun. Kasvainsoluja oleskella luuhun käyttämällä integriinin tyyppi soluadheesiota reseptoreihin ja saada toimintakyvyttömäksi luukipu ja murtumia. Erityisesti metastasoivaa ihmisen eturauhasen kasvaimia ilmaista ja pilkkovat integriini A6, reseptori soluväliaineen komponenttien luuhun, so laminiinin 332 ja laminiini 511. Yli 50% kaikista eturauhassyöpäpotilaalla kehittyy vakava luukipu niiden jäljellä olevan käyttöiän. Yksi tärkeä tavoite on ehkäistä tai viivyttää syövän aiheuttama luukipu. Käytimme uutta ksenografti hiirimallissa suoraan määrittää, onko luun kipua voitaisiin estää estämällä tunnettu lohkaisu A6-integriinin adheesio-reseptoriin. Ihmisen ilmentävien kasvainsolujen joko villityypin tai mutantit A6 integriini pantiin elävässä luuta ja 21 päivää myöhemmin, integriinin ilmentyminen varmistettiin RT-PCR: llä, röntgenkuvia otettiin talteen ja käyttäytymiseen mittaukset spontaani ja mieleen kipua suoritetaan. Kaikki eläimet riippumaton integriinin asema oli mahdoton erottaa kasvaintaakkaa ja kehitetään luukato 21 päivän kuluttua leikkauksesta. Vertailu eläimet, jotka sisältävät villin tyypin tai mutantit integriini paljasti, että kasvainsolut ilmentävät mutatoidun integriini johti dramaattiseen laskuun luukatoa, unicortical tai bicortical murtumia ja lasku kyky kasvainsolujen päästä epifyysilevyjen levyn luuhun. Lisäksi kasvainsolujen luuhun ilmaisemiseen integriinimutaatiota esti syövän aiheuttama spontaani flinching, tuntoon allodynia, ja liike herätti kipu. Estäminen A6 integriini pilkkominen on eturauhaskasvainsolun pinnan vähensi kasvainsolujen vaeltamista luuhun ja puhkeamista ja aste luukipu ja murtumia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että strategiat estää lohkeaminen tartunta reseptorien kasvainsolun pinnalla voidaan merkittävästi estää syövän indusoiman luun kipua, ja hidas sairauden eteneminen luun sisällä. Koska integriinin hajoamista välittävät urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA), työtä on perusteltua tehokkuuden testaamiseksi uPA estäjien ehkäisyyn tai viivästyminen syövän aiheuttama luukipu.

Citation: kuningas TE, Pawar SC, Majuta L, Sroka IC, Wynn D, Demetriou MC, et al. (2008) The Role of Alpha 6 integriini Eturauhassyöpä Migration and Bone Kipu Novel ksenograftimallissa. PLoS ONE 3 (10): e3535. doi: 10,1371 /journal.pone.0003535

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: Kesäkuu 27, 2008; Hyväksytty: 26 syyskuu 2008; Julkaistu: 28 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 King et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tuettiin osittain NIH myöntää CA56666, CA23074, ja GM008718. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

arvioidusta 565650 ihmistä Yhdysvalloissa joka kuolee syöpään vuonna 2008, lähes kaikki on etäpesäkkeitä [1]. Rinta-, eturauhas-, munuais-, kilpirauhas- ja keuhkojen syövät etäispesäkkeitä luuhun. Kasvain solujen luuta saada osteolyyttinen ja osteoblastien reaktioita ja työkyvyttömyyteen luukipu ja murtumia [2], [3]. Yksi tärkeä tavoite on ehkäistä tai viivyttää syövän aiheuttama luukipu. Invasiivinen ja metastaattinen ihmisen eturauhasen kasvaimia ilmaista integriini A6B1, reseptori soluväliaineen komponenttien luuhun, eli laminiinin 332 ja laminiini 511 [4] – [10].

Ihmisen eturauhasen syöpä on veltto sairaus, progressiivinen tarttuvuus muuttuu siirryttäessä normaalista rauhaset eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia (PIN) kohdunkaulan syöpä [5], [16] – [19]. Viimeaikainen tutkimus on osoittanut, muutos normaalissa ihmisen eturauhasessa organisaatio ja adheesiomolekyylien aikana eturauhasen syövän etenemistä [5], [15]. Paeta eturauhanen ja hyökkäyksen kautta kapselin liittyy huonoon ennusteeseen kun taas suljetussa tauti on hoidettavissa. Muutokset adheesiomolekyylien ja loppupään signalointi seuraukset voivat selittää stimuloidun hyökkäys syöpäsolujen niiden alkuperäisistä tiloista. Integriinit ovat transmembraaninen heterodimeerin soluadheesiota reseptoreihin [15]. Integriini ilmentymisen normaalissa eturauhasessa heijastaa monimuotoisuutta soluväliaineen komponentteja. Normaaleille integriinin ilmentymisen säilyvät vaurioita, joissa normaalit tyvisoluissa säilytetään ja hyökkäys ei ole tapahtunut (eli PIN vaurioita) [5], [16] – [19]. Kuitenkin sisällä invasiivisia karsinoomia, suurin osa integriini alayksiköt ei havaittu kasvainsolujen pintoja. Merkittävä poikkeus on läpitunkeva menetys integriinin ilmentyminen on jatkuva ilmaus laminiinin reseptorien, A3 (10% tapauksista) ja A6 (69% tapauksista) integriinit, havaittiin invasiivisen ihmisen eturauhasen syöpä jälkeen saatu eturauhasen [5], [17]. Tutkimukset osoittavat, että laminiinin reseptorit A6B1 ja A3B1 pidetään useimmissa eturauhasen karsinoomien. Aikana ihmisen PIN eturauhasen syöpä siirtyminen, A6B4 integriinin ilmentyminen on kadonnut ja A6B1 integriini vallitseva invasiivisen ihmisen eturauhassyövän ja etäpesäkeleesioita [4], [6]. Lukuisat tutkimukset ovat sekaantuneet A6 integriinien syövän etenemisessä [20]. Solunulkoista ligandeja A6B1 ovat Laminiinin 332 ja 511, näkyvä ainesosia ihmisen ja hiiren luuytimen [7], [21].

tarkastettua A6B1 integriinin ilmentymisen eturauhaskasvainsoluissa paljastaa uudenlainen rakenteellinen muunnos solun pinnalla kutsutaan A6pB1 [11], [14], [22]. A6 integriinin alayksikkö pilkkoutuu puoli kasvaimen solun pinnan tietyn aminohappotähteen aiheuttaen beta piipun domeenin ja jättää loput reseptorin ehjä [12]. Eturauhassyövän solut, jotka ilmentävät mutatoidun reseptoria, jota ei voida lohkaista, johti tuumorin solumigraation laminiinille 332 kudosviljelyolosuhteissa [13].

Tässä tutkimuksessa määritetään, onko integriini pilkkominen vaikuttaa tuumorisolujen muuttoa kliinisesti merkityksellistä etäpesäke sivuston, kuten luun. Käytimme uutta ksenografti hiirimallissa luun kipua suoraan määrittää vaikutukset ihmisen kasvainsoluissa sijoitettu elävän luuta syövän indusoiman luun kipua. Luuytimen on runsaasti laminiini 332 (Laminin 5) ja laminiini 511 (Laminin 10) [8], [9] ligandeja A6B1 integriini [7]. Olemme edelleen testanneet vaikutus syövän aiheuttama luukipu koska edellinen työ vahvasti osallisena integriinit ylläpidossa neuropaattista kipua [23].

Tulokset

Näin käytimme PC3N-A6-WT ja PC3N-A6-RR eturauhassyövän solut, jotka ilmentävät yhtä tasoja villityypin A6 alayksikön (katkaistavissa ja A6p kautta uPA hoito) ja ei-katkaistavissa alayksikön, vastaavasti (Fig. 1a). Pinta ekspressiotasot reseptorien vastasivat määritettynä virtaussytometrialla (FACS) (Fig. 1b). Kyky katkaista reseptorin urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA), ja sukupolvi A6p rakenteellinen muunnelma on esitetty kaavamaisesti (Fig. 1 c). Seuraavaksi testasimme funktionaalisia ominaisuuksia A6 integriini käyttäen laminiinin 111, joka sisältää matriisin, matrigeeliä, modifioitu sisältämään laminiinin 332. Matrigel on laminiini rikas soluväliaineen, että mallit fysiologisesti merkitykselliset olosuhteet [24]. PC3N-A6-WT-solut vaelsivat sisällä matrigeeliä tavalla, joka oli integriinin riippuvainen (Fig. 1 d). Solut, jotka sisältävät Lohkeamaton reseptorin, PC3N-A6- RR, eivät kyenneet voivat siirtyä matrigeeliä, yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten kanssa käyttämällä rutiininomaisia ​​kudosviljelmässä olosuhteissa (Fig. 1 d) [13].

(A): n ekspressio täyspitkä 6 integriiniä (6) ja uPA riippuu tuotannon 6p variantin (6p) määritettiin western blot -analyysillä. Integriini asema kokosoluliuotteista päässä doksisykliiniä (Dox) tai urokinaasi (uPA) käsittelemättä (-) ja sitä käsiteltiin (+) PC3N-A6-WT ja PC3N-A6-RR solulinjoissa määritettiin. (B) pinta-ekspressiota villityypin ja mutatoidun integriinin 6 doksisykliini indusoi PC3N-A6-WT ja PC3N-A6-RR-soluissa määritettiin virtaussytometrialla. PC3N-A6-WT ja PC3NA6- RR soluja inkuboitiin ensisijaisen Rat anti-integriini-A6-vasta-aineen J1B5 seuraa Alexa 488 anti-rotta-vasta-aine, ja visualisointiin käytettiin BD FACScan. Harmaa huippu osoittaa fluoresenssisignaalisuhteet johdetusta vasta-ainetta ainoastaan. (C) Kaaviokuva havainnollistaa lohkaisu täyspitkä muoto 6-integriinin, jolloin saatiin 6p variantti. Määritelmä PC3N-A6-WT ja PC3N-A6-RR-solujen suhteen integriinin tila näkyy. (D) integriini välittämää migraatio PC3N-A6-WT-solut (ylälevyissä) ja PC3NA6- RR soluja (alapaneeli) Matrigelillä. Solut sijoitettiin Matrigelillä läsnä ollessa peitelasi luoda solun vapaa vyöhyke matrigeeliä pinnalle. Sen jälkeen soluadheesion oli täydellinen, peitinlevyjä poistettiin matrigeelin pinnoista, jotta muuttoliikkeen soluun vapaa-alueelle osoitetaan valkoinen tai musta kaareva viiva. Solut muuttoliike tapahtui optimaalisissa kasvuolosuhteissa 37 noin 18 tuntia. Solut joko sallia siirtyä puuttuessa (vasen paneelit) tai läsnä ollessa (oikea paneeli) integriini estävän vasta-aineen AIIB2. Kuvat otettiin käyttäen Zeiss Axiovert mikroskooppi on varustettu 2,5 X tavoite.

Jotta vaikutuksen määrittämiseksi ihmisen eturauhasen syöpäsolujen luun sisällä, me mukautettu Clohisy-Mantyh hiirimallissa, jossa syöpä solut injektoidaan suoraan ja suljetaan osaksi reisiluun hiiren [25]. SCID-uroshiirissä nukutettiin ketamiini /ksylatsiini ja nivelen suoritettiin altistamalla nivelnastojen distaalisen reisiluun kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Reikä oli porattu reisiluun varten injektioneulalla varmistaa tarkka sijoittaminen kasvainsolujen luun sisällä. Tarkka sijoittaminen neula intramedullaarisessa tilaan reisiluun varmistettiin kuvantaminen (Fig. 2a, vasen paneeli). Ihmisen eturauhaskasvainsoluissa ruiskutettiin oikean jalan hiiren ja pistoskohdan sinetöity hammasamalgaami (Fig. 2a, oikea paneeli).

(A) Röntgenografiset Kuvat on otettu tarkastaa neulan sisälle intramedullaarisessa space reisiluun asti distaalisen kolmanneksen luun (vasen paneeli). Kasvain solut suljettiin luuhun (oikea paneeli). (B) Radiologinen otettuja kuvia 21 päivää injektioiden jälkeen osoittaa, luukato joko käsittelemättömiä hiiriä (kontrolli) tai hiiriä, joihin injektoitiin ilmentävien tuumorisolujen villityypin integriiniä (PC3N-A6-WT) tai mutatoidun integriini (PC3N-A6-RR). (C) kvantifiointi luukadon eläimille joko huijausta injektoitiin (Control) tai injektoitu kasvainsoluja, jotka ilmentävät villityyppistä integriiniä (PC3N-A6-WT) tai mutatoidun integriini (PC3N-A6-RR). Luukato oli mitoitettu seuraavien 5 pisteen asteikolla: 0 = normaali, 1 = luukatoa havaittiin alle puoli distaalisen kolmanneksen luun, 2 = luukatoa havaittu yli puoli distaalisen kolmanneksen luun, no murtuma, 3 = koko paksuudeltaan unicortical luukato osoittaa unicortical luun murtuma, 4 = koko paksuudeltaan bicortical luukato osoittaa bicortical luun murtuma. (D) prosenttimäärä hiirten murtuman 21 päivää leikkauksen. Lukumäärä hiirtä kussakin ryhmässä oli kaksitoista.

vieressä määrittää vahingollisia vaikutuksia syöpäsolujen asuvat luuhun käyttämällä tavanomaisia ​​röntgenkuvausta elävien eläinten 21 päivää leikkauksen. Kaikki eläimet injektoitiin PC3N-A6-WT, ja PC3N-A6-RR solujen kehitetty luukatoa 21 päivää leikkauksen (Fig. 2b). Kuvat osoittivat johdonmukaisesti osteolyyttisiä aktiivisuutta, erityisesti olevan luun distaalisen (polvi) pää reisiluun. Injektoitujen hiirien PC3N-A6-WT-solut osoittavat merkittävästi lisää luun menetystä verrattuna niihin ruiskutetaan PC3N-A6-RR-soluja. Ei luukato havaittu eläimillä injektoitiin median yksin (kuvio 2b). Eläimet injektoitiin PC3N-A6-WT-solut osoittivat lisääntynyttä luukato verrattuna pistetään PC3N-A6-RR-soluissa (kuvio. 2b). Röntgenkuvissa arvioitiin mukaisesti 4 pisteen asteikolla, jossa 0 tarkoittaa normaalia luun ja 3 osoittaa koko paksuudeltaan bicortical luukatoa (Fig. 2c). Eläimet injektoitiin PC3N-A6-WT-solut osoittivat dramaattinen kasvu murtumia (unicortical tai bicortical) 21 päivää leikkauksen jälkeen verrattuna PC3N-A6-RR käsitellyissä hiirissä (Fig. 2d). Nämä tiedot osoittavat, että sijoittaminen kasvainsolujen luuhun sisältää ei-katkaistavissa oleva A6 integriini johtaa merkittävään viivästymiseen kehittämisessä luukatoa.

Vaikka kuvantamisen tulokset antoivat tietoja vakava luun tuhoutumisen, se teki ei anna suoraa tietoa jakelun tuumorisoluihin. Luukato johtuu osittain syöpäsolujen asuva luun; tapahtuma, joka vaikuttaa dramaattisesti kriittinen tasapaino osteolyyttisiä ja osteoblastien [3]. Olemme suoraan tutkittu jakautuminen kasvainsolujen luuhun käyttäen histologisia analyysi hemotoksyliinillä ja eosiinilla värjäytyminen kalkittomat yksilöitä. Hiiren luut huolellisesti suunnattu pitkittäis- leikkauksessa sisällyttää havainnoimalla epifyysilevyjen levyn sekä distaalinen alue luun samaan jaksoon (Fig. 3A, yläpaneeli). Analyysi luiden kasvain pistetään eläimet osoittivat läsnä kasvaimen koko intramedullaarisessa tila luun niissä ruiskutetaan PC3N-A6-WT solut yhdessä invaasion luunkuoren (Fig. 3A, keskusta paneeli). Kasvain sisältävien solujen lohkeavan integriini oli saavuttanut epifyysilevyjen levy; luuytimen oli täysin korvattu. Tämä tulos on yhdenmukainen tieto, että kun eturauhassyövän on vakiinnuttanut asemansa luuytimen se korvaa lopulta luuytimen keskeyttäen luun homeostaasin [3]. Sen sijaan PC3N-A6-RR pistetään eläimiä sisältämät kasvainsoluihin varren alue luun ja kasvaimen jäi epifyysilevyjen levy. Normaali luuytimen oli läsnä alueilla, jotka eivät sisältäneet kasvainsoluja (Fig. 3A, alapaneeli). Kasvain solut puolivälissä varren alueella tai jotka olivat saavuttaneet epifyysilevyjen levy olivat elinkelpoisia ja morfologisesti erottaa. (Fig. 3A, keskusta ja alapaneelin, insets). Kasvain hajotuskuvio havaittiin olevan johdonmukaisesti histologinen analyysi kaikista koe-eläimistä analysoitiin.

(A) värjäys hematoksyliini-eosiinilla normaalin luun (kontrolli) tai luun ruiskutetaan PC3N-A6-WT-solut (WT, keskimmäinen paneeli ja upotus) ja PC3N-A6-RR-solut (RR, alapaneeli ja upotus). Kasvurustoa luun (epifyysilevyjen levy) on suunnattu vasemmassa yläreunassa kunkin paneelin vertailun vuoksi. (B) RT-PCR-analyysi tunnistaa ilmentymisen mutatoidun 6 integriini luuytimessä. Kaksikymmentäyksi päivää injektion, luuydin kerättiin, RNA uutettiin ja analysoitiin. RNA PC3N-A6-WT-solut ja PC3N-A6-RR kasvavien solujen kudosviljelmän verrattiin luuytimen eristetty hiiriä, joihin injektoitiin PC3N-A6-WT-soluja (luuytimen-WT-solut) tai PC3NA6- RR-soluja (luuytimen luuytimen-RR-solut). GAPDH monistus suoritettiin kontrollina, ja kB markkereita, kuten on esitetty.

Sen varmistamiseksi, että injektoitu kasvainsoluja, jotka ilmentävät mutatoitua integriiniä, 21 päivää injektion jälkeen PC3N-A6-WT tai PC3N-A6-RR-solujen, luuytimen ilmennettiin intramedullaarisessa tilaa hiiren reisiluissa. Analyysi luuytimen näytteet johtivat mRNA spesifinen PC3N-A6-RR-solut luuytimen injektoitujen hiirien PC3N-A6-RR, mutta ei PC3N-A6-WT-hiirissä. Nämä tiedot osoittivat, että PC3N transfektoitujen solujen Lohkeamaton A6 integriinin ylläpidetään ilmentymistä mutantti-integriinin sisällä intramedullaarisessa tilaan reisiluun ja olivat läsnä 21 päivää injektion jälkeen soluista reisiluun (Fig. 3B).

Behavioral analyysit spontaani ja mieleen kipua määritettiin 21 päivää injektion jälkeen PC3N-A6-WT tai PC3N-A6-RR solujen reisiluun arvioida rooli pilkkomisen A6 integriinin kehittämiseen spontaani ja mieleen syöpäkivun käyttäytymistä. Spontaani kipu mitattiin arvioimalla flinching on hoidettava syöpä takajalkojen kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Hiiret injektoitiin PC3N-A6-WT-solut osoittivat lisääntynyttä spontaania flinching käyttäytyminen verrattuna PC3N-A6-RR hoidetut hiiret, jotka osoittivat alhaisia ​​flinching jotka olivat verrattavissa kontrollieläimiin (Fig. 4a). Synnytyksen merkittävä kipua, kuten on osoitettu tuntoon allodynia, määritettiin käpälän vetäytyminen luotaa on takakäpälän samanpuoleisesti hoidettava syöpä reisiluu kalibroiduilla von Freyn filamentit kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Injektoitujen hiirien PC3NA6-WT-solut osoittivat tuntoon allodynia kuten on osoitettu alentaa kynnystä käpälän poisvetäminen von Freyn filamentit (Fig. 4b). Sen sijaan PC3N-A6-RR pistetään hiiret eivät näytä tuntoon allodynia, tassu-poisvetokynnykset samanlainen kontrollieläimiin (Fig. 4b). Movement-herätti kipu määritettiin mu raajan käyttö normaalissa avohoidossa liikkeen aikaisemmin kuvatulla [26]. Hiiret injektoitiin PC3N-A6-WT solujen kehitetty liike herätti kipu taas hiiriin ruiskutettiin PC3N-A6-RR-solut osoittivat mitään liikettä aikaansaaman kivun, raajan käyttö arvosanat sama kontrollieläiminä (Fig. 4c).

(A) Spontaneous kipua mitattuna flinching ja ipsilateraalisen takaraajan määritettiin huijausta injektoitiin eläimiin (kontrolli) tai jotka ruiskutetaan ilmentävien kasvainsolujen villityypin integriini (PC3N-A6-WT) tai niille ruiskutettiin ilmentävien kasvainsolujen mutatoitunut integriini (PC3N-A6-RR). Korkeus flinching toiminta osoittaa lisääntynyt kipu vastauksen. (B) Tactile allodynia mitattuna käpälän-vetäytyminen von Freyn filamentit huijausta injektoitiin eläimiin (kontrolli) tai jotka ruiskutetaan ilmentävien kasvainsolujen villityypin integriini (PC3N-A6-WT) tai niille ruiskutettiin ilmentävien kasvainsolujen mutatoitunut integriiniä (PC3N-A6-RR). Pieneneminen poisvetämiskynnys indikoi lisääntynyt kipu vastauksen. (C) liikkeen mieleen kipua havaittiin huijausta injektoitiin eläimiin (kontrolli) tai jotka ruiskutetaan ilmentävien kasvainsolujen villityypin integriini (PC3N-A6-WT) tai niille ruiskutettiin ilmentävien tuumorisolujen mutatoitunut integriiniä (PC3N-A6-RR) .

Nämä tiedot osoittavat, että lohkaisu integriinin A6 vaikuttanut kehittämistä cancerinduced spontaani ja herätti kipua, joka liittyy luukatoa ja murtumia. Estäminen pilkkominen integriinin A6 vähentynyt voimakkaasti luukatoa ja kehittämiseen cancerinduced kipua. Sitä vastoin ilmaus lohkeavan A6 integriinin lisääntynyt cancerinduced luukatoa ja murtumien kanssa samanaikaisen kivun lisääntyminen käyttäytymistä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa hyödynnetään suoraruiskutteisella luu malli nimenomaan sijoittaa ihmisen eturauhaskasvainsoluissa suoraan fysiologisesti ja kliinisesti merkittävää luun ympäristö, runsaasti laminiinin 332 ja 511. Näin saatoimme onko estää tuotannon laminiinireseptori (A6pB1) muuttaisivat kyky kasvainsolujen siirtää tai muuttaa ympäristön luun ja onko tämä järjestetään toiminnallista merkitystä kannalta luukipu.

tulokset osoittivat, että muuttamalla tuotanto A6pB1 laminiinireseptori on kasvainsolun pinta voi merkittävästi haitata muuttoliike luuhun. Suoraruiskutteisella malli mahdollistaa tarkka sijoittaminen tunnettu lukumäärä kasvainsolujen luuhun. Koska kasvainsolut kasvavat yhtä hyvin riippumatta integriinin asema [13], [27] (sekä kudosviljelmässä ja ihmisen kasvaimia hiirissä), tiedot viittaavat siihen, että jakelu kasvainsolujen luussa voi olla keskeinen vaikuttaminen syövän aiheuttamaa luukipu. Kyvyttömyys kasvainsolujen päästä epifyysilevyjen alueella luun johtuen integriinin aseman samaan aikaan merkittävä vähennys kolme erillistä käyttäytymiseen kipua mittauksia. Vaikka ei tiedetä tällä hetkellä, onko sijainti kasvainsolujen luussa ja luukipu olivat toiminnallisesti liittyvät, muut raportit ovat osoittaneet, että luu-, mikroympäristöihin ovat riittävän erilaisia ​​perusteeksi tätä mahdollisuutta [28].

On mahdollista, että vähentynyt luun kipu johtuu kyvyttömyydestä integriinin voidaan lohkaista, sijainnista riippumatta tuumorisolujen luun sisällä. Integriinit ja kadheriineja pilkotaan tai irtoa kasvainten solujen pinnalla [29] – [32]. Vapautunut reseptorien fragmentit meneillään ektodomeeni pilkkominen ovat biologisesti aktiivisia ja voivat edistää syövän aiheuttama luukipu [33]. Lisäksi kokeet erottaa näitä mahdollisuuksia.

Vaikka luuetäpesäkkeistä Perinteisesti ajatellaan olevan joko osteolyyttisiä tai osteoblastic, morfologiset analyysit ovat osoittaneet, että useimmilla potilailla, luumetastaaseja on sekä osteolyyttinen ja osteoblastic elementtejä [38]. Eturauhassyöpäpotilailla, luuetäpesäkkeistä usein näyttää enemmän osteoblastic fenotyyppi, vaikka jotkut potilaat ovat osteolyyttisiä vaurioita samankaltaisia ​​kuin potilailla, joilla on metastasoitunut rintasyöpä [38]. Tämä tutkimus keskittyi ihmisen eturauhassyövän solulinjaa, joka tuotti enimmäkseen osteolyyttiset luun hiiren luun. Kyvyttömyys integriinin voidaan lohkaista vähensivät luukatoa ja murtuma. Koska useimmat luukatoa ja murtumia havaitaan distaalipäähän luun, kyvyttömyys kasvainsolujen päästä epifyysilevyjen alueella luun voi ovat vähentäneet luukatoa ja murtumia tällä alueella. Tulevaisuuden tutkimukset roolista integriinien osteoblastic luun tarvittaisiin selvittää muuttamalla integriinifunktiota myös muuttavat osteoblastic reaktioita luun.

Lopuksi on huomautettava, että syöpä aiheuttama luun tuhoutumisen liittyy vakavasti heikentynyt laatu elämä johtuvat komplikaatiot, kuten hyperkalsemia, luun murtuma ja työkyvyttömyyteen kipua. Edistysaskeleet syövän havaitseminen ja hoito ovat laajentamalla elinajanodote syöpäpotilaiden ja kasvaa tavoitteenaan parantaa potilaiden elämänlaatua. Sekä käyttö uuden ksenografti hiirimallissa tutkimiseen syövän aiheuttama luukipu ja kohdistaminen adheesioreseptoreina kasvaimen solujen pinnalla luun pitäisi vaikuttaa merkittävästi elämänlaatua potilailla, joilla on etäpesäkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Human Prostate Cancer Cell Lines

PC3N-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka sisälsivät joko villityypin tai mutatoidun integriini A6 kuten aikaisemmin on kuvattu [13]. Vakaa kloonit (PC3N-A6-WT ilmentävät villityyppistä integriini A6 ja PC3N-A6-RR ilmentävät ei-katkaistavissa integriini A6) eristettiin ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. PC3N-A6-WT ja PC3N-A6-RR-soluja kasvatettiin Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan ​​(IMDM) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) plus 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kun läsnä oli 6 g /ml Blasticidin ( Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) ja 1 g /ml zeosiinia (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA).

vasta-aineet ja kemikaalit

vasta-aineet olivat seuraavat: J1B5, rotta monoklonaalisia vasta- A6 integriini (Dr. Caroline Damsky, University of California, San Francisco, USA) [34]; AA6A kanin polyklonaalista anti-A6 integriini-vasta-aine [13] ja AIIB2, rotan monoklonaalinen anti-B1-integriini-vasta-aine [35] (American Type Culture Collection). Ihmisen rekombinanttia EGF ostettiin Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA. Urokinaasi hankittiin Chemicon (Temecula, CA, USA).

immunoblottauksella

Solut kasvatettiin konfluenssiin ja pestiin sitten kolme kertaa HEPES-puskuria ja hajotettiin kylmässä RIPA-puskurissa plus proteaasi-inhibiittoreita (PMSF , 2 mM; leupeptiiniä ja aprotiniinia, 1 g /ml). Lysaatit sonikoitiin jäissä ennen suspendoitiin 2 x ei-pelkistävässä näytepuskurissa. Näytteitä keitettiin 5 minuutin ajan, ja sen jälkeen nopea chill jäällä, ne on lastattu 7,5% SDS-PAGE. Proteiinit erotetaan geelissä siirrettiin sähköllä Millipore Immobilon-P polyvinylideenifluoridia (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA), inkuboitiin Western-blottauksella vasta plus sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin ja visualisoitiin kemiluminesenssin (ECL Western Blotting Detection System , Amersham, Arlington Heights, IL, USA).

matrigeelin migraatiokokeessa

Kuusi hyvin päällystettiin 1 ml matrigeelin (BD Biosciences, Bedford, MA) ja täydennetty laminiinin 332 sisältävän pakatun väliainetta HaCaT soluista 2:01 suhde ja annetaan jähmettyä. Steriili pyöreä peitelevy on sijoitettu keskelle. Sitten soluja siirrostettiin levyjen ja annettiin kiinnittyä 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa väliä tarttumattomat solut poistettiin, ja sitten peitinlasit poistettiin jolloin jäljelle jäi kirkas vyöhyke keskellä levyä. Periferiassa Tämän vyöhykkeen oli merkitty. Seerumivapaassa tai seerumivapaassa kanssa estävää vasta-ainetta, lisättiin soluihin ja annettiin inkuboitua 37 ° C: ssa 18 tunnin ajan. 1 ng /ml EGF lisättiin median aiheuttaa muuttoliikettä. Solut havaittiin käyttäen Zeiss Axiovert mikroskooppi (2,5-kertainen suurennus) ja kuvien kerättiin käyttämällä CCD-kameraa.

Surgery

Kaikki toimenpiteet, joissa käytetään eläimiä hyväksyi Arizonan yliopiston institutionaalisten eläinten hoito ja käyttö komitea, IACUC protokolla # 06-081. Eläimet nukutettiin ketamiini /xylacine ja nivelen suoritettiin altistamalla nivelnastojen distaalisen reisiluun. Reikä oli porattu reisiluu, ja neula on työnnetty reikään. Faxitron-yksikköön kuvat otettiin 2 tasossa tarkastaa neulan sisälle intramedullaarisessa tilaa reisiluun. PC3N-A6-WT tai PC3N-A6-RR-soluja, 10

6 5 ul suodatettiin minimaalinen essential medium (MEM), joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) tai 5 ui suodatettua MEM, joka sisälsi 1% BSA: ta yksinään (kontrolli) injektoitiin intramedullaariseen tilaan hiiren reisiluu oikean jalan ja pistoskohdan suljettiin hammasamalgaami. Sillä Seuraavat kokeet 12 eläimet saivat PC3N-A6-WT, 12 sai PC3N-A6-RR-solut, ja 12 eläimet saivat solutonta seerumi (kontrolli).

Behavioral Pain Toimenpiteet [26]

Movement aikaansaaman kivun

. Hiiri pantiin tyhjään hiiren pannulla ja havaittu kävellessä ympäri pannulla jatkuvassa liikkeessä. Ontuminen ja /tai vartioinnista käyttäytymistä oikealle (syöpä pistetään) takaraajan arvioitiin seuraavalla asteikolla: 0 = täydellinen puuttuminen käytön, 1 = osittainen käyttämättä jättämisestä, 2 = ontuminen ja vartiointi, 3 = ontuminen, 4 = normaali kävely.

Spontaani kipu

. Arvioida flinching ja vartiointi käyttäytyminen, eläimet asetettiin esille pleksi kammioissa lanka ritilälattiaa havainnointiin flinching ja vartiointi oikean takaraajan. Hiirten annettiin sopeutua kammioon 20 minuuttia. Vartiointi- ja flinching käyttäytymistä kunkin hiiren mitattiin 2 minuuttia. Lukumäärä flinches laskettiin, ja käytetty aika vartiointi jalka (jalka on nostetaan pois lattian) mitattiin.

Tactile yliherkkyys (allodynia)

. Paw poisvetokynnykset von Freyn filamentit määritettiin kuvatulla tavalla Chaplan et al. [36] käpälän poisvetämisen kynnys määritettiin vastauksena hyvää kalibroiduilla von Freyn filamentit. Hiiret pidettiin keskeytettiin häkkejä metalliverkko lattiat ja von Frey hehkulampun levitettiin kohtisuoraan jalkapohjan pintaan käpälän hiiren kunnes se buckled hieman, ja pidettiin 3-6 sekuntia. Positiivinen vaste merkitty terävä peruuttaminen käpälän. 50% käpälän poisvetämisen kynnys määritettiin ei-parametrinen menetelmä Dixon [37]. Ensimmäinen koetin vastaa 2 g levitettiin ja jos vastaus oli kielteinen, ärsyke oli asteittain lisätään, kunnes positiivinen vastaus saatiin, laski sitten, kunnes negatiivinen tulos saatiin. Tämä ylös-alas menetelmää toistettiin, kunnes 3 käyttäytymisen muutoksia määritettiin, ja kuvio positiivisten ja negatiivisten vastausten oli taulukoitu. 50% käpälän poisvetämisen kynnys määritettiin (10

[Xf + k *]) /10000, jossa Xf = arvo viimeisen von Frey hehkulamppuja palveluksessa, k = Dixon arvo positiivinen /negatiivinen malli, ja * = keskiarvo (log) ero ärsykkeiden. Kaikki kipu testit tehtiin kunkin eläimen seuraavassa järjestyksessä, liike-mieleen kipu, spontaani kipu (kun 20 minuuttia totuttamistiedot aikana), ja tuntoon yliherkkyys.

määritys luun tuhoutumisen

Röntgenkuvat otettiin ennen injektiota syöpäsolut (lähtötilanteessa, BL) ja 21 päivän induktio luusyöpä käyttäen Faxitron-yksikköön MX-20 koneen 7 uM nimellinen resoluutio ja röntgenkuvaus virta 300 uA ja jännitteellä 26 kV (Faxiton X-ray Corp., Wheeling, IL). Digitaaliset röntgenkuvat otettiin seuraavat käyttäytymistestausta 12 eläintä per hoito kunnossa. Kuvat otettiin digitaalikameralla ja siirretty tietokoneelle ja tallennetaan digitaalisessa harmaasävy- muodossa (TIFF). Luukato oli mitoitettu seuraavien 4 pisteen asteikolla: 0 = normaali, 1 = luukato, ei murtuma, 2 = koko paksuudeltaan unicortical luukato osoittaa unicortical luun murtuma, 3 = koko paksuudeltaan bicortical luukato osoittaa bicortical luun murtuma.

Tilastolliset analyysit

tilastollinen vertailut hoitoryhmien välillä tehtiin käyttäen ANOVA. Parittaiset vertailut ryhmien välillä tehtiin Studentin t-testi, monivertailuja ryhmien välillä tehtiin käyttäen Newman-Keuls monivertailutestillä. Jotta luokitus määrityksiä, raajan käyttö ja luukatoa, tilastolliset vertailut tehtiin käyttäen ei-parametriset analyysi Mann-Whitney testi. Kaikkien analyysien merkitys asetettiin p 0,05.

histologinen analyysi kasvaimen luuhun

Päivänä 21 leikkauksen jälkeen, hiiret syvä anestesia ketamiinia ja perfusoitiin intrakardiaalisesti 25 ml 0,1 M PBS: ssä ja 25 ml 10% neutraaliksi puskuroituun formaliiniin. Ipsilateral reisiluusta poistettiin 6 eläintä kohden kunnossa ja jälkikiinnitettiin yön yli 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin. Reisiluusta huuhdeltiin vedellä poistaa formaliinilla ennen kuin ne laitetaan Tarra liuokseen (RDO-Apex, Aurora, IL), tunti saavuttaa kalkinpoisto. Näytteet poistettiin vesi arvostellaan etanoliliuoksessa ennen huolellisesti parafiiniin. Ne on suunnattu siten, että koko pituudelta reisiluun voitaisiin halkileikattuna. Kohdat 3 um paksu värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla havainnollistaa normaalia luuydinelementtien ja syöpäsolujen alla Kirkas mikroskopia. Näytteet havaittiin käyttäen Nikon mikroskooppi (10-kertainen suurennus) ja kuvat kerättiin käyttämällä CCD-kameraa.

RT-PCR-analyysi PC3N-A6-RR-solujen intramedullaariseen tilaan reisiluun

<